NO334058B1 - Prosess for deteksjon av gammasekretase aktivitet samt anvendelse derav - Google Patents
Prosess for deteksjon av gammasekretase aktivitet samt anvendelse derav Download PDFInfo
- Publication number
- NO334058B1 NO334058B1 NO20056029A NO20056029A NO334058B1 NO 334058 B1 NO334058 B1 NO 334058B1 NO 20056029 A NO20056029 A NO 20056029A NO 20056029 A NO20056029 A NO 20056029A NO 334058 B1 NO334058 B1 NO 334058B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- secretase
- protein
- cell
- gamma
- process according
- Prior art date
Links
- 102000002659 Amyloid Precursor Protein Secretases Human genes 0.000 title claims abstract description 161
- 108010043324 Amyloid Precursor Protein Secretases Proteins 0.000 title claims abstract description 161
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 61
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 84
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 77
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 134
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 129
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 87
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims abstract description 60
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 56
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims abstract description 46
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 45
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 45
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 42
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 40
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 36
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 36
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 30
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 30
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 27
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 20
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 claims abstract description 13
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 8
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 claims description 46
- 101710137189 Amyloid-beta A4 protein Proteins 0.000 claims description 44
- 101710151993 Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 claims description 44
- 102100022704 Amyloid-beta precursor protein Human genes 0.000 claims description 44
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 claims description 40
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 claims description 40
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 31
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 31
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 24
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 10
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 7
- 101100386089 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) MET17 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 101150014136 SUC2 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 claims description 3
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 claims description 3
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 claims description 3
- -1 GALI Proteins 0.000 claims description 3
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 claims description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 3
- 101100465890 Caenorhabditis elegans sel-12 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101100347613 Caenorhabditis elegans unc-54 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101000823051 Homo sapiens Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101150068888 MET3 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101100022915 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cys-11 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101100022918 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) sua1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102000046783 human APP Human genes 0.000 claims description 2
- 101100285000 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) his-3 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100316117 Rattus norvegicus Unc50 gene Proteins 0.000 claims 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 abstract description 30
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 abstract description 21
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 abstract description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 abstract 1
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000001777 nootropic effect Effects 0.000 abstract 1
- 108010068250 Herpes Simplex Virus Protein Vmw65 Proteins 0.000 description 66
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 14
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 14
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- ASCHNMXUWBEZDM-UHFFFAOYSA-N chloroperoxyl Inorganic materials [O]OCl ASCHNMXUWBEZDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 10
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- DWJXYEABWRJFSP-XOBRGWDASA-N DAPT Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)OC(C)(C)C)C=1C=CC=CC=1)C(=O)CC1=CC(F)=CC(F)=C1 DWJXYEABWRJFSP-XOBRGWDASA-N 0.000 description 3
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 3
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 3
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 3
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 3
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 3
- 238000011977 dual antiplatelet therapy Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000007466 Aβ secretion Effects 0.000 description 2
- 101100297345 Caenorhabditis elegans pgl-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000579835 Merops Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000003540 gamma secretase inhibitor Substances 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100040055 Amyloid beta precursor like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100040038 Amyloid beta precursor like protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 1
- 101100069049 Caenorhabditis elegans goa-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000132059 Carica parviflora Species 0.000 description 1
- 235000014653 Carica parviflora Nutrition 0.000 description 1
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 1
- 102000010170 Death domains Human genes 0.000 description 1
- 108050001718 Death domains Proteins 0.000 description 1
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108091005941 EBFP Proteins 0.000 description 1
- 101150103804 GAL3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100039558 Galectin-3 Human genes 0.000 description 1
- 101000890407 Homo sapiens Amyloid beta precursor like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000890401 Homo sapiens Amyloid beta precursor like protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 241001562081 Ikeda Species 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 101000823042 Mus musculus Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 102000012412 Presenilin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010036933 Presenilin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000015499 Presenilins Human genes 0.000 description 1
- 108010050254 Presenilins Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 101100250396 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) RPL28 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010044688 Trisomy 21 Diseases 0.000 description 1
- 102100033732 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Human genes 0.000 description 1
- 101710187743 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 101100527649 Wickerhamomyces ciferrii (strain ATCC 14091 / BCRC 22168 / CBS 111 / JCM 3599 / NBRC 0793 / NRRL Y-1031 F-60-10) RPL44 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 101150031224 app gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000036953 caspase-like activity Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 101150055276 ced-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150112018 ced-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150039936 ced-9 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000002121 endocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 102000038383 gamma-secretases Human genes 0.000 description 1
- 108091007739 gamma-secretases Proteins 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000012750 in vivo screening Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000008011 inorganic excipient Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003715 limbic system Anatomy 0.000 description 1
- 101150012912 mec-7 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002981 neuropathic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000008012 organic excipient Substances 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 101150114748 unc-119 gene Proteins 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
- C07K2319/81—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor containing a Zn-finger domain for DNA binding
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Neurology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører forbedrede prosesser for bestemmelse av y-sekretase aktivitet.
Alzheimers sykdom (AD) er en neurodegenerativ sykdom i hjernen som følges på det cellulære nivået av et massivt tap av neuroner i det limbiske systemet og i den cerebrale hjernebarken. I hjernen kan områder som er affisert, proteindeponeringer, såkalte plakk, oppdages på det molekylære nivået, som er en vesentlig karakteristikk for Alzheimers sykdom. Proteinet som oftest finnes i disse plakkene er et peptid på 40-42 aminosyrer som betegnes som Ap-peptid. Dette Ap-peptid er et kløyvningsprodukt fra et signifikant større protein på 695-770 aminosyrer, det såkalte amyloide forløperproteinet (APP).
APP er et integraltransmembranprotein som først går gjennom lipidlaget. Størstedelen av proteinet er ekstracellulært, mens det kortere C-terminale domene er rettet inn mot cytosol (figur 1). Ap-peptidet er vist mørkegrått i figur 1. Ca % av Ap-peptidet kommer fra det ekstracellulære domene, og ca lA fra det transmembrane domene av APP.
Foruten membranbaserte APP, kan en utskilt form av amyloidforløperproteinet detekteres som består av det store ektodomene til APP og blir betegnet som APP^c("utskilt APP"). APPsecdannes fra APP ved proteolytisk kløyvning som utføres av a-sekretasen. Den proteolytiske kløyvningen skjer på et sted i aminosyresekvensen til APP som er innen aminosyresekvensen til Ap-peptidet (etter aminosyreresidue 16 i Ap-peptidet). Proteolyse av APP ved a-sekretasen eksluderer dermed dannelsen av Ap-peptidet.
Ap-peptidet kan dermed bare dannes fra APP i en alternative prosesseringsrute. Det er postulert at to videre proteaser er involvert i denne prosesseringsrute, en protease som er betegnet som p-sekretase, som kløyver ved den N-terminale enden av Ap-peptidet i APP, og den andre proteasen som er betegnet y-sekretase, som frigjør den C-terminale delen av Ap-peptidet (Kang, J. et al, Nature, 325, 733) (figur 1).
Å lære mer om sekretasene (a-sekretase, P-sekretase, y-sekretase) er av stor interesse, spesielt i sammenheng med undersøkelser på Alzheimers sykdom, for eksempel for identifiseringen av sekretasene eller faktorer som er involvert i sekretaseregulering og Ap-peptiddannelse (Wolfe, M.S. (2001), J. Med. Chem., 44(13), 2039-2060). Hemmingen av P-sekretase og spesielt av y-sekretase kan føre til en reduksjon i Ap-produksjonen, på den andre siden kan en aktivering av a-sekretasen øke prosesseringen av APP i APPsec, og ville dermed samtidig redusere dannelsen av Ap-peptidet. En
transgen C. elegans som er funnet under slike undersøkelser, er beskrevet i den tyske patentsøknaden DE 198 49 073 Al.
Det er mange indikasjoner på at Ap-peptidet (AP) er en viktig faktor ved tilstedeværelsen av Alzheimers sykdom. Blant annet er nevrotoksisitet av Ap-fibriler i cellekultur blitt postulert (Yankner, B.A. et al, (1990) Proe Nati Acad Sei USA, 87, 9020). I pasienter med Downs syndrom, hvor genet som koder for APP finnes i en tilleggskopi, har man også de nevropatologiske karakteristikane til Alzheimers sykdom selv ved en alder på 30 år. Her antas det at overuttrykket av APP følger en økt omdannelse til Ap-peptidet (Rumble, B. et al, (1989), N. Engl. J. Med., 320, 1446).
Antagelig er den sterkeste indikasjonen på den sentrale rollen til Ap-peptidet de familiære formene til Alzheimers sykdom. Mutasjoner som her finnes i APP-genet rundt området for p- og y-sekretasekløyvningsstedene eller i to videre AD-assosierte gener (preseniliner), som i cellekultur fører til en signifikant økning i Ap-peptidproduksjon (Scheuner, D. et al., (1996), Nature Medicine, 2, 864).
Det er en rekke indikasjoner på det faktum at APP først kløyves til Ap-peptidet av p-sekretasen iløpet av dens prosessering for å tjene deretter som et substrat for y-sekretase. y-sekretasen har derfor en viktig rolle i dannelsen av Ap-peptidet (Wolfe, M.S. (2001), loc.cit).
Generelt er deteksjonen av Ap-peptid vanskelig, fordi bare en liten mengde APP blir omdannet (Simons M, et al, Neurosci (1996) l;16(3):899-908). Videre er Ap-peptidet et veldig lite fragment på ca 4 kDa, som har en stor tendens til selvaggregering, som skyldes dets hydrofobe karakter. Følgelig presipiterer Ap-peptid lett under fysiologiske tilstander (Hilbich, C. et al., (1991) J. Mol. Biol., 218, 149) og er i sin presipiterte form ikke tilgjengelig for deteksjon.
Deteksjonen av Ap-peptidet i eukaryote celler utføres ved hjelp av immunbiologiske fremgangsmåter slik som for eksempel ELISA, immunpresipitering og Westerblotting (Suzuki, N. et al, Science 1994, 27,264(5163) 1336; Haass, C. et al, (1992) Nature, 359, 322). En in vito-analyse for bestemmelsen av y-sekretaseaktivitet fra rensede membranfraksjoner som inneholder PSI (presenilin 1) ble videre beskrevet av Wolfe et al. (1999). Disse prosesser er veldig tidkrevende ettersom de involverer inkuberingstrinn med passende antistoff, trinn for å ødelegge cellene som skaffes tilveie fra passende cellekulturer eller modellorganismer (for eksempel C. elegans). De nevnte fremgangsmåtene er ikke passende i et automatisert analysesystem, for eksempel for høy kapasitetsscreening, og for å identifisere forbindelser, som spesifikk hemmer eller senker aktiviteten av en y-sekretase. Delvis skyldes dette at y-sekretaseaktivitet er avhengig av en sammenstilning av proteiner (Mattson, (2003) Nature 422, 385), som på det nåværende tidspunkt bare er aktiv i et komplekst membranlipidmiljø.
Aktiviteten til y-sekretasen kan videre påvises som angitt i WO00/34511A2, som beskriver en prosess for bestemmelsen av y-sekretaseaktivitet og for deteksjonen av y-sekretase ved deteksjonen av Ap-peptidet. Prosessen beskrevet i WO00/34511A2 benytter et transgen som koder for et fusjonsprotein som omfatter amionosyresekvensen GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML (SEQ IDNR. 1) som det enzymatiske målstedet for y-sekretase, et signalpeptid (SP) i den 5' enden, en promoter og, hvis det er passende, videre kodende og/eller ikke-kodende nukleotidsekvenser, som er inkorporert i en celle for å uttrykke det nevnte fusjonsproteinet.
Når fusjonsproteinet blir spesifikt kløyvet av y-sekretasen som er tilstede i cellen, blir et første delprotein dannet som inneholder aminosyresekvensen GAIIGLMVGGVV (SEQ IDNR. 2), og et andre delprotein som inneholder aminosyresekvensen VIVITLVML
(SEQ IDNR. 3). Deretter blir det nevnte første og/eller andre delproteinet detektert, for eksempel ved å anvende en passende reporter, som for eksempel er et reportergen, som blir aktivert ved frigjøringen av en transkripsjonsaktivator koblet til det første og/eller andre delproteinet.
Grunnet de kjente problemene som følger deteksjonen av Ap-peptid, så er målet med den foreliggende oppfinnelsen å forbedre prosessen i WO00/34511A2, for eksempel ved å senke bakgrunnssignalet og/eller å øke signalspesifisiteten, for å forbedre signal/bakgrunnsforholdet i analysen.
Overraskende er det mulig å forbedre signaLtøakgrunnsforholdet i en prosess ifølge WO00/34511A2 ved å senke den uspesifikke frigjøringen av første og/eller andre delvise protein som skyldes den uspesifikke proteaseaktiviteten. Dette oppnås for eksempel i fusjonspeptidet i WO00/34511A2, ved eksklusjonen/unngåelsen av noen andre sekvenser/motiver for proteasekløyvningssete og/eller internaliseirngssekvenser - ved siden av y-sekretasekløyvningssete. Den foreliggende oppfinnelsen vedrører derfor en forbedret prosess for bestemmelsen av y-sekretaseaktivitet og deteksjonen av et protein som har y-sekretaseaktivitet.
Bestemte utførelsesformer av prosessen vedrører prosesser for identifikasjonen av en y-sekretase, av et cDNA som koder for en y-sekretase, et subenhetprotein av y-sekretase, eller en y-sekretaselignende proteinase, og prosesser for identifikasjonen av en farmasøytisk aktiv forbindelse som kan modulere for eksempel senke eller hemme aktiviteten av et protein som har y-sekretaseaktivitet. Slike substanser er av spesiell interesse hvis de er farmasøytisk akseptable og passende for behandlingen av Alzheimers sykdom.
Et første aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en prosess for deteksjonen av aktiviteten til y-sekretase, hvori
A. et transgen som koder for et fusjonsprotein blir anvendt, hvori nevnte transgen omfatter: a) en første nukleotidsekvens som koder for et protein som inneholder aminosyresekvensen GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML (SEQ IDNR. 1), hvori nevnte protein kan kløyves inne i nevnte aminosyresekvens av y-sekretase som er tilstede i en celle; hvorved et første delprotein, som inneholder aminosyresekvensen GAIIGLMVGGVV (SEQ IDNR. 2), og et andre delprotein som inneholder aminosyresekvensen VIVITLVML (SEQ IDNR. 3) blir dannet; b) ved 5' enden av den første nukleotidsekvensen er det en andre nukleotidsekvens som koder for et signalpeptid;
c) en promoter; og
d) ytterligere kodende nukleotidsekvenser som koder for et protein som blir utrykt som et fusjonsprotein med nevnte første delprotein og nevnte andre delprotein og som blir anvendt for deteksjon av det nevnte andre delprotein, og hvis passende ytterligere ikke-kodende nukleinsyresekvenser; B. dette transgen blir inkorporert inn i en human celle in vitro eller en ikke-human eukaryot celle og fusjonsproteinet blir uttrykt; C. fusjonsproteinet blir kløyvet inne i aminosyresekvensen SEQ IDNR. 1 av y-sekretasen som er tilstede i cellen hvorved det første delprotein og det andre delprotein blir dannet; og D. det andre delproteinet blir detektert;
kjennetegnet ved at nevnte fusjonsprotein, med unntak av SEQ IDNR. 1, ikke inneholder en eller flere peptidmotiver som virker som et signal for endo- eller eksocytose og/eller proteasekløyvningssete.
Et andre aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en prosess for deteksjonen av aktiviteten til y-sekretase, hvori
A. et transgen som koder for et fusjonsprotein blir anvendt, hvori nevnte transgen inneholder følgende bestanddeler: a) en første nukleotidsekvens som koder for et protein som inneholder aminosyresekvensen GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML (SEQ IDNR. 1), hvori nevnte protein kan kløyves inne i nevnte aminosyresekvens av y-sekretase som er tilstede i en celle; hvorved et første delprotein, som inneholder aminosyresekvensen GAIIGLMVGGVV (SEQ IDNR. 2), og et andre delprotein som inneholder aminosyresekvensen VIVITLVML (SEQ IDNR. 3) blir dannet; b) ved 5' enden av den første nukleotidsekvensen er det en andre nukleotidsekvens som koder for et signalpeptid;
c) en promoter; og
d) ytterligere kodende nukleotidsekvenser som koder for et protein som blir utrykt som et fusjonsprotein med nevnte første delprotein og nevnte andre delprotein og som blir anvendt for deteksjon av det nevnte andre delprotein, og hvis passende ytterligere ikke-kodende nukleinsyresekvenser; B. dette transgen blir inkorporert inn i en human celle in vitro eller en ikke-human eukaryot celle og fusjonsproteinet blir uttrykt; C. fusjonsproteinet blir kløyvet inne i aminosyresekvensen SEQ IDNR. 1 av y-sekretasen som er tilstede i cellen hvorved det første delprotein og det andre delprotein blir dannet; og D. mengde av det andre delproteinet blir bestemt og aktiviteten til y-sekretasen blir bestemt utifrå mengde av det andre delprotein som blir dannet;
kjennetegnet ved at nevnte fusjonsprotein, med unntak av SEQ IDNR. 1, ikke inneholder en eller flere peptidmotiver som virker som et signal for endo- eller eksocytose og/eller proteasekløyvningssete.
Prosessene ifølge oppfinnelsen er passende for in vivo-deteksjon av en y-sekretase (protein som har y-sekretaseaktivitet) eller av aktiviteten til en y-sekretase, som muliggjør å benytte prosessene universelt, selv for eksempel i høy kapasitetsscreening ("HTS")-analyser. Prosessene har ikke de ovenfor nevnte ulempene til de konvensjonelle deteksjonsprosessene, spesielt unngås laboratorieisolering og deteksjonstrinn og det spesifikke signalet til y-sekretaseaktiviteten er signifikant forbedret. Det mer spesifikke signalet oppnås ved hjelp av et betraktelig redusert bakgrunnssignal og unngåelse, henholdsvis senking av frigjøringen av det første og andre delproteinet som skyldes virkningen til uspesifikke proteaser.
Et viktig element i prosessene ifølge oppfinnelsen er at det C-terminale APP-fragmentet som kløyves av y-sekretasen til to fragmenter - et første delprotein som inneholder aminosyresekvensen GAIIGLMVGGVV (SEQ IDNR. 2) og et andre delprotein som inneholder aminosyresekvensen VIVITLVML (SEQ IDNR. 3), det andre delproteinet som inneholder aminosyresekvensen VIVITLVML (SEQ IDNR. 3) diffunderer inn i cellers cytosol (figur 2). Dette andre delprotein som lett kan detekteres i cytosol til en celle, for eksempel som et fusjonsprotein med en transkripsjonsaktivatorfaktor (TAF) og ved hjelp av et reportergen; tjener som et deteksjonsredskap for tilstedeværelsen av y-sekretase eller kvantifiseringen av en y-sekretaseaktivitet. y-sekretasekløyvningssete er lokalisert i transmembran domene til APP (Kang, J. et al, (1987) Nature, 325, 733). APP transmembran domene har amonosyresekvensen GAIIGLMVGGVV40IA42TVIVITLVML. y-sekretasen kløyver etter V4, A42eller T43. Ap-peptider som produseres av eukaryote celler i cellekultur utskilles i mediesupernatanten.
Med hjelp av et passende reportersystem (for eksempel TAF og det korresponderende reportergenet), så kan frigjøringen av det andre delproteinet aktivere uttrykket av et reporterprotein, som kan detekteres i eukaryote celler. Ved hjelp av deteksjonen av reporterproteinet kan det demonstreres at en y-sekretasekløyvning har funnet sted i APP. Som et resultat kan y-sekretasen eller aktiviteten av y-sekretasen bestemmes kvalitativt og/eller kvantitativt.
Bestanddelene til prosessen kan karakteriseres i større detalj som følger:
Den første nukleotidsekvensen koder for et amyloidforløperprotein (APP) eller en del av det som omfatter SEQ IDNR. 1, hvor nevnte APP eller del av det ikke inneholder noen videre peptidmotiv som virker som et signal for endo- eller eksocytose og/eller proteasekløyvningssete. Helst koder nevnte første nukleotidsekvens for et protein som inneholder en aminosyresekvens som omfatter SEQ IDNR.l, for eksempel SEQ IDNR. 6 eller SEQ IDNR. 14.1 videre utførelsesformer koder den første nukleotidsekvensen for et avkortet APP eller et modifisert APP, for eksempel som kan skaffes tilveie ved hjelp av setedirigert mutagenese, for å unngå kodingen av et peptidmotiv som virker som et signal for endo- eller eksocytose og/eller proteasekløyvningssete ved siden av SEQ IDNR. 1.1 enda en annen utførelsesform er nevnte APP eller del av det, som kodes for av den nevnte første nukleotidsekvensen, et protein utledet fra APP hos mennesker, mus (for eksempel APLP1 eller APLP2).
Den andre nukleotidsekvensen koder helst for ethvert passende signalpeptid ("SP"). Signalpeptidet inneholder for eksempel SP'ene ifølge SEQ IDNR. 5 (SP til humant APP), SEQ IDNR. 12 (SP til gjær SUC2, "SP2") eller SEQ IDNR. 13 (SP til BM40, "SP3") eller ethvert annet signalpeptid som er kjent for eksempel ifølge Heijne et al.
(Nucl. Acids. Res. (1986), 14(11) 4683-4690).
Som en promoter er det mulig å anvende enhver passende regulerbar eller konstitutiv promoter. Promoteren kan være passende for eksempel for ekspresjon i pattedyrceller, i C. elegans, i gjær eller i Drosofila. Passende promoterer for pattedyrceller er for eksempel CMV, HSV, TK, SV40, LTR (alle: Clontech, Heidelberg, Tyskland), og RSV (for eksempel Invitrogen™ life technologies, NV Leek, Nederland). Promotere som kan anvendes for C. elegans er for eksempel unc-119, unc-54, hspl6-2, goa-1 og sel-12. For uttrykket i gjær er promoterne ADH1 (konstitutiv) (Vlckova et al. (1994) Gene, 25(5),
472-4), GALI (kondisjonelt induserbar) (Selleck et al. (1987) Nature 325,173-7), MET3 (kondisjonell) (Cherest et al. (1987) Mol Gen Genet 210, 307-13) og MET25 (cf. foreksempel, Kerjan et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14(20), 7861-71) passende. I Drosophila er det mulig å anvende for eksempel promoterne MT (metallotionin), Ac5 eller Ds47 (alle: Invitrogen™ life technologies).
Helst blir en eukaryot celle brukt i prosessen, for eksempel en humancelle eller ikke-humancelle, for eksempel ape, hamster, mus, Drosophila, zebrafisk eller gjær. For eksempel kan HeLa, HEK293, H4, SH-SY5Y, H9, Cos, CHO, N2A, SL-2 eller Saccharomyces cerevisiaeceller brukes. I en bestemt utførelsesform i oppfinnelsen blir en C. eleganscelle benyttet. Cellen kan være en bestanddel til et transgent, ikke-humant dyr. I en bestemt utførelsesform kan den transgene cellen være en bestanddel til en transgen C. elegans. Spesielt vedrører oppfinnelsen prosesser hvor gjærceller, for eksempel fra stammen MaV203 (Invitrogen™ life technologies, Rockville, MD, USA) eller EGY 48 (OriGene Technologies, Inc. Rockville, MD, USA), ble anvendt.
Transgenet koder for et fusjonsprotein; dette er sammensatt av de delproteinene som kodes for av den første og den andre nukleotidsekvensen, og hvis det er passende videre nukleotidsekvenser. Fusjonsproteinet inneholder dermed det første delproteinet og det andre delproteinet, og hvis det er passende, et videre delprotein. Det er imidlertid viktig at fusjonsproteinet ikke inneholder noe peptidmotiv som virker som et signal for endo- eller eksocytose og/eller proteasekløyvningssete, unntatt for SEQ IDNR. 1. Kjente proteasekløyvningsseter er kjent for fagfolk fra proteasedatabaser, for eksempel MEROPS (Rawlings et al. (2002) MEROPS: proteasedatabasen. Nucleic Acids Res. 30, 343-346).
Helst inneholder fusjonsproteinet ifølge den foreliggende oppfinnelsen ikke et proteasekløyvningssete som er et caspasekløyvningssete, for eksempel (IVL)ExD, spesielt VEVA, VEVD og i en annen utførelsesform inneholder fusjonsproteinet ifølge den foreliggende oppfinnelsen ikke videre et signalpeptid for endo- eller eksocytose som er et signal for APP internalisering, for eksempel NpxY eller Di-leucin spesielt,
NPTY.
I en spesifikk utførelsesform har fusjonsproteinet aminosyresekvensen SEQ IDNR. 14.1 tillegg til SEQ IDNR. 1 inneholder nevnte fusjonsprotein ikke noen (en eller flere) videre peptidmotiv som virker som et signal for endo- eller eksocytose (for eksempel APP internaliseringssignal) og/eller protease (for eksempel caspase) kløyvningssete.
Spesielt kan et transgen som har nukleotidsekvensen ifølge SEQ IDNR. 15 (SPC55GV TAG) benyttes i prosessen. I bestemte foretrukne utførelsesformer av prosessen, er transgenet tilstede i en vektor. Denne spesifikke utførelsesform i oppfinnelsen er også betegnet som SP-C55-Gal-4-VP16 (det vil si SPC55GV). I dette tilfellet blir et fusjonsprotein som består av signalpeptidet til APP, C55-fragmentet til APP, GAL4 og VP 16 uttrykt. Dette protein som er lokalisert i det transmembrane domene kløyves innen C55-fragmentet og det andre delproteinet, det vil si delen av fusjonsproteinet som inneholder en del av C55-fragmentet, GAL4 og VP16 blir detektert ved hjelp av et reporterplasmid.
Ved siden av transgenkonstruksjonen SPC55GV, er også andre reporterkonstruksjoner mulige hvor for eksempel det transkripsjonsaktiverende domene kunne settes inn mellom transmembrandomene og cytosoldomene til SPC55 eller en Tag (for eksempel MYC, FLAG) på den N- eller C-terminale enden og mellom transmembran og cytosoldomene til SPC55.
Den videre kodende nukleotidsekvensen kan for eksempel kode for et protein som kan anvendes for deteksjonen av det andre delproteinet. Helst er derfor den videre kodende nukleinsekvensen lokalisert i den 3' enden av den første nukleotidsekvensen. Den videre kodende nukleotidsekvensen koder for eksempel for et kimert protein eller et annet protein som er konstruert fra en rekke domener, for eksempel et protein som inneholder et DNA-bindende domene og et transkripsjonsaktiverende domene. I en bestemt utførelsesform av oppfinnelsen koder den videre kodende nukleotidsekvensen for et protein som består av et GAL4-bindende domene og av det transkripsjonsaktiverende domene til VP 16 (GAL4-VP16, "GV"), og det videre delproteinet har helst da aminosyresekvensen SEQ IDNR. 7.1 gjærceller kan det videre delproteinet også inneholde et LexA-bindende domene (for eksepel Lex A-VP16). Dette videre delproteinet er spesielt passende for prosesser hvor cellene i gjærstammen EGY48 anvendes.
Spesielt vedrører oppfinnelsen prosesser hvor celler som er kotransfektert med et reporterplasmid anvendes. Reporterplasmidet inneholder et reportergen under kontrollen av en regulerbar promoter. For eksempel kan reportergenet kode for GFP og dets derivater, for eksempel EGFP (forsterket grønt fluoriserende protein), EBFP, EYFP, d2EGFP, GFPuv eller Luciferase (for eksempel Promega, Mannheim, Tyskland), CAT (for eksempel Promega), SEAP (for eksempel Clontech), BGal (for eksempel Clontech), korallvev fluoresserendeprotein (RCFP, Clontech) eller apoptoseinduserende faktorer, for eksempel Fas, TNF-R1, døddomene og homologer (Tartaglia et al. (1993) Cell 74, 845-53), ced3, ced4, ced9. Som en regulerbar promoter kan reporterplasmidet inneholdet en minimal promoter, for eksempel et GAL4-bindende sete i kombinasjon med den minimale promoteren til HIV, til CDa-promoteren eller til mec7-promoteren. Valget av den passende regulerbare promoteren er avhengig av det transkripsjonsaktiverende domene som benyttes.
En bestemt utførelsesform av oppfinnelsen vedrøer implementeringen av prosessen, hvor cellene som anvendes er gjærceller. Som et alternativ til gjærekspresjonsvektoren pDBTrp (Invitrogen™ life technologies, The Netherlands, Cat. No. 10835023) som i en spesiell utførelsesform av oppfinnelsen en MET-25-promoter er integrert inn i (SEQ IDNR. 10), så kan et stort antall andre ekspresjonsvektorer med forskjellige promotere (for eksempel den induserbare GALI-promoteren, den konstitutivt aktive ADH1-promoter) og med forskjellige seleksjonsmarkører (ADE, LEU, TRP, HIS, LYS, PHE) selekteres.
En bestemt utførelsesform ved oppfinnelsen vedrører anvendelsen av gjærceller som inneholder GAL4- eller LexA-induserbare reportergener enten stabilt integrert i deres genom eller ekstrakromosomalt. I disse utførelsesformer blir helst gjærstammene MaV203 (Invitrogen™ life technologies Inc., Rockville, MD, USA) or EGY48 (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD, USA) anvendt.
En bestemt utførelsesform av prosessene vedrører anvendelsen av en celle som er tilleggstransfektert med en videre rekombinant vektor. Helst har cellen som er anvendt i disse utførelsesformene normalt ikke eller knapt noen endogen y-sekretase eller endogen y-sekretaseaktivitet, og er ikke detekerbar ved å anvende de ovenfor nevnte prosessene. Denne celle kan benyttes transformert med en videre vektor hvor en nukleotidsekvens - helst et cDNA - finnes som koder for en y-sekretase, et subenhetsprotein av y-sekretase, eller en y-sekretaselignende protinase. For eksempel kan et cDNA-bibliotek benyttes. Denne utførelsesform av prosessen kan så anvendes blant annet for å identifisere en y-sekretase, et subenhetsprotein av y-sekretase eller en y-sekretaselignende proteinase eller et cDNA som koder for en y-sekretase, et subenhetsprotein av y-sekretase, eller en y-sekretaselignende protinase. cDNA-biblioteker som kan benyttes til å søke for en y-sekretase, et subenhetsprotein av y-sekretase eller en y-sekretaselignende protease kan lages fra celler eller vev fra enhver organisme, for eksempel B-celler, neuroner, gliaceller, hippokampus, hel hjerne, placenta, nyre. Helst blir cDNA laget fra virveldyr (for eksempel hamster, rotte, mus, hund, ape, menneske), spesielt fra humane celler eller humane vev.
I tilfelle med celler, som uten transfeksjon ikke hemmer y-sekretaseaktivitet, men som etter tranfeksjon med et cDNA-bibliotek som utviser y-sekrataseaktivitet, kodes det DNA som er tilstede i cellen for en y-sekretase, et subenhetsprotein av y-sekretase eller en y-sekretaselignende protinase. Dette cDNA kan isolere ved hjelp av kjente prosesser fra celler, som utviser denne oppførsel, og kan videre analyseres ved hjelp av kjente fremgangsmåter.
Foreliggende beskrivelse omtaler også et transgen som koder for et fusjonsprotein, og som inneolder de følgende bestanddelene: a) en første nukleotidsekvens som koder for et protein som inneholder aminosekvensen GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML (SEQ IDNR. 1), b) en andre nukleotidsekvens som koder for et signalpeptid i den 5' enden av den første nukleotidsekvensen,
c) en promoter og
d) minst en videre nukleotidsekvens i den 5' enden av den første nukleotidsekvensen som koder for et DNA-bindende domene og for et
transkripsjonsaktiverende domene, hvor ved siden av SEQ IDNR. 1 nevnte
fusjonsprotein ikke inneholder et eller flere peptid som virker som et signal fra endo- eller eksocytose og/eller proteasekløyvningssete.
Helst koder den første nukleotidsekvensen for APP eller en del av det, som ikke omfatter i tillegg til SEQ IDNR. 1 noen videre peptidmotiv som virker som et signal for endo- eller eksocytose og/eller proteasekløyvningssete. Transgenet kan for eksempel ha nukleotidsekvensen SEQ IDNR. 15.
Transgenet kan være tilstede i en passende vektor, for eksempel pcDNA 3.1 + eller pDBTrp. En annen utførelsesform i beskrivelsen er en prosess som vedrører anvendelsen av transgenet og/eller av vektoren for produksjonen av en transgen celle hvorved valgfritt, nevnte transgene celle anvendes for å bli en bestanddel av en ikke-human organisme. Passende som en in vivo-reporterorganisme. For eksempel kan nevnte transgen og/eller vektor anvendes for produksjonen av en transgen C. elegans. I en annen utførelsesform så blir nevnte transgen og/eller vektoren anvendt for produksjonen av transgene gjærceller, for eksempel S. cerevisia.
Beskrivelsen omtaler også en prosess for produksjonen av en transgen ikke-human organisme, for eksempel av en transgen C. elegans hvor nevnte transgen og/eller en vektor som omfatter nevnte transgen mikroinjiseres inn i gonadene til organismen, for eksempel til en C. elegans. Oppfinnelsen vedrører også en celle som inneholder et transgen ifølge oppfinnelsen, og en transgen C. elegans som inneholder nevnte transgen. Oppfinnelsen vedrører også en celle, spesielt en gjærcelle, som inneholder nevnte transgen i oppfinnelsen, helst tilstede i en passende vektor. Videre omtaler beskrivelsen spesielt celler, helst gjærceller, som inneholder transgenet og et cDNA-bibliotek, "resp"., er passende for å bli underlagt et cDNA-ekspresjonsbibliotek (cDNA-bibliotek).
Beskrivelsen omtaler anvendelsen av nevnte transgene eller rekombinante celler, helst
celler fra gjær eller C. elegans i en prosess for bestemmelse eller for identifiseringen av y-sekretase, cDNA som koder for y-sekretase, cDNA som koder for et subenhetsprotein av y-sekretase, cDNA som koder for en y-sekretaselignende proteinase, eller aktiviteten til y-sekretase, et subenhetsprotein av y-sekretase, eller en y-sekretaselignende protease, anvendelsen av nevnte celler i en prosess for identifikasjonen av nemmere til y-sekretaseaktiviteten (y-sekretase, en subenhetsprotein av y-sekretase eller en y-sekretaselignende proteinase) og prosesser av dem.
Spesielt omtaler beskrivelsen prosesser for identifikasjonen av substanser (effektorer), som modulerer (det vil si hemmer, senker, øker eller forandrer) aktiviteten til en y-sekretase, et subenhetsprotein av y-sekretase eller en y-sekretaselignende proteinase, prosessen inneholder de følgende trinnene: 1. produksjon av en transgen ikke-human organisme, for eksempel av en transgen C. elegans eller Saccharomyces cerevisia eller av en transgen celle, den transgene ikke-humane organismen eller den transgene cellen som inneholder transgenet,
den transgene ikke-humane organismen eller den transgene cellen som videre inneholder et reporterplasmid, reporterplasmidet bærer et proteinbindingssete, en minimal promoter og et reportergen og,
hvis det er passende et cDNA som koder for y-sekretasen, subenhetsproteinet til y-sekretasen eller y-sekretaselignende proteinase hvor den transgene ikke-humane organismen eller den transgene cellen uttrykker transgenet, og hvis det er passende, y-sekretasen, et subenhetsprotein av y-sekretasen eller en y-sekretaselignende protease som kodes for cDNA; 2. den transgene ikke-humane organismen eller den transgene cellen blir inkubert med en testsubstans som skal undersøkes;
og
3. mengden av det andre delvise protein blir detektert. Beskrivelsen omtaler også en prosess for identifikasjonen av effektorer av y-sekretase, et subenhetsprotein av y-sekretase eller en y-sekretaselignende proteinase hvor 1. et transgen ifølge oppfinnelsen lages/anvendes; 2. nevnte transgen og et reporterplasmid, og hvis det er passende, et cDNa som koder for en y-sekretase, et subenhetsprotein av y-sekretase eller en y-sekretaselignende proteinase blir integrert inn i genomet til en celle og fusjonsproteinet som kodes for av det nevnte transgenet, og hvis passende, y-sekretasen, subenhetsproteinet til y-sekretasen, eller y-sekretaselignende proteinasen som kodes for av cDNAet blir uttrykt i nærværet av en substans som skal undersøkes;
3. fusjonsproteinet er
a) kløyvet innen aminosyresekvensen SEQ IDNR. 1 av y-sekretasen som er tilstede i cellen slik at b) et første delvis protein som inneholder aminosyresekvensen GAIIGLMVGGVV (SEQ IDNR. 2) og et andre delvis protein som inneholder aminosyresekvensen VIVITLVML (SEQ IDNR. 3) dannes; og 4. nevnte andre delvise protein blir bestemt kvalitativt eller kvantitativt.
Beskrivelsen omtaler også prosesser for identifikasjon av substanser som hemmer aktiviteten av en y-sekretase, et subenhetsprotein av y-sekretase eller en y-sekretaselignende proteinase hvor et transgen som koder for et protein som inneholder et signalpeptid og SEQ IDNR. 1 uttrykkes i nærværet av en substans som skal undersøkes og av et reporterplasmid, og effekten av substansen som skal undersøkes på mengden av andre delvise protein dannet blir bestemt, det andre delproteinet inneholder aminosyresekvensen VIVITLVML (SEQ IDNR. 3).
Beskrivelsen omtaler også nemmere av en y-sekretase, et subenhetsprotein av y-sekretase eller en y-sekretaselignende proteinase som er identifisert ved prosesser i oppfinnelsen.
For eksempel kan prosessene anvendes for eksempel sammen med C55-Gal 4-VP16-systemet (det vil si et fusjonsprotein som består av C55, GAL4 og VP16 eller ved å anvende en nukleinsyre som koder for et korresponderende fusjonsprotein) for: 1. Identifikasjon og bestemmelse (kvalitativ og/eller kvantitativ) av aktiviteten til en y-sekretase, et subenhetsprotein av y-sekretase eler en y-sekretaselignende proteinase. 2. Identifikasjon av y-sekretase, et subenhetsprotein av y-sekretase eller en y-sekretaselignende proteinase i forskjellige vev, celler og organismer eller arter. Identifikasjon og isolering av cDNA'ene det dreier seg om som koder for y-sekretase, et subenhetsprotein av y-sekretase, eller en y-sekretaselignende proteinase og den videre anvendelse av cDNA'ene. 3. In vivo-screening for eksempel i gjærceller (for eksempel Saccharomyces cerevisiae), i C. elegans eller i cellekultur, gjør det mulig å bestemme aktiviteten av y-sekretasen, et subenhetsprotein av y-sekretasen, av et subenhetsprotein av y- sekretasen eller av en y-sekretaselignende proteinase uten å anvende immunbiologiske fremgangsmåter. 4. Anvendelse av prosessen i forliggende oppfinnelse for identifikasjon og karakteriseringen av substanser, for eksempel farmakologisk aktive forbindelser, som modulerer den enzymatiske eller biologiske aktiviteten av y-sekretasen, av et subenhetsprotein av y-sekretasen, eller av en y-sekretaselignende protease, for eksempel effekter av (hemmere, aktivatorer, modulatorer) av y-sekretasen, av et subenhetsprotein av y-sekretasen, eller av en y-sekretaselignende proteinase. Spesielt kan denne prosess benyttes i en HTS (høy kapasitetsscreening). Ved anvendelse av HTS-analysesystemer, kan substanser identifiseres som kan benyttes for behandlingen av Alzheimers sykdom og/eller for preventiv behandling. 5. Undersøkelse på eller i sammenheng med Alzheimers sykdom, vil for eksempel fremme en dypere forståelse av mutert APP og fragmenter av disse, eller funksjonen av membranbaserte proteaser. 6. De beskrevne fusjonsproteiner/transgener, for eksempel C55 i SP-C55-Gal 4-VP16, kan erstattes av andre fragmenter ifølge oppfinnelsen, og y-sekretasen, et subenhetsprotein av y-sekretasen eller en y-sekretaselignende proteinase, dets aktivitet og regulering kan undersøkes ved hjelp av prosessene.
En annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er en farmasøytisk sammensetning som omfatter en farmasøytisk aktiv forbindelse som hemmer aktiviteten av en y-sekretase, et subenhetsprotein av y-sekretase eller en y-sekretaselignende proteinase som er blitt identifisert ved hjelp av en prosess som beskrevet ovenfor.
En videre utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er en prosess for å lage en farmasøytisk sammensetning som omfatter en prosess som beskrevet, og å formulere den nevnte identifiserte farmasøytiske aktive forbindelsen.
Enda en videre utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er en prosess for å lage et farmasøytika som omfatter a) en prosess som beskrevet og b) å blande den identifiserte farmasøytiske aktive forbindelse med et farmasøytisk uvirksom uorganisk og/eller organisk hjelpemiddel.
Enda en annen utførelsesform ifølge foreliggende beskrivelse er et testkit for å detektere aktiviteten til y-sekretase, til et subenhetsprotein av y-sekretase eller til en y-sekretaselignende proteinase, som omfatter transgene, vektoren eller celle som beskrevet ovenfor. Figur 1: Figur 1 viser det amyloid forløperproteinet (Isoform APP695 og Isoformene APP770 eller APP751) og sekretasekløyvningsprodukter. Figur 2: Viser skjematisk prinsippet som prosessene er basert på: P-sekretasekløyvningssete i den N-terminale enden; y-sekretasekløyvningssete i det transmembrane domene; Cl00 = ClOO-fragment til APP; GAL4-VP16 = DNA-bindende domene, transkripsjonsaktiverende domene (som består av DNA-bindende domene og transkripsjonsaktivator), som binder seg til det proteinbindende domene på DNA'et på reporterplasmidet. Figur 3: Konstruksjon av ekspresjonsplasmidene SP-C100-GAL4-VP16: aa = aminosyrer; restriksjonskløyvningsseter Sac I, Hind III og Kpn I indikerer posisjonen til kløyvningssetet på plasmidet. Figur 4: Ekspresjonsplasmid pDBTrp-MET25-SP-C100-GAL4-VP16: konstruksjon av ekspresjonsplasmidet for ekspresjonen av transgenet i gjær.
EKSEMPLER
Eksempel 1:
Konstruksjon av ekspresjonsplasmidet pcDNA3.1+ som omfatter SP-C100-GAL4/VP16
Plasmidet koder for APP-signalpeptidet (SP) som er fusert til det C-terminale 100-aminosyreresiduet til APP (Cl00). Cl00 begynner med den N-terminale enden av Ap-peptidet og slutter med den C-terminale enden av APP. Det må i tillegg kløyves av y-sekretasen for å frigjøre Ap-peptidet.
GAL4/VP16 (SEQ IDNR. 7) ble fusert til den C-terminale enden av SP-C100 (SEQ IDNR. 6). GAL4/VP16 omfatter de første 147 aminosyreresiduene til gjærtranskripsjonsaktivatoren GAL4 og de 78 C-terminale aminosyreresiduene til VP16, en transkripsjonsaktivator fra herpes simplex-viruset. Som et fusjonsprotein tar GAL4-fragmentet over funksjonen av DNA-bindingen, mens VP16-fragmentet aktiverer transkripsjonen (Sadowski et al, 1988).
pcDNA3.1+ (Invitrogen™ life technologies, Nederland, Cat.nr. V79020) tjener som plasmidvektoren.
Eksempel 2;
Konstruksjon av reporterplasmidet pGL2-MRG5-EGFP
Det pattedyrcellereporterplasmidet pGL2-MRG5 er pGL2 (Promega) hvor et cDNA-fragemt fra pMRG5 (Ikeda et al., 1998) som omfatter fem GAL4 DNA-bindingssete oppstrøms for det humane immundefisiente virus (HIV) core promoteren (Kretzschmar et al, 1994), er satt inn oppstrøms for luciferasereportergenet i pGL2. For lettere deteksjon i cellekultur ble luciferasereportergenet erstattet av genet for EGFP (forsterkeet grønt fluorisserende protein) skaffet tilveie fra vektoren pEGFP-Nl (Clontech Laboratories, Heidelberg).
Eksempel 3:
Co-transfeksjon av humane neuroblastomaceller.
Humane neuroblastomaceller SH-SY5Y (ATCC CRL-2266) ble co-transfektert med begge plasmidene fra eksemplene 1 og 2 og deretter mikroskopisk analysert under stråling med lys ved bølgelengde 480 nm, hvor EGFP blir eksitert. Det var mulig å detektere EGFP-uttrykkende celler som utviste sterk grønn fluoressens. For å sikre at den grønne fluoressensen spesifikt er avhengig av ekspresjonen av EGFP ved reporterplasmidet, ble SH-SY5Y-celler transfektert bare med reporterplasmidet pGL2-MRG5-EGFP. I disse cellene var det ingen grønn fluoressens detekterbar. Uttrykket ble aktivert av GAL4-VP16, som forutsetter en proteolytisk frigjøring av GAL4/VP16 fra den C-terminale enden av SP-C100-GAL4/VP16.
Eksempel 4;
Anvendelse av C100-Gal4/VP16-systemet for deteksjonen av et cDNA som koder for en y-sekretaseaktivitet i cDNA-biblioteker.
SP-C100-Gal4/VP16 ble klonet i gjærekspresjonsvektoren pDBTrp (Invitrogen™ life technologides, Nederland, Cat.nr. 10835023) under kontrollen av MET25-promoteren ved å erstatte delen av pDBTrp som inneholdt ADH-promoteren og GAL4DB-domener (posisjonert mellom CYH2-genet og det multiple kloningssetet) med et DNA-fragment som inneholdt MET25-promoteren fra p415MET25 (Mumbert et al, 1994) oppstrøms for SP-C100-Gal4-VP16. Gjærstammen MaV203 (Invitrogen™ life technologies) ble transformert med denne konstruksjon. MaV203 er genetisk modifisert og inneholder tre GAL4-induserbare reportergener (URA3, HIS3, lacZ), som er stabilt integrert inn i genomet (Vidal et al., 1996). I MaV203 resulterte den proteolytiske frigjøringsen av GAL4/VP16-domenet fra SP-C100-Gal4-VP16-protein i aktiveringen av URA3 og HIS3 "read-out" som tillater vekst for plater som mangler uracil eller histidin.
Ekspresjonen av SP-C100-Gal4-VP16 cDNa i MaV203 resulterte bare i lav aktivitet av reporterne, slik at dette in vivo-funksjonelle analysesystem er passende for å screene for og deteketere ekspresjon av et cDNA for en y-sekretase i et cDNA-bibliotek.
Eksempel 5:
Identifisering av y-sekretaser ved å screene et humant B-celle cDNA-bibliotek. Den rekombinante MaV203 gjærstammen fra eksempel 4 ble anvendt for formålet med å screene et humant B-celle cDNA-bibliotek (ATCC 87286; American Type Culture Collection, Manassas, USA; Elledge et al, 1991) for et cDNA som koder for et protein med y-sekretaseaktivitet. Alternativt kan et humant hippocampal cDNA-bibliotek integrert inn i gjærekspresjonsvektorene p415-MET25 (Mumberg et al., 1994) eller p415-ADHl (Mumberg et al, 1995) også benyttes for å screene etter et cDNA som koder for en y-sekretase eller et protein som har y-sekretaselignende aktivitet.
Eksempel 6;
Kloning av SP2-C100 og SP2-C100-GAL4/VP16.
Den kodende regionen for det humane signalpeptidet til SP-C100-GAL4/VP16 (som beskrevet i eksempel 1) ble erstattet med et signalpeptid utledet fra gjær SUC2-genet (SP2; SEQ IDNR. 12), som resulterer i en konstruksjon som koder for SP2-C100-GAL4/VP16 (SEQ IDNR. 19).
SP2-C100 ble konstruert med å oppformere den kodende regionen til den modne formen av Cl00 (uten signalsekvensen, jamfør SEQ IDNR. 4) med en 5' primer, som inkluderte den kodende sekvensen for SUC2-signalpeptidet (SEQ IDNR. 12) og en 3' primer som korresponderer til det naturlige stopkodonet (Kang et al., (1987)). For å fasilitere utbyttingen av signalpeptidet, ble primerne EH47 (SEQ IDNR. 23) og EH49 (SEQ IDNR. 24) designet slik at det resulterende PCR-produktet inneholdt et tilleggs Nhel-sete som forbinder de kodende regionene for signalpeptidet og det modne peptidet. EH47: 5'-GCTAGAATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTTGGCTGGTTTTGC AGCC AAAATATCTGCAGCGCTAGCTGATGCAGAATTCCGACATGAC-3' EH49: 5'-CGGGATCCCTAGGCGCCGTTCTGCATCTGCTCAAAGAAC-3'.
SP2-C100-GAL4/VP16 ble skaffet tilveie ved hjelp av EcoRl-kløyving for å fjerne ClOO-fragmentet i SP2-C100 og erstatte det med C100-GAL4/VP16. Fragmentene ble klonet inn i gjærekspresjonsvektoren pDBTrp (Invitrogen™ life technologies, Nederland, Catnr. 10835023) som inneholdt MET25-promoteren, som beskrevet i eksempel 4.
Eksempel 7:
Kloning av SP2-C-BAL4/VP16-100
For å skaffe tilveie konstruksjonen SP2-C-GAL4/VP16-100 (SEQ IDNR. 17), ble tre uavehengige PCR-reaksjoner utført ved å anvende de følgende primerne:
1) Ved å anvende SP2-C100 som et templat, ble ectodomene og transmembrandomene til Cl00 oppformert ved å anvende primerne EH53 (SEQ IDNR. 25) og EH54 (SEQ IDNR. 26) på en slik måte at PCR-produktet inneholdt også den 3' flankerende regionen som overlapper med den GAL4/VP16 kodende regionen. 2) Ved å anvende primerne EH55 (SEQ IDNO. 27) og EH56 (SEQ IDNO. 28), og GAL4/VP16 som DNA-templatet ble en PCR-reaksjon utført ved å identifisere den kodende regionen med 5'- og 3'-flankerende regioner som korresponderer til hver side av SP2-C100. 3) Det 3'segmentet til SP2-C100 som koder for det cytoplasmatiske domene til Cl00 ble oppformert ved å anvende primerne EH57 (SEQ IDNR. 29) og EH 59 (SEQ IDNR. 30), og resulterte i en 5' overlapp med den GAL4/VP16
kodende regionen. De resulterende PCR-produktene (på ca 200 bp,m 720 bp og 100 bp) ble renset og anvendt i en slutt-PCR i nærvær av EH53 og EH59 som korresponderer til de 5' og 3' endende til SP2-C100. Slutt-PCR-produktet på ca 1 000 bp blir klonet inn i en gjærekspresjonsvektor utledet fra pDBTrp (Invitrogen™ life technologies, Nederland, Catnr. 10835023) som inneholder MET25-promoteren, som beskrevet i eksempel 4.
Eksempel 8;
Kloning av SP3-C100, SP3-C100-GAL4/VP16 og SP3-C-GAL4/VP16-100.
For å lage de tre plasmidvektorene for ekspresjon av SP3-C100, SP3-C100-GAL4/VP16 (SEQ IDNR.21), og SP3-C-GAL4/VP16-100 (SEQ IDNR. 32) i pattedyrcellesystemer, så ble enten C100, C100-GAL4/VP16 eller C-GAL4/VP16-100 subklonet fra gjærekspresjonsvektorene i eksempel 6 eller 7 inn i den pattedyrekspresjonsvektoren pRc/CMV (Invitrogen, Catnr. V75020), som inneholder den kodende regionen for BM40-signalpeptidet (SP3; SEQ IDNR. 13). De kodende regionene til Cl00, Cl 00-GAL4/VP16 eller C-GAL4/VP16-100) ble ligert i leseramme fra den SP3-kodende regionen ved det unike Nhel-restriksjonssete som ble beskrevet i eksempel 6.
Eksempel 9;
Forbedring av ekspresjonen av C100-GAL4/VP16 i gjær.
Kvantifisering av ekspresjonsnivået til forskjellige konstruksjoner i råe lysater fra transformert gjær vista at ekspresjonen av SP-C100-GAL4/VP16 var veldig lav sammenlignet med lysater fra gjærceller transformert med vektorer som koder for fusjoner med gjær SUC2-signalpeptidet. For eksempel resulterte ekspresjon av SP2-C100-GAL4/VP16 i den sterke ekspresjonen av et spesifikt bånd av den forventede størrelsen. Imidlertid kunne også bånd med høyere elektroforetisk mobilitet detekteres ved immunblotting, noe som indikerer ikke spesifikk degradering av det rekombinante proteinet i gjær. Stabiliteten til proteinet ble forbedret i tilfellet med C-GAL4/VP16-100 (se nedenfor) hvor GAL4/VP16-domene ble satt inn i leseramme i C00, nær y-sekretasekløyvningssete. Begge fusjonsproteiner ga ekspresjonsnivåer som var sammenlignbare med konstruksjonen som koder for C100 uten GAL4/VP16, noe som indikerer at de to forskjellige fusjonene mellom C100 og GAL4/VP16 ikke intefererte med proteinekspresjon.
Eksempel 10;
Forbedring av bakgrunnen i gjær.
Den økede ekspresjonen av C100-GAL4/VP16 som skyldes utbyttingen av signalpeptidene korrelerte med en sterk økning i ikke-spesifikk aktivering av URA3, HIS3 og lacZ reportersystemene i gjærstammene MaV203. Fordi gjær mangler y-sekretaseaktivitet var dette mest sansynlig på grunn av ikke-spesifikk prosessering av C100-GAL4/VP16 av cellulære proteaser og frigjøringen av aktiv GAL4/VP16.
Ved å flytte GAL4/VP16-domene nærmere y-sekretasekløyvingssete ble den ikke-spesifikke proteolytiske kløyvingen som ble detektert med C100-GAL4/VP16 ved seter mellom transmembrandomene til Cl00 og den aminoterminale enden til GAL4/VP16-domene essensielt eliminert.
Kløyvning av de forskjellige konstruksjonene ble testet i MaV203 ved å undersøke GAL4/VP16-avhengig aktivering av reportersystemene. Transformering av MaV203 med SP-C100-GAL4/VP16 utviste en Ura<+>, His"fenotype (jamfør eksempel 4). Øking av ekspresjonsnivåene ved å erstatte SP-signalpeptidet med SP2-peptidet (for å gi SP2-C100-GAL4/VP16) resulterte i en sterk aktivering av alle "read-outs" til et nivå som lignet det som ble detektert i den positive kontrollen, MaV203 som konstitutiv uttrykker fullengde GAL4-protein (kodet av plasmid pCll; Clontech Laboratories).
I motsetning til dette utviste MaV203-celler som uttrykker SP2-C-GAL4/VP16-100, som uttrykkes ved nivåer som er sammenlignbare med SP2-C100-GAL4/VP16, en ura", His"fenotype som også ble utvist av MaV203 som var transformert med en tom vektorkontroll.
Derfor kan SP2-C-GAL4/VP16-100 uttrykkes sterkt i gjær, men fremdeles vise veldig lav ikke-spesifikk aktivering av de GAL4-avhengige reporterne. Høynivåekspresjon av SP2-C-GAL4/VP16-100-proteinet, kombinert med en lav bakgrunn av ikke-spesifikk kløyving/reporteraktivering, er en forutsetning for et "read-out"-system med et overraskende optimalisert signal til bakgrunnsratio.
Eksempel 11
Prosessering av SP3-C-GAL4/VP16-100 med y-sekretase i pattedyrceller.
For å demonstrere at SP3-C-GAL4/VP16-100-protein uttrykt i pattedyrceller prosesseres korrekt av y-sekretaseaktivitet, ble SP3-C-GAL4/VP16-100 transfektert inn i pattedyrceller som har vært vist å uttrykke y-sekretaseaktivitet endogent (Haass et al, 1992). For ekspresjon i pattedyrceller ble signalpeptidet i SP2-C-BAL4/VP16-100 erstattet som beskrevet i eksempel 8, med et pattedyrsignalpeptid utledet fra det basale membranproteinet BM40, som er kjent for høyt nivåekspresjon (SP3; SEQ IDNR. 13). Prosessering av y-sekretase ble målt ved å kvantifisere sekresjonen av Ap i dyrkningsmediet. Det utskilte Ap ble detektert ved hjelp av en sandwich ELISA ved å anvende monoklonale antistoffer 6E10 og biotinylert 4G8 (Senetec PLC, Napa, California, USA; jamfør Kim et al., 1990) som henholdsvis fangings- og
deteksj onsantistoffer.
Etter transfeksjon med SP3-C100 ble en åtte gangers økning i Ap-sekresjon observert sammenlignet med den tomme vektorkontrollen. Sender transfektert med SP3-C100-GAL4/VP16 eller SP3-C-GAL4/VP16-100 utskilte lignende mengder av Ap, noe som indikerer at verken den C-terminale eller den juktamembranfusjonen av GAL4/VP16 interfererer med proteolytisk prosessering ved y-sekretase.
Eksempel 12:
Transkripsjonen aktivering av GAL4/VP16-avhengig reportergen ved C-Gal4/VP16-100 uttrykt i pattedyrceller.
Prosessering av C100-GAL4/VP16 og C-GAL4/VP16-100 ved y-sekretase resulterte i frigjøringen av et polypeptid som innehnoldt GAL4/VP16 og tilleggsaminosyrer fra flankerende deler av Cl00. SP3-C100-GAL4/VP16 og SP3-C-GAL3/VP16-100 ble kotransfektert med det pattedyrreporterplasmidet pGL2-MRG5-EGFP (Ikeda et al, 1998) beskrevet i eksempel 2, som inneholder fem GAL4 DNA-bindende seter oppstrøms for den humane immundefisiente virus (HIV) kjernepromoteren og cDNA'et som koder for EGFP. Kotransfeksjonen av pGL2-MRG5-EGFP med GAL4/VP16-inneholdende fusjonene resulterte i tilstedeværelsen av GFP-positive celler i begge tilfeller.
Eksempel 13:
Konstruksjon av pattedyrekspresjonsplasmidet SP3-C55-GAL4/VP16. Konstruksjoner som inneholder ClOO-sekvensen til APP og GAL4/VP16 inneholder begge kløyvningsseter for y-sekretase og et kløyvningssete for caspaselignende proteaser. For å unngå at en uspesifikk caspaselignende aktivitet kunne køyve SP3-C100-GAL4/VP16 mellom det autentiske y-sekretasesete og GAL4/VP16-domene for å frigjøre GAL4/VP16 og aktivere reportersystemet i pattedyrceller, ble det 45 aminosyre C-terminale segmentet til C100 som fantes i SP3-C100-GAL4/VP16, som koder for det cytoplasmatiske domene til APP, slettet. Fjerning av de C-terminale 45-aminosyrene i Cl00 eliminerer også et "internaliseringssignal"peptid i den C-terminale enden av APP som dirigerer endocytosen av APP etter å ha blitt satt inn i plasmamembranen.
Pattedyrekspresjonsplasmidet SP3-C55-GAL4/VP16 omfatter dermed BM40-signalpeptidet (SEQ IDNR. 13), de N-terminale 55 aminosyreresiduene (C55; SEQ IDNR. 6) til APP-C100 og GAL4/VP16. C55 begynner med den N-terminale enden av Ap-peptidet og slutter med det transmembrane domene til APP. ISP3-C55-GAL4/VP16-protein er bare kløyvningssete for y-sekretase tilstede. C55 omfatter y-sekretasekløyvningssete og må kløyves av P-sekretase for å frigjøre Ap-peptidet og GAL3/VP16. Fordi det endocytiske internaliseringssignalpeptidet ikke er tilstede i SP3-C55-GAL4/VP16, vil videre bare y-sekretase som katalyserer kløyvninger plasmamembranassosiert C55-GAL4/VP16 frigjøre Ap-peptid og akativere GAL4/VP16-avhengig transkripsjon av reportersystemet.
Ekspresjonsplasmidet ble utledet fra vektoren SP3-C-GAL4/VP16-100 ved introduksjonen av et stoppkodon (TAG) etter GAL4/VP16-sekvensen. Dette ble utført ved å erstatte Hpal-Clal-fragmentet i SP3-C-GAL4/VP16-100 med et DNA-fragment laget ved PCR ved å anvende SP3-C-GAL4/VP16-100 som DNA-templatet, en 5' primer oppstrøms for det unike Hpal-sete i GAL4/VP16 og en 3' primer (5'-CCATCGATTTTCTAACCCCCACCGTA-3'; SEQ IDNR. 31) som introduserer et TAG-stoppkodon (understreket) og et Clal-restriksjonssete i den C-terminale enden av GAL4/VP16 åpne leseramme.
Eksempel 14:
Stabile transfikterte HEK293-celler.
HEK293-celler (Human Embryonisk nyrecellelinje, (ATCC)) ble cotransfektert med plasmidet SP3-C55-GAL4/VP16 og luciferasereporterplasmidet PGL2-MRG5 (beskrevet i eksempel 2). Deretter ble stabile cellelinjer selektert ved å inkubere med 400 ug/ml geneticin (GibcoBRL) for å selektere for Neomycinresisitente kloner og deretter karakterisere for stabil ekspresjon av SP3-C55-GAL4/VP16 og luciferase.
Eksempel 15:
Transient transfeksjon av HEK 293-celler.
HEK293-celler ble kotransfektert med SP3-C55-GAL3/VIP16-vektoren (0.03 ug) og pGL2-MRG5-luciferasereportervektoren (1 ug) i multibrønn 12 plater.
Forbindelsene DPAT (fra Elan Pharmaceuticals; Dovey et al., 2001) og L-685,458 (fra Merck Pharmaceuticals; Shearman et al., 2000), begge kjente y-sekretasehemmere, hemmet doseavhengig luciferaseaktivitet og AB-produksjon og utviste en IC50på henholdsvis 14nM (DAPT) og 19nM (L-685,458), respektivt.
Luciferaseaktivitet ble kvantifisert ved Bright-Glo Luciferase Assay kittet (Promega). Ap i cellemediet ble kvantifisert med ELISA ved å anvende antistoffene 4G8 og 6E10 (fra Senetek), som beskrevet i eksempel 11. Disse antistoffer er spesifikke for aminosyrene 17-24 (4G8) og 1-17 (6E10) i Ap-peptidet.
I transiente transfeksjonseksperimenter ble Ap også identifisert ved immunpresipitering og ved immunblotting. Begge fremgangsmåter identifiserte et 4 kDa-bånd som korresponderer til Ap-peptid.
Eksempel 16:
Farmakologisk karakterisering av de stabilt transfekterte HEK293-celler.
En klon med HEK293-celler som stabilt uttrykker både SP3-C55-GAL4/VP16 og MRG5-luciferasekonstruksjonene ble identifisert ifølge eksempel 14. Denne celleklon ble anvendt for å undersøke responsen til det stabilt transfekterte pattedyrcelleanalysesystemet til DAPT (fra Elan Pharm.; Dovey et al, 2001), og L-685,458 (fra Merck Pharm.; Shearman et al, 2000)., begge forbindelser utviste doseavhengig hemming av Luciferaseaktivitet (24 timers behandling) med en IC50på henholdsvis 230nM (DAPT) og 130nM (L-685,458).
Eksempel 17:
Identifikasjon av hemm ere til y-sekretase.
For identifikasjonen av y-sekretasehemmere, ble stabilt dobbelttransfekterte HEK293-celler (se eksempel 14) inkubert i multibrønns 96-plater, i nærværet av forbindelsen eller forbindelsene som skulle undersøkes (for eksempel sammensatt bibliotekscreening ved en konsentrasjon på 10 uM eller mindre i analysen, og luciferaseaktivitet ble bestemt 24 timer senere. Luciferaseaktivitet kan kvantifiseres med luciferaseanalysesystemkittet (Promega), Brigh-Glo Luciferaseanalysekittet (Promega) eller ved hjelp av andre fremgangsmåter for luciferasekvantifisering. En nedgang i luciferaseaktiviteten reflekterer en nedgang i y-sekretaseaktivitet.
Referanser:
Dovey et al. (2001) J. Neurochem. 76, 173.
Elledge et al. (1991) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88, 1731.
Estus et al. (1992) Science 255, 726.
Haass et al. (1992) Nature 359, 322.
Heijne et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14(11), 4683-4690.
Hilbich et al. (1991) J. Mol. Biol. 218, 149.
Ikeda et al. (1998) Mol. Cell. Biol. 18,10.
Kang et al. (1987) Nature 325, 733.
Kim et al. (1990) Neurosci. Res. Comm. 7, 113.
Kretzschmar et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14, 3927.
Maruyama et al. (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 202, 1517.
Mattson (2003) Nature 422, 385.
Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res. 22, 5767.
Mumberg et al. (1995) Gene 156, 119.
Rumble et al. (1989), N. Engl. J. Med. 320,1446.
Sadowski et al. (1988) Nature 335, 563.
Scheuner et al. (1996), Nature Medicine 2, 864.
Shearman et al. (2000) Biochemistry 39, 8698.
Simons et al. (1996) J. Neurosci. 16(3), 899-908.
Suzuki et al (1994) Science 264(5163),1336-1340.
Vidal et al. (1996) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 93,10315.
Yankner et al. (1990) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87, 9020.
For generelt rekombinant DNA-arbeid:
Sambrook, J., Fritsch, E. F., og Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY
For gjærarbeid (DNA-transformering):
Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., og Struhl, K. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, s. 13.7.1-13.7.2, Greene Publishing Associates/Wiley-Interscience, New York
For C. Elegans-arbeid (transgener):
Mello, C. og Fire, A. (1995) DNA-transformering. I: Epstein, H.F.
og Shakes, D.C., ed. Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. Methods in Cell Biology, Vol. 48. Academic Press, San Diego, CA, s. 451-482.
Claims (27)
1.
Prosess for deteksjonen av aktiviteten til y-sekretase, hvori A. et transgen som koder for et fusjonsprotein blir anvendt, hvori nevnte transgen omfatter: a) en første nukleotidsekvens som koder for et protein som inneholder aminosyresekvensen GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML (SEQ IDNR. 1), hvori nevnte protein kan kløyves inne i nevnte aminosyresekvens av y-sekretase som er tilstede i en celle; hvorved et første delprotein, som inneholder aminosyresekvensen GAIIGLMVGGVV (SEQ IDNR. 2), og et andre delprotein som inneholder aminosyresekvensen VIVITLVML (SEQ IDNR. 3) blir dannet; b) ved 5' enden av den første nukleotidsekvensen er det en andre nukleotidsekvens som koder for et signalpeptid; c) en promoter; og d) ytterligere kodende nukleotidsekvenser som koder for et protein som blir utrykt som et fusjonsprotein med nevnte første delprotein og nevnte andre delprotein og som blir anvendt for deteksjon av det nevnte andre delprotein, og hvis passende ytterligere ikke-kodende nukleinsyresekvenser; B. dette transgen blir inkorporert inn i en human celle in vitro eller en ikke-human eukaryot celle og fusjonsproteinet blir uttrykt; C. fusjonsproteinet blir kløyvet inne i aminosyresekvensen SEQ IDNR. 1 av y-sekretasen som er tilstede i cellen hvorved det første delprotein og det andre delprotein blir dannet; og D. det andre delproteinet blir detektert;
karakterisert vedat nevnte fusjonsprotein, med unntak av SEQ IDNR. 1, ikke inneholder en eller flere peptidmotiver som virker som et signal for endo- eller eksocytose og/eller proteasekløyvningssete.
2.
Prosess for deteksjonen av aktiviteten til y-sekretase, hvori A. et transgen som koder for et fusjonsprotein blir anvendt, hvori nevnte transgen inneholder følgende bestanddeler: a) en første nukleotidsekvens som koder for et protein som inneholder aminosyresekvensen GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML (SEQ IDNR. 1), hvori nevnte protein kan kløyves inne i nevnte aminosyresekvens av y-sekretase som er tilstede i en celle; hvorved et første delprotein, som inneholder aminosyresekvensen GAIIGLMVGGVV (SEQ IDNR. 2), og et andre delprotein som inneholder aminosyresekvensen VIVITLVML (SEQ IDNR. 3) blir dannet; b) ved 5' enden av den første nukleotidsekvensen er det en andre nukleotidsekvens som koder for et signalpeptid; c) en promoter; og d) ytterligere kodende nukleotidsekvenser som koder for et protein som blir utrykt som et fusjonsprotein med nevnte første delprotein og nevnte andre delprotein og som blir anvendt for deteksjon av det nevnte andre delprotein, og hvis passende ytterligere ikke-kodende nukleinsyresekvenser; B. dette transgen blir inkorporert inn i en human celle in vitro eller en ikke-human eukaryot celle og fusjonsproteinet blir uttrykt; C. fusjonsproteinet blir kløyvet inne i aminosyresekvensen SEQ IDNR. 1 av y-sekretasen som er tilstede i cellen hvorved det første delprotein og det andre delprotein blir dannet; og D. mengde av det andre delproteinet blir bestemt og aktiviteten til y-sekretasen blir bestemt utifrå mengde av det andre delprotein som blir dannet;
karakterisert vedat nevnte fusjonsprotein, med unntak av SEQ IDNR. 1, ikke inneholder en eller flere peptidmotiver som virker som et signal for endo- eller eksocytose og/eller proteasekløyvningssete.
3.
Prosess ifølge ett av kravene log2,karakterisert vedat peptidmotivet er et caspasekløyvningssete.
4.
Prosess ifølge ett av kravene 1 til 3,karakterisert vedat den første nukleotidsekvensen koder for et amyolidforløperprotein (APP) eller en del derav, hvori nevnte peptidmotiv som virker som et signal for endo- eller eksocytose er NPTY og nevnte peptidmotiv som virker som et proteasekløyvningssete er VEVD.
5.
Prosess ifølge ett eller flere av kravene 1 til 4,karakterisertv e d at den første nukleotidsekvensen koder for et protein som er utledet fra aminosyresekvensen SEQ IDNR. 4.
6.
Prosess ifølge ett eller flere av kravene 1 til 5,karakterisertv e d at den andre nukleotidsekvensen koder for signalpeptidet til humant APP (SEQ IDNR. 5), SUC2 (SEQ IDNR. 12) eller BM40 (SEQ IDNR. 13).
7.
Prosess ifølge ett eller flere av kravene 1 til 6,karakterisertv e d at signalpeptidet har aminosyresekvensen SEQ IDNR. 5.
8.
Prosess ifølge ett eller flere av kravene 1 til 7,karakterisertv e d at promoteren er en promoter for ekspresjon i pattedyrceller, i C. elegans, i gjær eller i Drosophila.
9.
Prosess ifølge ett eller flere av kravene 1 til 8,karakterisertved at promoteren er CMV,HSVTK,RSV,SV40,LTR,uncl 19, unc54,hspl6-2, GoAl, sel-12, ADH1, GALI, MET3, MET25, MT, Ac5 eller Ds47-promoter.
10.
Prosess ifølge krav 1,karakterisert vedat cellen er en HeLa, 293, H4, SH-SY5Y, H9, Cos, CHO, N2A, SL-2 eller gjærcelle.
11.
Prosess ifølge krav 1,karakterisert vedat cellen er en C. eleganscelle.
12.
Prosess ifølge krav 1,karakterisert vedat cellen er en bestanddel av en transgen C. elegans.
13.
Prosess ifølge krav 1,karakterisert vedat cellen er en Saccharomyces cerevisiacelle.
14.
Prosess ifølge ett eller flere av kravene 1 til 13,karakterisertv e d at fusjonsproteinet inneholder aminosyresekvensen SEQ IDNR. 6.
15.
Prosess ifølge ett eller flere av kravene 1 til 14,karakterisertved at den ytterligere kodende nukleotidsekvensen er lokalisert i den 3'enden av den første nukleotidsekvensen.
16.
Prosess ifølge ett eller flere av kravene 1 til 15,karakterisertv e d at den ytterligere kodende nukleotidsekvensen koder for et protein som inneholder et DNA-bindende domene og et transkripsjonsaktiverende domene.
17.
Prosess ifølge ett eller flere av kravene 1 til 16,karakterisertv e d at den ytterligere kodende nukleotidsekvensen koder for et protein som består av et GAL4-bindende domene og av det transkripsjonsaktiverende domenet til VP 16 (GAL4-VP16).
18.
Prosess ifølge ett eller flere av kravene 1 til 17,karakterisertv e d at cellen er kotransfektert med et reporterplasmid hvor reporterplasmidet inneholder et reportergen under kontrollen av en regulerbar promoter.
19.
Prosess ifølge krav 18,karakterisert vedat den regulerbare promoteren er aktiverbar av det transkripsjonsaktiverende domenet.
20.
Prosess ifølge krav 19,karakterisert vedat reporterplasmidet koder for reportergenet for EGFP (forsterket grønt fluoriserende protein), Ura 3, His 3 eller Lac Z og at den regulerbare promoteren inneholder GAL4-bindende seter og en minimal promoter til HrV.
21.
Prosess ifølge ett eller flere av kravene 1 til 20,karakterisertv e d at transgenet omfatter en nukleotidsekvens som koder for SEQ IDNR. 14.
22.
Prosess ifølge ett eller flere av kravene 1 til 21,karakterisertv e d at transgenet er tilstede i en vektor.
23.
Prosess ifølge ett eller flere av kravene 1 til 22,karakterisertv e d at den rekombinante vektoren er pcDNA 3.1+.
24.
Prosess ifølge ett eller flere av kravene 1 til 23,karakterisertv e d at ingen endogen y-sekretaseaktivitet er detekterbar i cellen.
25.
Prosess ifølge ett eller flere av kravene 1 til 24,karakterisertv e d at cellen er kotransfektert ved å anvende et cDNA-bibliotek.
26.
Prosess ifølge krav 25,karakterisert vedatcDNA laget fra humant eller ikke-humant vev eller humane eller ikke-humane celler er tilstede i cDNA-biblioteket.
27.
Anvendelsen av en prosess ifølge ett eller flere av kravene 24 til 26 for identifisering av et cDNA som koder for en y-sekretase, et subenhetsprotein av y-sekretase eller en y-sekretaselignende protease hvori a) en celle er identifisert hvor aktiviteten av en y-sekretase er detekterbar og b) cDNA som koder for y-sekretasen er isolert fra denne celle.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP20030011807 EP1481987A1 (en) | 2003-05-26 | 2003-05-26 | Method for screening inhibitors of the gamma-secretase |
| PCT/EP2004/004550 WO2004104037A1 (en) | 2003-05-26 | 2004-04-29 | Method for screening inhibitors of the gamma-secretase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20056029L NO20056029L (no) | 2006-02-24 |
| NO334058B1 true NO334058B1 (no) | 2013-12-02 |
Family
ID=33104072
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20056029A NO334058B1 (no) | 2003-05-26 | 2005-12-19 | Prosess for deteksjon av gammasekretase aktivitet samt anvendelse derav |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7892778B2 (no) |
| EP (2) | EP1481987A1 (no) |
| JP (1) | JP4903046B2 (no) |
| KR (1) | KR101215855B1 (no) |
| CN (1) | CN1795203B (no) |
| AT (1) | ATE393779T1 (no) |
| AU (1) | AU2004241151B2 (no) |
| BR (1) | BRPI0410736A (no) |
| CA (1) | CA2526790C (no) |
| DE (1) | DE602004013440T2 (no) |
| DK (1) | DK1631584T3 (no) |
| ES (1) | ES2307012T3 (no) |
| HK (1) | HK1091215A1 (no) |
| IL (1) | IL172119A (no) |
| MX (1) | MXPA05012663A (no) |
| NO (1) | NO334058B1 (no) |
| RU (1) | RU2373284C2 (no) |
| WO (1) | WO2004104037A1 (no) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007028655A2 (en) * | 2005-09-09 | 2007-03-15 | H. Lundbeck A/S | Drug discovery for neurodevelopmental disorders and their complications |
| WO2007030937A2 (en) * | 2005-09-16 | 2007-03-22 | Institut De Recherches Cliniques De Montreal/I.R.C.M. | Screening proteinase modulators using a chimeric protein and ski-i proprotein convertase substrates and inhibitors |
| KR100883158B1 (ko) * | 2005-10-26 | 2009-02-10 | 주식회사 뉴젝스 | 살아있는 세포에서 단백질분해효소의 활성 측정 방법 |
| JP2007300856A (ja) * | 2006-05-11 | 2007-11-22 | Hiroshi Mori | アミロイドタンパク質模倣物 |
| WO2008061673A2 (en) * | 2006-11-24 | 2008-05-29 | Synthon B.V. | Drug discovery for cancer |
| CN104880441B (zh) * | 2015-05-14 | 2017-12-22 | 上海皓拓生物技术有限公司 | β‑分泌酶特异性抑制剂的筛选方法及其筛选系统 |
| WO2017041037A1 (en) * | 2015-09-04 | 2017-03-09 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Disruption of the interaction between amyloid beta peptide and dietary lipids |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998015828A1 (en) * | 1996-10-07 | 1998-04-16 | Scios Inc. | Method to identify direct inhibitors of the beta-amyloid forming enzyme gamma-secretase |
| DE19849073A1 (de) * | 1998-10-24 | 2000-04-27 | Aventis Pharma Gmbh | Transgener C. elegans als Modellorganismus für Untersuchungen zur Alzheimer'schen Krankheit |
| DE19856261C1 (de) * | 1998-12-07 | 2000-03-30 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Aß-Peptid Screening Assay |
| DE19920514A1 (de) * | 1999-05-05 | 2000-11-16 | Boehringer Ingelheim Pharma | Methoden zur Auffindung von Proteasen, die spezifisch membrangebundene Substrate spalten |
| US7718391B2 (en) * | 2001-05-11 | 2010-05-18 | Medical Research Council | Assays for identifying modulators of rhomboid polypeptides |
-
2003
- 2003-05-26 EP EP20030011807 patent/EP1481987A1/en not_active Withdrawn
-
2004
- 2004-04-29 RU RU2005140567/13A patent/RU2373284C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2004-04-29 DE DE602004013440T patent/DE602004013440T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-29 JP JP2006529722A patent/JP4903046B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-04-29 ES ES04730223T patent/ES2307012T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-29 WO PCT/EP2004/004550 patent/WO2004104037A1/en active IP Right Grant
- 2004-04-29 BR BRPI0410736-5A patent/BRPI0410736A/pt not_active IP Right Cessation
- 2004-04-29 EP EP04730223A patent/EP1631584B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-29 MX MXPA05012663A patent/MXPA05012663A/es active IP Right Grant
- 2004-04-29 CN CN2004800142844A patent/CN1795203B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-04-29 CA CA2526790A patent/CA2526790C/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-04-29 AT AT04730223T patent/ATE393779T1/de not_active IP Right Cessation
- 2004-04-29 DK DK04730223T patent/DK1631584T3/da active
- 2004-04-29 AU AU2004241151A patent/AU2004241151B2/en not_active Ceased
- 2004-05-19 US US10/849,423 patent/US7892778B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-11-22 IL IL172119A patent/IL172119A/en not_active IP Right Cessation
- 2005-11-25 KR KR1020057022603A patent/KR101215855B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2005-12-19 NO NO20056029A patent/NO334058B1/no not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-10-25 HK HK06111751.0A patent/HK1091215A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1481987A1 (en) | 2004-12-01 |
| BRPI0410736A (pt) | 2006-06-27 |
| DE602004013440T2 (de) | 2009-05-20 |
| EP1631584A1 (en) | 2006-03-08 |
| KR101215855B1 (ko) | 2012-12-31 |
| AU2004241151B2 (en) | 2009-04-09 |
| KR20060015312A (ko) | 2006-02-16 |
| RU2005140567A (ru) | 2006-06-27 |
| EP1631584B1 (en) | 2008-04-30 |
| CA2526790A1 (en) | 2004-12-02 |
| NO20056029L (no) | 2006-02-24 |
| AU2004241151A1 (en) | 2004-12-02 |
| CA2526790C (en) | 2013-12-24 |
| JP4903046B2 (ja) | 2012-03-21 |
| US7892778B2 (en) | 2011-02-22 |
| HK1091215A1 (en) | 2007-01-12 |
| JP2008502302A (ja) | 2008-01-31 |
| RU2373284C2 (ru) | 2009-11-20 |
| CN1795203A (zh) | 2006-06-28 |
| DK1631584T3 (da) | 2008-09-01 |
| MXPA05012663A (es) | 2006-05-25 |
| CN1795203B (zh) | 2010-06-16 |
| ES2307012T3 (es) | 2008-11-16 |
| ATE393779T1 (de) | 2008-05-15 |
| US20050032150A1 (en) | 2005-02-10 |
| WO2004104037A1 (en) | 2004-12-02 |
| DE602004013440D1 (de) | 2008-06-12 |
| IL172119A (en) | 2010-12-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO334058B1 (no) | Prosess for deteksjon av gammasekretase aktivitet samt anvendelse derav | |
| US7109027B2 (en) | Aβ-Peptide screening assay | |
| Lamb et al. | Altered metabolism of familial Alzheimer's disease-linked amyloid precursor protein variants in yeast artificial chromosome transgenic mice | |
| Caldwell et al. | Suppression of polyglutamine-induced protein aggregation in Caenorhabditis elegans by torsin proteins | |
| Biederer et al. | Regulation of APP-dependent transcription complexes by Mint/X11s: differential functions of Mint isoforms | |
| Pellegrini et al. | PAMP and PARL, two novel putative metalloproteases interacting with the COOH-terminus of Presenilin-1 and-2 | |
| WO1999047640A1 (en) | Method for identifying proteases, protease target sites and regulators of protease activity in cells | |
| Cervantes et al. | Homodimerization of presenilin N-terminal fragments is affected by mutations linked to Alzheimer’s disease | |
| Jo et al. | Overexpression of calsenilin enhances γ-secretase activity | |
| US20030148356A1 (en) | Novel APP mutation associated with an unusual Alzheimer's disease pathology | |
| US20020025508A1 (en) | Process for finding a protease inhibitor | |
| DE60210266T2 (de) | Verfahren zum nachweis von modulatoren einer sekretaseaktivität | |
| Ghersi et al. | The intracellular localization of amyloid β protein precursor (AβPP) intracellular domain associated protein-1 (AIDA-1) is regulated by AβPP and alternative splicing | |
| US20060270841A1 (en) | Assays to monitor amyloid precursor protein processing | |
| Kim et al. | Drosophila homolog of APP-BP1 (dAPP-BP1) interacts antagonistically with APPL during Drosophila development | |
| US20030134323A1 (en) | Methods of identifying agents that affect cleavage of amyloid-beta precursor protein | |
| US20030036169A1 (en) | Methods for modulating transcriptional activation using mint proteins | |
| Gunyuzlu et al. | A yeast genetic assay for caspase cleavage of the Amyloid-β precursor protein | |
| US20130179998A1 (en) | Transgenic mouse model expressing amyloid beta 4-42 peptide | |
| US20040038338A1 (en) | Influence of LRP cytoplasmic domain on Abeta production | |
| US20100017894A1 (en) | Mutants of Human App and Their Use for the Production of Transgenice Animals | |
| WO2001049871A2 (en) | Process for finding a protease inhibitor | |
| MXPA01005486A (en) | A&bgr;-PEPTIDE SCREENING ASSAY | |
| Caldwell et al. | The role of the RING-finger protein Elfless in Drosophila spermatogenesis and apoptosis | |
| WO2004108079A2 (en) | Parkin-interacting proteins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |