JP2002531141A - Aβ−ペプチドのスクリーニングアッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
びその方法の使用に関する。
の大量の喪失を伴う脳の神経変性疾患である。冒された脳の領域にはアルツハイ
マー病の主要な特徴である分子レベルでのタンパク質の沈着いわゆるプラークを
分子レベルで検出することができる。これらのプラーク中に最も頻繁に存在する
タンパク質はサイズ40〜42アミノ酸のペプチドであり、これはAβ−ペプチ
ドと命名されている。このペプチドは有意により大きな695〜770アミノ酸
の切断生成物いわゆるアミロイド前駆体タンパク質(APP)である。
ンパク質のかけ離れて大きな部分は細胞外にあるが、短いC−末端ドメインは細
胞質ゾルに向けられている(図1)。Aβ−ペプチドは図1中に暗灰色で示して
いる。Aβ−ペプチドの約3分の2は細胞外ドメインに由来し、約3分の1はA
PPの膜貫通ドメインに由来する。
APPsec(分泌APP)と呼ばれるアミロイド前駆体タンパク質の分泌型がある
。APPsecはAPPから蛋白質分解的切断によって形成され、これはα−セク
レターゼによって行われる。蛋白質分解的切断はAβ−ペプチドのアミノ酸配列
内のAPPのアミノ酸配列の部位(Aβ−ペプチドのアミノ酸残基16のあと)
で起こる。α−セクレターゼによるAPPの蛋白質分解は、したがってAβ−ペ
プチドの形成を除外する。
される。このプロセッシング経路にはさらに2種のプロテアーゼが関与し、β−
セクレターゼと命名される1つのプロテアーゼはAPP中のAβ−ペプチドのN
−末端を切断し、γ−セクレターゼと呼ばれる第二のプロテアーゼはAβ−ペプ
チドのC−末端を遊離させると考えられている(Kang Jら, Nature, 325, 733)
(図1)。
セクレターゼ、γ−セクレターゼ)のいずれも同定することができていない。し
かしながら、セクレターゼの知識はとくにアルツハイマー病および関連するタン
パク質の同定の研究の関係で大きな興味をもたれ、それはまた研究を継続する標
的ともなっている。一方では、β−セクレターゼおよびとくにγ−セクレターゼ
の阻害はAβの産生を減少させるのに対して、他方ではα−セクレターゼの活性
化はAPPsec中のAPPのプロセッシングを増大し、したがって同時にAβ−
ペプチドの形成を低下させる。このような研究の過程で発見されたトランスジェ
ニックシーエレガンスが未公開ドイツ特許出願198 49 073.9に記載されている。
事実の多くの指示がある。とくに、細胞培養においてAβ−原繊維には神経毒性
があると考えられている(Yankner B. A.ら, 1990, Proc Natl Acad Sci USA, 8
7, 9020)。APPが付加的なコピーとして生じるダウン症候群の患者では、3
0歳の年齢でもアルツハイマー病に特徴的な神経の病変が起こる。この場合はA
β−ペプチドへの変換の増加がAPPの過剰発現をもたらすものと推測される(
Rumble,B.ら, 1989, N.Engl,J.Med., 320, 1446)。
よく知られている形態であろうと思われる。この場合、β−およびγ−セクレタ
ーゼ切断部位の領域の周辺のAPP遺伝子中またはさらに2つのAD−関連遺伝
子(プレセニリン)に突然変異が見いだされ、これが細胞培養においてAβの産
生の有意な増大を招来する(Scheuner,D.ら, 1996, Nature Medicine, 2, 864
)。
よってAβ−ペプチドに切断され、これに続いて、γ−セクレターゼの基質とし
て働くという事実の多くの指示がある(Maruyama,K.Y.ら, 1994, Biochem.Bio
phys Res Commun, 202, 1517; Estus,S.ら, 1992, Science, 255, 726)。した
がって、γ−セクレターゼはAβ−ペプチドの形成にきわめて重要な役割を有す
る。慣用的に用いられているγ−セクレターゼ活性の証明はAβ−ペプチドの検
出であるが、これには多くの場合、困難を伴うことが明らかにされている。
いことである(Simons,M.ら, Neurosci, 1996, 1; 16(3): 899-908)。しかも
、Aβ−ペプチドは約4kDaのきわめて小さい切断フラグメントであり、その疎
水性の性質のため自己凝集を起こす傾向があって、生理学的な条件下には容易に
沈殿してしまう(Hilbich,C.ら, 1991, J.Mol.Biol., 218, 149)。
,免疫沈降、ならびにウエスタンブロッティングによって行われる(Suzuki,N.
ら, Science, 1994, 27, 264(5163) 1336; Haass Cら, 1992, Nature, 359, 322
)。これらの方法は、適当な抗体とのインキュベーションを包含し、細胞培養ま
たはモデル生物体(とくに、シーエレガンス)から得られる使用細胞の破壊を必
要とするので比較的労力を要する。
の新規な方法に関し、その方法の特定の実施態様は、一方では、γ−セクレター
ゼまたはγ−セクレターゼをコードするcDNAの同定方法に関し、他方では、
γ−セクレターゼの活性を阻害できる物質の同定方法に関する。このような物質
は、それらがたとえばアルツハイマー病の治療のための医薬活性化合物として使
用できるのでとくに重要である。
1のアミノ酸配列の内部で切断し、アミノ酸配列GAIIGLMVGGVV(配
列番号:2)を含有する第一の部分タンパク質と、アミノ酸配列VIVITLV
ML(配列番号:3)を含有する第二の部分タンパク質を形成させ、 4.第一の部分タンパク質および/または第二の部分タンパク質を検出するこ
とからなる方法に関する。
1のアミノ酸配列の内部で切断し、アミノ酸配列GAIIGLMVGGVV(配
列番号:2)を含有する第一の部分タンパク質と、アミノ酸配列VIVITLV
ML(配列番号:3)を含有する第二の部分タンパク質を形成させ、 4.第二の部分タンパク質の量を測定し、形成された第二の部分タンパク質の
量からγ−セクレターゼの活性を決定することからなる方法に関する。
アッセイ」)は、γ−セクレターゼまたはγ−セクレターゼ活性のインビボ検出
に適当であり、たとえば、普遍的な高スループットスクリーニング(HTS)の
方法に採用することが可能である。これらの方法は慣用検出方法の上述の欠点を
示さず、とくに労力を要する単離および検出工程を必要としない。これらの方法
のベースは、C−末端APPフラグメントがγ−セクレターゼによって2つのフ
ラグメントに切断されることである。すなわち、アミノ酸配列GAIIGLMV
GGVV(配列番号:2)を含有する第一の部分タンパク質と、アミノ酸配列V
IVITLVML(配列番号:3)を含有する第二の部分タンパク質に切断され
、アミノ酸配列VIVITLVML(配列番号:3)を含有する第二の部分タン
パク質は細胞の細胞質ゾル中に拡散する(図2)。この第二の部分蛋白質は細胞
の細胞質ゾル中で、例えばγ−セクレターゼもしくはγ−セクレターゼ活性の検
出に役立つレポーター遺伝子の補助によって容易に検出することが可能である。
γ−セクレターゼの切断部位は、APPの膜貫通ドメイン内に存在する(Kang J
ら, 1987, Nature, 325, 733)。APP膜貫通ドメインはアミノ酸配列GAII
GLMVGGVV40IA42TVIVITLVMLを有する。γ−セクレターゼは
V40、A42またはT43のあとを切断する。これに反して、真核細胞中細胞培養に
よって産生されるAβ−ペプチドはメジウム上清中に分泌される。
タータンパク質の発現を活性化し、それは真核細胞中で検出することができる。
レポーター蛋白質の検出によって、γ−セクレターゼの切断はAPP中で起こる
ことを証明することができる。その結果、γ−セクレターゼまたはγ−セクレタ
ーゼ活性は定性的および/または定量的に検出することができる。
部分をコードする。好ましくは、第一のヌクレオチド配列はアミノ酸配列(配列
番号:4)を含有するタンパク質をコードする。配列番号:4は配列番号:1を
含有する。
プチド(以下「SP」と略す)をコードする。シグナルペプチドは、たとえば、
アミノ酸配列、配列番号:5を含有する。
できる。プロモーターは、たとえば哺乳動物細胞、シーエレガンス、酵母または
ショウジョウバエでの発現に適当なものでよい。哺乳動物細胞に適当なプロモー
ターとしては、たとえばCMV(たとえばClontech, Heidelberg, Germany)、
HSV TK(たとえばClontech)、RSV(たとえばInvitrogen, NV Leek, Ne
therlands)、SV40(たとえばClontech)とLTR(たとえばClontech)が
ある。シーエレガンスに使用できるプロモーターはたとえば、unc119、unc5
4、hsp16−2、G0A1、およびsel−12がある。酵母における発現にはプ
ロモーターADH1(構成的)(Vlckovaら,1994, Gene, 25(5), 472-4)、Gal
1(条件的に誘導性)(Selleckら,1987, Nature, 325, 173-7)、MET3(条
件的)(Cherestら,1987, Mol Gen Genet, 210, 307-13)とMET25が適当で
ある。ショウジョウバエではプロモーターMT(メタロチオニン)(たとえば、I
nvitrogen)、Ac5(Invitrogen)またはDs47(Invitrogen)が使用可能
である。
胞たとえばサル、ハムスター、マウス、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュま
たは酵母が使用される。たとえばHeLa、293、H4、SH−SY5Y、H
9、Cos、CHO、N2A、SL−2またはSaccharomyces cerevisiae細胞が
使用できる。本発明の特定の実施態様においては、シーエレガンス細胞が使用さ
れる。細胞は、トランスジェニック、非ヒト動物の構成成分であってもよい。特
定の実施態様においては、トランスジェニック細胞はトランスジェニックシーエ
レガンスの構成成分である。とくに本発明は、たとえば株MAV203(Life T
echnologies, Rockville, MD, USA)またはEGY48(OriGene Technologies,
Inc. Rockville, MD, USA)からの酵母細胞を使用する方法に関する。
チド配列ならびに、適宜更なるヌクレオチド配列によりコードされる部分タンパ
ク質から構成される。したがって、融合タンパク質は第一の部分タンパク質およ
び第二の部分タンパク質ならびに、適宜更なる部分タンパク質を含有する。融合
タンパク質はたとえば、配列番号:6のアミノ酸配列を有する。
用いることができる。この方法のとくに好ましい実施態様においては、導入遺伝
子はベクター内に存在する。組換えベクターは配列番号:9のヌクレオチド配列
をもっていてもよい。本発明のこの特定の実施態様はまた、SP−C100−G
al4−VP16システムとも呼ばれる。この場合、APPのシグナルペプチド
、APPのC100フラグメント、Gal4およびVP16からなる融合タンパ
ク質が発現される。膜貫通ドメインに位置するこのタンパク質は、C100フラ
グメントおよび第二の部分タンパク質内すなわちC100フラグメント、Gal
4およびVP16の一部分を含有する融合タンパク質の部分内で切断され、レポ
ータープラスミドの補助により検出される。
構築体も考慮できる。これには、たとえば、転写活性化ドメインを膜貫通ドメイ
ンとSPC100またはTag(たとえばMYC,FLAG)の細胞質ゾルドメ
インの間、ならびにN−およびC−末端上およびSPC100の膜貫通と細胞質
ゾルドメインの間に挿入できる。
用できるタンパク質をコードすることができる。したがって好ましくは、更なる
コードヌクレオチド配列は第一のヌクレオチド配列の3′末端に位置する。更な
るコードヌクレオチド配列は、たとえばキメラタンパク質、または多数のドメイ
ンから構築された他のタンパク質たとえばDNA結合ドメインおよび転写活性化
ドメインを含有するタンパク質をコードする。本発明の特定の実施態様において
は、更なるコードヌクレオチド配列は、Gal4結合ドメインおよびVP16の
転写活性化ドメイン(Gal4−VP16)から構成されるタンパク質をコード
し、したがって更なる部分タンパク質は配列番号:7のアミノ酸配列を有するこ
とが好ましい。酵母細胞においては、更なる部分タンパク質はまたLexA−結
合ドメイン(たとえばLexA−VP16)を含有してもよい。この更なる部分
タンパク質は、株EGY48の酵母細胞が使用される場合の方法にとくに適して
いる。
使用する方法に関する。レポータープラスミドは、調節可能なプロモーターの制
御下にレポーター遺伝子を含有する。たとえば、レポーター遺伝子はGFPおよ
びその誘導体、たとえばEGFP(促進グリーン蛍光タンパク質)、EBFP、
EYFP、d2EGFP、GFPuvまたはルシフェラーゼ(たとえばPromega,
Mannheim, Germany)、CAT(たとえばPromega)、SEAP(たとえばClont
ech)、β−Gal(たとえばClontech)またはアポトーシス誘発因子、たとえ
ばFas、TNF−R1、細胞死ドメインおよび類縁体(Tartagliaら, 1993, C
ell, 74, 845-53)、ced3、ced4、ced9をコードすることができる。調節可能
なプロモーターとしては、レポータープラスミドは例えばHIVの最小プロモー
ター、CD4プロモーターまたはmec7プロモーターを含有することができる。
適当に調節可能なプロモーターの選択は用いられた転写活性化ドメインに依存す
る。
する。特定の実施態様においてMET−25プロモーターが使用された酵母発現
ベクターpDBTRP(Life Technologies Inc.)(配列番号:11)の代替と
して(配列番号:12参照)、異なるプロモーター(たとえば誘導性Gal1プ
ロモーターおよびMET−25プロモーター、あるいは構成的に活性なADH1
プロモーター)および異なる選択マーカー(ADE,LEU,TRP,HIS,
LYS,PHE)を有する他の多数の発現ベクターを選択することができる。
に存在するGal4−またはLexA−誘導性レポーター遺伝子を含有する酵母
細胞の使用に関する。これらの実施態様のためには、株MaV203(Life Tec
hnologies, Rockville, MD, USA)またはEGY48(Origene Technologies, I
nc. Rockville, MD, USA)の酵母の使用が好ましい。
フェクトされた細胞の使用に関する。これらの実施態様に使用する細胞は通常、
全くまたはほとんど内因性γ−セクレターゼもしくは内因性γ−セクレターゼ活
性が上述の方法を用いては検出できないことが好ましい。この細胞はγ−セクレ
ターゼをコードするヌクレオチド配列−好ましくはcDNA−を含有する更なる
ベクターを用いてトランスフォームすることができる。たとえば、cDNAバン
クを使用することができる。ついでこの方法の実施態様がとくにγ−セクレター
ゼまたはγ−セクレターゼをコードするcDNAを同定するために用いられる。
γ−セクレターゼを検索できるcDNAバンクは細胞または組織、たとえばB細
胞、ニューロン、グリア細胞、海馬、全脳、胎盤、腎臓から調製することができ
る。好ましくは、cDNAはヒト細胞またはヒト組織から調製されるが、他の生
物体(たとえば、ハムスター、ラット、マウス、イヌ、サル)からも調製される
。
Aバンクでトランスフェクション後にはγ−セクレターゼ活性を示す細胞の場合
、細胞中に存在するcDNAはγ−セクレターゼをコードする。この挙動を示す
細胞から、既知の方法でこのcDNAを単離し、確認することができる。
る。導入遺伝子はたとえば、配列番号:8のヌクレオチド配列を有することがで
きる。導入遺伝子はベクター中に存在させてもよい。これはたとえば配列番号:
9のヌクレオチド配列を有することができる。
またはベクターの使用に関し、細胞は非ヒト生物体の構成成分とすることが可能
である。たとえば、導入遺伝子および/またはベクターは、トランスジェニック
シーエレガンスの産生のために使用することができる。他の特定の実施態様にお
いては、導入遺伝子および/またはベクターはトランスジェニック酵母細胞たと
えばS.cerevisiae細胞の産生のために使用することができる。
生方法において、導入遺伝子および/または導入遺伝子を含有するベクターを、
生物体たとえばシーエレガンスの生殖腺にマイクロインジェクションする方法に
関する。本発明はまた、本発明による導入遺伝子を含有する細胞、および本発明
による導入遺伝子を含有するトランスジェニックシーエレガンスに関する。本発
明はまた、本発明による導入遺伝子、好ましくは適当なベクター中に存在する導
入遺伝子を含有する細胞とくに酵母細胞に関する。本発明はとくに本発明による
導入遺伝子および付加的なcDNAバンクを含有する細胞、好ましくは酵母細胞
に関する。
トランスジェニックシーエレガンスの、γ−セクレターゼまたはγ−セクレター
ゼ活性の測定のための使用、これらの細胞またはトランスジェニックシーエレガ
ンスのγ−セクレターゼ活性阻害剤の同定方法における使用、およびその方法自
体に関する。
、以下のプロセス工程: 1.以下の構成成分: a)アミノ酸配列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(配 列番号:1)を含有するタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、 b)第一のヌクレオチド配列の5′末端においてシグナルペプチドをコード する第二のヌクレオチド配列、 c)プロモーター を有する導入遺伝子を含有するトランスジェニック非ヒト生物体たとえばトラン
スジェニックシーエレガンスもしくはSaccharomyces cerevsiaeまたはトランス
ジェニック細胞であり、さらに トランスジェニック非ヒト生物体またはトランスジェニック細胞は、さらにレ
ポータープラスミドを含有し、レポータープラスミドはタンパク質結合部位、最
小プロモーターおよびレポーター遺伝子、ならびに、 適宜、γ−セクレターゼをコードするcDNAを有するトランスジェニック非
ヒト生物体またはトランスジェニック細胞を産生させ、 このトランスジェニック非ヒト生物体またはトランスジェニック細胞に導入遺
伝子および、適宜cDNAによりコードされるγ−セクレターゼを発現させ、 2.このトランスジェニック非ヒト生物体またはトランスジェニック細胞を検
討される物質とインキュベートし、ついで 3.第二の部分タンパク質の量を検出することからなる方法に関する。
ゼをコードするcDNAを細胞に導入し、導入遺伝子によってコードされる融合
タンパク質および、適宜cDNAによってコードされるγ−セクレターゼを検討
される物質の存在下に発現させ、 3.融合タンパク質は配列番号:1のアミノ酸配列内で細胞中に存在するγ−
セクレターゼによって a)切断され、または b)切断されず、その結果、 a)アミノ酸配列GAIIGLMVGGVV(配列番号:2)を含有する第 一の部分タンパク質およびアミノ酸配列VIVITLVML(配列番号:3) を含有する第二の部分タンパク質が形成されるか、 b)検出可能な量の第一および/または第二の部分タンパク質が形成されな ず、 4.第二の部分タンパク質が形成されたか否かを測定することからなる方法に
関する。
て、シグナルペプチドおよび配列番号:1を含有するタンパク質をコードする導
入遺伝子を検討される物質およびレポータープラスミドの存在下に発現させ、形
成されたアミノ酸配列VIVITLVML(配列番号:3)を含有する第二の部
分タンパク質の量に対する検討される物質の効果を測定する方法に関する。
関する。 本発明はまた、医薬の製造のために、上述の方法の補助により同定された医薬
的に活性な化合物(たとえば阻害剤)をさらに医薬的に耐性のある担体と製剤化
および/または混合手段によって処理する方法に関する。
すなわちC100、Gal4およびVP16から構成される融合タンパク質また
は相当する融合タンパク質をコードする核酸の使用)と接合させて、 1.γ−セクレターゼの活性の同定および測定(定性および定量)、 2.様々な組織、細胞および生物体または種におけるγ−セクレターゼの同定
、このγ−セクレターゼのコードに関与するcDNAの同定および単離、ならび
にこのcDNAの更なる使用、 3.たとえば酵母細胞(Saccharomyces cereviriae)またはシーエレガンス中
におけるインビボスクリーニング(免疫生物学的方法を使用しないでγ−セクレ
ターゼ活性の測定が可能である)、 4.γ−セクレターゼの活性を修飾するたとえば医薬的に活性な化合物、たと
えばγ−セクレターゼ阻害剤のような物質の同定および特性解析のための方法の
使用[とくにこの方法はHTS(高スループットスクリーニング)に使用できる
。たとえばアルツハイマー病の治療および/またはその予防的処置のために使用
できる物質の同定が可能である]、 5.アルツハイマー病に関連しての、たとえば突然変異APPまたはC100 の検討、 6.記載された融合タンパク質/導入遺伝子の検討(たとえば、SP−C10
0−Gal4−VP16中のC100は全APPおよびγ−セクレターゼによっ
て置換が可能であり、その活性および調節は同様にこれらの方法の補助によって
検討が可能である) に使用することができる。
するAPPシグナルペプチド(SP)をコードする。C100はAβ−ペプチド
のN−末端に始まり、APPのC−末端に終わる。さらにそれはAβ−ペプチド
を放出するためにはγ−セクレターゼで切断されねばならない。
16は酵母の転写アクティベーターGal4の最初の147アミノ酸残基とVP
16の78C−末端アミノ酸残基、ヘルペス単純ウイルスからの転写アクティベ
ーターから構成される。融合タンパク質としてGal4フラグメントはDNAの
結合機能を引き継ぎ、一方VP16フラグメントは転写を活性化する(Sadowski
ら, 1988, Science, 335, 563)。pcDNA3.1+(Invitrogen, Netherland
s)はベクタープラスミドとして働く。
5つのGal4結合部位を有する。細胞培養液中での簡単な検出には、ルシフェ
ラーゼの遺伝子を、ベクターpEGFP N1(Clontech, Heidelberg)からE
GFP(促進グリーン蛍光蛋白質)の遺伝子に交換した。
し、ついでEGFPを励起させる波長480nmの光を照射しながら顕微鏡下に解
析した。一部の例では、強い緑色を発光する細胞を検出することができた。
にも基づき、SH−SY5Y細胞はレポータープラスミドによってのみトランス
フェクトされた。これらの細胞では、緑色の蛍光は検出できなかった。したがっ
て、発現はAPP−C末端の蛋白分解的放出が予測されるGal4−VP16に
よって活性化されねばならない。今日まで、γ−セクレターゼのほかにAPPを
膜貫通ドメイン内もしくは細胞質部分で蛋白分解的にプロセッシングする他の蛋
白分解活性は報告されていない。したがって、Gal4−VP16に融合したA
PP−C末端の放出はγ−セクレターゼの活性に基づくものと考えられる。
C100−Gal4−VP16の使用 SPC100−Gal4−VP16を、MET25プロモーターの制御下に酵
母発現ベクターpDBTRP(Life Technologies, Rockville, MD, U.S.A.)に
クローン化し、これらの構築体を用いて酵母株MaV203(Life Technologie
s)をトランスフォームした。酵母株MaV203は遺伝子的に修飾され、3つ
のGal4−誘導性レポーター遺伝子(URA3,HIS3,LacZ)を含有
し、これらは安定にゲノム中にインテグレートされた。MaV203中SPC1
00−Gal4−VP16 cDNAの発現はレポーターのわずかな活性のみを
与え、このシステムはcDNAバンク中のγ−セクレターゼの検索に適している
。
Type Culture Collection, Manassas, VA, U.S.A)のスクリーニングのために
実施例4からの組換えMaV203細胞を使用することができる。同様に、酵母
発現ベクターp415−MET25(ATCC, Nucleic Acid Research, 1994, Vol
. 22, No. 25, 5767)またはp415−ADH1(ATCC, Gene, 1995, 158: 119
-122)中にインテグレートしたヒト海馬cDNAバンクも、γ−セクレターゼま
たはγ−セクレターゼ活性を有するタンパク質をコードするcDNAのスクリー
ニングに使用することができた。
ソフォームAPP770または751)およびセクレターゼ切断生成物を示す。
ーゼ切断部位、膜貫通ドメインにおけるγ−セクレターゼ切断部位、C100=
APPのC100フラグメント、Gal4−VP16=DNA結合ドメイン、転
写活性化ドメイン(DNA結合ドメインおよび転写アクティベーターからなる)
、これはレポータープラスミドのDNA上のタンパク質結合ドメインに結合する
。
切断部位の位置を指示する。
16。 酵母における導入遺伝子の発現のための発現プラスミドの構築。
Claims (50)
- 【請求項1】 γ−セクレターゼの活性を検出する方法において、 1.融合タンパク質をコードし、以下の構成成分: a)アミノ酸配列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(配
列番号:1)を含有するタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、 b)第一のヌクレオチド配列の5′末端においてシグナルペプチドをコード
する第二のヌクレオチド配列、 c)プロモーター、ならびに d)適宜、更なるコードおよび/または非コードヌクレオチド配列 を含有する導入遺伝子を使用し、 2.この導入遺伝子を細胞に導入して融合タンパク質を発現させ、 3.融合タンパク質を細胞内に存在するγ−セクレターゼによって配列番号:
1のアミノ酸配列の内部で切断し、アミノ酸配列GAIIGLMVGGVV(配
列番号:2)を含有する第一の部分タンパク質と、アミノ酸配列VIVITLV
ML(配列番号:3)を含有する第二の部分タンパク質を形成させ、 4.第一の部分タンパク質および/または第二の部分タンパク質を検出する ことからなる方法。 - 【請求項2】 γ−セクレターゼの活性を検出する方法において、 1.融合タンパク質をコードし、以下の構成成分: a)アミノ酸配列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(配
列番号:1)を含有するタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、 b)第一のヌクレオチド配列の5′末端においてシグナルペプチドをコード
する第二のヌクレオチド配列、 c)プロモーター、ならびに d)適宜、更なるコードおよび/または非コードヌクレオチド配列 を含有する導入遺伝子を使用し、 2.この導入遺伝子を細胞に導入して融合タンパク質を発現させ、 3.融合タンパク質を細胞内に存在するγ−セクレターゼによって配列番号:
1のアミノ酸配列の内部で切断し、アミノ酸配列GAIIGLMVGGVV(配
列番号:2)を含有する第一の部分タンパク質と、アミノ酸配列VIVITLV
ML(配列番号:3)を含有する第二の部分タンパク質を形成させ、 4.第二の部分タンパク質の量を測定し、形成された第二の部分タンパク質の
量からγ−セクレターゼの活性を決定する ことからなる方法。 - 【請求項3】 第一のヌクレオチド配列はアミロイド前駆体タンパク質(A
PP)またはその部分をコードする請求項1または2に記載の方法。 - 【請求項4】 第一のヌクレオチド配列は配列番号:4のアミノ酸配列を有
するタンパク質をコードする請求項1〜3のいずれかに記載の方法。 - 【請求項5】 第二のヌクレオチド配列はAPPのシグナルペプチド(SP)
をコードする請求項1〜4のいずれかに記載の方法。 - 【請求項6】 シグナルペプチドは、配列番号:5のアミノ酸配列を有する
請求項1〜5のいずれかに記載の方法。 - 【請求項7】 プロモーターは哺乳動物細胞、シーエレガンス、酵母または
ショウジョウバエ細胞中における発現のためのプロモーターである請求項1〜6
のいずれかに記載の方法。 - 【請求項8】 プロモーターは、CMV、HSV TK、RSV、SV40
、LTR、unc119、unc54、hsp16−2、G0A1、sel−12、ADH1
、Gal1、MET3、MET25、MT、Ac5またはDs47プロモーター
である請求項1〜7のいずれかに記載の方法。 - 【請求項9】 細胞は真核細胞である請求項1〜8のいずれかに記載の方法
。 - 【請求項10】 細胞はヒト細胞である請求項1〜9のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項11】 細胞は非ヒト細胞である請求項1〜9のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項12】 細胞はHeLa、293、H4、SH−SY5Y、H9、
Cos、CHO、N2A、SL−2またはSaccharomyces cerevisiae細胞である
請求項11記載の方法。 - 【請求項13】 細胞はシーエレガンス細胞である請求項11記載の方法。
- 【請求項14】 細胞はトランスジェニックシーエレガンスの構成成分であ
る請求項12記載の方法。 - 【請求項15】 細胞は酵母細胞である請求項11記載の方法。
- 【請求項16】 融合タンパク質は配列番号:6のアミノ酸配列を有するか
、または含有する請求項1〜15のいずれかに記載の方法。 - 【請求項17】 更なるコードヌクレオチド配列は第一のヌクレオチド配列
の3'末端に位置する請求項1〜16のいずれかに記載の方法。 - 【請求項18】 更なるコードヌクレオチド配列は第一の部分タンパク質お
よび第二の部分タンパク質の融合タンパク質として発現され、第二の部分タンパ
ク質の検出に使用できるタンパク質をコードする請求項1〜17のいずれかに記
載の方法。 - 【請求項19】 更なるコードヌクレオチド配列はDNA結合ドメインおよ
び転写活性化ドメインを含有するタンパク質をコードする請求項1〜18のいず
れかに記載の方法。 - 【請求項20】 更なるコードヌクレオチド配列は、Gal4−結合ドメイ
ンおよびVP16の転写活性化ドメイン(Gal4−VP16)から構成される
タンパク質をコードする請求項1〜19のいずれかに記載の方法。 - 【請求項21】 細胞はレポータープラスミドでコトランスフェクトされ、
レポータープラスミドは調節可能なプロモーターの制御下にレポーター遺伝子を
含有する請求項1〜20のいずれかに記載の方法。 - 【請求項22】 調節可能なプロモーターは転写活性化ドメインによって活
性化することができる請求項21記載の方法。 - 【請求項23】 レポータープラスミドはEGFP(促進グリーン蛍光タン
パク質)のレポーター遺伝子をコードし、調節可能なプロモーターはGal4結
合部位およびHIVの最小プロモーターを含有する請求項22記載の方法。 - 【請求項24】 導入遺伝子は配列番号:8のヌクレオチド配列を有する請
求項1〜23のいずれかに記載の方法。 - 【請求項25】 導入遺伝子はベクター内に存在する請求項1〜24のいず
れかに記載の方法。 - 【請求項26】 組換えベクターは配列番号:9のヌクレオチド配列を有す
る請求項1〜25のいずれかに記載の方法。 - 【請求項27】 細胞内に内因性γ−セクレターゼ活性は検出できない請求
項1〜26のいずれかに記載の方法。 - 【請求項28】 細胞はcDNAバンクを使用してコトランスフェクトされ
る請求項1〜27のいずれかに記載の方法。 - 【請求項29】 ヒトもしくは非ヒト組織またはヒトもしくは非ヒト細胞か
ら調製されるcDNAはcDNAバンク中に存在する請求項28記載の方法。 - 【請求項30】 γ−セクレターゼをコードするcDNAの同定のために、 a)γ−セクレターゼの活性が検出できる細胞を同定し、 b)この細胞から、γ−セクレターゼをコードするcDNAを単離する請求項
27〜29のいずれかに記載の方法の使用。 - 【請求項31】 a)アミノ酸配列GAIIGLMVGGVVIATVIV
ITLVML(配列番号:1)を含有するタンパク質をコードする第一のヌクレ
オチド配列、 b)第一のヌクレオチド配列の5′末端においてシグナルペプチドをコードす
る第二のヌクレオチド配列、 c)プロモーター、ならびに d)DNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインをコードする第一のヌク
レオチド配列の3′末端における少なくともさらに1種のヌクレオチド配列から
なる導入遺伝子。 - 【請求項32】 第一のヌクレオチド配列はAPPもしくはAPPの部分を
コードする請求項31記載の導入遺伝子。 - 【請求項33】 導入遺伝子は配列番号:8のヌクレオチド配列を有する請
求項31または32のいずれかに記載の導入遺伝子。 - 【請求項34】 請求項31〜33のいずれかに記載の導入遺伝子からなる
ベクター。 - 【請求項35】 ベクターは配列番号:9または配列番号:12のヌクレオ
チド配列を有する請求項34記載のベクター。 - 【請求項36】 細胞は請求項34および35のいずれかに記載のベクター
でトランスフェクトされるトランスジェニック細胞の製造方法。 - 【請求項37】 請求項31〜33のいずれかに記載の導入遺伝子をシーエ
レガンスの生殖腺にマイクロインジェクションするトランスジェニックシーエレ
ガンスの製造方法。 - 【請求項38】 請求項31〜33のいずれかに記載の導入遺伝子からなる
細胞。 - 【請求項39】 請求項31〜33のいずれかに記載の導入遺伝子からなる
トランスジェニックシーエレガンス。 - 【請求項40】 請求項31〜33のいずれかに記載の導入遺伝子からなる
酵母細胞。 - 【請求項41】 a)請求項31〜33のいずれかに記載の導入遺伝子、 b)cDNAバンク、および c)レポータープラスミド からなる細胞。
- 【請求項42】 γ−セクレターゼをコードするcDNAの同定のための請
求項41記載の細胞の使用。 - 【請求項43】 γ−セクレターゼのcDNAの同定方法において、 1)請求項41記載の細胞を産生させ、 2)第二の部分タンパク質が形成されたか否かを決定する方法。
- 【請求項44】 γ−セクレターゼの活性の阻害剤の同定方法における請求
項41記載の細胞の使用。 - 【請求項45】 γ−セクレターゼの活性を阻害する物質を同定する方法に
おいて、以下のプロセス工程: 1.以下の構成成分: a)アミノ酸配列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(配 列番号:1)を含有するタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、 b)第一のヌクレオチド配列の5′末端においてシグナルペプチドをコード する第二のヌクレオチド配列、 c)プロモーター、ならびに d)適宜、更なる非コードおよび/またはコードヌクレオチド配列 を有する導入遺伝子を含有し、タンパク質結合部位、最小プロモーターおよびレ
ポーター遺伝子および、適宜、γ−セクレターゼをコードしているcDNAを輸
送するレポータープラスミドを含有しているトランスジェニック非ヒト生物体ま
たはトランスジェニック細胞であり、導入遺伝子および適宜、cDNAによって
コードされるγ−セクレターゼを発現するトランスジェニック非ヒト生物体また
はトランスジェニック細胞を産生し、 2.トランスジェニック非ヒト生物体またはトランスジェニック細胞を検討さ
れる物質とインキュベートし、ついで 3.第二の部分タンパク質の量を測定する ことからなる方法。 - 【請求項46】 γ−セクレターゼの活性を阻害する物質を同定する方法に
おいて、 1.以下の構成成分: a)アミノ酸配列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(配 列番号:1)を含有するタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、 b)第一のヌクレオチド配列の5′末端においてシグナルペプチドをコード する第二のヌクレオチド配列、 c)プロモーター、ならびに d)適宜、更なるコードおよび/または非コードヌクレオチド配列 を含有する導入遺伝子を使用し、 2.この導入遺伝子およびレポータープラスミドならびに、適宜、γ−セクレ
ターゼをコードするcDNAを細胞に導入し、導入遺伝子によってコードされる
融合タンパク質および、適宜、cDNAによってコードされるγ−セクレターゼ
を検討される物質の存在下に発現させ、 3.融合タンパク質は a)アミノ酸配列GAIIGLMVGGVV(配列番号:2)を含有する第 一の部分タンパク質およびアミノ酸配列VIVITLVML(配列番号:3) を含有する第二の部分タンパク質を形成して切断されるか、または b)細胞内に存在するγ−セクレターゼによって配列番号:1のアミノ酸配 列内に検出可能な量の第一および/または第二の部分タンパク質は形成されず
、 すなわち切断されず、 4.第二の部分タンパク質の量を測定する ことからなる方法。 - 【請求項47】 γ−セクレターゼの活性を阻害する物質を同定する方法に
おいて、シグナルペプチドおよび配列番号:1を含有する融合タンパク質をコー
ドする導入遺伝子を検討される物質の存在下に発現させ、アミノ酸配列VIVI
TLVML(配列番号:3)を含有する第二の部分タンパク質が形成される量に
対する検討される物質の効果を測定する方法。 - 【請求項48】 医薬の製造方法において、請求項45〜47のいずれかに
記載の方法からなり、最終的に同定された阻害剤を医薬的に耐性のある担体と混
合する方法。 - 【請求項49】 同定された阻害剤をさらに医薬的に耐性ある形態に製剤化
することからなる請求項45〜47のいずれかに記載の方法。 - 【請求項50】 配列番号:1のアミノ酸配列を含有する融合タンパク質か
らなるγ−セクレターゼ活性を定性的および/または定量的に検出するための試
験キット。
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