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Die vorliegende Erfindung betrifft a) Fusions-Polypeptide, welche als Gesamt-
Polypeptid multimere Aggregate (z. B. Filamente) bilden und aus zwei oder mehr
Peptid-Domänen heterologer Herkunft bestehen, von denen mindestens eine für
die Aggregat-/Filament-Bildung des Gesamt-Polypeptids hinreichend ist und
mindestens eine weitere Domäne aus einem Polypeptid bzw. einer Polypeptid-
Domäne (Bait-Polypeptid) besteht, dessen/deren Fähigkeit mit anderen
modifizierten oder nicht-modifizierten, bereits bekannten oder noch unbekannten
Polypeptiden (Prey-Domäne) zu interagieren untersucht werden soll, sowie b)
Aggregat-(Filament) bildende, nicht-kovalent gebundene Polypeptid-Komplexe, in
denen ein oder mehrere Polypeptid(e) enthalten ist/sind, welche die
Multimerisierung vermitteln sowie mindestens ein Polypeptid oder auch Fusions-
Polypeptid heterologer Polypeptid-Domänen (Bait-Polypeptid), dessen Fähigkeit
mit anderen modifizierten oder nicht-modifizierten, bereits bekannten oder noch
unbekannten Polypeptiden (Prey-Polypeptid) zu interagieren untersucht werden
soll.
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Die Erfindung zeichnet sich dabei dadurch aus, daß der Nachweis der Protein-
Protein-Interaktion, die untersucht bzw. identifiziert werden soll, auf der Detektion
des Prey-Polypeptids bzw. von Prey-Domänen-enthaltenden Polypeptiden beruht,
die in Bait-Domäne-enthaltende polymere Strukturen, z. B. Filamente, rekrutiert
werden. Um diese Protein-Protein-Interaktion-indizierende Rekrutierung
detektieren zu können, werden Prey-Polypeptide in Form von Fusionsproteinen
mit fluoreszierenden Polypeptiden (z. B. DsRED, GFP, YFP, CFP, BFP), die durch
rekombinante DNA-Technologien hergestellt werden können, verwendet, oder die
Prey-Polypeptide mittels Fluoreszenz-markierter sekundärer Reagenzien z. B.
FITC-markierter Antikörper nachgewiesen. Die Antikörper können dabei das
interessierende Prey-Polypeptid selbst oder eine daran direkt oder indirekt
gekoppelte Struktur erkennen, z. B. einen Peptid-Tag, der durch rekombinante
Techniken eingeführt wird. Die Erfindung zeichnet sich weiterhin dadurch aus,
daß die Interaktion von Bait- und Prey-Polypeptiden in lebenden Zellen erfolgt, die
stabil oder transient mit entsprechenden Nukleinsäure-Konstrukten transfiziert
wurden. Das beschriebene Verfahren ist weiterhin geeignet, die genannten
Wechselwirkungen in experimentell transient membran-permeabilisierten, aber
ansonst vitalen Zellen, sowie in fixierten Zellen oder auch in zellfreien Systemen
zu untersuchen.
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Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung, den Polypeptiden zugrundeliegende
Nukleinsäuresequenzen, Vektoren, die diese erfindungsgemäßen
Nukleinsäuresequenzen enthalten, mit erfindungsgemäßen
Nukleinsäuresequenzen oder Vektoren transfizierte Zellen, und
Zusammensetzungen, enthaltend erfindungsgemäße Gegenstände.
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Für die oben genannten und später näher ausgeführten FIT-Anwendungen sind
prinzipiell alle filamentbildenden Polypeptide oder Polypeptid-Domänen geeignet,
die eine Filamentbildung auch dann erlauben, wenn sie in Form von
Fusionsproteinen mit heterologen Peptid-Domänen vorliegen oder die
Rekrutierung von Bindeproteinen erlauben, die als Fusionsproteine mit
heterologen Polypeptid-Domänen exprimiert werden können, ohne daß ihre
Bindefähigkeit an das filamentbildende Protein verloren geht. Beispiele hierfür
sind manche Mitglieder der "death domain" (DD)-Proteinfamilie (z. B. TRADD),
manche "caspase-recruitment domain" (CARD)-Domäne enthaltenden Proteine
(z. B. RAIDD und RICK) oder manche Polypeptide mit einer "death effector
domain" DED-Domäne (z. B. Caspase-8, FLIP). Desweiteren sind auch
filamentbildende nicht-kovalent gebundene Polypeptid-Komplexe geeignet, die ein
Bait-Polypeptid der beschriebenen Art enthalten. Beispiele hierfür sind Komplexe
aus TRADD und TRAF1 oder TRAF2 oder Fusionsproteine von TRAF1 oder
TRAF2 oder deren TRAF-Domänen mit heterologen Polypeptid-Domänen.
Weiterhin sind auch alle die Polypeptide als Polymerisierungskomponente des
Bait-Komplexes geeignet, die fluoreszenzmikroskopisch darstellbare
charakteristische Strukturen ausbilden.
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Damit werden in einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
erfindungsgemäß Bait-Polypeptide zur Verfügung gestellt, die (i) einen Abschnitt
(1) mit einer DD, CARD oder DED enthalten (ii) einen N-terminal oder C-terminal
von Abschnitt (1) gelegenen Abschnitt (2), welcher ein Peptidlinker ist, und (iii)
einen Abschnitt (3), welcher ein Polypeptid repräsentiert dessen Protein-Protein-
Interaktionsfähigkeiten analysiert werden sollen bzw. für welches noch
unbekannte Interaktionspartner identifiziert werden sollen. In einer weiteren
Ausführungsform werden Bait-Polypeptide zur Verfügung gestellt, die (i) einen
Abschnitt (1) mit einer Polypeptid-Domäne, die direkt oder indirekt an
filamentbildende Polypeptid-Einheit binden, enthalten, (ii) einen N-terminal oder
C-terminal von Abschnitt (1) gelegenen Abschnitt (2), welcher ein Peptidlinker ist,
und (iii) einen Abschnitt (3), welcher ein Polypeptid repräsentiert, dessen Protein-
Protein-Interaktionsfähigkeiten analysiert bzw. für welches noch unbekannte
Interaktionspartner identifiziert werden sollen, enthalten.
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Desweiteren werden in einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
erfindungsgemäß Prey-Polypeptide zur Verfügung gestellt, die (i) einen Abschnitt
(1) enthalten, der mittels Fluoreszenz direkt oder indirekt nachgewiesen werden
kann und zudem (ii) einen N-terminal oder C-terminal von Abschnitt (1) gelegenen
Abschnitt (2) enthalten, welcher ein Peptidlinker ist, und (iii) einen Abschnitt (3),
welcher jegliches Polypeptid repräsentierten kann dessen Protein-Protein-
Interaktionsfähigkeiten analysiert werden soll.
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In einer bevorzugten Ausführungsform weisen erfindungsgemäße Bait-
Polypeptide in ihrem Abschnitt (1) entweder eine Aminosäuresequenz eines
filamentbildenden Polypeptids, eine funktionelle Variante einer filamentbildenden
Polypeptid-Sequenz oder ein Fragment hiervon auf, oder eine
Aminosäuresequenz eines Polypeptids, einer funktionellen Variante eines
Polypeptids oder eines Polypeptid-Fragments, das an ein filamentbildendes
Polypeptid binden kann. Unter einer funktionellen Variante werden Sequenzen
verstanden, die zumindest tw., vorzugsweise mindestens 50%, stärker bevorzugt
mindestens 80% der nativen Sequenz aufweisen und sich durch bspw.
Deletion(en), Insertion(en) und/oder mindestens eine Mutation von der nativen
Sequenz unterscheiden. Hierbei ist eine Sequenzhomologie von mindestens 90,
vorzugsweise mindestens 95 und am stärksten bevorzugt mindestens 97% mit
der entsprechenden nativen Sequenz bevorzugt. Bei einem funktionellen
Fragment kann es sich um N-Terminal, C-terminal oder intrasequentiell verkürzte
native filamentbildende Polypeptid-Sequenzen handeln, insbesondere um
gewisse Domänen, vorzugsweise mindestens eine, stärker bevorzugt mindestens
eine filamentbildende Domäne der nativen Vollängen-Sequenz. Auch biologisch
aktive Varianten dieser Fragmente werden erfindungsgemäß mitoffenbart.
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Bevorzugt sind dabei solche filamentbildende Polypeptide, deren funktionelle
Varianten oder Fragmente eine CARD, DD oder DED Domäne enthalten.
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Ganz besonders bevorzugt ist als Abschnitt (1) der Bait-Polypeptide die DD von
RIP (Rezeptor-interacting protein), RAIDD (RIP-associated ICH-1/CED-3
homologous protein with a death domain) oder TRADD (TNF receptor 1-
associated death domain protein), die DED von FLIP (FLICE inhibitory protein)
oder Caspase-8, oder die CARD von RAIDD, RICK, oder E10, oder die TRADD
bindende TRAF (TNF receptor associated factor)-Domäne von TRAF1, TRAF2
oder TRAF3.
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Als Prey-Polypeptide sind ganz besonders bevorzugt Polypeptide oder
Polypeptid-Domänen in Form von Fusionsproteinen mit fluoreszierenden
Proteinen wie DsRED, GFP und GFP-Varianten.
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Der Linkerabschnitt (2) zwischen den Abschnitten (1) und (3) der Bait - wie auch
der Prey-Polypeptide stellt sich bei erfindungsgemäßen Polypeptidkonstrukten
bspw. als eine flexible Verbindung dar, die vorzugsweise die intrinsischen Protein-
Protein-Interaktionseigenschaften der durch diesen Linker verbundenen
Polypeptid-Domänen nicht wesentlich beeinflußt. In Spezialfällen, in denen Prey-
Polypeptide analysiert werden sollen, die mit multimeren (z. B. dimeren oder
trimeren) Domänen interagieren, oder in denen aus einer Prey-Polypeptid-cDNA-
Bibliothek Interaktionspartner für multimerisierte Bait-Polypeptide identifiziert
werden sollen, werden vorzugsweise Bait-Polypeptide mit Linker mit intrinsischen
Multimerisierungseigenschaften (bspw. Di- Tri- oder Hexamere) gewählt. Solche
Linker werden auch verwendet, um eine erhöhte Stabilität von Prey-Polypeptiden
zu erreichen, die eine intrinsische Multimerisierungs-Tendenz aufweisen.
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Im Falle eines Linkers der als Dimerisierungsmodul (Linkertyp 2a) wirkt, wird
beispielsweise die dimerisierende coiled-coil Domäne des Hefe
Transkriptionsfaktors GCN4 verwendet.
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Ein Trimerisierungsmodul (Linkertyp 2b) als Linker kann bspw. aus der coiled-coil
Strukturen bildenden N-TRAF Domäne von TRAF-Proteinen bestehen.
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In jedem Fall können die Sequenzen von nativen Polypeptiden oder Fragmenten
dieser nativen Polypeptide, die als Linker in Abschnitt (2) eines
erfindungsgemäßem Polypeptids zum Einsatz kommen, auch in Form biologisch
aktiver Varianten derselben im Sinne dieser Erfindung und nach obiger Definition
auftreten.
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Alternativ sind in Abschnitt (2) andere, natürlich vorkommende oder synthetisch
hergestellte Linker-Peptide denkbar. Grundsätzlich kann ein Linker einer nativen
oder variierten (Teil)sequenz aller Organismen, vorzugsweise aus Vertebraten,
insbesondere aus Säugetieren, vor allem aus dem Menschen, entsprechen.
Ferner sind als Linker bspw. alle Sequenzabschnitte von Proteinen geeignet, die
durch Ausbildung von Supersekundärstrukturen Di- oder Multimere generieren,
z. B. "Coiled-Coil-Helices".
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Offenbart werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch alle sich aus den
erfindungsgemäßen Konstrukten durch spezifische Linkerwahl (2) ergebenden Di-
oder Multimere, auf die sich die Gesamtoffenbarung zu erfindungsgemäßen
Konstrukten inhaltsgleich bezieht. Insoweit fällt ein Di- oder Multimer von
erfindungsgemäßen Polypeptiden nach Maßgabe der vorliegenden Offenbarung
immer unter den weiteren Begriff "erfindungsgemäßes Polypeptid".
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind DNA-Sequenzen, die
für Fusionsproteine der vorgenannten erfindungsgemäßen Art kodieren
(Nukleinsäurekonstrukte) oder einen solchen für ein erfindungsgemäßes
Polypeptid kodierenden Bereich enthalten. Derartige DNA-Sequenzen werden in
Expressionsvektoren exprimiert, wobei auch die entsprechenden
Expressionsvektoren, die eine DNA-Sequenz für die erfindungsgemäßen
Fusionsproteine enthalten, Gegenstand der Erfindung sind. Vorzugsweise
besitzen erfindungsgemäße Vektoren die Fähigkeit zur Expression und/oder
Amplifikation in einer prokaryontischen und/oder eukaryontischen Zelle.
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Weiterhin gehören zur vorliegenden Erfindung solche Wirtszellen, die mit DNA-
Sequenzen (Nukleinsäurekonstrukte), die für die erfindungsgemäßen
Fusionsproteine kodieren, stabil oder transient transfiziert sind. Ganz besonders
bevorzugt sind in diesem Zusammenhang Wirtszellen, die mit
erfindungsgemäßen Expressionsvektoren oder erfindungsgemäßen
Nukleinsäurekonstrukten transfiziert sind, wobei die Expressionsvektoren
wiederum DNA-Sequenzen enthalten, die für die erfindungsgemäßen
Fusionsproteine kodieren. Erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukte sind
dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleotidsequenz, kodierend für ein
Polypeptid nach einem der vorgenannten Ansprüche, enthalten.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Verfahren zur
Expression und Detektion von erfindungsgemäßen Polypeptiden und deren
eventueller Protein-Protein-Interaktion, wobei ein erfindungsgemäßes
Expressions- und Detektionsverfahren typischerweise gekennzeichnet ist durch
(a) Bereitstellen erfindungsgemäßer Paare von Vektoren oder
Nukleinsäurekonstrukten, die für ein filamentbildendes Bait-Polypeptid oder einen
ein filamentbildenden Bait-Polypeptid-enthaltenden Komplex kodieren sowie
einem oder mehreren Prey-Polypeptiden bzw. Prey-Polypeptid-Banken, (b)
Transfektion von Zellen mit gemäß Verfahrensschritt (a) erhaltenen Vektoren oder
Nukleinsäurekonstrukten, (c) Kultivierung der gemäß (b) transfizierten Zellen, und
(d) Analyse der möglichen Protein-Protein-Interaktion von unter entsprechenden
Bedingungen exprimierten erfindungsgemäßen Polypeptiden aufgrund der
Rekrutierung von Prey-Polypeptiden in die Bait-Polypeptid enthaltenden
Filamente der Wirtszellen und dem anschließenden Fluoreszenz-technischem
Nachweis der Prey-Polypeptide. Der Nachweis der Protein-Protein-Interaktion
beruht dabei darauf, daß nur im Fall einer vorliegenden Interaktion von Bait- und
Prey-Polypeptid letzteres in Filamenten detektiert werden kann. Die Expression
der Fusionsproteine erfolgt hierbei typischerweise durch folgende
Vorgehensweisen:
- 1. transiente Kotransfektion eines Vektors kodierend für ein Bait-Polypeptid oder
mehreren Vektoren kodierend für die Komponenten eines filamentbildenden Bait-
Polypeptid-enthaltenden Komplexes sowie eines odere mehreren Vektoren,
der/die für Prey-Polypeptide kodieren nach dem Stand der Technik in geeigneten
Expressionssystemen.
- 2. Transfektion eines oder mehrer Vektoren kodierend für ein Prey-Polypeptid in
Zellen die stabil ein Bait-Polypeptid oder die Komponenten eines
filamentbildenden Bait-Polypeptid-enthaltenden Komplexes exprimieren.
- 3. Transfektion eines oder mehrer Vektoren kodierend für ein Bait-Polypeptid oder
mehreren Vektoren kodierend für die Komponenten eines filamentbildenden Bait-
Polypeptid-enthaltenden Komplexes in Zellen, die stabil ein Prey-Polypeptid
exprimieren.
- 4. Transfektion eines oder mehrer Vektoren kodierend für ein Bait-Polypeptid oder
mehreren Vektoren kodierend für die Komponenten eines filamentbildenden Bait-
Polypeptid-enthaltenden Komplexes in einen Pool von Zellen, die jeweils stabil ein
oder wenige von Zelle zu Zelle jedoch oft verschiedene Prey-Polypeptide
exprimieren (Prey-Polypeptid Library).
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Zusammenfassend ist festzustellen, dass erfindungsgemäß Fusionsproteine
(bzw. Proteinkomplexe) mit filamentbildenden Eigenschaften
(Bait-Polypeptide/Bait-Polypeptid-Komplexe) zur Verfügung gestellt werden, die es erlauben
Protein-Protein-Interaktionen auf zellulärer Ebene in lebenden Zellen
nachzuweisen, dadurch daß die Rekrutierung interagierender Proteine oder
Peptid-Domänen (Prey-Polypeptide) in diese Filamente z. B. mikroskopisch durch
Fluoreszenztechniken (Verwendung von fluoreszierenden Fusionsproteinen,
Antikörperfärbung) nachgewiesen wird. Die Prey-Polypeptid-abhängige "Färbung"
der Bait-Polypeptid-enthaltenden Filamente ist somit indikativ für das
Vorhandensein einer direkten oder, in Einzefällen auch indirekten Protein-Protein-
Interaktion zwischen der Bait-Domäne des Bait-Polypeptids und der Prey-
Domäne des Prey-Polypeptids.
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Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Figuren näher erläutert.
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Fig. 1 zeigt filamentbildende Fusionsproteine aus filamentbildenden Polypeptid-
Domänen und einer heterologen Polypeptiddomäne, die selbst keine
filamentbildenden Eigenschaften, besitzt. Um eine einfache Visualisierung der
filamentbildenden heterologen Fusionsproteine zu ermöglichen, wurde in diesen
Beispielen fluoreszierende Proteine als Fusionspartner der filamentbildenden
Polypeptid-Domäne verwendet. In praktischen Anwendungen werden jedoch
anstatt der fluoreszierenden Proteine solche Polypeptid-Domänen verwendet, die
hinsichtlich ihrer Protein-Protein-Interaktions-Möglichkeiten analysiert werden
sollen und die selbst nicht fluoreszieren.
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Fig. 2 zeigt beispielhaft die Rekrutierung verschiedener Prey-Polypeptide
(Sentrin-GFP, cIAP1-GFP, IKK1-GFP, IKK2-GFP, NEMO-GFP) in die Filamente
eines Bait-Proteinkomplexes, der aus TRADD und TRAF1 besteht. Die zelluläre
Verteilung des Prey-Polypeptids in der Abwesenheit des Bait-Komplexes oder
eines seiner Komponenten ist gleichfalls gezeigt. Da das filamentbildende TRADD
Polypeptid und TRAF1 natürlicher Weise miteinander interagieren, ist es in
diesem Fall für die Analyse von Protein-Protein-Interaktionen von TRAF1 mit
Prey-Polypeptiden nicht notwendig, ein heterologes Bait-Fusionspolypeptid aus
der filamentbildenden Domäne von TRADD und TRAF1 zu verwenden.
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Fig. 3 zeigt beispielhaft die Rekrutierung verschiedener Prey-Polypeptide
(TRAF4-GFP, TRAF4-TD-YFP) in die Filamente des Bait-Fusionsproteins TRAF4-
TRADD-DD, das aus TRAF4 und der filamentbildenden Todesdomäne (DD) von
TRADD besteht. Die zelluläre Verteilung der Prey-Polypeptide in der Abwesenheit
des Bait-Fusionsprotein ist gleichfalls gezeigt. Die Prey-Proteine binden dabei
nicht an die filamentbildende TRADD-Todesdomäne allein (Daten nicht gezeigt).
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Fig. 4 zeigt beispielhaft die Rekrutierung des Prey-Polypeptids TRAF2-GFP in
die Filamente des Bait-Fusionsproteins TRAF2-NT-TRADD-DD, das aus der N-
terminalen Domäne von TRAF2 und der filamentbildenden Todesdomäne (DD)
von TRADD besteht. Die zelluläre Verteilung des Prey-Polypeptids in der
Abwesenheit des Bait-Fusionsprotein ist gleichfalls gezeigt. Das Prey-Protein
bindet dabei nicht an die filamentbildende TRADD-Todesdomäne allein (Daten
nicht gezeigt).
Konstrukt (A): TRAF6-TRADD-DD
NH2-[TRAF6]-[2AS-Linker]-[TRADD(169-312)]-COOH
Konstrukt (B): Myc-TRADD-DD-TNF-R2(cyt)
NH2-[myc-tag]-[2AS-Linker]-[TRADD(169-312)]-[2AS-Linker]-[TNF-R2(286-461)]-
COOH
Konstrukt (C): Myc-Caspase-8(1-277)-TNF-R2(cyt)
NH2-[myc-tag]-[2AS-Linker]-[Caspase-8(1-277)]-[4AS-Linker]-[TNF-R2(286-461)]-
COOH
Konstrukt (D): TRAF4-TRADD-DD
NH2-[TRAF4]-[2AS-Linker]-[TRADD(169-312)]-COOH
Konstrukt (E): TRAF2-NT-TRADD-DD
NH2-[TRAF6]-[2AS-Linker]-[TRADD(169-312)]-COOH
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Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele
näher erläutert.
Beispiel 1
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Koexpression bzw. einzelne Expression erfindungsgemäßer Bait- und Prey-
Polypeptide
Beispiel 2
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Expression des erfindungsgemäßen Bait-Komplexes aus TRADD und TRAF1
Beispiel 3 und 4
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Expression des erfindungsgemäßen Bait-Fusionsproteine TRAF4-TRADD-DD
und TRAF2-NT-TRADD-DD und Rekrutierung von entsprechenden Prey-
Proteinen.
Beispiel 5
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Konstruktion der erfindungsgemäßen Polypeptide TRAF2-NT-TRADD-DD,
TRAF4-TRADD-DD, TRAF6-TRADD-DD, Myc-TRADD-DD-TNF-R2(cyt) und Myc-
Caspase-8-TN F-R2(cyt)
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Die Fusionsproteine wurden, wie folgt, hergestellt:
TRAF6-TRADD-DD
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- 1. cDNA für humanes TRAF6 wurde mit den Primern 1 und 2 mittels proof-reading
PCR amplifiziert. Durch die PCR wurden im 5-Ende der Amplicons eine Bgl2-
Schnittstelle und in das 3'-Ende eine Sac2-Schnittstelle eingeführt. Nach
Verdau mit Bgl2 und Sac2 wurde die TRAF6-cDNA in den mit Bgl2 und Sac2
geschnittenen pEGFP-N1 Vektor eingefügt. Das so erhaltene Konstrukt
pEGFP-N1-TRAF6-GFP kodiert für ein TRAF6 Fusionsprotein mit C-
terminalem GFP.
- 2. cDNA für die AS 169-312 + Stopkodon des humanen TRADD (TRADD(169-
312)) wurde mit den Primern 3 und 4 mittels proof-reading PCR amplifiziert.
Durch die PCR wurden im 5'-Ende der Amplicons eine Sac2-Schnittstelle und
in das 3'-Ende eine Not1-Schnittstelle eingeführt. Nach Verdau mit Sac2 und
Not1 wurde die TRADD(169-312) cDNA in das mit Sac2 und Not1
geschnittenen pEGFP-N1-TRAF6-GFP Plasmid eingefügt. Das durch den
Sac2/Not1-Verdau des pEGFP-N1-TRAF6-GFP Plasmids anfallende GFP-
cDNA-Fragment wurde zuvor entfernt. Das so erhaltenen Plasmid pEGFP-N1-
TRAF6-TRADD-DD kodiert für ein TRAF6-Protein, an das C-terminal einige
Linker-kodierte AS sowie DD des TRADD Proteins folgt.
Myc-TRADD-DD-TNF-R2(cyt)
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- 1. cDNA für die N-terminal myc (mit Start-ATG)-getaggten AS 195-312 des
humanen TRADD wurden mit den Primern 5 und 6 mittels proof-reading PCR
aus einem ein entsprechendes myc-getaggtes TRADD-Fragment kodierendem
Plasmid amplifiziert. Durch die PCR wurden im 5'-Ende der Amplicons eine
Hind3-Schnittstelle und in das 3'-Ende eine EcoR1-Schnittstelle eingeführt.
Nach Verdau mit Hind3 und EcoR1 wurde die myc-TRADD-cDNA in den mit
Hind3 und EcoR1 geschnittenen pcDNA3.1 Vektor eingefügt. Das so
erhaltenen Konstrukt pcDNA3.1-myc-TRADD-DD kodiert für ein N-terminales
myc-getaggtes TRADD-Fragment, das die DD des Moleküls beinhaltet.
- 2. cDNA für die AS 286-461 des humanen TNF-R2 wurden mit den Primern 7 und
8 mittels proof-reading PCR aus Kym1-Gesamt-RNA durch RT-PCR
amplifiziert. Durch die PCR wurden im 5'-Ende der Amplicons eine EcoR1-
Schnittstelle und in das 3'-Ende eine Not1-Schnittstelle eingeführt. Nach
Verdau mit EcoR1 und Not1 wurde die TNF-R2-cDNA-Fragment in das mit
EcoR1 und Not1 geschnittenen pcDNA3.1-myc-TRADD-DD Plasmid eingefügt.
Das so erhaltenen Konstrukt pcDNA3.1-myc-TRADD-DD-TNFR2(cyt) kodiert
für ein N-terminales myc-getaggtes Fusionsprotein, aus einem auf den myc-
tag folgenden TRADD-Fragment, das die DD des Moleküls beinhaltet, einigen
Linker-kodierten AS und einem C-terminalen Fragment, das für die
zytoplasmatische Domäne des TNF-R2 kodiert.
Myc-Caspase-8(1-277)-TN F-R2(cyt)
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- 1. cDNA für die AS 1-277 der humanen Caspase-8 wurden mit den Primern 9 und
10 mittels proof-reading PCR aus Kym1-Gesamt-RNA durch RT-PCR
amplifiziert. Durch die PCR wurden im 5'-Ende der Amplicons eine BamH1-
Schnittstelle und in das 3'-Ende eine EcoR5-Schnittstelle eingeführt. Nach
Verdau mit BamH1 und EcoR5 wurde das Caspase-8-cDNA-Fragment in den
mit BamN1 und EcoRS geschnittenen pcDNA3.1-myc-TRADD-DD Vektor
kloniert, aus dem durch diesen Verdau gleichzeitig das TRADD-Fragment
deletiert wurde. Das so erhaltenen Konstrukt pcDNA3.1-myc-Caspase-8(1-
277) kodiert für ein N-terminal, myc-getaggtes Caspase-8 Fragment, das u. a.
die DED des Moleküls enthält.
- 2. cDNA für die AS 286-461 des humanen TNF-R2 wurden mit den Primern 7 und
8 mittels proof-reading PCR aus Kym1-Gesamt-RNA durch RT-PCR
amplifiziert. Durch die PCR wurden im 5'-Ende der Amplicons eine EcoR5-
Schnittstelle und in das 3'-Ende eine Not1-Schnittstelle eingeführt. Nach
Verdau mit EcoR5 und Not1 wurde die TNF-R2-cDNA-Fragment in das mit
EcoR5 und Not1 geschnittenen pcDNA3.1-myc-Caspase-8(1-277) Plasmid
eingefügt. Das so erhaltenen Konstrukt pcDNA3.1-myc-Caspase-8(1-277)-
TNFR2(cyt) kodiert für ein N-terminales myc-getaggtes Fusionsprotein aus
einem auf den myc-tag folgenden Caspase-8-Fragment, das die DED des
Moleküls beinhaltet, einigen Linker-kodierten AS und einem C-terminalen
Fragment, das für die zytoplasmatische Domäne des TNF-R2 kodiert.
TRAF4-TRADD-DD
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- 1. cDNA für humanes TRAF4 wurde mit den Primern 11 und 12 mittels proof-
reading PCR amplifiziert. Durch die PCR wurden im 5'-Ende der Amplicons
eine BamH1-Schnittstelle und in das 3'-Ende eine Sac2-Schnittstelle
eingeführt. Nach Verdau mit BamH1 und Sac2 wurde die TRAF4-cDNA in den
mit Bgl2 und Sac2 geschnittenen pEGFP-N1 Vektor eingefügt. Das so
erhaltene Konstrukt pEGFP-N1-TRAF4-GFP kodiert für ein TRAF4
Fusionsprotein mit Cterminalem GFP und einer zwischen TRAF4 und GFP
liegenden Linker.
- 2. cDNA für die AS 169-312 + Stopkodon des humanen TRADD wurde mit den
Primern 3 und 4 mittels proof-reading PCR amplifiziert. Durch die PCR wurden
im 5'-Ende der Amplicons eine Sac2-Schnittstelle und in das 3'-Ende eine
Not1-Schnittstelle eingeführt. Nach Verdau mit Sac2 und Not1 wurde die
TRADD(169-312) cDNA in das mit Sac2 und Not1 geschnittene pEGFP-N1-
TRAF4-GFP Plasmid eingefügt. Das durch den Sac2/Not1-Verdau des
pEGFP-N1-TRAF4-GFP Plasmids anfallende GFP-cDNA-Fragment wurde
zuvor entfernt. Das so erhaltenen Konstrukt pEGFP-N1-TRAF4-TRADD-DD
kodiert für ein TRAF4-Protein, einigen Linker-kodierten AS auf die C-terminal
die DD des TRADD Proteins folgt.
TRAF2-NT-TRADD-DD
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- 1. cDNA für die N-terminalen 272 Aminosäuren des humanen TRAF2 (TRAF2-
NT) wurde mit den Primern 13 und 14 mittels proof-reading PCR amplifiziert.
Durch die PCR wurden im 5'-Ende der Amplicons eine BamH1-Schnittstelle
und in das 3'-Ende eine Sac2-Schnittstelle eingeführt. Nach Verdau mit
BamH1 und Sac2 wurde die TRAF2-NT-cDNA in den mit Bgl2 und Sac2
geschnittenen pEGFP-N1 Vektor eingefügt. Das so erhaltene Konstrukt
pEGFP-N1-TRAF2-NT-GFP kodiert für ein C-terminales Fusionsprotein der N-
terminalen 180 Aminosäuren des TRAF2-Proteins mit GFP.
- 2. cDNA für die AS 169-312 + Stopkodon des humanen TRADD wurde aus dem
Komnstrukt TRAF6-TRADD-DD durch Restriktionsverdau mit Sac2 und Not1
gewonnen. Nach Verdau des Plasmids pEGFP-N1-TRAF2-NT-GFP mit Sac2
und Not1 wurde das TRADD(169-312) cDNA-Fragment in dieses eingefügt.
Das durch den Sac2/Not1-Verdau des pEGFP-N1-TRAF2-NT-GFP Plasmid
anfallende GFP-cDNA-Fragment wurde zuvor entfernt. Das so erhaltenen
Plasmid pEGFP-N1-TRAF2-NT-TRADD-DD kodiert für ein Fusionsprotein
bestehend aus den 272 N-terminalen Aminosäuren des TRAF2-Proteins,
einigen Linker-kodierten AS sowie der DD des TRADD Proteins.
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Alle Klonierungs- und PCR-Amplifikationsschritte erfolgten nach üblichen
Standardprozeduren mit den nachfolgenden Primern. Alle Konstrukte wurden zur
Verifikation der cDNA-Sequenz sequenziert. Die Aminosäure-Numerierung und
cDNA Sequenzverifikation erfolgte aufgrund der in der Genbank abgelegten und
öffentlich zugänglichen Informationen (humanes TRAF2, Accession-No: U12597;
humanes TRAF4, Accession-No: X80200; humanes TRAF6, Accession-No:
U78798; humanes TRADD, Accession-No: L41690; humanen TNF-R2,
Accession-No: M55994; humane Caspase-8, Accession-No: NM_001228).
Verwendete Abkürzungen
CARD caspase-recruitment domain
CFP cyan fluorescent protein
cIAP cellular inhibitor of apoptosis
DD death domain
DED death effector domain"
DsRED Discosom sp. Red
FADD Fas-associated protein with death domain
FIT Filament-based Interaction Trap
FITC Fluorescein Isothiocyanat
FLICE FADD-like ICE
FLIP FLICE inhibitory protein
GFP green fluorescent protein
IKK inhibitor of kappaB kinase
NEMO NF-kappaB essential Modulator
RAIDD RIP-associated ICH-1/CED-3-homologous protein with a death domain
RICK RIP-like interacting CLARP kinase
RIP receptor interacting protein
TD TRAF domain
TNF Tumor-Nekrose-Faktor
TRADD TNF receptor-1 associated protein with death domain
TRAF TNF receptor associated factor
YFP yellow fluorescent protein