DE60210266T2 - Verfahren zum nachweis von modulatoren einer sekretaseaktivität - Google Patents

Verfahren zum nachweis von modulatoren einer sekretaseaktivität Download PDF

Info

Publication number
DE60210266T2
DE60210266T2 DE60210266T DE60210266T DE60210266T2 DE 60210266 T2 DE60210266 T2 DE 60210266T2 DE 60210266 T DE60210266 T DE 60210266T DE 60210266 T DE60210266 T DE 60210266T DE 60210266 T2 DE60210266 T2 DE 60210266T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
secretase
protein
process according
invertase
activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE60210266T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60210266D1 (de
Inventor
Alcide Barberis
Michael Oliver MIDDENDORP
Urs LÜTHI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Esbatech a Novartis Co LLC
Original Assignee
Esbatech AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Esbatech AG filed Critical Esbatech AG
Publication of DE60210266D1 publication Critical patent/DE60210266D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE60210266T2 publication Critical patent/DE60210266T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96472—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein in vivo-Verfahren zur Identifizierung von Modulatoren von Sekretaseaktivitäten.
  • Stand der Technik
  • Proteinsekretion ist zentral für die einwandfreie Entwicklung und Funktion von eukaryontischen Organismen. Zudem sind verschiedene pathophysiologische Prozesse wie Neurodegeneration, Onkogenese, Apoptose und Entzündung assoziiert mit der Fehlfunktion oder der aberrierenden Regulation von Proteinsekretion. Es ist klar, dass es keinen einzigen biosynthetischen Mechanismus gibt, der allen sekretorischen Proteinen gemein ist. Sekretion von Proteinen kann entweder über regulierte oder konstitutive Wege geschehen, und in einigen Zelltypen kann diese Sekretion auf bestimmte zellulären Domänen polarisiert sein. Eine wachsende Anzahl von Proteinen sind jetzt erkannt als abgeleitet von integralen Membranproteinen mit Typ I und Typ II Topologie und in diesem Fall beinhaltet das sekretorische Ereignis deren selektive posttranslationelle Hydrolyse von der Zelloberfläche. Diese Sekretion ist durch Proteine katalysiert, die als Sekretasen bekannt sind. Die Spaltung von Membranproteinen geschieht im allgemeinen nahe der extrazellulären Seite der Membran, obwohl in einigen Fällen gezeigt wurde, dass sie auch innerhalb der Transmembrandomäne geschieht. Proteine, die in dieser Weise sekretiert werden, schliessen Membranrezeptoren und Rezeptorliganden, Ectoenzyme, Zelladhäsionsmoleküle und andere ein. Beispiele von Proteinsekretion durch die Wirkung von Sekretasen schliessen das vasoregulatorische Enzym ACE (angiotensin convering enzyme), den Tumor-Nekrose Faktor (TNF) Liganden und Rezeptoren-Superfamilien, den transformierenden Wachsumsfaktor α (Transforming Growth Factor-α), gewisse Cytokinrezeptoren, das Alzheimer-Amyloid-Vorläuferprotein (APP) und andere ein (7).
  • Die Beteiligung von Sekretasen an der Entwicklung von menschlichen Krankheiten macht diese zu möglichen Zielkandidaten für Arzneimittel in verschiedenen Krankheitsgebieten, einschliesslich Antikrebsmittel, kardiovaskuläre Arzneimittel, anti-neurodegenerative Arzneimittel und anti-inflammatorische Arzneimittel.
  • In der Vergangenheit wurden verschiedene in vitro/in vivo und biochemische Verfahren benützt, um Modulatoren von Sekretaseenzymen zu identifizieren.
  • US-Patent Nr. 5,942,400 und WO 96/40885 offenbaren in vitro-Verfahren für das Screening von Kandidaten-Arzneimitteln mit der Fähigkeit, die Aktivität von beta-Sekretasen zu hemmen. Diese Verfahren gründen auf der Detektion von APP-Spaltprodukten unter Verwendung von spezifischen Aktikörpern.
  • WO 98/13488 beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Modulatoren von APP-Sekretasen, die in gezüchteten menschlichen Zellen aktiv sind. Dieses Verfahren beinhaltet Transfektion von Gewebskulturzellen mit Vektoren, die spaltbare Reporterproteine exprimieren. Nach Spaltung durch die endogenen Sekretasen wird eine Reporterdomäne ausgeschieden und kann mittels standardbiochemischen und immunologischen Verfahren detektiert werden.
  • WO 01/49871 offenbart ein in vivo Verfahren um Substanzen zu finden, welche spezifisch die γ-Sekretase inhibieren. Dieses Verfahren umfasst Zellen, die eine Sekretaseaktivität exprimieren und ein Fusionsprotein, welches das Substrat dieser Sekretasen mit der spezifischen Schnittstelle und einen Reporter enthalten. Diese Zellen werden mit einer Testsubstanz kontaktiert, und die Menge an abgespaltenem Reporter wird entweder direkt oder indirekt gemessen. Geeignete Reporterproteine, die eine direkte Detektion gestatten, sind GFP, Luciferase, β-Galactosidase und sekretierte alkalische Phosphata se. Im Falle einer indirekten Detektion des Reporters ist der geschnittene Reporter ein Transkriptionsfaktor oder Teil eines Transkriptionsfaktors, welcher in den Zellkern wandert und die Expression eines Reporters, z.B. Luciferase induziert.
  • WO 01/75088 offenbart ein Verfahren zur Identifizierung von Modulatoren einer Sekretaseaktivität ("ein Interaktionspartner-Protein", Seite 5, Zeile 5; oder "ein Protein, das in der Lage ist, eine spezifische Sekretase zu prozessieren"; Seite 6, Zeile 33) in einem eukaryontischen Wirtszellsystem (Hefemutante). Diese Zellen exprimieren ein Transmembran-Fusionsprotein, das ein sekretorisches Invertase-Fragment umfasst, eine Sekretaseschnittstelle (a-Sekretase [recte: α-Sekretase]), und einen transkriptionellen Aktivator, der Teil eines stabil in das Wirtszellgenom integrierten Reportersystems ist (HIS3, zum Beispiel) (siehe Seite 5, Zeile 27, bis Seite 6, Zeile 24). Das sekretorische Fragment ist ein funktionelles Invertaseprotein (Aminosäuren 1-532 von SUC2), welches Sensitivität gegenüber einer Chemikalie (Saccharose, Glucose, Galactose) verleiht, ein zweites Reportergen darstellt, das Auxotrophie (SUC2) komplementiert und eine enzymatische Aktivität hat.
  • WO 00/34511 offenbart ein Verfahren zur Identifizierung von Modulatoren einer Sekretaseaktivität in einem eukaryontischen Zellsystem (siehe Seite 5, Zeile 15, bis Seite 8, Zeile 8; Seite 11, Zeile 23, bis Seite 12, Zeile 16; 1 und 2). Das Substrat ist ein Fusionsprotein, das ein sekretorisches Fragment, einen Membrananker und eine Schnittstelle (C100 Fragment von APP fusioniert mit GAL4-VP16 Aktivierungsdomäne) umfasst. Nach Abspaltung durch γ-Sekretase wird die GAL4-VP16 Aktivierungsdomäne zum Zellkern transloziert, wo sie ein Reportergen (GFP) unter der Kontrolle eines GAL4 Transkriptions-Aktivierungssystems aktiviert.
  • US 2002/025508 beschreibt ein ähnliches Verfahren um Inhibitoren von membrangebundenen Proteasen (einschliesslich Sekretasen) mit einem Fusionssubstrat zu identifizieren, welche ein APP-Fragment und ein GAL4-Fragment umfassen. Die γ-Sekretase enthält ein ER-Retentionssignal. Nach dem Schnitt wird das GAL4-Protein abgespalten und zum Zellkern transloziert, wo es die Transkription des Luciferase-Reportersystems aktiviert (siehe Zusammenfassung; Seiten 2-4; 1 und 2; Beispiel 3).
  • WO 01/62897 beschreibt ein Verfahren zur Identifizierung von Modulatoren von intramembranären protoiytischen Aktivitäten in einem eukaryontischen Wirtszellsystem (siehe Zusammenfassung; 4A; Beispiel 5). Ein APP-Notch Transmembran-Chimärenprotein wird als Substrat von γ-Sekretase verwendet; wenn das intrazelluläre Notch-Fragment durch Proteolyse freigesetzt wird, wird es zum Kern transloziert und aktiviert ein Luciferase-Reportersystem.
  • US-B 1-6333167 offenbart ein Verfahren, das dem gleichen Prinzip wie oben beschrieben folgt, aber ein unterschiedliches Chimärensubstrat verwendet: extrazelluläres und transmembranäres Fragment von P450, intrazelluläres lacI-NLS transkriptionelles Repressorfragment, beide Fragmente verbunden durch einen Proteaseschnittstellenstrang. Nach dem Schnitt wird das LacI-NLS-Fragment freigesetzt und zum Kern transloziert, wo es die Transkription des RSVO-Luciferase-Reportersystems reprimiert (siehe Zusammenfassung; 1 und 2; Spalte 3, Zeile 5, bis Spalte 4, Zeile 19; Spalte 8, Zeile 47, bis Spalte 10, Zeile 2).
  • Obschon der Stand der Technik bereits Screeningverfahren für Sekretasemodulatoren offenbart, besteht ein Bedarf für verbesserte, zuverlässige in vivo-Screeningsysteme zur Identifizierung von Modulatoren einer Sekretaseaktivität.
  • Darstellung der Erfindung
  • Deshalb ist es ein allgemeines Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Identifizierung/Isolierung von Modulatoren einer Sekretaseaktivität zur Verfügung zu stellen. Dieses Verfahren ist durch die folgenden Schritte definiert:
    geeignete eukaryontische Wirtszellen, welche mit einer Testsubstanz kontaktiert werden, wobei diese Wirtszellen umfassen:
    • a) ein Fusionsprotein umfassend ein sekretorisches Protien, eine Membrananker-Domäne und mindestens eine Sekretaseschnittstelle,
    • b) ein Protein umfassend eine Sekretaseaktivität, welche die Schnittstelle des Fusionsproteins erkennt und
    • c) mindestens ein Reportergen unter der Kontrolle eines transkriptionellen Aktivierungssystems, wobei dieses transkriptionelle Aktivierungssystem dadurch reguliert wird, dass das sekretorische Protein durch die Sekretaseaktivität von dem Fusionsprotein abgespalten und anschliessend ausgeschieden wird
    dann Züchten dieser Zellen unter geeigneten Bedingungen, so dass das Reportergen, welches die Detektion und/oder das Überleben der Zellen gestattet, nur in einer Weise exprimiert oder reprimiert wird, die von einer durch die Testsubstanz veränderten Sekretaseaktivität abhängig ist.
  • In einer bevorzugten Ausführung bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Identifizierung eines Sekretaseinhibitors. Dieses Verfahren ist charakterisiert dadurch, dass verminderte oder keine Freisetzung des Sekretionsproteins von dem Fusionsprotein aufgrund einer verminderten/gehemmten Sekretaseaktivität zu einer verminderten oder zu keiner Sekretion des sekre torischen Proteins und zur Induktion der Expression dieses Reportergens führt. Die Induktion der Expression dieses Reportergens gestattet unter geeigneten Kulturbedingungen die Detektion und/oder das Überleben von Zellen, welche in Kontakt mit einer Testsubstanz, die einen hemmenden Effekt auf die Sekretaseaktivität hat sind.
  • Das Reportergen ist vorzugsweise ausgewählt aus Genen die Antibiotikaresistenz verleihen, Genen, die Auxotrophien komplementieren und Genen, die Reportermoleküle mit einer Aktivität codieren, welche durch kolorimetrische oder Fluorezenzverfahren detektiert werden kann, wie z.B. Gene ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: LacZ, Luciferase-Gen, Gen für das grün fluoreszierende Protein und Chloramphenicol Acetyltransferase-Gen.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Identifizierung von Stimulatoren einer Sektretaseaktivität. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Abspalten des sekretorischen Proteins von dem Fusionsprotein aufgrund einer erhöhten Sekretaseaktivität zur Repression der Expression des Reportergens führt, wodurch Detektion und/oder Überleben von Zellen gestattet wird, welche in Kontakt mit einer Testsubstanz sind, die einen stimulierenden Effekt auf die Sekretaseaktivität hat. Geeignete Kulturbedingungen der Zellen müssen verwendet werden, so dass das Fusionsprotein in Abwesenheit von jener Testsubstanz, die einen stimulatorischen Effekt auf die Sekretaseaktivität hat, durch die Sekretase nicht effizient geschnitten wird.
  • Das Reportergen ist vorzugsweise ausgewählt aus den Genen wie CYH2 oder CAN1, welche Sensitivität gegenüber einer Chemikalie verleihen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthalten geeignete Wirtszellen ein zweites Reportergen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
    • a) Genen codierend für Reportermoleküle mit einer Aktivität, die detektiert werden kann durch kolorimetrische oder Fluoreszenzverfahren wie z.B. Gene ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: lacZ, Luciferase-Gen, Gen für das grün fluoreszierende Protein (GFP) und Choramphenicol Acetyltransferase-Gen (CAT),
    • b) Gene die Antibiotikaresistenz verleihen, c) Gene die Sensitivität gegenüber einer Chemikalie verleihen und
    • d) Gene die Auxotrophien komplementieren.
  • Anschauliche Beispiele von geeigneten Reportergenen, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden können, sind oben erwähnt.
  • In einem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann irgend eine eukaryontische Zelle benützt werden, vorzugsweise eine Hefezelle.
  • Der Ausdruck Membrananker-Domäne, wie hier benützt, bezieht sich auf Moleküle und/oder Proteindomänen, welche für die Verbindung eines Proteins mit der Membran verantwortlich sind und schliesst z.B. Transmembran-Domänen und GPI Anker mit ein.
  • Der Ausdruck sekretorisches Protein, wie hier benützt, umfasst Polypeptide oder Fragmente davon, welche für den Export bestimmt sind. Ein solches sekretorisches Protein hat vorzugsweise eine enzymatische Aktivität, stärker bevorzugt ist es ein Protein mit Invertaseaktivität oder funktionelle Fragmente eines Proteins mit Invertaseaktivität. Eine speziell bevorzugte Invertase ist eine Hefeinvertase oder funktionelle Fragmente davon. Es ist jedoch klar für den Fachmann, dass in einem Verfahren der vorliegenden Erfindung andere sekretorische Proteine benützt werden können.
  • Irgendeine Erkennungssequenz einer bekannten Sekretase kann für die Konstruktion des besagten Fusions proteins der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Vorzugsweise sind Sekretase-Erkennungsstellen ausgewählt aus der β-Stelle und der α-Stelle des menschlichen Amyloidvorläuferproteins (APP) und der S2-Stelle des Notch 1 Proteins. Eine sehr bevorzugte Erkennungsstelle ist die β-Stelle des humanen APP in welcher die Änderungen Lys595Asn und Met596Leu eingeführt worden sind (Schwedische APP-Mutante).
  • In einer sehr bevorzugten Ausführung der Erfindung umfasst das Fusionsprotein die Aminosäurenreste 1-532 von Hefeinvertase, die Aminosäurenreste 590-695 des menschlichen APP und gegebenenfalls ein ER-Retentionssignal.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführung umfasst das Fusionsprotein die Aminosäurenreste 1-532 von Hefeinvertase, die Aminosäurenreste 1714-1976 des humanen Notch 1 und gegebenenfalls ein ER-Retentionssignal.
  • Das Fusionsprotein kann von einem extrachromosomalen Genkonstrukt, z.B. von einem episomalen Vektor exprimiert werden, der die Expression des Fusionsproteins in einer Wirtszelle ermöglicht. Vorzugsweise ist das Nukleinsäurenkonstrukt, das das Fusionsprotein codiert, in das Genom der Wirtszelle integriert. Die Nukleinsäure kann durch irgend ein Transfektionsverfahren, das zur Aufnahme der Nukleinsäurensequenz in die Zelle führt, in die Zelle eingeführt werden. Solche Verfahren sind dem Fachmann bekannt und sind beispielsweise beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 2001.
  • Der Ausdruck Sekretaseaktivität, wie er hier benützt wird, umfasst proteolytische Enzyme oder funktionelle Fragmente davon, welche membranassoziierte Proteine und integrale Membranproteine mit Typ I oder Typ II Topologie spalten.
  • In einer bevorzugten Ausführung umfasst das eine Sekretaseaktivität aufweisende Protein weiter eine ER-Signalsequenz.
  • Bevorzugte Sekretaseaktivitäten für die vorliegende Erfindung sind ausgewählt aus β-Sekretase und α-Sekretase von menschlichem APP.
  • In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung umfasst das eine β-Sekretaseaktivität aufweisende Protein weiter eine ER Signalsequenz und Aminosäurenreste 616-695 von menschlichem APP.
  • Das Protein, das diese Sekretaseaktivität umfasst, kann endogen von der Wirtszelle exprimiert werden, oder es kann durch ein Nukleinsäurekonstrukt, z.B. einen episomalen Expressionsvektor oder durch ein Nukleinsäurenkonstrukt, welches stabil in das Genom der Wirtszelle integriert ist, codiert sein.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die Erfindung wird besser verstanden und andere Gegenstände als jene die oben vorgebracht worden sind werden offensichtlich, wenn die folgende detaillierte Beschreibung davon in Betracht gezogen wird. Eine solche Beschreibung bezieht sich auf die angehefteten Zeichnungen, worin
  • 1 die Primärstruktur und das zelluläre Prozessieren von APP zeigt. APP wird prozessiert durch eine Abfolge von Schnittreaktionen während des Durchlaufens des sekretorischen Wegs. Der α-Sekretaseweg ist der bevorzugte konstitutive Weg, der in Kombination mit der γ-Sekretase ein nicht toxisches p3-Fragment freisetzt. In Alzheimerpatienten wird der α-Sekretaseweg durch den Amyloid generierenden β-Sekretaseweg, worin nach Spaltung durch die γ-Sekretase die Sekretion des Aβ-Peptids zur Bildung von extrazellulären Plaques führt, konkurrenziert;
  • 2A zeigt das Invertase-Selektionssystem. Ein Anteil an APP, der die α- und die β-Stelle enthält, ist fusioniert zu dem Enzym Invertase. Die β-Sekretase (BACE) wird co-exprimiert mit dem Invertase-APP- Fusionsprotein. Der Schnitt des Invertase-APP-Reporters an der β-Stelle setzt die Invertase frei. Sekretion der Invertase führt zum Spalten von Saccharose in Glucose und Fructose, was das Wachstum auf Saccharose-Platten erlaubt;
  • 2B zeigt eine schematische Zeichnung des Invertase-APP-Reporters. Der Invertase-APP-Reporter wurde durch Fusionieren der Invertase in voller Länge (Aminosäuren 1-532) mit einem Teil des APP (Aminosäuren 590-695) konstruiert, welches die Sekretasestellen, die Transmembran-Domäne und den cytoplasmatischen Schwanz enthält. Fusion des ER-Retentionssignals DEKKMP (Seq. ID No. 1) mit dem C-Terminus verlangsamt ausserdem das Wachstum von Klonen welche keine aktive Sekretase exprimieren;
  • 2C zeigt eine schematische Zeichnung des konstruierten BACE. Die Signalsequenz von BACE wurde durch die SUC2 Signalsequenz (Aminosäuren 1-19) ersetzt, um eine effiziente Translokation in das ER von Hefe sicherzustellen. Um Co-Lokalisierung von BACE mit dem Invertase-APP-Fusionsprotein zu erreichen, wurde der C-Terminus von BACE durch einen Teil von APP, der die Transmembran-Domäne und den cytosolischen Schwanz (Aminosäuren 616-695) enthält, ersetzt;
  • 2D zeigt, dass BACE das Wachstum auf Saccharoseplatten erhöht. Das Invertase-APP Fusionsprotein, welches die schwedische Mutation enthält, wurde mit den bezeichneten Konstrukten co-exprimiert [BACE, leerer Vector oder Yap3p (eine Hefesekretase, welche APP spezifisch an der α-Stelle schneidet)] in einem Hefestamm, der für das suc2-Gen und die endogenen α-Sekretasen mkc7 und yap3 defekt ist. Wachstum auf Saccharoseplatten wurde nach 2.5 Tagen resp. 3 Tagen gemessen;
  • 3 zeigt Prinzipien eines zellulären Selektionssystems zur Identifizierung von Sekretasemodulatoren. 3A-C zeigen schematische Zeichnungen von Hefezellen. Das Reportergen ist entweder das LacZ oder ver schiedene selektierbare Marker-Gene, welche entweder positiv oder negativ auf das Wachstum wirken. Diese Gene sind unter der Kontrolle des Gal1/10 Promotors (bezeichnet durch den GAL4 Transkriptionsfaktor);
  • 3A zeigt „Standardanzeigen" (ohne BACE): das Reportergen ist induziert. Biscre1-Zellen, welche das Invertase-APP-Fusionsprotein enthalten, exprimieren in Abwesenheit von Sekretaseaktivität das Reportergen, wenn sie auf 5 % Saccharose/2 % Galactose angezogen werden. Galactose aktiviert Transkription der Reportergene, wohingegen Saccharose in Abwesenheit von ausgeschiedener Invertase gegenüber dem System inert ist;
  • 3B zeigt dass das Reportergen in Anwesenheit eines aktiven BACE reprimiert ist. Das Schneiden der Invertase-APP (Sw) durch die β-Sekretase führt zur Freisetzung und nachfolgenden Sekretion der Invertase. Im Periplasma hydrolysiert Invertase Saccharose zu Glucose und Fructose. Die erhaltene Glucose wird durch die Zelle aufgenommen, wo sie dominant die Transkription des Reportersystems reprimiert;
  • 3C zeigt, dass in Anwesenheit einer gehemmten BACE das Reportergen induziert wird. Wenn die Wirkung von BACE durch einen potenten Inhibitor blockiert wird, ist der Anzeige des Systems gleich wie in Abwesenheit von BACE (beschrieben in 3A);
  • 4A zeigt eine schematische Darstellung des Reportergens. Das HIS3 offene Leseraster (ORF) wurde mit den 47 N-terminalen Aminosäuren von GAL10 fusioniert. Die Expression des GAL10-HIS3-Fusionsproteins ist unter der Kontrolle des GAL10-Promotors, die Expression des LacZ ORF ist kontrolliert durch den GAL1-Promotor. Die Pfeile bezeichnen die Startpunkte der Transkription. Die mit I, II, III und IV bezeichneten Boxen stellen GAL4-Bindungsstellen dar;
  • 4B zeigt LacZ-Versuche. Biscre1-Zellen, welche die angegebenen Produkte enthalten, wurden in 5 Saccharose, 2 % Galactose -ura -trp Mangelmedium kulti viert. Expression des LacZ-Reportergens wurde über das β-Galactosidasesubstrat ONPG quantifiziert. Die Spalten stellen die durchschnittlichen β-Galactosidase-Einheiten von jeweils drei Proben dar. Fehlerschranken sind angegeben. Invertase: lösliche und ausgeschiedene Invertase; Invertase-APP: dargestellt in 2B; Invertase-APP(Sw): gleich wie Invertase-APP, aber mit der schwedischen Mutation an der β-Stelle; BACE: dargestellt in 2C; BACEi: gleich wie BACE, aber mit einer Punktmutation im aktiven Zentrum, welche das Enzym inaktiviert. Die Konstrukte, die mit "leer" bezeichnet sind, tragen nur Hefe-Markergene, die für das Wachstum im Mangelmedium nötig sind.
  • 4C zeigt Flüssigwachstumsversuche. Biscrel-Zellen, welche die bezeichneten Konstrukte enthalten, wurden in nicht selektivem -ura -trp 2 % Glucose Medium und in selektivem -his -ura -trp 5 % Saccharose 2 % Galactose Medium gezüchtet. Nach 24 Stunden wurde die Zelldichte der Kulturen durch Messung der optischen Dichte (OD600) bestimmt. Die Zelldichte im selektiven Medium ist ein Indikator für die Expression des HIS3-Gens. Zur Erklärung der verschiedenen Konstrukte siehe Legende von 4B. Für die selektiven Kulturen ist die durchschnittliche OD600 von drei Kulturen dargestellt. Die Standardabweichung ist mit einem Fehlerbalken bezeichnet.
  • 5 zeigt dass das Spalten der Invertase-APP durch die Hefesekretase Yap3p mit dem zellulären System zur Identifizierung von Modulatoren von Sekretasen verfolgt werden kann. Induktion von Reportergen-Expression (LacZ) wurde in einem LacZ-Versuch gemessen.
  • 6 zeigt eine schematische Zeichnung des Invertase-Notch 1-Reporters. Der Invertase-Notch 1-Reporter wurde konstruiert durch Fusionieren der Invertase in voller Länge (Aminosäuren 1-532) mit einem Teil von Notch 1 (Aminosäuren 1714-1876), welcher die S2-Stelle, die Transmembran-Domäne und den cytoplasmatischen Schwanz des Notch 1-Proteins enthält. Die Fusion des ER-Reten tionssignales DEKKMPO (Seq. ID. No. 1) mit dem C-Terminus verzögert das Wachstum von Klonen weiter, welche keine aktive Sekretase exprimieren und
  • 7 zeigt, dass das Spalten von Invertase-Notch durch die Hefe α-Sekretase Yap3p mit dem zellulären System zur Identifizierung von Modulatoren von Sekretasen verfolgt werden kann. Induktion der Expression des Reportergens (LacZ) wurde in einem LacZ-Versuch gemessen.
  • Wege zur Ausführung der Erfindung
  • Ein Reportergen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist unter der Kontrolle eines transkriptionellen Aktivierungssystems. Ein bevorzugtes transkriptionelles Aktivierungssystem ist ein GAL-Genregulationssystem, stärker bevorzugt ein Hefe-GAL-Genregulationssystem.
  • In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung ist diese Reportergen unter Kontrolle der Hefe-GAL1-10-genregulatorischen Region.
  • Die Verwendung dieses Systems in einer bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung hat den folgenden theoretischen Hintergrund:
    Das bevorzugte Kohlenhydrat von Hefezellen ist Glucose, weil sie direkt metabolisiert werden kann. Andere Kohlenhydrate werden in mehreren Schritten in das glycolytische Substrat Glucose-1-Phosphat umgewandelt. Zugabe von Galactose zu Hefekulturen, die in Glycerol gezüchtet wurden, induziert die Expression der GAL-Gene mindestens 1000-fach. Wenn Glucose zu den Galactose enthaltenden Medien gegeben wird, werden die GAL-Gene nur zu 1 % der Werte induziert, die mit Galactose allein erhalten werden. Dieses Phänomen ist als Glucoserepression bekannt. GAL2, GAL1-GRL7-GAL10, und MEL1 sind die GAL-Strukturgene. Ihre Produkte transportieren Galactose in die Zelle und wandeln sie zu Glucose-1-Phosphat um. Die hauptsächlichen Regulationsproteine dieses Systems sind die Produkte der Gene GAL3, GAL4 und GAL80. Gal4p, das Produkt des GAL4-Gens, ist ein transkriptioneller Aktivator der spezifische regulatorische DNA-Elemente genannt UASG bindet, welche in der Nähe der Promotorregionen von Galactose induzierbaren Genen vorhanden sind. Seine Aktivität wird benötigt um die Expression der GAL-Gene in Anwesenheit von Galactose zu stimulieren. Gal80p ist ein direkter Repressor von Gal4p, währenddem Gal3p das Aufheben der Glactose abhängigen Gal80p Inhibition von Gal4p steuert (für ein Review siehe [5)).
  • Die Glucoserepression wird durch verschiedene Mechanismen ausgeübt [5]. Hier beschränken wir uns auf die Regulation von divergent orientierten GAL1-10-Genen, von welchen die regulatorische Region für die unten beschriebenen Experimente benützt wurde. Die GAL1-10 regulatorische Region enthält vier UASG-Elemente, die zwischen den divergenten Promotoren GAL1 und GAL10 liegen. Diese UASG-Elemente sind durch Gal4p in kooperativer Weise gebunden. Wegen dieser Kooperativität ist das System ziemlich sensitiv gegenüber Änderungen in der Konzentration von Gal4p, welches in Anwesenheit von Glucose 3- bis 5-fach reduziert ist. Gal80p trägt signifikant bei zur Glucoserepression der GAL1-10-Gene, indem es Gal4p bindet um dessen Aktivierungsdomäne zu maskieren, wodurch die Expression dieser GAL-Gene verhindert wird [6]. Der GAL1-Promotor enthält ein zusätzliches regulatorisches Element, nämlich die Bindestelle für den Repressor Mig1p. Die Aktivität dieses Repressors ist also durch Glucose reguliert. (Eine Mig1p-Stelle ist auch in dem GAL4-Promotor vorhanden.)
  • Die Konstruktion von geeigneten Wirtszellen und die anderen molekularbiologischen Reagenzien für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung, z.B. Fusionsproteinskonstrukte, können hergestellt werden, indem standardbiologische Techniken, wie sie z.B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 2001, beschrieben sind verwendet werden.
  • Der Fachmann ist ebenso fähig, geeignete Wachstumsbedingungen zu bestimmen, welche die Detektion und/oder das Überleben der verwendeten Zellen erlauben. Diese Bedingungen sind abhängig von den verwendeten genetischen Konstrukten und den Wirtszellen.
  • Es gibt mindestens drei verschiedene Kategorien von Stoffen, die durch ein Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung gesucht werden können: chemische Bibliotheken, Bibliotheken von natürlichen Produkten und kombinatorische Bibliotheken. Chemische Bibliotheken bestehen aus Strukturanaloga von bekannten Chemikalien. Bibliotheken von natürlichen Produkten sind Sammlungen von Mikroorganismen, Tieren, Pflanzen oder Meeresorganismen, welche verwendet werden, um Mischungen für Screenings herzustellen, z.B. durch Fermentation und Extraktion von Brühen aus dem Boden, aus Pflanzen oder aus Meeresmikroorganismen, oder durch Extraktion von Pflanzen oder Meeresorganismen. Kombinatorische Bibliotheken bestehen aus einer grossen Zahl von Peptiden, Oligonukleotiden oder organischen Molekülen in einer Mischung. Sie sind relativ einfach herzustellen z.B. durch traditionelle Syntheseverfahren, PCR oder Klonierung.
  • In einem Screeningtest der vorliegenden Erfindung kann eine Testsubstanz z.B. zu dem Kulturmedium der Wirtszellen zugefügt werden, oder sie kann durch die Wirtszellen exprimiert werden, z.B. von einem Expressionskonstrukt. Die Expression von Testsubstanzen in den Wirtszellen ist z.B. geeignet für das Screening von Peptidbibliotheken.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun weiter veranschaulicht durch Beispiele.
  • Rekonstitution von Sekretaseaktivitäten in Hefe
  • Um BACE-Aktivität in Hefezellen zu messen, machten wir Gebrauch vom Invertasereportersystem, das in unserer Patentanmeldung WO 01/75088, Titel: "Method for identification of polypeptides with protease activity" beschrieben worden ist.
  • Sekretion von Invertase befähigt Hefe Saccharose als Kohlenstoffquelle zu benützen. Die Invertase hydrolysiert Saccharose, um Fructose und Glucose zu bilden. Für das Reportersystem, das in unserer Patentanmeldung WO 01/75088 beschrieben ist, wurde das endogene Gen, das die Invertase (das SUC2-Gen) codiert, ausgeschaltet. Eine rekombinante Invertase wurde fusioniert mit dem N-Terminus eines Anteils von APP, der sowohl die transmembrane Domäne als auch die α- und β-Stelle (Reste 590-695) enthält. Zusätzlich wurde ein ER-Retentionssignal zum C-Terminus dieses Fusionskonstruktes hinzugefügt (2A, B). Diese Änderungen verhindern, dass Invertase sekretiert wird, und infolgedessen sind die Hefezellen unfähig, auf Platten, die Saccharose als einzige C-Quelle enthalten, effizient zu wachsen. Das hier beschriebene System basiert auf der Beobachtung, dass nach dem Abspalten des APP-Anteils an der α- oder β-Stelle die Invertase freigesetzt und in die extrazelluläre Umgebung ausgeschieden wird, wo sie Saccharose zu Fructose und Glucose hydrolysiert.
  • Es gibt zwei in der Literatur beschriebene endogene Hefesekretasen, welche APP an der α-Stelle schneiden können: Yap3p und Mkc7 [1, 2]. Weil diese Proteine α-Sekretaseaktivität haben, die APP konstitutiv schneidet, mussten deren Gene ausgeschaltet werden, um die β-Sekretaseaktivität in Hefe unter Gebrauch des Invertase-Reportergens, das in WO 01/75088 beschrieben ist zu untersuchen.
  • Um APP-spezifische BACE-Aktivität in Hefezellen zu detektieren, musste das Protein modifiziert werden. Weil transmembrane und cytosolische Sequenzen zur subzellulären Lokalisierung von Transmembran-Proteinen beitragen, wurden die transmembranen und cytosolischen Anteile von BACE ersetzt durch die transmembranen und cytosolischen Anteile von APP ersetzt. Auf diese Weise wurde die Co-Lokalisierung des Enzyms mit seinem Substrat erleichtert. Um effiziente Translokation in das Hefe-ER sicherzustellen, wurde die Signalsequenz von BACE durch das SUC2-Signalpeptid am N-Terminus des Proteins ersetzt (2C). Weil BACE das Wildtyp-APP weniger effizient schneidet als die sogenannte schwedische APP-Mutante [3], wurde die β-Stelle des Invertase-APP (590-695) Reporterkonstruktes so verändert, dass die Austausche Lys595Asn und Met596Leu eingeführt wurden, was als Invertase-APP(Sw) bezeichnet wurde. 2D zeigt den Wachstumseffekt auf Saccharose Platten aufgrund der Spaltungs des Invertase-APP(Sw) Reporterproteins durch BACE oder Yap3p.
  • Zelluläres System für das Screening von Sekretaseinhibitoren
  • Um das beschriebene zelluläre System für das Screening von BACE-Inhibitoren aufzustellen, kombinierten wir das BACE-abhängige Invertase-Sekretionssystem mit dem endogenen GAL-Genregulationsnetzwerk.
  • Ein Reporterkonstrukt wurde kloniert, welches das LacZ-Gen unter der Kontrolle des GAL1-Promotors und das divergent orientierte HIS3-Gen unter der Kontrolle des GAL10-Promotors exprimiert. Wie im Falle der endogenen GAL1 und GAL10-Gene sind vier UASG-Elemente zwischen diesen beiden Promotoren lokalisiert. Um den Stamm Biscrel herzustellen, wurde dieses Reporterkonstrukt in Hefezellen integriert, die defekt für suc2, mkc7 und yap3 sind. Wenn dieser Stamm in Anwesenheit von Galactose gezüchtet wird, wird Expression des LacZ-Gens und des HIS3-Gens durch den UASG-bindenden Aktivator Gal4p induziert. Wie im Falle der endogenen GALT und GAL10-Gene werden diese Reportergene nach Zugabe von Glucose zum Medium dominant reprimiert. Das Produkt des HIS3-Gens wird benö tigt für Wachstum auf Histidin-Mangelmedium (-his). Infolgedessen kann Biscre1 nur auf -his-Medium wachsen, welches Galactose aber keine Glucose enthält. Das HIS3-Reportergen des Stammes Biscre1, dem die endogene Invertaseaktivität fehlt, wird ebenfalls durch Gal4p induziert, wenn diese Zellen in Anwesenheit von Saccharose zusammen mit Galactose wachsen (3A). Wenn jedoch Biscre1 Invertase sekretieren kann, wird Glucose durch die Hydrolyse von Saccharose erzeugt. Als Folge davon reprimiert die neu erzeugte Glucose dominant das HIS3-Gen, das vom GAL10-Promotor exprimiert wird, und Wachstum auf -his Medium ist gehemmt.
  • Biscre1, das auf Saccharose und Galactose gezüchtet ist und das Invertase-APP(Sw) Fusionsprotein exprimiert ist ein Werkzeug um auf gehemmte BACE zu selektieren. Wenn in Biscre1 exprimierte BACE aktiv ist, wird in der Tat das membranverankerte Invertase-APP(Sw) Fusionsprotein an der β-Stelle geschnitten und der Invertaseteil ausgeschieden. Die ausgeschiedene Invertase hydrolysiert Saccharose zu Fructose und Glucose, wobei letztere die HIS3- und LacZ-Reportergene reprimiert (3B). Wenn BACE entweder durch Mutationen oder durch eine hemmende Substanz inhibiert ist, bleibt der Invertaseteil mit der ER-Membran über die APP-Domäne verankert, die Saccharose im Medium wird nicht hydrolysiert und die Expression der HIS3 und LacZ-Gene ist durch Galactose induziert (3C).
  • Resultate
  • Expression des LacZ-Genprodukts, einer β-Galactosidase, kann unter Verwendung des Substratanalogons o-Nitro-phenyl-β-galactopyranosid (ONPG) gemessen werden. Ein Spaltprodukt von ONPG ist gelb. OD-Messungen bei 420 nm gestatten die Quantifizierung der durch β-Galactosidase katalysierten Reaktion und indirekt der LacZ-Expression. Dieser Versuch erlaubte uns den Effekt des Schnittes von Invertase-APP durch BACE im Zusammenhang mit Biscre1 zu untersuchen.
  • Biscre1 wurde transformiert mit Plasmiden, die verschiedene β-Sekretaseaktivitäten zusammen mit dem Invertase-APP (Sw)-Konstrukt, oder seiner Wildtypvariante (Invertase-APP) exprimierten. Leere Plasmide und ein Plasmid, das eine Invertase exprimiert, wurden als negative bzw. positive Kontrollen verwendet. Flüssigkulturen wurden in 5 % Saccharose, 2 % Galactose, 0,1 % Glucose-Mangelmedium gezüchtet (das Medium enthielt in diesem Versuch Histidin, weil die Kulturen gleichmässig wachsen sollten). Die maximale Menge an LacZ-Expression in diesem Versuch wurde mit Transformanden erhalten, die zwei leere Plasmide enthielten. In diesen Zellen war keine Invertaseaktivität vorhanden und deshalb wurde in Anwesenheit von Saccharose keine Glucose produziert. Auf diese Weise wurden Werte von > 0,6 β-Galactosidase Einheiten gemessen (4B, Spalte 1). Expression von löslicher und ausgeschiedener Invertase resultierte in einer starken Repression der Reportergene (4B, Spalte 2). Expression des Invertase-APP(Sw) Fusionsproteins alleine resultierte in einer β-Galactosidase-Aktivität von 0,25 Einheiten (4B, Spalte 3). Expression des Invertase-APP-Wildtyproteins resultierte in einer vergleichbaren Menge an LacZ-Genaktivierung (4B, Spalte 4). Die 2-3-fache Reduktion an LacZ-Expression, die in Anwesenheit dieser Ivertasefusionsproteine beobachtet wurde, ist wahrscheinlich eine Folge des restlichen Vorkommens des Invertaseanteils an der Oberfläche der Zelle. Dies könnte verursacht sein durch einen kleinen Anteil des Fusionsproteins, welches die Zelloberfläche erreicht oder durch eine verbleibende endogene Sekretaseaktivität, die in der Zelle anwesend ist, obschon die beiden hauptsächlichen endogenen α-Sekretasen Yap3p und Mkc7p ausgeschaltet worden waren.
  • Co-Expression von BACE mit dem Invertase-APP (Sw)-Fusionsprotein führte zu einer signifikanten Reduk tion der β-Galactosidaseaktivität (0,026 β-Galactosidaseeinheiten, 4B, Spalte 5), währenddem Co-Expression mit dem Konstrukt das die APP-Wildtypsequenz enthielt (Invertase-APP), nur in einer leichten Reduktion (4B, Spalte 6) resultierte. Eine katalytisch inaktive Version von BACE (BACEi) verhielt sich ähnlich wie wenn ein leeres Plasmid zusammen mit der einen oder der anderen dieser Fusionskonstrukte exprimiert wurde (4B, Spalten 7, 8).
  • Diese Resultate zeigen, dass der Expressionsgrad des Reportergensystems von der Anwesenheit von freigesetzter Invertase abhängig ist. Freie Invertase wurde entweder durch direkte Expression des natürlichen SUC2-Gens oder durch Freisetzen von dem membrangebundenen Fusionsprotein erzeugt. Das Freisetzen und die folgende Sekretion des Invertaseteils erfolgte nur effizient, wenn die aktive BACE-Sekretase mit dem Invertase-Fusionsprotein, das die schwedische Mutation enthielt, co-exprimiert wurde, womit die Spezifität des Systems unterstrichen wird.
  • Die Expression des HIS3-Gens wurde durch einen Wachstumsversuch in Flüssigmedium quantifiziert. Für diesen Versuch wurde Biscre1-Zellen in flüssigem -his Medium kultiviert, das 5 % Saccharose und 2 % Galactose (selektive Bedingungen) enthielt. Zwei-ml-Kulturen wurden mit gleichen Zellmengen beimpft, die mit den Konstrukten von Interesse transformiert worden waren. Die Zelldichte wurde nach 24 Stunden gemessen. Die gleichen Zellmengen wurden verwendet, um Kulturen in nicht-selektives Medium zu überimpfen. Dieses Kontrollexperiment zeigte, dass keines der Konstrukte per se einen Effekt auf Zellwachstum unter nicht-selektiven Bedingungen hatte (4C; Spalten 1-4). Die Zelldichten, die nach Wachstum in selektivem Medium gemessen wurden, sind in 4C, Spalten 5-8 dargestellt. Biscre1, das zwei leere Plasmide enthielt, induzierte das HIS3-Gen vollständig und konnte unter selektiven Bedingungen wachsen (4C, Spalte 5).
  • Die Zelldichte dieser Kultur war vergleichbar mit jener von allen Kulturen, die in nicht selektivem Medium gezüchtet wurden. Die Zellen, die mit dem Invertase-APP(Sw)-Konstrukt, zusammen mit einem zweiten Plasmid oder mit dem inaktivierten BACE transformiert waren, wuchsen zu einer Dichte von ungefähr 75 % jener, die mit zwei leeren Plasmiden erreicht wurde (4, Spalten 6, 7). Expression von aktiver BACE zusammen mit dem Invertase-APP(Sw)-Fusionsprotein verminderte Zellwachstum um ungefähr 10 % des Wertes der mit inaktiviertem BACE erhalten wurde (4C, Spalte 8). Deshalb stellt dieser Versuch ein Werkzeug zum Screenen von Stoffbibliotheken zur Verfügung, um BACE-Inhibitoren zu identifizieren, die in einer eukaryontischen zellulären Umgebung aktiv sind und nicht grundlegende zelluläre Funktionen in negativer Weise beeinflussen.
  • Das Screeningsystem ist ebenfalls geeignet um Modulatoren von anderen Sekretasen zu suchen. 5 zeigt die Resultate eines solchen Experimentes. Yap3p ist eine Hefe Sekretase, welche APP an der α-Stelle schneidet. Die experimentellen Verfahren waren die gleichen wie für 4B beschrieben. Das mutierte Yap3p und die Wildtypversion wurden auf einem Hefe-Expressionsvektor zur Verfügung gestellt. Yap3p schneidet das Invertase-APP-Fusionsprotein an der α-Stelle, wobei die Invertase freigesetzt wird. Der beobachtete Effekt auf LacZ-Expression ist vergleichbar zu dem Effekt der beobachtet wurde, wenn lösliche und ausgeschiedene Invertase exprimiert wurden (letzte Spalte).
  • Um die allgemeine Anwendbarkeit unseres Systemes weiter zu untersuchen, wurde ein anderes Zielprotein, nämlich das menschliche Notch 1 Protein mit der Invertase fusioniert (6). Die Eigenschaften dieses neuen Konstruktes sind identisch mit jenen des Invertase-APP Fusionsproteins, ausser dass der APP-Teil durch die Aminosäuren 1714-1876 des Notch 1-Proteins (NCBI Protein Datebank accession number AAG33848) ersetzt ist, welche die Transmembran-Domäne einschliessen. Das Invertase-Notch-Konstrukt wurde mit Yap3p (α-Sekretase) oder mit einem leeren Vektor in dem Biscre1 Stamm co-exprimiert, und ein β-GalactosidaseVersuch wurde durchgeführt. Die Resultate dieses Experimentes sind in 7 dargestellt. Die erste Spalte bezeichnet den Wert der mit leerem Vektor (0,4532 β-Gal-Einheiten) erhalten wurde; die zweite Spalte bezeichnet den Wert, der mit Yap3p (0,0724 β-Gal-Einheiten) erhalten wurde. Die Spaltung des Invertase-Notch-Fusionsproteins wurde durch Detektion des Spaltproduktes in einem Westernblott bestätigt (Daten nicht gezeigt).
  • Während derzeit bevorzugte Ausführungen der Erfindung gezeigt und beschrieben sind, ist ausdrücklich zu verstehen, dass die Erfindung nicht darauf beschränkt ist, sondern im Umfang der folgenden Ansprüche anders und auf verschiedene Weisen ausgeführt und praktiziert werden kann.
  • Referenzen
    • 1. Zhang, W., et al., Characterization of beta-amyloid peptide precursor processing by the yeast Yap3 and Mkc7 proteases. Biochimica et Biophysica Acta, 1997. 1359(2): S. 110-22.
    • 2. Komano, H., et al., Involvement of cell surface glycosyl-photphatidylinosiol-linkes aspartyl proteases in alpha-secretase-type cleavage and ectodomain solubilization of human Alzheimer beta-amyloid precursor protein in yeast. J Biol Chem, 1998. 273(48): S. 31648-51.
    • 3. Citron, M., et al., Mutation of the beta-amyloid precursor protein in familial Alzheimer's disease increses beta-protein production. Nature, 1992. 360(6405): p. 672-4.
    • 4. Lohr, D., P. Venkov, und J. Zlatanova, Transcriptional regulation in the yeast GAL gene family: a complex genetic network. The FASEB Journal, 1995. 9: S. 777-786.
    • 5. Lamphier, M.S. und M. Ptashne, Multiple mechanisms mediate glucose repression of the yeast GAL1 gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992. 89: S. 5922-5926.
    • 6. Melcher, K. und H.E. Xu, Gal80-Gal80 interaction on adjacent Gal4p binding sites is required for complete GAL gene repression. Embo J, 2001. 20(4): S. 841-851.
    • 7. Hooper, N.M., Karran, E.H., Turner, A.J. Membrane protein secretases Biochem. J, 1997. 321: 265-279.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00240001

Claims (20)

  1. Ein Verfahren zur Identifiziertung/Isolierung von Modulatoren einer Sekretaseaktivität wobei geeignete eukaryontische Wirtszellen mit einer Testsubstanz kontaktiert werden, wobei diese Wirtszellen enthalten: a) ein Fusionsprotein umfassend ein sekretorisches Protein, eine Membranankerdomäne und eine Sekretaseschnittstelle, b) ein Protein mit einer Sekretaseaktivität, welche die Schnittstelle des Fusionsproteins erkennt und c) mindestens ein Reportergen unter der Kontrolle eines transkriptionellen Aktivierungssystems, wobei dieses transkriptionelle Aktivierungssystem dadurch reguliert wird, dass das sekretorische Protein durch die Sekretaseaktivität von dem Fusionsprotein abgetrennt und anschliessend ausgeschieden wird, diese Zellen dann unter geeigneten Bedingungen gezüchtet werden, so dass jenes Reportergen, welches die Detektion und/oder das Überleben der Zellen gestattet, nur in einer Weise exprimiert oder reprimiert wird, die von einer durch die Testsubstanz veränderten Sekretaseaktivität abhängig ist.
  2. Verfahren zur Isolierung eines Sekretaseinhibitors gemäss Anspruch 1, wobei eine verminderte oder keine Abspaltung des sekretorischen Proteins aufgrund von einer reduzierten/gehemmten Sekretaseaktivität zur Expression jenes zumindest einen Reportergens führt, wodurch die Detektion und/oder das Überleben von Zellen unter geeigneten Kulturbedingungen gestattet wird.
  3. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, wobei jenes zumindest eine Reportergen ausgewählt ist aus Genen, die Antibiotikaresistenz verleihen, Genen die für Reportermoleküle codieren, welche eine mit colorimetri schen oder Fluoreszenz-Verfahren detektierbare Aktivität haben, und Genen, die Auxotrophien komplementieren, vorzugsweise ein His3-Gen.
  4. Verfahren zur Identifizierung von Agonisten einer Sekretaseaktivität gemäss Anspruch 1, wobei das Abtrennen des sekretorischen Proteins aufgrund einer erhöhten Sekretaseaktivität zu einer verminderten Expression jenes zumindest einen Reportergens führt, wodurch die Detektion und/oder das Überleben der Zellen unter geeigneten Bedingungen gestattet wird.
  5. Verfahren gemäss Anspruch 4, wobei dieses zumindest eine Reportergen ausgewählt ist aus Genen, die Sensitivität gegenüber einer Chemikalie verleihen.
  6. Verfahren gemäss irgend einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zellen ein zweites Reportergen enthalten, das ausgewählt ist aus der Gruppe von a) Genen, die für Reportermoleküle kodieren mit einer durch colorimetrische oder Fluoreszenz-Verfahren detektierbaren Aktivität, b) Genen, die Antibiotikaresistenz verleihen und Genen, die Sensitivität gegenüber einer Chemikalie verleihen und c) Genen, die Auxotrophien komplementieren.
  7. Verfahren gemäss irgend einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die besagte Zelle eine Hefezelle ist.
  8. Verfahren gemäss irgend einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das sekretorische Protein eine enzymatische Aktivität hat, vorzugsweise ein Protein mit Invertaseaktivität oder funktionelle Fragmente eines Proteins mit Invertaseaktivität.
  9. Verfahren gemäss irgend einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das sekretorische Protein eine Hefeinvertase ist oder funktionelle Fragmente einer Hefeinvertase.
  10. Verfahren gemäss irgend einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Sekretaseschnittstelle aus der β-Stelle und der α-Stelle des humanen Amyloid-Vorläuferproteins und der S2-Stelle des Notch 1-Proteins ausgewählt ist.
  11. Verfahren gemäss Anspruch 10, wobei in die β-Stelle die Lys595Asn und Met596Leu Änderungen eingeführt wurden.
  12. Verfahren gemäss irgend einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Fusionsprotein ein ER-Retentionssignal umfasst.
  13. Verfahren gemäss irgend einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Fusionsprotein die Aminosäurenreste 1-532 der Hefeinvertase, die Aminosäurenreste 590-695 des humanen APP und ein ER-Retentionssignal umfasst.
  14. Verfahren gemäss irgend einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Fusionsprotein die Aminosäuren 1-532 der Hefeinvertase, die Aminosäurenreste 1714-1876 des humanen Notch 1 und ein ER-Retentionssignal umfasst.
  15. Verfahren gemäss irgend einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein Nukleinsäurenkonstrukt, das für jenes Fusionsprotein codiert, in das Genom der Wirtszellen integriert ist.
  16. Verfahren gemäss irgend einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Protein, welches eine Sekretaseaktivität umfasst, welche die Schnittstelle des Fusionsproteins erkennt, weiter ein ER-Retentionssignal umfasst.
  17. Verfahren gemäss irgend einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Sekretaseaktivität ausgewählt wird aus β-Sekretase und α-Sekretase.
  18. Verfahren gemäss Anspruch 16, wobei das Protein, welches eine β-Sekretaseaktivität umfasst, eine ER-Signalsequenz und die Aminosäurenreste 616-695 des humanen APP umfasst.
  19. Verfahren gemäss irgend einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das transkriptionelle Aktivierungssystem mindestens einen Teil des Hefe-GAL-Gen-Regulationssystems umfasst.
  20. Verfahren gemäss irgend einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Reportergen unter der Kontrolle der Hefe-GAL1-10-Regulationsregion ist.
DE60210266T 2002-04-18 2002-04-18 Verfahren zum nachweis von modulatoren einer sekretaseaktivität Expired - Fee Related DE60210266T2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/IB2002/001342 WO2003087842A1 (en) 2002-04-18 2002-04-18 Method for the identification of modulators of a secretase activity

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60210266D1 DE60210266D1 (de) 2006-05-18
DE60210266T2 true DE60210266T2 (de) 2007-01-11

Family

ID=29227360

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60210266T Expired - Fee Related DE60210266T2 (de) 2002-04-18 2002-04-18 Verfahren zum nachweis von modulatoren einer sekretaseaktivität

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20060068388A1 (de)
EP (1) EP1495329B1 (de)
AU (1) AU2002253468B2 (de)
CA (1) CA2482824A1 (de)
DE (1) DE60210266T2 (de)
WO (1) WO2003087842A1 (de)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ547398A (en) * 2003-10-24 2008-10-31 Esbatech Ag Method for the identification and/or validation of receptor tyrosine kinase inhibitors
WO2006133588A1 (en) * 2005-06-13 2006-12-21 Oncalis Ag ARYL UREA COMPOUNDS AS β-SECRETASE INHIBITORS
EP1734039A1 (de) * 2005-06-13 2006-12-20 Esbatech AG Arylharnstoffverbindungen als BETA-Secretase-Hemmer
US20120034155A1 (en) * 2010-08-03 2012-02-09 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Artificial cells
US8211656B2 (en) 2008-08-13 2012-07-03 The Invention Science Fund I, Llc Biological targeting compositions and methods of using the same
US20100042072A1 (en) * 2008-08-13 2010-02-18 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Biological targeting compositions and methods of using the same
US20100040546A1 (en) * 2008-08-13 2010-02-18 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Biological targeting compositions and methods of using the same
US10942184B2 (en) 2012-10-23 2021-03-09 Caris Science, Inc. Aptamers and uses thereof
BR112015009138A2 (pt) 2012-10-23 2020-10-20 Caris Life Sciences Switzerland Holdings, S.A.R.L. métodos para caracterizar um câncer
AU2013361323B2 (en) 2012-12-19 2018-09-06 Caris Science, Inc. Compositions and methods for aptamer screening
CN108004198B (zh) * 2016-10-28 2021-07-16 华中农业大学 基于icam-1信号通路的高通量药物筛选模型的建立方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6083693A (en) * 1996-06-14 2000-07-04 Curagen Corporation Identification and comparison of protein-protein interactions that occur in populations
DE19641180A1 (de) * 1996-09-24 1998-03-26 Schering Ag Verfahren zur Darstellung von APP-Sekretase Modulation und deren Verwendung als Mittel zur Behandlung der Alzheimer'schen Erkrankung
DE19856261C1 (de) * 1998-12-07 2000-03-30 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Aß-Peptid Screening Assay
DE19920514A1 (de) * 1999-05-05 2000-11-16 Boehringer Ingelheim Pharma Methoden zur Auffindung von Proteasen, die spezifisch membrangebundene Substrate spalten
US20020025508A1 (en) * 2000-01-06 2002-02-28 Katja Fechteler Process for finding a protease inhibitor
WO2001062897A1 (en) * 2000-02-25 2001-08-30 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Presenilin deficient multipotent cell lines and screening methods for intramembrane regulated proteolytic activities using these lines
US6333167B1 (en) * 2000-03-10 2001-12-25 American Home Products Corp. Methods and reagents for identifying inhibitors of proteolysis of membrane-associated proteins
EP1268755A1 (de) * 2000-04-05 2003-01-02 Esbatech AG Verfahren zur identifizierung von polypeptiden, die protease aktivität aufweisen
ATE397077T1 (de) * 2000-07-19 2008-06-15 Pharmacia & Upjohn Co Llc Substraten und nachweise zur wirksamkeit von beta-secretase
CA2422781A1 (fr) * 2000-09-19 2002-03-28 Christophe Dutordoir Systeme d'accuse de reception automatique de courrier electronique

Also Published As

Publication number Publication date
US20060068388A1 (en) 2006-03-30
AU2002253468B2 (en) 2008-04-03
DE60210266D1 (de) 2006-05-18
WO2003087842A1 (en) 2003-10-23
EP1495329B1 (de) 2006-03-29
CA2482824A1 (en) 2003-10-23
AU2002253468A1 (en) 2003-10-27
EP1495329A1 (de) 2005-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69731960T2 (de) Verfahren und zusammensetzungen für die identifizierung von receptor effectoren
DE69532127T2 (de) Interaktions-fullensysteme zum nachweis von protein-interaktionen
DE69831083T2 (de) Reprimiertes trans-aktivatorsystem zur charakterisierung von protein-protein interaktionen
DE69534741T2 (de) In hefe exprimierte heteologe g-protein-gekoppelte rezeptoren, fusionen desselben mit g-proteinen und deren verwendung im biotest
EP1483576B1 (de) Neue verfahren zur detektion und analyse von protein-interaktionen in vivo
DE69333969T2 (de) Wechselwirkendes Fallensystem zur Isolierung von Proteinen
Inouye et al. Mutational analysis of STE5 in the yeast Saccharomyces cerevisiae: application of a differential interaction trap assay for examining protein-protein interactions
DeMarini et al. A septin-based hierarchy of proteins required for localized deposition of chitin in the Saccharomyces cerevisiae cell wall
DE69838748T2 (de) Feststellung molekularer interaktionen durch marker-untereinheiten-komplementation
DE60210266T2 (de) Verfahren zum nachweis von modulatoren einer sekretaseaktivität
US20030186385A1 (en) Method of identifying polypeptide monobodies which bind to target proteins and use thereof
DE69918123T2 (de) Verfahren und reagentiensatz zur erkennung von protein-protein wechselwirkungen
WO1995020652A1 (de) Verfahren zur bestimmung der aktivität eines regulatorischen faktors sowie verwendung dieses verfahrens
DE69434661T2 (de) An die periplasmatische Membran gebundenes System zur Ermittlung von Protein-Protein Interaktionen
Theulaz et al. Expression of human estrogen receptor mutants in Xenopus oocytes: correlation between transcriptional activity and ability to form protein‐DNA complexes.
DE69935414T2 (de) Humanes h-TRCP Protein
DE60216721T2 (de) Verfahren zum Nachweis von Protein-Proteininteraktionen in Membranen
DE60221550T2 (de) Methode zur bestimmung der zellzyklusposition
DE69935539T2 (de) Untersuchungsverfahren für Protein-Protein-Interaktion
DE60316718T2 (de) Lösliche notch basierte substrate für gamma secretase, methoden, zusammensetzungen und verwendungen davon
RU2373284C2 (ru) Способ скрининга ингибиторов гамма-секретазы
EP1141716B1 (de) Methode zur zellulären high-throughput-detektion von rezeptor-liganden-interaktionen
DE60225839T2 (de) Mittel zur isolierung von lebensfähigen zellen, die c-kit exprimieren
WO2004092211A1 (de) Nicht fluoreszierende, durch proteolyse zur fluoreszenz aktivierbare reporterproteine und ihre verwendung zur detektion protease-abhängiger ereignisse
EP1141291A1 (de) Methode zur zellulären high-throughput-detektion von nukleären rezeptor-liganden-interaktionen

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee