DE69831083T2

DE69831083T2 - Reprimiertes trans-aktivatorsystem zur charakterisierung von protein-protein interaktionen

Info

Publication number: DE69831083T2
Application number: DE69831083T
Authority: DE
Inventors: Ivan Sadowski; Martin Hirst; John Rohde
Original assignee: Interomex Biopharmaceuticals Inc
Current assignee: Interomex Biopharmaceuticals Inc
Priority date: 1997-09-09
Filing date: 1998-09-08
Publication date: 2006-06-22
Anticipated expiration: 2018-09-09
Also published as: US5885779A; AU748706B2; EP1012265B1; ATE301188T1; WO1999013069A1; CA2303416A1; DE69831083D1; JP2001515718A; CA2303416C; AU9057398A; EP1012265A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Praktisch alle Zellantworten, einschließlich Wachstum und Differenzierung, werden streng durch physiologische Signale in Form von Wachstumsfaktoren, Hormonen, Nährstoffen und Kontakt mit benachbarten Zellen kontrolliert. Diese verschiedenen Signale werden durch Signaltransduktionsmechanismen verarbeitet und interpretiert, die schließlich die Zelle zu einer geeigneten Antwort induzieren. Signalwege, die durch physiologische Signale stimuliert werden, umfassen ein Netz aus spezifischen Protein-Protein-Wechselwirkungen, die dazu dienen, das Signal an nachgeschaltete Effektormoleküle weiterzuleiten, die die Antwort ausführen (32). Daher sind bestimmte Wechselwirkungen zwischen Proteinen kritisch für Signaltransduktionsmechanismen sowie die Regulierung der Zellarchitektur und Reaktionen auf physiologische Signale. Vorausgesetzt, dass bestimmte Protein-Protein-Interaktionen bei der Ausführung von praktisch allen Zellfunktionen beteiligt sind, sind Technologien, die das Erfassen und die Analyse von bestimmten Protein-Protein-Wechselwirkungen vereinfachen und erleichtern, wertvoll für die Entdeckung, die Ausbildung und das Testen von Medikamenten, die auf hochspezifische biologische Prozesse gerichtet sind.
Transkriptionsaktivatoren und Regulation von eukaryontischer Transkription
Die eukaryontische Genexpression wird geregelt durch eine Proteinklasse, bekannt als Transkriptionsaktivatoren, oder Enhancer-Bindungsproteine. Diese Moleküle binden an bestimmte Sequenzen auf der DNA in den Promotoren von Genen, die sie regulieren, und arbeiten dahingehend, dass sie den allgemeinen Transkriptionsinitiationskomplex an der rekrutieren, an der die Transkription von DNA in Boten-RNA beginnt (33). Neuere Versuche legen nahe, dass der allgemeine eukaryontische Transkriptionsinitiationskomplex aus zwei großen Proteinkomplexen besteht, die durch den Transkriptionsfaktor IID (TFIID), der das TATA-Elementbindungsprotein enthält, das dazu dient, den allgemeinen Initiationskomplex an einer bestimmten Stelle auf dem Promotor anzuordnen, und das RNA-Polymerase-II-Holoenzym dargestellt sind, das die katalytische Funktion enthält, die notwendig ist, um die doppelsträngige DNA aufzuwickeln und eine Kopie der DNA-Matrize in Boten-RNA zu transkribieren (42). Bekannte Transkriptionsaktivatoren funktionieren offenbar, indem sie direkte Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Teilen von TFIID und/oder dem RNA-Polymeraseholoenzym bilden und ihren Zusammenbau in einen Initiationskomplex am TATA-Element des Promotors katalysieren.
Regulation der GAL-Gene in Saccharomyces, ein Paradigma für eine eukaryontische Transkriptionsregulation.
Proteine, die die Expression von eukaryontischen Genen regulieren, besitzen typischerweise zwei Funktionselemente, ein ortsspezifische DNA-Bindungsdomäne und eine Transkriptionsaktivierungsdomäne, die entweder mit TFIID oder dem RNA-Polymeraseholoenzym in Wechselwirkung treten kann. Eukaryontische Transkriptionsregulationsproteine werden durch das Saccharomyces-Hefe-GAL4-Protein verkörpert, das eines der ersten eukaryontischen Transkriptionsaktivatoren war, auf das diese Funktionselemente charakterisiert wurden (33, 35). GAL 4 ist für die Regulation von Genen verantwortlich, die zur Verwendung von sechs Kohlenstoff-Zucker-Galactose notwendig sind. Galactose muss vor dem Katabolismus in Glucose umgewandelt werden; bei Saccharomyces umfasst dieses Verfahren typischerweise vier Reaktionen, die durch fünf unterschiedliche Enzyme katalysiert werden. Jedes Enzym wird durch ein GAL-Gen (GAL 1, 2, 5, 7 und 10) kodiert, das durch den Transaktivator GAL4 in Ansprechung auf das Vorhandensein von Galactose reguliert wird. Jedes GAL-Gen hat ein cis-Element im Promotor, das als vorgeschaltete Aktivierungssequenz für Galactose (UAS_G) bezeichnet wird und 17 Basenpaarsequenzen enthält, an das GAL4 spezifisch bindet. Die GAL-Gene werden reprimiert, wenn Galactose fehlt, werden aber stark und schnell durch das Vorhandensein von Galactose induziert. GAL4 wird davon abgehalten, die Transkription zu aktivieren, wenn Galactose fehlt, und zwar durch ein Regulationsprotein GAL80. GAL80 bindet direkt an GAL 4 und dient wahrscheinlich dazu, eine Wechselwirkung zwischen den Aktivierungsdomänen von GAL4 und den allgemeinen Transkriptionsinitiationsfaktoren zu verhindern. Wenn Hefe mit Galactose versorgt wird, wird die Transkription der GAL-Gene induziert. Galactose bewirkt eine Änderung der Wechselwirkung zwischen GAL4 und GLA 80 derart, dass die Aktivierungsdomänen von GAL4 exponiert werden, um einen Kontakt mit den allgemeinen Transkriptionsfaktoren zu ermöglichen, die durch TFIID und das RNA-Polymerase-II-Holoenzym dargestellt werden und ihren Aufbau am TATA-Element katalysieren, was zu einer Transkription der GAL-Gene führt.
Das GAL4-Protein.
Die Funktionsregionen von GAL4 sind sorgfältig durch eine Kombination von biochemischen und molekularen genetischen Strategien definiert worden (35). GAL4 bindet als Dimer an sein spezifisches cis-Element in dem UAS_G der GAL-Gene. Die Fähigkeit enge Dimere zu bilden und spezifisch an DNA zu binden, wird durch eine N-terminale DNA-Bindungsdomäne verliehen. Dieses Fragment von GAL4 (Aminosäuren 1–147) kann wirksam und spezifisch an DNA binden, kann aber nicht die Transkription aktivieren. Zwei Teile des GAL4-Proteins sind zur Aktivierung der Transkription notwendig, die so genannte Aktivierungsregion 1 und Aktivierungsregion 2. Es wird davon ausgegangen, dass die Aktivierungsregionen dazu dienen, mit den allgemeinen Transkriptionsfaktoren in Wechselwirkung zu treten. Der große zentrale Abschnitt von GAL4 zwischen den Aktivierungsregionen ist zum Hemmen von GAL4 in Ansprechung auf das Vorhandensein von Glukose erforderlich. Die C-terminalen 30 Aminosäuren von GAL4 binden das negative regulatorische Protein GAL80; eine Deletion dieses Segments bewirkt die konstitutive Induktion der GAL-Transkription.
Interaktionsfalle und Zwei-Hybrid-Standardassay.
Die Hefe-Zwei-Hybrid- und Interaktionsfallensysteme stellen starke Ansätze zur Charakterisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo zur Verfügung. Beide Strategien nutzen die Tatsache, dass die Transkriptionsaktivierung und DNA-Bindungsdomänen der meisten eukaryontischen Transkriptionsaktivatoren arbeiten, wenn sie als Fusionen mit heterologen Proteinen exprimiert sind (7), und transaktivieren können, wenn sie durch eine bestimmte Protein-Protein-Interaktion zwischen einzelnen Fusionen zusammengebracht werden (10, 14). Ein wichtiger Beitrag zur Entwicklung dieser Systeme war die Entdeckung, dass einige Transkriptionsaktivatorproteine, besonders das Herpes-Virusprotein 16 (VP16), indirekt durch Wechselwirkung mit einem sequenzspezifischen DNA-Bindungsprotein an DNA rekrutiert werden (46). VP16 aktiviert die Transkription durch Bildung eines Komplexes mit den zellulären Proteinen Oct-1 und HCF; der Oct-1/HCF/VP16-Komplex bindet an Enhancer-Elemente von Herpes-immediate-early-Gene (43). Es wurde anschließend gezeigt, dass das negative regulatorische Protein GAL80 mittels Fusion einer kurzen, negativ geladenen Transkriptionsaktivationssequenz B17 in einen GAL4 abhängigen Transaktivator umgewandelt werden konnte (30). Es wurde gefunden, dass das GAL80-B17-Fusionsprotein, wenn es mit GAL koexprimiert wurde, die Aktivierung eines GAL4 abhängigen Reportergens in einem größeren Umfang als GAL4 allein bewirkte (30). Ein ähnliches Experiment, das in jüngerer Zeit durchgeführt wurde, wurde dazu verwendet, die Wechselwirkung zwischen GAL4 und GAL80 in vivo anschließend an eine Induktion zu untersuchen (28).
Das anfängliche „Zwei-Hybrid"-Experiment zeigte, dass eine spezifische Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen Snf1p und Snf4p, von denen keines selbst ein Transaktivator ist, die DNA-Bindungs- und C-terminalen Aktivierungsdomänen von GAL 7 zusammenbringen konnte, um bei Expression als einzelne Fusionen einen funktionsfähigen Transaktivator zu bilden (14). Im standardgemäßen Zwei-Hybrid-System wird ein interessantes Protein an die DNA-Bindungsdomäne von GAL4 fusioniert, um ein „Köder"-Fusionsprotein zu erzeugen. Proteine, die mit dem Köderprotein in Wechselwirkung stehen, die als „Beute" bezeichnet werden, können durch ihre Fähigkeit, bei Expression als Fusion an die C-terminale Transaktivierungsdomäne von GAL4 eine Transaktivierung eines GAL4 abhängigen Reportergens zu bewirken, identifiziert werden (10, 15, 16). Das „Interaktionsfallen"-System benutzt das identische Prinzip der Anwendung von einzelnen Fusionen mit DNA-Bindungs- und Transaktivierungsdomänen, mit der Ausnahme, dass die Beute an LexA fusioniert wird, bei dem es sich um ein sequenzspezifisches DNA-Bindungsprotein aus E. coli handelt, und eine künstliche Transaktivierungsdomäne, die als B42 bekannt ist (31) wird für die „Beute"-Fusionen benutzt. Die Wechselwirkungen zwischen den Köder- und Beute-Fusionen wird durch Expression eines auf Lex-A ansprechenden Reportergens erfasst (6).
Transkriptionsaktivatorproteine können für die standardgemäße Zwei-Hybrid-Analyse nicht verwendet werden.
Eine Haupteinschränkung für standardgemäße Zwei-Hybrid- und Interaktionsfallensysteme ist, dass Köderproteine, die selbst in der Lage sind, die Transkription zu aktivieren, nicht als Körper verwendet werden können, weil sie eine Aktivierung der Reportergene selbst bewirken, ohne dass sie mit einem Beute-Aktivierungsdomänen-Fusionsprotein in Wechselwirkung stehen. Dies ist bedauerlich, weil Transkriptionsregulationsproteine Schlüsselmoleküle darstellen, die die meisten Zellprozesse kontrollieren; die meisten Transkriptionsregulationsproteine aktivieren die Transkription natürlich, wenn sie an eine heterologe DNA-Bindungsdomäne fusioniert sind. Die Hefegenomsequenz weist darauf hin, dass ein überraschend großer Anteil sogar eines einfachen Eukaryonten die Transkriptionsregulationsproteine kodieren soll (17). Die Lebensdauer der Saccharomyces-Hefe beinhaltet nur vier ausgeprägte differenzierte Zustände. Durch einen Vergleich muss die menschliche Entwicklung eine deutlich größere Zahl an Transkriptionsregulatoren umfassen, um eine Differenzierung von Tausenden unterschiedlicher Zelltypen zu koordinieren. Schon aus diesem Grund ist es kritisch, dass einfache und zuverlässige Strategien verfügbar werden, die eine Charakterisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, die durch eukaryontische Transaktivatoren erzeugt werden, ermöglichen.
Das Erfordernis, dass die Köderfusion nicht in der Lage sein darf, die Transkription zur Verwendung in den Zwei-Hybrid- und Interaktionsfallensystem zu aktivieren, ist eine Einschränkung, die auch für viele Proteine gilt, deren Funktion normalerweise nicht die Transkriptionsregulation umfasst. Ungefähr 10 bis 15 % Proteine, die normalerweise nicht als Transkriptionsfaktoren fungieren, können künstlich eine Aktivierung der Transkription bewirken, wenn sie an eine DNA-Bindungsdomäne fusioniert sind (31, 34). Dies wird durch Versuche veranschaulicht, die gezeigt haben, dass mindestens 10 % an willkürlichen Proteinfragmenten, die an die GAL4-DNA-Bindungsdomäne fusioniert sind, eine Aktivierung der Transkription in Hefe bewirkten (31, 34). Diese Ergebnisse legen nahe, dass viele Aminosäuresequenzen, die mit dem großen RNA-Polymerase-Holoenzym-Komplex in Wechselwirkung stehen, eine Transkriptionsaktivierung bewirken können, wenn sie an eine DNA-Bindungsdomäne fusioniert sind (3).
Es ist möglich, den Zwei-Hybrid-Assay zu verwenden, um Verbindungen zu identifizieren, die bestimmte Protein-Protein-Wechselwirkungen stören. Bei dem Zwei-Hybrid-Assay führt eine solche Störung zu einem negativen Signal, d.h. es wird keine Expression des Reportergens erhalten. Allerdings gibt es Probleme, die mit dem Beruhen auf einem negativen Signal verbunden sind, d.h. einer fehlenden Expression, um solche Verbindungen zu identifizieren. Das Ausbleiben einer Expression kann durch andere Faktoren als die Störung der interessanten Protein-Protein-Wechselwirkung bewirkt werden. Zum Beispiel können Verbindungen, die die Transkription stören, ein falsch positives Ergebnis erbringen. In ähnlicher Weise können Verbindungen, die generell das Zellwachstum hemmen, ein falsch positives Ergebnis erbringen, indem sie anscheinend die Expression eines Reportergens stören, das einem restriktiven Medium das Überleben bringen würde.
Zwei-Hybrid-Umkehrassay.
Es ist eine Modifizierung des standardgemäßen Zwei-Hybridsystems, das als Umkehr-Zwei-Hybrid" bekannt ist (27; Erickson u. a., US-Patent 5,525,490, Vidal u. a., internationale Anmeldung PCT/US96/04995), beschrieben worden, das bei der Identifizierung von bestimmten Inhibitoren einer standardgemäßen Zwei-Hybrid-Protein-Protein-Wechselwirkung verwendet werden soll. Das Umkehr-Zwei-Hybrid-System arbeitet durch Steuerung der Expression eines Relay-Gens, wie beispielsweise das GAL80-Gen, das ein Protein kodiert, das an die Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsaktivators, wie beispielsweise GAL4, bindet und dieses maskiert. Die Expression der Reportergene wird von dem Funktionieren der Aktivierungsdomäne des Transkriptionsaktivators abhängig gemacht. Nur wenn das Niveau des maskierenden Proteins reduziert wird, weil eine Verbindung die Zwei-Hybrid-Wechselwirkung stört, wird die Aktivierungsdomäne des Transkriptionsaktivators demaskiert und kann funktionieren.
Allerdings gibt es Probleme, die mit der Verwendung des Zwei-Hybrid-Umkehrassays in Verbindung stehen, um Verbindungen zu identifizieren, die die ausgewählten Protein-Protein-Wechselwirkungen stören. Zum Beispiel erbringen Verbindungen, die die Wechselwirkung zwischen dem maskierenden Protein und dem Transkriptionsaktivator stören, falsch positive Ergebnisse. Falsch positive Ergebnisse entstehen auch, wenn das „Köder"-Fusionsprotein als Transkriptionsaktivator wirkt, weil das maskierende Protein eine solche Aktivität nicht maskiert. Wie oben angegeben, wird dieses letztere Problem durch die Tatsache erschwert, dass viele Proteine und Proteinfragmente als Transkriptionsaktivatoren zu wirken scheinen, wenn sie an eine DNA-Bindungsdomäne fusioniert sind.
Transkriptionsrepression.
Während die meisten Gene positiv durch Transkriptionsaktivatoren kontrolliert werden, gibt es auch Mechanismen zum Reprimieren oder Hemmen der Transkription in Ansprechung auf physiologische Signale. Es sind mehrere Proteine identifiziert worden, die als allgemeine Repressoren der Transkription dienen. Einige der beschriebenen ersten eukaryontischen Transkriptionsrepressoren umfassen das Hefeprotein, das durch TUP1 kodiert wird, und das Drosophila Kruppel Protein, obwohl es jetzt viele unterschiedliche Proteine gibt, die, wie gezeigt wurde, eine Transkriptionsrepression bewirken (19).
Bestimmte Aminosäuresequenzen in den Transkriptionsrepressorproteinen sind identifiziert worden, die in der Lage sind, eine Repression der Transkription zu bewirken, wenn sie an eine heterologe DNA-Bindungsdomäne fusioniert sind (19, 35). Solche Transkriptionsrepressordomänen sind in vielen eukaryontischen Transkriptionsrepressoren identifiziert worden. Transkriptionsrepressordomänen müssen nicht strukturmäßig ähnlich sein, sie werden durch ihre allgemeine Fähigkeit, die Transkription zu reprimieren, definiert.
TUP1 ist ein 713 Aminosäure langes Protein, das dazu benötigt wird, die Transkription von spezifischen Genklassen in Ansprechung auf physiologische Signale und den Differenzierungszustand der Hefezelle zu hemmen. Man geht gegenwärtig davon aus, dass TUP1 nicht direkt an die DNA bindet, sondern vielmehr mit spezifischen DNA-Bindungsproteinen in Wechselwirkung steht, die an cis-Elemente gebunden sind, die als vorgelagerte Repressionsequenzen (URS) in einem Komplex mit dem Produkt von SSN6 bekannt sind (50, 45, 12). Es ist gezeigt worden, dass TUP1 für die aktive Repression in einem Experiment verantwortlich ist, in dem TUP1-Fragmente direkt an das E.coli-DNA-Bindungsprotein LexA fusioniert waren (47). Es wurde festgestellt, dass die LexA-TUP1-Fusionen die Transkription eines Reportergens hemmten, das vorgeschaltete Bindungsstellen für LexA enthielt (47). In diesem System waren nur die N-terminalen 200 Reste von TUP1 notwenig, um die Repression zu vermitteln. Dieses Experiment war ähnlich den früheren Experimenten, die Transkriptionsrepressordomänen in anderen eukaryontischen Transkriptionsrepressoren zeigten (19, 35). Die mit Holoenzym verbundene, Cyclin abhängige Proteinkinase SRB10 wird für die Repression der Transkription durch TUP1 benötigt (48).
Zusammenfassung der Erfindung
Das System der vorliegenden Erfindung, die als reprimiertes Transaktivator(RTA)-System bezeichnet wird, erfasst die Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Repression von Reportergenen. In dem RTA-System bewirkt eine Wechselwirkung zwischen einem „Köder"-Fusionsprotein, enthaltend eine DNA-Bindungsdomäne, wie beispielsweise der DNA-Bindungsdomäne von GAL4 oder LexA (2, Protein X), mit einem „Beute"-Fusionsprotein, enthaltend eine Repressionsdomäne, wie beispielsweise die N-terminale TUP1-Repressionsdomäne (2, Protein Y-RD), eine Hemmung der Expression, d.h. der Expression von bestimmten Reportergenen.
Das „Köder"-Fusionsprotein kann ein Transkriptionsaktivatorprotein sein (was mit den Zwei-Hybrid- und Interaktionsfallensystemen des Standes der Technik nicht möglich ist). Alternativ können die Reportergene und/oder Köderfusionsproteine so modifiziert werden, dass sie selbst Transkriptionsaktivatoraktivität aufweisen, wodurch es ermöglicht wird, den Assay der vorliegenden Erfindung auf Köder-Fusionsproteinen durchzuführen, die die Transkription nicht aktivieren.
Das Beute-Fusionsprotein bewirkt eine Repression der Reportergene, die sonst aktiv wären, wie beispielsweise der GAL4 abhängigen Reportergene GAL1-CAN1, GAL1-URA3, des endogenen GAL1-Gens und eines GAL1-LacZ-Fusionsgens. Durch Verwendung dieser Reportergene kann eine Hemmung der GAL4 abhängigen Reportergenexpression durch Wachstum auf Canavanin, 5-FOA, und 2-Deoxygalactose bzw. Bildung von blauen Kolonien auf X-gal angezeigt werden.
Das RTA-System der Erfindung kann auch zur Verwendung bei der Identifizierung und Charakterisierung bestimmter Verbindungen verwendet werden, die Protein-Protein-Wechselwirkungen hemmen.
Bei dem RTA-System stören Inhibitoren einer bestimmten Protein-Protein-Wechselwirkung die Rekrutierung der Repressorfunktion des Beute-Fusionsproteins, was zur Aktivierung der Reportergenexpression führt. Die Tatsache, dass ein solcher Assay auf der Aktivierung der Reportergenexpression und nicht dem Fehlen der Aktivierung im standardgemäßen Zwei-Hydrid-Assay beruht, kann dazu führen, dass das RTA-System dem Zwei-Hybrid-System zur Suche nach Inhibitoren der Protein-Protein-Wechselwirkungen bevorzugt wird.
Die vorliegende Erfindung stellt Zellen zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Fusionsproteinen zur Verfügung, wobei die Zellen ein erstes rekombinantes Gen, ein zweites rekombinantes Gen und ein rekombinantes Reportergen umfassen. Die Zellen können beispielsweise Saccharomyces cerevisiae Zellen, Schizosaccharomyces pombe Zellen oder Säugetier-Gewebekulturzellen sein. Das erste rekombinante Gen kodiert für ein Beute-Fusionsprotein. Das erste rekombinante Gen kann unter der Kontrolle eines reprimierbaren Promotors sein, wie beispielsweise eines Promotors, der zum MET3-Promotor homolog ist. Das Beute-Fusionsprotein umfasst eine Transkriptionsrepressordomäne und eine erste heterologe Aminosäuresequenz. Das zweite rekombinante Gen kodiert für ein Köder-Fusionsprotein, wobei das Köder-Fusionsprotein eine DNA-Bindungsdomäne und eine zweite heterologe Aminosäuresequenz umfasst. Die DNA-Bindungsdomäne kann Sequenzen aufweisen, die zur DNA-Bindungsdomäne von GAL4 oder LexA homolog sind. Das rekombinante Reportergen kodiert für ein erfassbares Genprodukt. Das rekombinante Reportergen umfasst eine Operator-DNA-Sequenz in dem Promotor, die in der Lage ist, die DNA-Bindungsdomäne des Köder-Fusionsproteins zu binden. Das Reportergen wird bei Fehlen einer Bindung zwischen dem Beute-Fusionsprotein und dem Köder-Fusionsprotein exprimiert, wobei ein solches Fehlen einer Bindung das Ergebnis eines Fehlens der Bindung zwischen der ersten heterologen Aminosäuresequenz und der zweiten heterologen Aminosäuresequenz ist. Das Reportergen wird reprimiert, wenn eine Bindung zwischen der ersten heterologen Aminosäuresequenz und der zweiten heterologen Aminosäuresequenz besteht. Der Promotor des Reportergens kann eine Bindungsstelle für zusätzliche Transaktivatorproteine, wie beispielsweise GCN4, aufweisen.
Das Köder-Fusionsprotein kann eine Transkriptionsaktivatordomäne, wie beispielsweise Sequenzen, die zu den Aminosäuren 147–238 (Aktivierungsregion 1) von GLA 4 homolog sind, aufweisen.
Die Transkriptionsrepressordomäne kann Sequenzen aufweisen, die zur Transkriptionsrepressordomäne des Hefe-TUP1-Proteins, der Transkriptionsrepressordomäne des Drosophila Kruppel Proteins, der Transkriptionsrepressordomäne des Drosophila engralled Proteins, der Transkriptionsrepressordomäne des Drosophila knirps Proteins, der Transkriptionsrepressordomäne des Drosophila even-skipped Proteins, der Transkriptionsrepressordomäne des Drosophila paired Proteins, der Transkriptionsrepressordomäne des Säugetier-Egr-1-Proteins, der Transkriptionsrepressordomäne des Säuretier-WT1-Proteins, der Transkriptionsrepressordomäne des Säugetier-RARa-Proteins oder der Transkriptionsrepressordomäne des Säugetier-KRAB-Proteins homolog sind.
In Hefezellen kann das Reportergen homolog zum Hefe-URA3-Gen, Hefe-CAN1-Gen, Hefe-GAL1-Gen, Hefe-HIS3-Gen oder E.coli-LacZ-Gen sein. Bei Säugetierzellen kann das Reportergen homolog zum CAT-Gen, LacZ-Gen, SEAP-Gen, Luciferase-Gen, GFP-Gen, BFP-Gen, CD2-Gen; Flu-HA-Gen oder tPA-Gen sein.
Die vorliegende Erfindung stellt einen Kit zur Herstellung von Zellen zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Fusionsproteinen zur Verfügung. Der Kit umfasst einen ersten Vektor zur Expression eines Beute-Fusionsproteins mit einer Transkriptionsrepressordomäne, einen zweiten Vektor zur Expression eines Köder-Fusionsproteins mit einer DNA-Bindungsdomäne und Wirtszellen mit einem rekombinanten Reportergen, das für ein detektierbares Genprodukt kodiert. Der erste Vektor umfasst ein exprimierbares Gen mit einer Insertionsstelle und eine Sequenz, die für die Transkriptionsrepressordomäne kodiert. Der zweite Vektor hat ein exprimierbares Gen mit einer Insertionsstelle und eine Sequenz, die für eine DNA-Bindungsdomäne kodiert. Das rekombinante Reportergen in den Wirtszellen hat eine Operator-DNA-Sequenz, die in der Lage ist, an die DNA-Bindungsdomäne des Köder-Fusionsproteins zu binden. Das Reportergen wird bei Fehlen einer Bindung zwischen dem Beute-Fusionsprotein und dem Köder-Fusionsprotein exprimiert, wobei ein solches Fehlen einer Bindung das Ergebnis eines Fehlens der Bindung zwischen der ersten heterologen Aminosäuresequenz und der zweiten heterologen Aminosäuresequenz ist. Das Reportergen wird reprimiert, wenn eine Bindung zwischen der ersten heterologen Aminosäuresequenz und der zweiten heterologen Aminosäuresequenz ist. Der Kit kann auch Oligonukleotidprimer aufweisen, die homolog zu den Sequenzen sind, die die Insertionsstellen im ersten und zweiten Vektor flankieren.
Die Zellen in dem Kit können Hefezellen sein. Die Transkriptionsrepressordomäne des Beute-Fusionsproteins kann homolog zur Transkriptionsrepressordomäne von TUP1 sein. Die DNA-Bindungsdomäne des Köder-Fusionsproteins kann zur DNA-Bindungssequenz von GAL4 homolog sein. Der Operator des Reportergens kann eine DNA-Sequenz haben, die zur GAL4-Protein-Bindugnssequenz des GAL1-Gens homolog ist. Das Reportergen kann zum CAN1-Gen, dem URA3-Gen oder dem LacZ-Gen homolog sein.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Untersuchung auf Wechselwirkungen zwischen Fusionsproteinen in Zellen zur Verfügung. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
Ausstatten der Zellen mit einem rekombinanten Reportergen, das ein nachweisbares Genprodukt kodiert. Das rekombinante Reportergen umfasst eine Operator-DNA-Sequenz, die die Fähigkeit zur Bindung an eine DNA-Bindungsdomäne eines Köder-Fusionsproteins besitzt.
Veranlassen der Zellen, ein rekombinantes Gen zu exprimieren, das ein Beute-Fusionsprotein kodiert, welches eine Transkriptionsrepressordomäne und eine erste heterologe Aminosäuresequenz umfasst.
Veranlassen, dass die Zellen ein rekombinantes Gen exprimieren, das das Köder-Fusionsprotein kodiert, welches eine DNA-Bindungsdomäne und eine zweite heterologe Aminosäuresequenz umfasst.
Das Reportergen wird bei Fehlen einer Bindung zwischen dem Beute-Fusionsprotein und der Köder-Fusionsprotein exprimiert, wobei ein solches Fehlen einer Bindung das Ergebnis eines Fehlens der Bindung zwischen der ersten heterologen Aminosäuresequenz und der zweiten heterologen Aminosäuresequenz ist. Das Reportergen wird reprimiert, wenn eine Bindung zwischen der ersten heterologen Aminosäuresequenz und der zweiten heterologen Aminosäuresequenz besteht.
Eine Wechselwirkung zwischen dem Köder- und Beute-Fusionsprotein wird durch Untersuchen auf Expressionsverlust des erfassbaren Genprodukts detektiert. Bei Hefezellen kann zum Beispiel eine Wechselwirkung zwischen den Köder- und Beute-Fusionsproteinen durch das Wachstum der Zellen auf Canavanin erfasst werden, wenn CAN1 das Reportergen ist, durch Wachstum auf 5-FOA, wenn URA3 das Reportergen ist, durch Wachstum auf 2-Deoxygalactose, wenn GAL1 das Reportergen ist, durch Fehlen eines Wachstums auf Medium, dem Histidin fehlt, wenn das Reportergen HIS3 ist, oder durch Bildung von blauen Kolonien, wenn die Zellen auf Medium, das X-gal enthält, wachsen gelassen werden.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Untersuchen der Fähigkeit von Verbindungen zur Verfügung, die Wechselwirkung zwischen Fusionsproteinen in Zellen zu stören. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
Ausstatten der Zellen mit einem rekombinanten Reportergen, das für ein detektierbares Genprodukt kodiert. Die Operator-DNA-Sequenz des Reportergens ist in der Lage, an eine DNA-Bindungsdomäne eines Köder-Fusionsproteins zu binden.
Bewirken, dass die Zellen ein rekombinantes Gen exprimieren, das ein Beute-Fusionsprotein mit einer Transkriptionsrepressordomäne und einer ersten heterologen Aminosäuresequenz kodiert.
Bewirken, dass die Zellen ein rekombinantes Gen exprimieren, das für das Köder-Fusionsprotein mit der DNA-Bindungsdomäne und einer zweiten heterologen Aminosäuresequenz kodiert. Die zweite heterologe Aminosäuresequenz ist in der Lage, an die erste heterologe Aminosäuresequenz zu binden.
Die Fähigkeit einer exogenen Verbindung, die Bindung der Köder- und Beute-Fusionsproteine zu stören, wird durch Untersuchen auf Expression des detektierbaren Genprodukts getestet. Das Reportergen wird bei Fehlen der Bindung zwischen den Köder- und Beute-Fusionsproteinen exprimiert, die ein Fehlen der Bindung zwischen der ersten heterologen Aminosäuresequenz und der zweiten heterologen Aminosäuresequenz widerspiegelt. Das Reportergen wird reprimiert, wenn eine Bindung zwischen der ersten heterologen Aminosäuresequenz und der zweiten heterologen Aminosäuresequenz besteht.
Eine „DNA-Bindungsdomäne" ist eine Sequenz von Aminosäuren, die in der Lage sind, an eine bestimmte DNA-Sequenz zu binden.
Eine „Transkriptionsrepressordomäne" ist eine Sequenz von Aminosäuren, die in der Lage ist, eine Transkription zu hemmen, wenn sie in geeigneter Weise in der Nähe der Transkriptions-Startstelle eines Gens angeordnet ist.
Ein „Fusionsprotein" ist ein Protein, das aus Aminosäuresequenzen zusammengesetzt ist, die von mindestens zwei unterschiedlichen Quellen stammen. IM Kontext eines Fusionsproteins ist eine „heterologe" Aminosäuresequenz eine Sequenz, die von einer anderen Quelle stammt als andere Teile des Fusionsproteins.
Eine Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenz ist „homolog" zu einer anderen Sequenz, wenn die beiden Sequenzen im Wesentlichen identisch sind und die funktionelle Aktivität der Sequenzen konserviert wird (zum Beispiel fungieren beide Sequenzen als DNA-Bindungsdomäne oder kodieren sie oder beide Sequenzen fungieren als Transkriptionsrepressordomäne oder kodieren diese; wie hier verwendet, lässt sich von einer Sequenzkonservierung nicht auf eine entwicklungsmäßige Bezogenheit schließen). Zwei Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenzen werden als im Wesentlichen identisch angesehen, wenn sie mindestens etwa 75 % Sequenzidentität, vorzugsweise mindestens etwa 90 % Sequenzidentität und besonders bevorzugt mindestens 95 % Sequenzidentität aufweisen. Die Sequenzidentität kann unter Verwendung des BLAST-Algorithmus, der in Altschul u.a. (1990), J. Mol. Biol. 215:403–10 beschrieben ist (unter Verwendung der veröffentlichten Standardeinstellungen) bestimmt werden.
Eine alternative Angabe, dass zwei Nukleinsäuresequenzen im Wesentlichen identisch sind, besteht darin, dass die beiden Sequenzen miteinander unter gemäßigt stringenten oder bevorzugt stringenten Bedingungen hybridisieren. Eine Hybridisierung an filtergebundene Sequenzen unter gemäßigt stringenten Bedingungen kann zum Beispiel in 0,5 M NaHPO₄, 7 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C und Waschen in 0,2 × SSC/0,1 % SDS bei 42° durchgeführt werden C (siehe Ausubel u.a. (Hrsg.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 1, Green Publishing Associates, Inc. und John Wiley & Sons, Inc., New York, auf Seite 2.10.3). Alternativ kann eine Hybridisierung an filtergebundene Sequenzen unter stringenten Bedingungen zum Beispiel in 0,5 M NaHPO₄, 7 % SDS, 1 mM EDTA bei 65°C und Waschen in 0,1 × SSC/0,1 % SDS bei 68°C durchgeführt werden (siehe Ausubel u.a. (Hrsg.), 1989 oben). Die Hybridisierungsbedingungen können gemäß bekannter Verfahren je nach der interessanten Sequenz modifiziert werden (siehe Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology – Hybridization with Nucleic Acid Probes, Teil I, Kapitel 2 „Overview of priniciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York). Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so gewählt, dass sie etwa 5°C niedriger als der thermale Schmelzpunkt für die spezifische Sequenz bei einer bestimmten ionischen Stärke und pH sind.
Ein detektierbares Genprodukt ist ein Nukleotid oder eine Aminosäuresequenz, die durch einen Assay festgestellt werden kann. Vorzugsweise verleiht die Expression eines detektierbaren Genprodukts einer Zelle ein Merkmal, durch das es möglich wird, dass die Zelle in geeigneter Weise von den anderen Zellen, die das detektierbare Genprodukt nicht exprimieren, abgesondert wird.
Ein „reprimierbarer Promotor" ist eine DNA-Sequenz, die die Transkription eines Gens fördert, mit der es unter bestimmten Bedingungen funktionsfähig verbunden ist, und unter anderen Bedingungen fördert die reprimierbare Promotorsequenz nicht die Expression des Gens. In diesem Zusammenhang sind die Bedingungen, die die Funktion des reprimierbaren Promotors variieren, typischerweise physiologische Bedingungen, wie beispielsweise das Vorhandensein oder Fehlen einer bestimmten Verbindung in den Medien, in denen eine Zelle lebt.
Ein „Transaktivatorprotein" ist ein Protein, das an die Operatorregion eines Gens binden kann und dadurch die Transkription des Gens fördert.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: Schematische Darstellung des reprimierten Transaktivatorsystems (RTA). Bild A. Ein Köder-Fusionsprotein, bestehend aus einem Transkriptionsaktivatorprotein 3, das an eine ortsspezifische DNA-Bindungsdomäne 2 fusioniert ist, bewirkt die Aktivierung der Expression des Reportergens 6 durch Bindung an das verwandte cis-Element 1 im Promotor und durch Rekrutierung der allgemeinen Transkriptionsfaktoren 7 (GTF) an das TATA-Element 8. Bild B. Die Wechselwirkung zwischen der Transaktivator-Köder-Fusion und einem Beuteprotein, das an eine Transkriptionsrepressionsdomäne fusioniert ist, bewirkt eine Hemmung der Reportergenexpression.
2: Schematische Darstellung des GAL4-Proteins. Die N-terminalen 147 Aminosäuren enthalten die DNA-Bindungsdomäne 10, die spezifisch an 17 Basenpaarsequenzen in dem UAS_G bindet. Die Transkriptionsaktivierung wird durch die Aktivierungsregion 1 11 und die Aktivierungsregion 2 13 vermittelt. Die Zentralregion 12, die zwischen den beiden Aktivierungsregionen liegt, ist zur Hemmung der GAL4-Aktivität in Gegenwart von Glucose notwendig. Das negative regulatorische Protein GAL80 stellt einen primären Kontakt mit den C-terminalen 30 Aminosäureresten des GAL4-Proteins 14 her.
3: Funktion des TUP1-Proteins in der Glucoserepression der GAL-Gene. Schematische Darstellung eines typischen GAL-Gens in Saccharomyces. Bild A. Bei Fehlen von Glucose (und bei Vorhandensein von Galactose) werden die GAL-Gene durch das GAL4-Protein 21 aktiviert, das an das UAS_G 20 gebunden ist. Das MIG1-Protein 22 bindet an die vorgelagerte Repressionssequenz (URS) 23, beeinflusst aber nicht die GAL-Transkription bei Fehlen von Glucose. Bild B. Bei Vorhandensein von Glucose wird ein Komplex, bestehend aus den Proteinen TUP1 26 und SSN6 25, an das MIG1-Protein rekrutiert. TUP1 enthält eine Repressionsdomäne, die die allgemeinen Transkriptionsfaktoren hemmt und die Repression der GAL-Gentranskription bewirkt.
4: Identifizierung einer Transkriptionsrepressionsdomäne auf dem TUP1-Protein. Bild A. Schematische Darstellung des Saccharomyces TUP1 Proteins. Die N-terminalen 200 Aminosäuren von TUP1 enthalten die Transkriptionsrepressionsdomäne 31. Bild B. Die Fusion der TUP1-Repressionsdomäne 31 an das E.coli-LexA-Protein 32 erzeugt ein chimeres Protein, das in der Lage ist, eine Repression eines Reportergens zu bewirken, das durch den Transkriptionsaktivator GCN4 34 kontrolliert wird und das vorgeschaltete LexA-Operatoren 33 hat.
5: Schematische Darstellung von Reportergenen, die für das nicht modifizierte, reprimierte Transaktivatorsystem verwendet werden. Bild A: Endogenes GAL1-Gen. Bild B: GAL1-URA3, integriert an der ADE2-Stelle. Bild C: GAL1-LacZ integriert an MFA2. Bild D: GAL1-CAN1 integriert an der LYS2-Stelle.
6. Schematische Darstellung der GAL4-Köder-Expressionsplasmide für das reprimierte Transaktivatorsystem. Bild A: Darstellung der pY-Vektoren, bei denen der ADH1-Promotor (pADH) verwendet wird, um die GAL4-DNA-Bindungsdomäne (GAL4 DBD) zu exprimieren. Der DBD folgen eine Mehrfachklonierungsstelle (MCS) und Translations-Terminationskodons in jedem Leserahmen (nicht angegeben). Die Plasmide haben eine Hefe-autonome Replikationssequenz und ein Zentromerfragment (ARS-CEN) und das TRP1-Gen für die Verbreitung und Selektion in Hefe, und ein Ampicillinresistenzgen (Amp) für die Selektion in E. coli. pY1, pY2 und pY3 sind identisch, mit der Ausnahme, dass die Mehrfachklonierungsstelle um ein einzelnes Nukleotid zueinander versetzt ist, um den Aufbau von in-frame-Fusionen zu vereinfachen (36). GAL4-Köder-Transkripte werden in dem ADH1-Terminator (tADH) abgeschlossen. Bild B: Darstellung der pG-Vektoren, die mit den pY-Plasmiden identisch sind, mit der Ausnahme, dass die GAL4-DNA-Bindungsdomäne vom GAL4-Promotor (pGAL4) exprimiert ist.
7: Schematische Darstellung der TUP1-Beute-Expressionsvektoren für das reprimierte Transaktivatorsystem. Die TUP1-Beute-Expressionsplasmide sind 2 μm Ursprungsvektoren (2μ ori), bei denen der MET3-Promotor (pMET3) dazu verwendet wird, um die TUP1-Repressionsdomäne (TP1) zu exprimieren. TUP1 wird direkt von den Restriktionsendonukleasestellen, wie angegeben, gefolgt. TUP-1-Beute-Transkripte werden durch den ADH1-Terminator (tADH) abgeschlossen. Die pBDH-Plasmide enthalten das HIS3-Gen, während die pBDL-Plasmide (nicht gezeigt) das LEU2-Gen zur Selektion in Hefe enthalten. Die mit 1, 2 und 3 nummerierten pBDH- und pBDL-Plasmide (nicht gezeigt) sind identisch, mit der Ausnahme, dass die Mehrfachklonierungsstellen um ein einzelnes Nukleotid zueinander versetzt sind, um den Aufbau von in-frame-Fusionen zu vereinfachen und den Bibliotheksaufbau zu erleichtern.
8: Fließdiagramm, das eine Strategie zum Screenen von Bibliotheken auf neue Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung der nicht modifizierten Form des reprimierten Transaktivatorsystems veranschaulicht. In dem gezeigten Beispiel wird die von pBDH stammende Bibliothek verwendet, die eine his^–-Selektion erfordert; ein Screen mittels einer von pBDL stammenden Bibliothek ist identisch, mit der Ausnahme, dass die Selektion auf Bibliothekstransformanten das leu^–-Medium verwenden würde.
9: Schematische Darstellung von Säugetier-pT-TUP1-Beute-Expressionvektoren zum Durchführen des RTA-Systems in Säugetierzellen. Die pT-Plasmide verwenden die SV40-early-Promotorregion (SV40 early/ori) zur Expression der N-terminalen Repressionsdomäne von TUP1. Die für TUP1 kodierende Sequenz wird direkt von einer Mehrfachklonierungsstelle gefolgt, die mit den pM-Plasmiden identisch ist (36). Die TUP1-Beute-Trasnkripte werden durch das SV40-Polyadenylierungssignal (SV40 term.) abgeschlossen. Die pT1-, pT2- und pT3-Plasmide sind identisch, mit der Ausnahme des Leserahmens für die Mehrfachklonierungsstellen.
10: Schematische Darstellung der Verwendung des RTA-Systems zum Untersuchen von Inhibitoren einer spezifischen Protein-Protein-Wechselwirkung. Bild A: Eine eukaryontische Zelle wird aufgebaut, die die GAL4-Köder- und TUP1-Beutefusionen exprimiert, deren Wechselwirkung die Expression eines Reportergens hemmt. Bild B: Die Zugabe eines Inhibitors der Köder- und Beute-Wechselwirkung 41 bewirkt die Induktion des Reportergens, dessen Produkt biochemisch oder genetisch erfasst werden kann.
11: Balkendiagramm, das zeigt, dass das RTA-System die Wirkung der Serin-699-Phosphorylierung auf GAL4-GAL80-Wechselwirkung in vivo detektieren kann. Es wurden Hefe, die ein GAL1-LacZ-Reportergen enthält, und überexprimierendes Wildtyp-GAL4 (WT) oder die GAL4-S699A-Mutation (A699) mit Plasmiden transformiert, die GAL80 (GAL80), TUP1-GAL80 (Tup1/Ga180) oder eine Vektorkontrolle (Vektor) exprimieren. Zellen wurden bis zur mid-log-Phase wachsen gelassen und dann durch Bestimmen der beta-Galactosidaseaktivität auf LacZ-Transkription untersucht.
12: Balkendiagramm, das zeigt, dass die hemmende Wirkung der TUP1-Repressionsdomäne in einer Ausführungsform der RTA-Wechselwirkung SRB10 erfordert. Die Wildtyp-Hefe (WT) oder srb10^–-Hefe (srb10^–), die Wildtyp-GAL4 überexprimiert, das ein GAL1-LacZ-Reportergen enthält, wurden mit Plasmiden transformiert, die GAL80 (GAL80), TUP1 (Tup1), TUP1-GAL80 (Tup1:Ga180) oder eine Vektorkontrolle (Vektor) exprimieren. Zellen wurden bis zur mid-log-Phase wachsen gelassen und dann durch Bestimmen der beta-Galactosidaseaktivität auf LacZ-Transkription untersucht.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Ein Ausführungsbeispiel des RTA ist in 1 gezeigt. Das interessierende Köderprotein, das fähig ist die Transkription zu aktivieren, ist an eine DNA-bindende Domäne fusioniert. Die DNA-bindende Domäne-Köderfusion wird dann in einer Zelle exprimiert, die ein Reportergen enthält, welches stromaufwärts Bindungsstellen für die DNA-bindende Domäne hat. Wenn sie von sich aus exprimiert wird, sollte die Köderfusion die Reportergentranskription aktivieren. Das Beuteprotein ist an eine transkriptionelle Repressionsdomäne fusioniert, wie z.B. die TUP1-Repressionsdomäne. Wenn es in der gleichen Zelle wie die Köderfusion exprimiert wird, bringen spezifische Interaktionen zwischen den Köder- und Beute-Fusionsproteinen die Repressionsdomäne in die Nähe zu dem Reportergenpromotor und verursacht die Inhibition der Transkription. Die spezifische Interaktion zwischen den Köder- und Beute-Fusionsproteinen kann deshalb durch Prüfen auf reduzierte Expression des Reportergens detektiert werden. Verschiedene Reporter können verwendet werden, z.B. beta-Galactositaseaktivität, die durch das LacZ-Reportergen produziert wird. Die Aktivität des Reportergens kann auch durch direkte Analyse der Menge der von dem Reportergen transkribierten mRNA bestimmt werden.
Kontraselektierbare (Gegenselektierbare) Reportergene für die Detektion der transkriptionellen Repression. Weil Protein-Protein-Interaktion im RTA-System die Inhibition der Transkription verursacht, kann die genetische Selektion von Zellen, die spezifische Protein-Protein-Interaktionen unter Verwendung des RTA-Systems zeigen, mit Reportergenen erreicht werden, gegen deren Expression selektiert werden kann, oder kontraselektiert (gegenselektiert) werden kann. Spezielle kontraselektierbare Gene sind hier beispielsweise gezeigt, um Eigenschaften solcher Gene zu illustrieren; Fachleute werden verstehen, dass das RTA-System der Erfindung auch mit anderen kontraselektierbaren Reportergenen verwendet werden kann.
Eine Anzahl von Genen, die für Kontraselektionsstrategien in Saccharomyces verwendet wurden, wie in Tabelle 1 zusammengefasst ist, können in dieser Erfindung verwendet werden. Vorzugsweise sind die verwendeten kontraselektierbaren Gene URA3, CAN1 oder die GAL1-Gene (wie in Tabelle 1 beschrieben).
Tabelle 1
Das URA3-Gen kodierte Orotidindecarboxylase, welches für die de novo-Biosynthese von Pyrimidinnukleotiden erforderlich ist. Hefezellen, denen ura3 fehlt, benötigen Uracil um zu wachsen. 5-Fluororotsäure (5-FOA) ist ein Pyrimidinanalog, das in 5-Fluoruracil durch die Aktion von Orotidylinatdecarboxylase (URA3) umgewandelt werden kann. 5-Fluoruracil ist sehr toxisch zu Hefezellen und deshalb können Zellen, die URA3 exprimieren, nicht in der Anwesenheit von 5-FOA wachsen, was eine Kontraselektion für URA3-Expression bereitstellt.
Das CAN1-Gen kodiert ein Membranarginintransporterprotein. Zellen, die Arginin de novo synthetisieren können, benötigen kein CAN1-Enzym um zu wachsen. Canavanin ist ein toxisches Argininanalog, das in die Zelle durch das CAN1-Membranarginintransporterprotein transportiert werden kann. Deshalb können Zellen, die CAN1 produzieren nicht in der Anwesenheit von Canavanin wachsen, weil die toxische Substanz in die Zelle transportiert wird.
Das GAL1-Gen kodiert die Galactokinase, die Galactose-1-phosphat aus Galactose produziert; dies ist die erste Reaktion in dem Stoffwechselweg, der Galactose in Glucose umwandelt. Das Galactoseanalog 2-Deoxygalactose wird durch GAL1 in die toxische Substanz 2-Deoxygalactose-1-phosphat umgewandelt, welche sich anreichert, weil sie nicht durch die Stromabwärtsenzyme im Galactosekatabolismus verwendet werden kann. Zellen, die GAL1 exprimieren, können nicht auf 2-Deoxygalactose wachsen.
Die Repression der URA3, CAN1 und GAL1-Gentranskription kann durch die Fähigkeit der Zellen in Anwesenheit von 5-FOA, Canavanin bzw. 2-Deoxygalactose zu wachsen, detektiert werden.
Komponenten, um genetische Screens mit dem RTA-System durchzuführen.

1) RTA-Wirte. Zellen, die für den RTA-Assay verwendet werden, werden typischerweise mit Vektoren transformiert, die die Köder- und Beute-Fusionsproteingene enthalten. Um die Selektion der transformierten Zellen zu ermöglichen, sollten Zellen zum Durchführen der RTA-genetischen Screens vorteilhafterweise Mutationen in den Genen enthalten, welche als selektierbare Marker auf solchen Plasmiden verwendet werden. Zusätzlich sollten die Stämme Reportergene haben, wie z. B. kontraselektierbare Gene, welche für die Selektion auf RTA-Interaktionen verwendet werden können. In beispielsweise Hefezellen, können GAL4 DBD Köderexpressionsplasmide mit einem TRP1-Marker verwendet werden und TUP1-Beuteexpressionsplasmide können mit entweder einem HIS3 oder LEU2-Marker verwendet werden. In solch einer Ausführungsform wird die Selektion der Köder- und Beuteplasmide in Wirtstämmen erleichtert, denen solche Funktionen fehlen, genannt trp1^–, his3^–, oder leu2^–. Die Stämme können auch can1^– und ura3^– sein, um die Verwendung der CAN1 und URA3-Gene als Reporter für den RTA-Assay zu ermöglichen. In Ausführungsformen, in denen GAL4's DNA-bindende Domäne für die Köderfusionsproteine verwendet wird, sollte der Hefestamm auch gal4^– sein, so dass die Expression der Reportergene einzig von der GAL4-Transaktivator-Köderfusion abhängig ist. Als Zusammenfassung, solch ein Hefestamm kann den genetischen Hintergrund trp1, his3, ura3, can1 haben und Kombinationen von integrierten URA3, CAN1 und LacZ-Reportergenen tragen, und zwar unter der Kontrolle von Promotoren, die Bindungsstellen für GAL4 (siehe unten) tragen. Das endogene Wildtyp GAL1-Gen kann auch für den genetischen Screen durch Kontraselektion mit 2-Deoxygalactose verwendet werden.
2) Reportergene. Wirtszellen für RTA-System-Assays können auch Reportergene beinhalten, welche Promotoren mit Bindungsstellen für die DNA-bindende Domäne des Köderfusionsproteins, das verwendet werden wird, haben. Alternativ können solche Reportergene transient in Wirtszellen auf Vektoren zum Zwecke der Durchführung des RTA-Assays eingeführt werden.

In einer Ausführungsform können Hefestämme, die spezifische Protein-Protein-Interaktionen in einem RTA-Assay zeigen, genetisch selektiert werden unter Verwendung von kontraselektierbaren Reportergenen unter der Kontrolle von Promotoren mit Bindungsstellen für GAL4. In solch einer Ausführungsform ist das GAL1-URA3-Reportergen so konstruiert, dass seine natürlichen stromaufwärts regulatorischen Sequenzen mit der stromaufwärts Aktivierungssequenz (UAS) vom GAL1-Promotor, welcher vier starke Bindungsstellen für das GAL4-Protein (35) enthält, ersetzt worden sind. Die GAL1-LacZ und GAL1-CAN1-Reportergene können den GAL1-Promotor, einschließlich der UAS und URS, das TATA-Element und die kodierenden Sequenzen für die ersten wenigen Aminosäuren von GAL1-Protein enthalten, das in-frame mit dem E.coli LacZ-Gen bzw. dem CAN1-Gen fusioniert ist (siehe 5). Weil das LacZ-Gen aus E.coli stammt und kein Signal für die Polyadenylierung von Transkripten enthält, kann eine transkriptionale Terminationssequenz, die aus dem Hefe-ADH1-Gen stammt, der LacZ kodierenden Sequenz folgend, insertiert werden (5).
Reportergene können in Wirtshefestämme durch homologe Rekombination unter Verwendung der Standard „Zwei-Schritt"-Technik, welche flankierende DNA-Duplikationen zur Sicherstellung ihrer Stabilität eliminiert, integriert werden (40). Dies wird wie folgt erreicht. Die Reportergene werden in das Integrationslocusgen auf Plasmiden insertiert, welche auch den URA3-Marker enthalten. Reporterplasmide werden unter Verwendung einer Restriktionsendonuklease linearisiert, welche innerhalb des Integrationsgens schneidet. Die linearisierte DNA wird in ura3^– -Hefe transformiert und die transformierte Hefe wird auf einem Minimalmedium, dem Uracil fehlt, plattiert, um auf Plasmidintegranten zu selektieren. URA⁺-Transformanten werden dann nicht-selektiv für mehrere Generationen wachsen gelassen und auf 5-FOA plattiert, um auf den Verlust des URA3-Gens durch Rekombination zu selektieren. Ein Teil der 5-FOA-resistenten Hefekolonien wird das Reportergen, das an den definierten Locus integriert ist, behalten; die übrigen Kolonien werden typischerweise das integrierende Plasmid vollständig verloren haben.
Reportergentransformanten können durch Southern-Blot-Analyse genomischer Hefe-DNA identifiziert werden. Durch diese Technik können Hefestämme konstruiert werden, welche mehrere Reportergene ohne Verlust von selektierbaren Markern haben. Das GAL1-URA3-Fusionsgen wird in das Hefechromosom am ADE2-Locus integriert, GAL1-CAN1 ist am LYS2-Locus integriert und die GAL1-LacZ-Fusion ist am MFA2 integriert (siehe Tabelle 2 und 5). Tabelle 2

3) Köderexpressionsplasmide. Vektoren zur Expression des Köder-Fusionsproteins, das eine DNA-bindende Domäne hat, können eine Insertionsstelle in-frame mit einer Sequenz, die für die DNA-bindende Domäne kodiert, enthalten. Insertionen an solch einer Insertionsstelle erlauben die Expression eines Köder-Fusionsproteins, das die DNA-bindende Domäne hat.

In einer Ausführungsform können die Köder-Fusionsproteine für RTA-genetische Screens als Fusionen mit den N-terminalen 147 Aminosäuren von GAL4 konstruiert werden. Dieser Teil von GAL4 umfaßt die DNA-bindende Domäne (siehe 2). Diese DNA-bindende Domäne bindet an 17-Basenpaarelemente innerhalb der stromaufwärts aktivierenden Sequenz für Galactose, aber aktiviert nicht die Transkription. Für das RTA-System kann diese DNA-bindende Domäne an eine heterologe Aminosäureseguenz, die eine Transkriptions-aktivierende Domäne hat, fusioniert werden. Eine alternative DNA-bindende Domäne ist die DNA-bindende Domäne von E.coli LexA-Protein.
Die Sensitivität des RTA-Assays kann abhängig vom Level der Köderexpression variieren. Um Ausführungsformen von RTA mit verschiedenen Leveln der Köderexpression herzustellen, können Plasmide konstruiert werden, die den GAL4-Köder in verschiedenen Leveln exprimieren. Zum Beispiel sind die pY1-, pY2- und pY3-Plasmide, die hier vorgestellt werden, ARS-CEN-Vektoren, welche auf einer einzelnen Kopie pro Hefezelle gehalten werden (36). Diese Plasmide verwenden den ADH1-Promotor, um GAL4-DNA-bindende Domäne-Fusionen zu exprimieren. Die pY-Plasmide produzieren moderate bis hohe Level an GAL4-DBD-Köderfusionsexpression. Es sind auch die pG1-, pG2- und pG3- Plasmide offenbart, welche die Expression von niedrigen Leveln an Köderfusion ermöglichen können. Diese Plasmide sind identisch zu den pY-Vektoren, außer dass die GAL4-DBD-Köderfusionen von GAL4's eigenem schwachen Promotor exprimiert werden (6). Beide Sätze an Plasmiden haben das TRP1-Gen, um die Selektion und den Erhalt im TRP1^– Hefestamm zu ermöglichen. Die mit 1, 2 und 3 nummerierten pY- und pG-Vektoren haben mehrere Klonierungs(insertions)stellen, die der GAL4 DNA-bindenden Domäne kodierenden Sequenz folgen, versetzt angeordnet durch ein einzelnes Nucleotid, um die Konstruktion von in-frame-Fusionen zu erleichtern. Die multiplen Klonierungsstellen werden direkt gefolgt von translationalen Stoppkodons in allen drei Leserahmen, und der transkriptionalen Terminationssequenz vom ADH1-Promotor (6, (36)).

4) Beutevektoren und Bibliotheken. Um einen Vektor zu konstruieren, der für ein Beutefusionsprotein kodiert, kann eine interessierende Aminosäuresequenz in-frame in eine kodierende Sequenz für eine transkriptionale Repressordomäne insertiert werden. Die Expression des rekombinanten Gens produziert das Beutefusionsprotein mit einer transkriptionalen Repressordomäne und der interessierenden Aminosäuresequenz für den RTA-Assay. Die Position der Repressordomäne kann variieren. Einige Repressordomänen können am C-Terminus des Fusionsproteins funktionieren, andere können am N-Terminus funktionieren. Potentielle Repressordomänen können auf ihre Funktion als Teil eines Fusionsproteins getestet werden, wie es unten in dem „Beispiel"-Abschnitt für die TUP1-Repressordomäne offenbart ist.

Bestimmte Repressordomänen können ihren Effekt durch Interaktion mit spezifischen Teilen der transkriptionalen Maschinerie ausüben. Zum Beispiel wird die Holoenzym-assoziierte Cyclin-abhängige Proteinkinase SRB10 für die Repression der Transkription durch TUP1 benötigt (48). Wie unten im „Beispiel"-Abschnitt ausgeführt wird, kann die TUP1-Repressordomäne nicht in SRB10^–Stämmen funktionieren. Assays ähnlich zu dem Assay, der in dem „Beispiel"-Abschnitt offenbart ist, können ausgeführt werden, um zu bestimmen, ob andere Repressordomänen ähnliche Erfordernisse für die Interaktion mit speziellen Teilen des transkriptionalen Apparates haben.
In einer Ausführungsform um die Sensitivität der Detektion spezifischer RTA-Interaktionen zu variieren, kann das Beutefusionsprotein in vorteilhafter Weise auf einem höheren Level exprimiert werden als das Köderfusionsprotein. In einer solchen Ausführungsform der Erfindung kann das TUP1-Beuteexpressionsplasmid die 2 Mikron Ring(2μ) Replikationssequenz enthalten, welche sich mit 40–100 Kopien pro Hefezelle repliziert. In einer solchen Ausführungsform kann das Beutefusionsprotein im allgemeinen relativ zum Köderfusionsprotein überexprimiert sein.
Das Gen für das Beutefusionsprotein kann vorteilhafterweise unter der Kontrolle eines reprimierbaren Promotors platziert sein. In einer Ausführungsform können die Beutefusionsvektoren (pBDH und pBDL, siehe 7) den MET3-Promotor für die Expression der TUP1-Beutefusionen enthalten. Der MET3-Promotor wird in Hefe, die in Methionin wächst, reprimiert (11). Zur Bestätigung von Protein-Protein-Interaktionen, die durch genetische Screens unter Verwendung von RTA identifiziert werden, kann es vorteilhaft sein, die Expression von TUP1-Beutefusion nach anfänglicher Selektion zu reprimieren, um sicherzustellen, dass die GAL4-Köderfusion nicht ihre Fähigkeit verloren hat, um die Transkription zu aktivieren (siehe unten). Der MET3-Promotor kann stromaufwärts der kodierenden Sequenz für die N-terminale Repressionsdomäne von TUP1 (Aminosäuren 1–200) fusioniert sein, welche direkt durch eine multiple Klonierungsstelle gefolgt sein kann (siehe 7). Die pBDH- und pBDL-Plasmide mit den Nummern 1, 2 und 3 haben die multiple Klonierungsstelle versetzt angeordnet durch ein einzelnes Nukleotid, um die Wahrscheinlichkeit der Generierung von in-frame-Fusionen mit Insertionen von zufälliger DNA („Random-DNA") und cDNA-Fragmenten zu erhöhen. Transkripte des MET3-Promotors werden durch den ADH1-Terminator terminiert. In dieser Ausführungsform haben die pBDH TUP1-Köderexpressionsvektoren das HIS3-Gen, welches die Selektion und den Erhalt in his3^–Hefestämmen erlaubt, während die pBDL-Plasmide identisch sind, außer dass der selektierbare Marker LEU2 ist.
Die pBDH und pBDL-Plasmide können verwendet werden, um vorher klonierte DNA-Fragmente zur Charakterisierung von bekannten oder vermuteten Protein-Protein-Interaktionen zu insertieren. Die Plasmide sind auch bestimmt für die Konstruktion von cDNA-Bibliotheken aus Geweben oder Organismen, welche einen hohen Anteil an gespleißten Transkripten haben, oder genomische Bibliotheken für niedere Eukaryoten und Prokaryoten, welche wenige Introns haben.
Genomische Bibliotheken für Organismen, wie Saccharomyces, können hergestellt werden durch Durchführen eines partiellen Verdaus von genomischer DNA mit der Endonuklease Sau3A1, um eine Population von Fragmenten innerhalb eines gewünschten Größenbereichs zu erzeugen, z.B. 400–1000 Nukleotide im Durchschnitt. Die zufällig bzw. willkürlich verdaute DNA kann dann an einen Pool der drei pBDH- oder pBDL-Plasmide, die mit BamH1 verdaut sind, legiert werden, was Enden erzeugt, die mit Sau3A1 kompatibel sind. Weil die Klonierungsstellen in den pBDH- und pBDL-Vektoren durch ein einziges Nukleotid versetzt angeordnet sind, sollte theoretisch jedes partiell verdaute genomische Fragment durch in-frame-Fusionen innerhalb der Bibliothek repräsentiert sein. cDNA-Bibliotheken können aus mRNA hergestellt werden, die aus Gewebe, einem Zelltyp oder interessierenden Spezies extrahiert worden ist. Beim Konstruieren von DNA-Bibliotheken kann eine direktionale Klonierungsstrategie (26) verwendet werden, so daß die cDNA-Inserts in der Sinn-Orientierung relativ zur TUP1 kodierenden Sequenz exprimiert sind. cDNA kann auch aus polyadenylierter mRNA hergestellt werden, gereinigt durch Affinität mit Oligo dT und revers transkribiert mit zufälligen Primern enthaltend einen 5'BamH1-Linker, unter Verwendung von 5-Methyl-Cytidintriphosphat in der Reaktion. Die cDNA-Synthese des zweiten Strangs kann dann folgend auf den Verdau mit RNAse H normal ausgeführt werden. Das 5'-Ende der cDNA kann mit S1-Nuklease stumpf gemacht werden („blunt") und die cDNA-Fragmente an einen EcoR1-Linker ligiert werden. Die Linker an den Enden der cDNAs können dann mit EcoR1 und BamH1 verdaut werden; Einbau von 5-Methyl-cytidin in der anfänglichen reversen Transkriptionsreaktion schützt gegen Verdau von internen EcoR1- und BamH1-Stellen. cDNA-Fragmente können dann in einen Pool der drei pBDH- oder pBDL-Plasmide, welche mit EcoR1 und BamH1 verdaut worden waren, kloniert werden.
Um die Konstruktion von großen repräsentativen TUP1-cDNA-Fusionsbibliotheken zu vereinfachen, können die pBDH- und pBDL-Plasmide in Lambda-Phagen Ersatzvektoren insertiert werden, so dass das Plasmid durch loxP-Stellen, das Ziel-cis-Element für Cre-Rekombinase, flankiert ist. Sobald die cDNA in die Lambdavektoren kloniert worden ist, kann die gesamte Bibliothek als Plasmide freigesetzt werden durch Infektion der Phagenbibliothek in E.coli-Zellen, die Cre-Rekombinase exprimieren (8).
RTA genetischer Screen. Um Aminosäuresequenzen zu identifizieren, die mit einer interessierenden transkriptionalen Aktivatoraminosäuresequenz interagieren, kann eine geeignete Wirtszelle mit einem Gen für das Köderfusionsprotein, das die transkriptionale Aktivatorsequenz aufweist und mit einem Gen für das Beutefusionsprotein, das die transkriptionale Repressordomäne aufweist, kotransformiert werden.
In einem Ausführungsbeispiel wird ein Hefestamm, der die GAL4-ansprechenden Reportergene trägt, mit einem GAL4-Ködertransaktivatorexpressionsplasmid (konstruiert in entweder pY- oder den pG-Vektoren) transformiert; Transformanten, die das GAL4-Köderexpressionsplasmid aufnehmen und exprimieren, können durch Wachstum auf einem Medium, dem Tryptophan fehlt, identifiziert werden. Die GAL4-Ködertransaktivatorfusion, die in TRP⁺-Transformaten exprimiert wird, sollte die Expression der GAL4-ansprechenden Reportergene verursachen, so dass sie blaue Kolonien auf einem Medium enthaltend X-gal, ein chromogenes Substrat für beta-Galactosidase produziert durch das LacZ-Gen, bilden. Die Aktivierung der Reportergene sollte es dem Stamm auch unmöglich machen auf 5-FOA, 2-Deoxygalactose und Canavanin zu wachsen. Der Tester-Hefestamm, der mit dem GAL4-Köderexpressionsplasmid tranformiert worden ist, sollte auch fähig sein auf einem Medium zu wachsen, dem Uracil fehlt, weil der GAL4-Transaktivatorköder auch die Expression von URA3 verursacht.
Der Hefestamm, der das Köderfusionsprotein exprimiert, kann mit einer Plasmidbibliothek, die in pBDH- oder pBDL-Vektoren konstruiert worden ist, transformiert werden; die Bibliothekstransformanten können dann auf Agarplatten, denen Tryptophan und Histidin bzw. Leucin fehlt, selektiert werden. Kolonien aus der Bibliothekstransformation können in Minimalmedium enthaltend 25% Glycerin geschabt werden, die Zellsuspension kann dann „gepoolt" werden und in flüssigem Stickstoff als Aliquots gefroren aufbewahrt werden.
Um auf TUP1-Beutefusionsproteine, die mit den GAL4-Köderfusionsproteinen interagieren, zu selektieren, können die Bibliothekstransformanten auf ein Medium gebracht werden und plattiert werden, welches auf die Repression der GAL4-ansprechenden Reportergene selektiert. Bibliothekstransformanten können anfänglich auf Klone selektiert werden, die Wachstum auf Canavanin verursachen, was die Repression der GAL1-CAN1-Reportergene anzeigt. Klone, die auf Canavanin wachsen, können dann auf Wachstum auf 5-FOA und 2-Deoxygalactose getestet werden. Die Repression der GAL1-LacZ-Reportergene sollte auch die Bildung von weißen Kolonien auf X-gal-Platten verursachen.
Die Repression der Reportergene kann verursacht werden durch:

a) eine RTA-Interaktion zwischen dem GAL4-Köder transkriptionalen Aktivator und der TUP1-cDNA-Fusion, so dass die TUP1-transkriptionale Repressionsdomäne die Reportergenexpression inhibiert oder
b) könnte resultieren aus dem Verlust der Expression der GAL4-Köderfusion wegen einer Mutation im Köderexpressionsplasmid. Die Verwendung von vier verschiedenen Reportergenen in solch einem Screen reduziert größtenteils die Wahrscheinlichkeit, dass Wachstum unter den kontraselektierbaren Bedingungen durch Mutationen der Reportergene verursacht sein könnte. Daher, um zwischen den möglichen Möglichkeiten zu unterscheiden, können Klone, in denen alle Reportergene reprimiert sind, auf Agarplatten enthaltend Methionin wachsengelassen werden, um die Expression der TUP1-Beutefusionen zu inhibieren, wegen des MET3-Promotors. Auf Methionin-enthaltendem Medium sollte die GAL4-Köderfusion frei sein, um die Transkription zu aktivieren, weil die TUP1-Beutefusion nicht exprimiert wird. Dies kann bestätigt werden durch Transferieren von Kolonien auf X-gal-Platten, welche Methionin enthalten oder denen Methionin fehlt. Klone, die TUP1-Beutefusionen produzieren, interagieren mit dem GAL4-Köder, und in denen der GAL4-Köder intakt ist, sollte blaue Kolonien auf X-gal-Platten enthaltend Methionin bilden, aber weiße Kolonien auf X-gal ohne Methionin.

Weitere Kontrollassays können ausgeführt werden, um zu demonstrieren, dass die TUP1-Beutefusion spezifisch mit dem interessierenden Köder interagiert und nicht die Repression der Transkription durch Interaktion mit der DNA-bindenden Domäne von GAL4, oder einem anderen Protein, das stromaufwärts der Reportergene bindet, verursacht. Dies kann beispielsweise durchgeführt werden durch Transformieren des erhaltenen TUP1-Beuteexpressionsplasmids in einen Hefestamm, der ein unverwandtes GAL4-DBD-Transaktivatorköderfusionsprotein exprimiert.
Plasmidklone identifiziert durch die vorangegangenen Tests können aus Hefe extrahiert werden und durch Transformation in E.coli erhalten werden. Plasmid DNAs können unter Verwendung von Oligonucleotidprimern, die pBDH- und pBDL-Klonierungsstellen flankieren, sequenziert werden.
Modifizierung des RTA-Systems, um Protein-Protein-Interaktionen mit Nicht-Transaktivatoren zu detektieren.
Verschiedene Modifikationen können an dem RTA-System gemacht werden, um die Detektion von Protein-Protein-Interaktionen, welche Köderfusionsproteine, die nicht die Transkription aktivieren, involvieren. Dies stellt zusätzliche Flexibilität für das System bereit, weil die Interaktionen von interessierenden Aminosäuresequenzen untersucht werden können, ob eine solche Sequenz die Transkription aktiviert oder nicht.

a) Modifikation der Reportergene. Eine Ausführungsform von RTA zur Verwendung mit nicht-transaktivierenden Aminosäuresequenzen beinhaltet die Modifikation von Reportergenen, sodaß sie ein stromaufwärts Element ansprechend auf ein Transaktivatorprotein (d.h. ein Transaktivatorprotein, das nicht das Köderfusionsprotein ist) haben. Die Reportergene zum Testen der Interaktion von Aminosäuresequenzen, welche nicht-transkriptionale Aktivatoren sind, können identisch zu GAL1-, CAN1-, GAL1-URA3- und GAL1-LacZ-Reportern wie oben beschrieben (5) sein, außer dass die Promotoren für solche Reportergene weiter eine Bindungsstelle für einen zusätzlichen transkriptionalen Aktivator enthalten. In einer Ausführungsform kann solch eine Bindungsstelle in dem Promotor stromaufwärts von UAS_G insertiert sein, enthaltend die GAL4-Bindungsstellen (siehe Tabelle 2). In einer Ausführungsform kann GCN4 als der transkriptionale Aktivator für die Reportergene verwendet werden. GCN4 ist normalerweise involviert bei der Aktivierung der Transkription von Genen, die für die Synthese von Histidin erforderlich sind, und bindet an Elemente innerhalb der stromaufwärts aktivierenden Sequenz für die HIS-Gene (UAS_H). Wo es eine GCN4-Bindungsstelle in den Promotoren der Reportergene gibt, in Abwesenheit der Interaktion zwischen dem Beuterepressorfusionsprotein, wie z.B. TUP1-Beute, und dem DNA-bindenden Köderfusionsprotein, wie z.B. GAL4-Köder, wird GCN4 die konstitutive Expression der Reportergene, wie z.B. H-GAL1-CAN1, H-GAL1-URA3 und H-GAL1-LacZ verursachen, sodaß der Hefestamm blaue Kolonien auf X-gal bilden wird und wird nicht fähig sein auf Canavanin oder 5-FOA zu wachsen. Jedoch wird eine Interaktion zwischen den Beute- und Köder-Fusionen die Repressionsdomäne in die Nachbarschaft des Promotors bringen und die Reportergentranskription inhibieren.
b) Modifikationen der Köder-Fusionsvektoren. Alternative Ausführungsformen der Erfindung können verwendet werden, um Interaktionen von Fusionsproteinen enthaltend heterologe Nicht-Transaktivatoraminosäuresequenzen zu untersuchen. Eine solche Ausführungsform enthält modifizierte Vektoren, in denen das Köderfusionsprotein selbst transaktivierende Aktivität besitzt. In einem Aspekt der Erfindung kann die transkativierende Aktivität bereitgestellt werden durch Verwendung der Aminosäuren 1–238 von GAL4, um das Köderfusionsprotein zu machen (eher als nur die DNA-bindende Domäne Aminosäuren 1–147 von GAL4 zu verwenden). Die GAL4-Aminosäuren 148–238 enthalten die aktivierende Region 1 (siehe 2). Hybridproteine, die durch Fusionieren interessierender Köder an GAL4 (1–238) hergestellt worden waren, können die Transkription aktivieren, und zwar wegen der Anwesenheit der GAL4 aktivierenden Region. Ein dreiteiliges Köderfusionsprotein bestehend aus der GAL4 DNA-bindenden Domäne, der GAL4 aktivierenden Region 1 und dem interessierenden Proteinfragment können verwendet werden, um Bibliotheken zu screenen mit den Standard GAL1-CAN1, GAL1-URA3 und GAL1-LacZ-Reportern, wie oben beschrieben. Ein Mangel dieser Strategie ist, dass Proteine, die mit der aktivierenden Region 1 interagieren, um ihre aktivierende Funktion zu maskieren, ein positives Ergebnis in einem RTA-Assay hervorrufen können, ebenso solche Proteine, welche spezifisch mit dem Köder interagieren. Wie oben für die Standard-RTA-Assays erwähnt, können Klone, die Köderfusionen exprimieren, welche die Repression der Reportergene verursachen, auf Spezifität in Hinsicht auf den Köder getestet werden. In einer Ausführungsform des RTA, welcher GAL(1–238)-Fusionsproteine als Köder verwendet, können potentiell positive Beuteklone in einen Stamm retransformiert werden, der GAL4(1–238) ohne eine heterologe Aminosäuresequenzfusion exprimiert, um zwischen Beutefusionen, die mit der heterologen Aminosäuresequenz in der Köderfusion interagieren, von solchen zu unterscheiden, die mit GAL4's DNA-bindender Domäne oder aktivierenden Region 1 interagieren.

Adaptionen des RTA-Systems für andere Zellen.
Transkriptionale Repressoren ähnlich zu Saccharomyces TUP1-Protein wurden in Zellen anderer Eukaryoten (19) identifiziert, einschließlich WT1, verbA, Egr-1, YY1, AdE1B, SCIP, kid-1, Znf2 und kox1 (siehe Tabelle 7, Ref. 35). Das RTA-System der Erfindung kann in jeder dieser Zellen ausgeführt werden, in denen geeignete Komponenten des Systems verfügbar sind: Repressordomänen für die Beutefusionsproteine, DNA-bindende Domänen für die Köderfusionsproteine und Reportergene zur Detektion von Interaktionen zwischen den Köder- und Beute-Fusionsproteinen.
Das RTA-System kann adaptiert werden zur Verwendung in Säugetierzellen, um Protein-Protein-Interaktionen mit Transaktivatoren und Nicht-Transaktivatoren, für welche molekulare Klone verfügbar sind, zu charakterisieren. In einer Ausführungsform können die GAL4-Transaktivatorköderfusionen unter Verwendung der Säugetierexpressionsplasmide pM1, pM2 und pM3 (36) konstruiert werden. Die relevanten Kennzeichen dieser Plasmide beinhalten: der starke „SV40 early region"-Promotor, welcher die Expression der GAL4-DBD-Fusionen steuert; eine multiple Klonierungsstelle, welche versetzt angeordnet ist durch ein einzelnes Nukleotid in den 1, 2 und 3 nummerierten Plasmiden, um die Konstruktion von in-frame-Fusionen zu erleichtern; translationale Terminationscodons in allen drei den Klonierungsstellen folgenden (Lese)rahmen; und ein transkriptionales Terminationssignal aus SV40-Virus, direkt den translationalen Stoppkodons folgend. Ähnliche Vektoren können konstruiert werden für die Expression von TUP1-Fusion Beutefusionen in Säugetierzellen, genannt pT1, pT2 und pT3 (siehe 9).
Eine Vielzahl von verschiedenen Reportergenen wurden zur Verwendung in Säugetierzellen beschrieben und können verwendet werden, um die Transaktivierung durch Köderfusionen und den repressiven Effekt einer RTA-Interaktion zwischen Köder- und Beute-Fusionsproteinen zu messen. In einer Ausführungsform hat das Plasmid pG5EC einen minimalen Promotor bestehend aus 5 GAL4-Stellen insertiert direkt stromaufwärts des Adenovirus E1B TATA-Boxelements und den bakteriellen Chloramphenicolacetyltransferase(CAT)gens (36). Ähnlich hat das Plasmid pG5tkCAT 5 GAL4-Bindungsstellen stromaufwärts eines verkürzten Derivats des Herpesvirus Thymidinkinase(tk)gens. CAT-Enzymaktivität kann in Extrakten von Zellen detektiert werden, was die Messung der Expression der Reportergene vereinfacht. Wenn in Säugetierzellen transfektiert, produziert das pG5EC-Reportergen vernachlässigbare CAT-Aktivität, außer es ist ko-transfektiert mit einem Plasmid, das eine GAL4-Ködertransaktivatorfusion produziert. Im Gegensatz dazu produziert der pG5tkCAT-Reporter eine kleine Menge eigener CAT-Aktivität, aufgrund des verbleibenden „cis-acting"-Elements innerhalb des tk-Promotors. Ko-Transfektion eines GAL4-Ködertransaktivatorexpressionsplasmids verursacht signifikant erhöhte CAT-Aktivität, die durch den pG5tkCAT-Reporter erzeugt wird.
Um die Interaktion zwischen den Köder- und Beute-Fusionsproteinen zu messen, kann das Reportergenplasmid in Säugetierzellen mit sowohl den Köder- und Beute-Expressionsplasmiden ko-transfektiert werden. In einer Ausführungsform kann die Interaktion zwischen den zwei Fusionsproteinen detektiert werden durch verringerte Produktion von CAT-Aktivität verursacht durch die TUP1-Beutefusion relativ zu einer Kontrollprobe, in der das GAL4-Köderfusion-Expressionsplasmid mit dem ursprünglichen TUP1-Expressionsplasmid ohne ein Insert ko-transfektiert ist. Ein Vorteil der Verwendung des pG5tkCAT-Reportergenkonstrukts ist, dass die Köderfunktion nicht notwendigerweise die Transkription von sich aus zu aktivieren hat. Die Interaktion von GAL4-Köder mit TUP1-Beute sollte einen Rückgang in der erhöhten Basaltranskription dieses Reportergens verursachen.
Bekannte andere sich von CAT unterscheidende Reportergene können auch für RTA in Säugetierzellen verwendet werden. Diese beinhalten Feuerfliegen-Luciferase, sekretierte alkalische Phosphatase (SEAP) (4), beta-Galactosidase (lacZ) (20), die grünen oder blauen fluoriszierenden Proteine (GFP, BFP) (1) oder Zelloberflächenmarker wie sie Hemaglutinin (HA) hat, oder CD2 (13). Einige dieser Reportergene können besser als das CAT-Gen für Anwendungen verwendbar sein, in denen automatisierte Detektionsmethoden zum Einsatz kommen.
Modifikationen können an dem Säugetier-RTA-System gemacht werden, was das Screenen von Bibliotheken auf neue interagierende Proteine in Säugetierzellen erlaubt. Ein Säugetierzellen-Standard-2-Hybrid-Assay wurde beschrieben, welcher das Screenen von Bibliotheken erlauben könnte (49). Solch ein Screeningsystem könnte für RTA-Assays durch Auswahl geeigneter Repressoren und DNA-bindenden Domänen für die Fusionsproteine adaptiert werden und die Annahme geeigneter Markergene in Übereinstimmung mit der vorliegenden Offenbarung.
Verwendung des RTA-Systems zur Identifizierung und Charakterisierung spezifischer Protein-Protein-Interaktions-Inhibitoren. Das RTA-System der Erfindung kann adaptiert werden zur Verwendung beim Screenen und Charakterisieren spezifischer Inhibitoren von Protein-Protein-Interaktionen. Ein Inhibitor kann jegliche kleine molekulare Verbindung, jegliches Lipid, Peptid, Polypeptid oder jegliche Nukleinsäure sein, welche an das Testsystem durch Expression oder exogenen Zusatz zugeführt werden kann. Das RTA-System kann zur Verwendung in einer Vielzahl von Zellen, einschließlich Hefe- oder Säugetierzellen adaptiert werden, um auf Inhibitoren von Protein-Protein-Interaktionen zu screenen.
Weil Protein-Protein-Interaktionen in dem RTA-System durch Repression eines Reportergens detektiert werden, wird die Inhibition einer Interaktion zwischen den Köder- und Beute-Fusionen in dem RTA-System eine Induktion der Reportergene (siehe 10) induzieren. Dieser fundamentale Unterschied zwischen dem RTA und dem 2-Hybrid- und Interaktions-Falle-System des Standes der Technik stellt einen wichtigen Vorteil beim Testen von Protein-Protein-Interaktionen bereit, weil die Inhibition eher in einem positiven als in einem negativen Signal resultiert. Die Detektion von eher einem positiven als einem negativen Signal ist vorteilhaft, weil sie dazu neigt, falsche Resultate zu minimieren, welche erhalten werden können, weil einige Faktoren die sich von einer spezifischen interessierende Interaktion unterscheiden, das Assaysystem unterbrochen haben und ein negatives Signal verursacht haben.

a) Assay spezifischer Protein-Protein-Interaktions-Inhibitoren. In einer Ausführungsform können Inhibitoren einer spezifischen Protein-Protein-Interaktion getestet werden durch zuerst Konstruieren eines Hefestamms, der die Köder- und Beutefusionsproteine exprimiert, wie z.B. GAL4 DBD-Köder- und TUP1-Beutefusionen, welche die spezifischen interessierenden Interaktionen darstellen. Interaktion zwischen den Köder- und Beutefusionen wird die Repression der Reportergene, wie z.B. der GAL4-abhängigen Reportergene, verursachen. Wenn eine Substanz zu der Hefe hinzugefügt wird, welche die Interaktion zwischen den Köder und Beute-Fusionsproteinen verhindert, wird das Köderfusionsprotein, wie z.B. eine GAL4-Köderfusion, frei werden, um die Transkription zu aktivieren, was in der Expression von Reportergenen, wie z.B. GAL4-abhängigen Reportergenen (siehe 10) resultiert. Falls die oben genannten GAL4-abhängigen Reportergene verwendet werden, wird ein spezifischer Inhibitor verursachen, dass der Hefestamm sensitiv auf die Anwesenheit von Canavanin, 2-Deoxygalactose und 5-FOA wird, weil die GAL-CAN1, endogenen GAL1 und GAL1-UR3-Reportergene exprimiert werden.

Es könnte nützlich beim Test auf Inhibitoren sein, ein positives Signal bereitzustellen, um die Expression des Reportergens bzw. der Reportergene anzuzeigen. Z.B. kann ein GAL1-HIS3-Reportergen verwendet werden. Die Induktion des HIS3-Gens erlaubt das Wachstum in einem Medium, dem Histidin fehlt. In solch einer Ausführungsform kann der Testerstamm zum Testen von Inhibitoren von Protein-Protein-Interaktionen sowohl die GAL1-LacZ- und GAL1-HIS3-Reportergene enthalten, und hat ein fehlerhaftes chromosomales his3-Gen. Weil das HIS3-Gen als ein Reportergen für diese Modifikation verwendet wird, können die pBDL-Expressionsplasmide (siehe Tabelle 2) vorteilhafterweise verwendet werden, um die TUP1-Beutefusionen herzustellen. Mit der Kombination von Reportern in solch einem modifizierten Stamm kann die Inhibition der Köder- und Beute- Interaktion durch Wachstum auf einem Medium, dem Histidin fehlt und durch Produktion von b-Galactosidase aus dem LacZ-Gen, welches enzymatisch gemessen werden kann, detektiert werden.
Eine zusätzliche Modifikation des RTA-Assay der Erfindung kann nützlich sein, um zwischen starken und schwachen Inhibitoren der Köder- und Beute-Interaktion zu unterscheiden. Das Histidinanalog 3-Aminotriazol(3-AT) ist ein kompetitiver Inhibitor des HIS3-Genprodukts. 3-AT kann dem Wachstumsmedium hinzugefügt werden, um ein Erfordernis zu verursachen für die stärkere Expression des HIS3-Gens, um den 3-AT-inhibitorischen Effekt zu überwinden. In bestimmten Ausführungsformen kann der Level der HIS3-Expression, der für das Wachstum im Abwesenheit von Histidin erforderlich ist, direkt proportional zur Konzentration von 3-AT im Wachstumsmedium (23) sein. Die Ergebnisse solch eines Assays können unter der Prämisse bewertet werden, dass stärkere Inhibitoren einer spezifischen Interaktion zwischen den Köder- und Beute-Fusionsproteinen Zellwachstum bei höheren Konzentrationen von 3-AT erlauben sollten.

b) Assay von Protein-Protein-Interaktions-Inhibitoren in Säugetierzellen. In Übereinstimmung mit einem Aspekt der Erfindung können Inhibitoren von Protein-Protein-Interaktionen in Säugetierzellen getestet werden, und zwar unter Verwendung ähnlicher Strategien, wie sie hier zur Verwendung mit Hefezellen offenbart sind. Inhibitoren können in einem begrenzten Maßstab getestet werden durch einfaches Behandeln von Zellen, welche transient mit einem Reportergen, einem Köderfusionsproteingen und einem Beutefusionproteingen ko-transfektiert worden sind. Eine solche Ausführungsform kann das rekombinante GAL4-abhängige Reportergenkonstrukt und die GAL4-Köder- und TUP1-Beuteexpressionsplasmide (siehe oben) verwenden. Inhibition der RTA-Interaktion wird die erhöhte Reportergenexpression relativ zu unbehandelten Kontrollproben verursachen. Weil transiente Transfektionen einige Variabilität bei der Genexpression von Probe zu Probe verursachen können, kann es bevorzugt sein, zur Quantifizierung eines Inhibitoreffekts mehrere unabhängige transiente Transfektionen zu erfordern (z.B. vier oder fünf unabhängige Proben), um statistische signifikante Ergebnisse zu erhalten.

Um die Anzahl unabhängiger Proben, die für die genaue Prüfung verschiedener Inhibitoren erforderlich sind, zu reduzieren, kann es vorteilhaft sein, eine Zelllinie zu konstruieren, unter Verwendung des interessierenden Zelltyps, welche ein integriertes Reportergen und Expressionsplasmide für die Köder- und Beute-Fusionsproteine trägt. Um die Verifizierung der Vollständigkeit der Köder- und Beutefusionen in der konstruierten Zelllinie zu erleichtern, kann es nützlich sein, das Beutefusionsprotein von einem induzierbaren Promotor zu exprimieren, so dass die Interaktion von Köder- und Beute je nach Willen angeschaltet oder abgeschaltet werden kann. Für Säugetierzellen kann ein induzierbarer Promotor, wie z.B. MMTV-LTR verwendet werden. Der MMTV-LTR-Promotor ist induzierbar durch die Anwesenheit des Glucocorticoidsteroids Dexamethason. Somit kann in solch einer Testerzelllinie ein Reportergen, wie z. B. ein GAL4-abhängiges Reportergen in der Abwesenheit von Dexamethason exprimiert werden, es wird aber inhibiert, wenn das Beutefusionsproteingen in Anwesenheit von Dexamethason induziert wird. Der Effekt eines Protein-Protein-Interaktions-Inhibitors kann demgemäß durch Messen einer Reportergenexpression folgend dem Zusatz einer interessierenden Verbindung zu den Zellen, welche eine Vorbehandlung mit einer induzierenden Menge an Dexamethason erhalten haben, bestimmt werden. Die Verwendung eines induzierbaren Promotors für das Beutefusionsprotein erlaubt die Vollständigkeit des zu testenden RTA-Systems in einer stabil tranfektierten Zelllinie, spezifisch für eine definierte interessierende RTA-Protein-Protein-Interaktion. Die Stabilität der Zelllinie in Verbindung mit dem Test für die Lebensfähigkeit des RTA-Systems kann die Verwendung einer solchen Zelllinie für das automatische Screenen spezifischer Inhibitoren erleichtern.
Beispiele
In den folgenden Beispielen sind die Techniken für die genetischen und biochemischen Manipulationen von Hefen wie vorher beschrieben (18). Standardprotokolle für rekombinante DNA werden zur Konstruktion der Köder- und Beute-Expressionsplasmide und der Reportergene (2) verwendet.
Charakterisierung der GAL4-GAL80-Interaktion in vivo unter Verwendung von TUP1-GAL80-Fusionen. Die Induktion der GAL4-Gene beinhaltet eine Galactose-induzierte Änderung bei der Interaktion zwischen dem transkriptionalen Aktivator GAL4 und seinem negativen Regulatorprotein GAL80. Um die Interaktion zwischen GAL4 und GAL80 unter induzierenden und nicht-induzierenden (37) Bedingungen in vivo unter Verwendung des erfindungsgemäßen RTA-Assays zu bestimmen, werden Hefeexpressionsplasmide konstruiert, welche ein Beute-Fusionsprotein mit einer TUP1-Repressordomäne und einer heterologen GAL80-Aminosäuresequenz produzierten. TUP1 wurde an den C-Terminus von GAL80 fusioniert. Das rekombinante Gen kodierend für das Beute-Fusionsprotein wurde von dem ADH1-Promotor auf 2 Mikron-Plasmidvektoren exprimiert. GAL80, TUP1 und GAL80-TUP1-Fusionsproteine wurden mit GAL4-Protein in einem Hefestamm ko-exprimiert, welcher ein GAL1-HIS3-Reportergen enthielt. Die Aktivierung des Reportergens wurde bestimmt durch die Fähigkeit der Hefe in Abwesenheit von Histidin (Tabelle 3) zu wachsen. GAL4 war fähig die Expression des GAL1-HIS3-Reportergens zu induzieren, wie es bestimmt wurde durch Wachstum auf Galactoseplatten, denen Histidin fehlte, wenn es mit GAL80 oder dem N-Terminus von TUP1 ko-exprimiert wurde. Das chimäre Protein bestehend aus GAL80 fusioniert an seinem C-Terminus an die N-terminale TUP1-Repressionsdomäne (GAL80-TUP1(1–200)) hatte keinen Effekt auf die Fähigkeit von GAL4 das GAL1-HIS3-Reportergen (Tabelle 3) zu aktivieren.
Tabelle 3

a: Hefen wurden mit den Köder- und Beuteexpressionsplasmiden transformiert und auf synthetische Galactose (SG)-platten, denen Histidin fehlte, gestrichen. Das Wachstum wurde nach drei Tagen bewertet:
++++ = volles Wachstum;
– = kein Wachstum

Die N-terminale 200 Aminosäuren lange Repressordomäne von TUP1 wurde an den N-Terminus von GAL80 fusioniert, um ein Beutefusionsprotein, genannt TUP1 (1–200)-GAL80 zu erzeugen. Im Gegensatz zu den Ergebnissen, die mit dem GAL80-TUP1-Fusionsprotein beobachtet worden waren, reprimierte das TUP1 (1–200)-GAL80-Beutefusionsprotein die Fähigkeit von GAL4 die Transkription des GAL1-HIS3-Reportergens auf Galactose zu aktivieren, wie es durch die Unfähigkeit von Hefe, die dieses Protein exprimierte, in Abwesenheit von Histidin zu wachsen (Tabelle 3), bestimmt wurde. Dieses Ergebnis demonstriert, dass die TUP1-Repressionsdomäne die transkriptionsaktivierende Tätigkeit von GAL4 inhibiert, wenn sie an den N-Terminus, aber nicht an den C-Terminus, von GAL80 fusioniert ist.
Um den Effekt des TUP1-GAL80-Fusionsproteins auf die GAL4-Aktivität in Zellen, die unter induzierenden und nicht- induzierenden Bedingungen wachsen, zu testen, wurden die oben beschriebenen Experimente wiederholt, und zwar unter Verwendung eines GAL1-URA3-Reportergens, welches kontraselektiert werden konnte und in welchem GAL4-Protein überexprimiert war. Die Aktivierung des GAL1-URA3-Reportergens kann getestet werden durch Wachstum auf einem Medium, dem Uracil fehlte, während die Repression der URA3-Expression bestimmt werden kann durch Wachstum in Anwesenheit des Pyrimidinanalogs 5-Fluorodsäure (siehe Tabelle 1). TUP1-GAL80 inhibiert stark transkriptionale Aktivierung durch überexprimiertes GAL4 im Medium, das Glucose, Galactose oder Raffinose enthielt, während weder GAL80 noch TUP1 allein fähig waren, GAL4-Aktivität unter diesen Bedingungen zu verhindern (Tabelle 4). Diese Ergebnisse zeigen an, dass die N-terminale Repressionsdomäne von TUP1, wenn sie an GAL80 fusioniert war, die transkriptionale Aktivierung durch GAL4 verhindern kann, sogar, wenn GAL4 auf hohem Niveau exprimiert wird, unter sowohl induzierenden als auch nicht-induzierenden Bedingungen.
Tabelle 4

a: GAL4-Protein war überexprimiert von ADH1-Promotor auf einem 2-Mikron-Plasmid
b: Hefen wurden mit den Köder- und Beuteexpressionsplasmiden transformiert und auf synthetisches Medium, das die angegebenen Kohlenstoffquellen in Anwesenheit von 0,1% 5-FOA enthielt, gestrichen. Das Wachstum wurde nach drei Tagen bewertet:
++++ = volles Wachstum;
– = kein Wachstum

Um zu prüfen, ob die spezifische Interaktion zwischen GAL4 und GAL80 für den Effekt von TUP1-GAL80 auf GAL4's-Aktivität erforderlich war, wurde der erfindungsgemäße RTA-Assay verwendet, um den Effekt von TUP1-GAL80 auf ein GAL4-Derivat, von dem die C-terminalen 30 Aminosäuren von GAL4 deletiert worden waren, zu testen. Ein GAL4-Derivat bestehend aus den Resten 1–848, dem das C-terminale GAL80-Interaktionssegment (siehe 2) fehlt, wurde nicht durch TUP1-GAL80 inhibiert. Ein Stamm, der das GAL1-URA3-Reportergen exprimierend GAL4 (1–848) und TUP1-GAL80 enthielt, war unfähig auf 5-FOA zu wachsen (Tabelle 5). Dieses Ergebnis zeigt an, dass das TUP1-GAL80-Protein nur die transkriptionale Aktivierung durch ein GAL4-Derivat, mit dem es eine spezifische Interaktion bilden kann, inhibiert.
Tabelle 5

Phosphorylierung bei GAL4-Serin-699 reguliert die Affinität der GAL4-GAL80-Interaktion in vivo wie es durch das RTA-System gemessen wurde. Der erfindungsgemäße RTA-Assay wurde verwendet, um den Effekt der Phosphorylierung an Serin 699 von GAL4 auf die GAL4-GAL80-Interaktion zu untersuchen. Der Effekt der TUP1-GAL80-Fusion auf die transkriptionale Aktivierung durch Wildtyp GAL4 und GAL4, das die S699A-Mutation trägt, wurde in einem Hefestamm verglichen, der ein GAL1-LacZ-Reportergen trägt. Wenn überexprimiert verursachen sowohl GAL4 als auch GAL4 S699A die effiziente Aktivierung dieses Reportergens in Anwesenheit von entweder GAL80 oder TUP1 allein, wie es durch die beta-Galactositaseaktivität (11) gemessen wurde. Jedoch inhibierte die TUP1-GAL80-Fusion die transkriptionale Aktivierung durch GAL4 S699A signifikant mehr als sie Wildtyp GAL4 inhibierte (11), was anzeigt, dass die Phosphorylierung an Serin 699 die Interaktion zwischen GAL4 und GAL80 schwächt.
Interaktion zwischen GAL4 und SUG1 kann in vivo durch RTA-Assay detektiert werden.
Der erfindungsgemäße RTA-Assay wurde verwendet, um die Interaktion zwischen GAL4 und 26S-Proteosomuntereinheit kodiert durch SUG1 unter Verwendung eines GAL1-HIS3-Reportergens zu testen. Weder SUG1 noch die unabhängig exprimierte TUP1-Repressionsdomäne hatte einen Effekt auf die Fähigkeit von GAL4 die GAL1-HIS3-Transkription zu aktivieren, was angezeigt wurde durch die Fähigkeit in Abwesenheit von Histidin zu wachsen. Die TUP1-SUG1-Fusion verursachte signifikant langsameres Wachstum auf SD-His, was anzeigt, dass diese Fusion GAL4's Fähigkeit inhibiert, die GAL1-HIS3-Reportergene zu aktivieren.
Tabelle 6

a : Hefen wurden mit den Köder- und Beuteexpressionsplasmiden transformiert und auf synthetische Galactose (SG)-platten, denen Histidin fehlte, gestrichen. Das Wachstum wurde nach drei Tagen bewertet:
++++ = volles Wachstum;
– = kein Wachstum

Die Sensitivität des GAL1-URA3-Reportergens kann eingestellt werden durch die 5-FOA-Konzentration. Die Konzentration von 5-FOA kann angeglichen werden, um die Detektion schwächerer Protein-Protein-Interaktionen unter Verwendung eines erfindungsgemäßen RTA-Assays zu ermöglichen. Die Verwendung geringerer Konzentrationen von 5-FOA selektiert auf eine schwächere Repression durch die Beutefusion und erleichtert die Detektion differentieller repressiver Effekte der TUP1-GAL80 und GAL80-Proteine auf überexprimiertes GAL4. Das TUP1-GAL80-Beutefusionsprotein erlaubt das Wachstum auf Hefe, die das GAL1-URA3-Reportergen trägt, und überexprimiert Wildtyp GAL4-Protein bei Konzentrationen von 5-FOA bis zu 0,1 (Tabelle 7). Im Gegensatz dazu erlaubt das GAL80-Protein alleine nur das minimale Wachstum auf einem Medium, das 0,05 5-FOA enthielt, aber signifikantes Wachstum auf 0,01 % 5-FOA. Dieses Ergebnis zeigt an, dass das TUP1-GAL80-Protein 5–10fach mehr effizient die transkriptionale Aktivierung durch überexprimiertes GAL4 inhibieren kann, als GAL80-Protein allein. Dies zeigt an, dass durch Variieren der Konzentration von 5-FOA in dem selektiven Medium der erfindungsgemäße RTA-Assay angepasst werden kann, um auf schwache oder starke Interaktionen zwischen den Köder- und Beutefusionen zu selektieren.
Tabelle 7

a: Hefezellen, die die Köder- und Beuteproteine exprimieren, wurden auf Glucose-enthaltendes Minimalmedium, das 5-FOA in den angegebenen Konzentrationen enthielt, gegeben. Wachstum der Hefen wurde nach 3 Tagen bewertet:
++++ = volles Wachstum;
– = kein Wachstum

Der RTA-Assay kann verwendet werden, um eine spezifische Protein-Protein-Interaktion aus einer Bibliothek zu identifizieren. In diesem Aspekt des RTA-Assays kann die Selektion mit 5-FOA für die Repression des GAL1-URA3-Reportergens verwendet werden, um Bibliotheken auf spezifische Protein-Protein-Interaktionen zu screenen. Plasmide, die TUP1, GAL80 und TUP1-GAL80 exprimieren, wurden zu einer existierenden Hefeplasmidbibliothek hinzugefügt. Zu 10 Mikrogramm Plasmidbibliothek wurden 10 Mikrogramm jeweils von TUP1 und GAL80-Expressionsplasmid und 1 Nanogramm TUP1-GAL80-Espressionsplasmid hinzugefügt. Das Plasmidgemisch wurde dann in eine Hefe transformiert, die ein Wildtyp GAL4 exprimierendes Plasmid enthielt, und welches das GAL1-URA3-Reportergen enthielt. Bibliothekstransformanten wurden auf Platten gestrichen, die 0,01 % 5-FOA enthielten, und für drei Tage wachsengelassen. Aus einer Transformation von insgesamt 10 Mikrogramm wurden 24 Kolonien gepickt, welche schnell auf 5-FOA wuchsen, was die Repression des URA3-Reportergens anzeigt. Plasmid-DNA wurde aus den 5-FOA resistenten Kolonien durch Transformation in E.coli gewonnen und durch Restriktionsendonukleasenverdau analysiert. Aus jede der 5-FOA-resistenten Kolonien gewonnene DNA stellte das Original GAL4-Espressionsplasmid oder das TUP1-GAL80-Expressionsplasmid dar. Eine Kolonie enthielt eine umgeordnete Form des GAL4-Expressionsplasmids. Es wurden keine Plasmide gewonnen, die GAL80 oder TUP1 allein exprimierten, oder Plasmide aus der Originalhefebibliothek. Dieses Experiment zeigt an, dass kontraselektierbare Reportergene in Übereinstimmung mit dem erfindungsgemäßen RTA-Assay verwendet werden können, um Protein-Protein-Interaktionen aus Plasmidbibliotheken zu identifizieren. Auch die Tatsache, dass eine der 24 Kolonien ein umgeordnetes GAL4-Espressionsplasmid enthielt, betont die Vorteile, die mit der Expression der Beutefusionsproteine von einem regulierbaren Promotor assoziiert sind, um die Verifikation der Vollständigkeit des Köders folgend dem anfänglichen Screen zu erleichtern.
Die N-terminale TUP1-Repressionsdomäne erfordert SRB10 für seine Funktion im RTA-System. Die genetische Analyse der TUP1-Funktion legt nahe, dass es Komponenten des RNA-Polymeraseholoenzyms für seine Funktion benötigt. Insbesondere wird die Holoenzym-assoziierte Cyclin-abhängige Proteinkinase SRB10 für die Repression der Transkription durch TUP1 (48) benötigt. Um zu bestimmen, ob die TUP1-Repressionsdomäne normal in einer RTA-Interaktion funktioniert, wurde die Fähigkeit der TUP1-GAL80-Fusion die Transkription in einem srb10^–Stamm zu inhibieren getestet. Überexprimiertes GAL4 aktivierte die Transkription eines GAL1-LacZ-Reportergens normal in diesem Stamm (12). Weder GAL80 noch TUP1 exprimiert allein in Kombination mit GAL4 hat einen signifikanten Effekt auf die LacZ-Transkription. Im Gegensatz zu dem in Wildtyphefe beobachteten Ergebnissen hatte die TUP1-GAL80-Fusion keinen Effekt auf die transkriptionale Aktivierung durch GAL4 in dem srb10^–Stamm (12). Dieses Ergebnis zeigt an, dass die Interaktion zwischen den GAL4-Köder und TUP1-Beutefusionen in einer RTA-Interaktion Eigenschaften hat, die ähnlich zum normalen Funktionieren des TUP1-Proteins sind.
Literaturstellen

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Demgemäß wird der Umfang der Erfindung in Übereinstimmung mit den durch die folgenden Ansprüche definierten Substanzen abgeleitet.

Claims

Zellen zur Untersuchung der Interaktionen zwischen Fusionsproteinen, wobei die Zellen umfassen: ein erstes rekombinantes Gen, das ein Beute-Fusionsprotein codiert, wobei das Beute-Fusionsprotein eine Transkriptionsrepressordomäne und eine erste heterologe Aminosäuresequenz umfasst; ein zweites rekombinantes Gen, das ein Köder-Fusionsprotein codiert, wobei das Köder-Fusionsprotein eine DNA-Bindungsdomäne und eine zweite heterologe Aminosäuresequenz umfasst; und ein rekombinantes Reportergen, das ein nachweisbares Genprodukt codiert, wobei das rekombinante Reportergen eine Operator-DNA-Sequenz umfasst, die die Fähigkeit zur Bindung an die DNA-Bindungsdomäne des Köder-Fusionsproteins besitzt; wobei das Reportergen in Abwesenheit einer Bindung zwischen der ersten heterologen Aminosäuresequenz und der zweiten heterologen Aminosäuresequenz exprimiert wird und das Reportergen reprimiert wird, wenn eine Bindung zwischen der ersten heterologen Aminosäuresequenz und der zweiten heterologen Aminosäuresequenz vorliegt.
Die Zellen nach Anspruch 1, wobei das Köder-Fusionsprotein außerdem eine Transkriptionsaktivatordomäne umfasst.
Die Zellen nach Anspruch 2, wobei das Köder-Fusionsprotein Sequenzen homolog zu den Aminosäuren 1–238 von GAL4 umfasst.
Die Zellen nach Anspruch 1, wobei das erste rekombinante Gen unter der Kontrolle eines reprimierbaren Promotors steht.
Die Zellen nach Anspruch 4, wobei der reprimierbare Promotor homolog zum MET3-Promotor ist.
Die Zellen nach Anspruch 1, wobei die DNA-Bindungsdomäne eine Aminosäuresequenz umfasst ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DNA-Bindungsdomänen homolog zu einer DNA-Bindungsdomäne von GAL4.
Die Zellen nach Anspruch 1, wobei die DNA-Bindungsdomäne eine Aminosäuresequenz umfasst ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DNA-Bindungsdomänen homolog zu einer DNA-Bindungsdomäne von LexA.
Die Zellen nach Anspruch 1, wobei die Transkriptionsrepressordomäne eine Aminosäuresequenz umfasst ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Transkriptionsrepressordomäne des Hefe TUP1-Proteins, einer Transkriptionsrepressordomäne des Drosophila Krüppel-Proteins, einer Transkriptionsrepressordomäne des Drosophila engrailed-Proteins, einer Transkriptionsrepressordomäne des Drosophila knirps-Proteins, einer Transkriptionsrepressordomäne des Drosophila even-skipped-Proteins, einer Transkriptionsrepressordomäne des Drosophila paired-Proteins, einer Transkriptionsrepressordomäne des Säuger Egr-1-Proteins, einer Transkriptionsrepressordomäne des Säuger WT1-Proteins, einer Transkriptionsrepressordomäne des Säuger RARa-Proteins und einer Transkriptionsrepressordomäne des Säuger KRAB-Proteins.
Die Zellen nach Anspruch 1, wobei die Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Saccharomyces cerevisiae-Zellen, Schizosaccharomyces pombe-Zellen und Säuger-Gewebekulturzellen.
Die Zellen nach Anspruch 1, wobei die Zellen Hefe-Zellen sind und das Reportergen ausgewählt wird aus einer Gruppe bestehend aus dem Hefe URA3-Gen, dem Hefe CAN1-Gen, dem Hefe GAL1-Gen, dem Hefe HIS3-Gen und dem E. coli LacZ-Gen.
Die Zellen nach Anspruch 1, wobei die Zellen Säugerzellen sind und das Reportergen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem CAT-Gen, dem LacZ-Gen, dem SEAP-Gen, dem Luziferase-Gen, dem GFP-Gen, dem BFP-Gen dem CD2-Gen, dem Flu HA-Gen und dem tPA-Gen.
Die Zellen nach Anspruch 1, wobei der Operator des Reportergens außerdem eine Bindungsstelle für ein Transaktivatorprotein umfasst.
Die Zellen nach Anspruch 12, wobei das Transaktivatorprotein GCN4 ist.
Ein Kit zur Herstellung von Zellen zur Untersuchung der Interaktionen zwischen Fusionsproteinen, wobei das Kit umfasst: einen ersten Vektor zur Expression eines Beute-Fusionsproteins mit einer Transkriptionsrepressordomäne, wobei der erste Vektor ein exprimierbares Gen umfasst, das eine erste Insertionsstelle und eine Sequenz enthält, die die Transkriptionsrepressordomäne codiert; einen zweiten Vektor zur Expression eines Köder-Fusionsproteins mit einer DNA-Bindungsdomäne, wobei der zweite Vektor ein exprimierbares Gen umfasst, das eine zweite Insertionsstelle und eine Sequenz enthält, die die DNA-Bindungsdomäne codiert; und Wirtszellen mit einem rekombinanten Reportergen, das ein nachweisbares Genprodukt codiert, wobei das rekombinante Reportergen eine Operator-DNA-Sequenz umfasst, die die Fähigkeit zur Bindung an die DNA-Bindungsdomäne des Köder-Fusionsproteins besitzt, wobei das Reportergen in Abwesenheit einer Bindung zwischen dem Beute-Fusionsprotein und dem Köder-Fusionsprotein exprimiert wird und das Reportergen reprimiert wird, wenn eine Bindung zwischen dem Beute-Fusionsprotein und dem Köder-Fusionsprotein vorliegt.
Das Kit nach Anspruch 14, wobei die Zellen Hefezellen sind; die Transkriptionsrepressordomäne eine Aminosäuresequenz homolog zu einer Transkriptionsrepressordomäne eines TUP1-Proteins umfasst; die DNA-Bindungsdomäne eine Aminosäuresequenz homolog zu einer DNA-Bindungssequenz eines GAL4-Proteins umfasst; der Operator des Reportergens eine DNA-Sequenz homolog zu einer GAL4-Proteinbindungssequenz eines GAL1-Gens umfasst; das Reportergen eine codierende Sequenz umfasst homolog zu einer codierenden Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den codierenden Sequenzen des CAN1-Gens, des URA3-Gens und des LacZ-Gens.
Das Kit nach Anspruch 15, wobei der zweite Vektor aus der Gruppe bestehend aus den pY- und den pG-Plasmiden ausgewählt ist.
Das Kit aus Anspruch 15, außerdem umfassend Oligonukleotidprimer homolog zu Sequenzen, die die erste und zweite Insertionsstelle flankieren.
Das Kit nach Anspruch 15, wobei der erste Vektor aus der Gruppe bestehend aus den pBDH- und pBDL-Plasmiden ausgewählt ist.
Ein Verfahren zur Untersuchung der Interaktionen zwischen Fusionsproteinen in Zellen, wobei das Verfahren umfasst: die Zellen dazu zu veranlassen ein rekombinantes Gen zu exprimieren, das ein Beute-Fusionsprotein codiert, wobei das Beute-Fusionsprotein eine Transkriptionsrepressordomäne und eine erste heterologe Aminosäuresequenz umfasst; die Zellen dazu zu veranlassen ein rekombinantes Gen zu exprimieren, das ein Köder-Fusionsprotein codiert, wobei das Köder-Fusionsprotein eine DNA-Bindungsdomäne und eine zweite heterologe Aminosäuresequenz umfasst; die Zellen mit einem rekombinanten Reportergen auszustatten, das ein nachweisbares Genprodukt codiert, wobei das rekombinante Reportergen eine Operator-DNA-Sequenz umfasst, die die Fähigkeit zur Bindung an die DNA-Bindungsdomäne des Köder-Fusionsproteins besitzt, wobei das Reportergen in Abwesenheit einer Bindung zwischen der ersten heterologen Aminosäuresequenz und der zweiten heterologen Aminosäuresequenz exprimiert wird und das Reportergen reprimiert wird, wenn eine Bindung zwischen der ersten heterologen Aminosäuresequenz und der zweiten heterologen Aminosäuresequenz vorliegt; und auf Expression des nachweisbaren Genprodukts zu testen.
Das Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Zellen Hefezellen sind, das Reportergen eine codierende Sequenz homolog zu der codierenden Sequenz des CAN1-Gens umfasst und der Schritt des Testens auf Expression des nachweisbaren Genprodukts die Kultivierung der Zellen auf Canavanin umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Zellen Hefezellen sind, das Reportergen eine codierende Sequenz homolog zu der codierenden Sequenz des URA3-Gens umfasst und der Schritt des Testens auf Expression des nachweisbaren Genprodukts die Kultivierung der Zellen auf 5-FOA umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Zellen Hefezellen sind, das Reportergen eine codierende Sequenz homolog zu der codierenden Sequenz des Gal1-Gens umfasst und der Schritt des Testens auf Expression des nachweisbaren Genprodukts die Kultivierung der Zellen auf 2-Desoxygalaktose umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Zellen Hefezellen sind, das Reportergen eine codierende Sequenz homolog zu der codierenden Sequenz des LacZ-Gens umfasst und der Schritt des Testens auf Expression des nachweisbaren Genprodukts die Kultivierung der Zellen auf X-Gal umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Zellen Hefezellen sind, das Reportergen eine codierende Sequenz homolog zu der codierenden Sequenz des HIS3-Gens umfasst und der Schritt des Testens auf Expression des nachweisbaren Genprodukts die Kultivierung der Zellen auf einem Histidin-freien Medium umfasst.
Ein Verfahren zur Untersuchung der Fähigkeit von Verbindungen, die Interaktion zwischen Fusionsproteinen in Zellen zu stören, wobei das Verfahren umfasst: die Zellen dazu zu veranlassen ein rekombinantes Gen zu exprimieren, das ein Beute-Fusionsprotein codiert, wobei das Beute-Fusionsprotein eine Transkriptionsrepressordomäne und eine erste heterologe Aminosäuresequenz umfasst; die Zellen dazu zu veranlassen ein rekombinantes Gen zu exprimieren, das ein Köder-Fusionsprotein codiert, wobei das Köder-Fusionsprotein eine DNA-Bindungsdomäne und eine zweite heterologe Aminosäuresequenz umfasst, wobei die zweite heterologe Aminosäuresequenz zur Bindung an die erste heterologe Aminosäuresequenz fähig ist; die Zellen mit einem rekombinanten Reportergen auszustatten, das ein nachweisbares Genprodukt codiert, wobei das rekombinante Reportergen eine Operator-DNA-Sequenz umfasst, die die Fähigkeit zur Bindung an die DNA-Bindungsdomäne des Köder-Fusionsproteins besitzt, wobei das Reportergen in Abwesenheit einer Bindung zwischen der ersten heterologen Aminosäuresequenz und der zweiten heterologen Aminosäuresequenz exprimiert wird und das Reportergen reprimiert wird, wenn eine Bindung zwischen der ersten heterologen Aminosäuresequenz und der zweiten heterologen Aminosäuresequenz vorliegt; die Zellen mit einer exogenen Verbindung auszustatten; und auf Expression des nachweisbaren Genprodukts zu testen.
Das Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Zellen Hefezellen sind, das Reportergen eine codierende Sequenz homolog zu der codierenden Sequenz des URA3-Gens umfasst und der Schritt des Testens auf Expression des nachweisbaren Genprodukts die Kultivierung der Zellen in einem Uracil-freien Medium umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Zellen Hefezellen sind, das Reportergen eine codierende Sequenz homolog zu der codierenden Sequenz des HIS3-Gens umfasst und der Schritt des Testens auf Expression des nachweisbaren Genprodukts die Kultivierung der Zellen auf einem Histidin-freien Medium umfasst.