DE60031414T2

DE60031414T2 - Einkettige polypeptide enthaltend n-terminale troponin i fragmente und troponin c

Info

Publication number: DE60031414T2
Application number: DE60031414T
Authority: DE
Inventors: Qinwei Etobicoke SHI; Shigui Mississauga LIU; Mingfu Etobicoke LING
Original assignee: Spectral Diagnostics Inc Canada
Current assignee: Spectral Diagnostics Inc Canada
Priority date: 1999-08-05
Filing date: 2000-08-07
Publication date: 2008-04-10
Anticipated expiration: 2020-08-08
Also published as: EP1200588B1; CA2381439A1; ATE342978T1; WO2001011043A1; CA2381439C; EP1200588A1; DE60031414D1; US6475785B1; ES2274799T3; AU6310100A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinant exprimierte einkettige Polypeptide, die ein N-terminales Fragment von Troponin I gebunden an Troponin C umfassen, sowie ihre entsprechenden genetischen Sequenzen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Eine frühe und genaue Beurteilung eines vermuteten akuten Myokardinfarktes hängt entscheidend von einer empfindlichen und spezifischen Bestimmung und quantitativen Erfassung freigesetzter intrazellulärer kardialer (d.h. herzspezifischer) Muskelkomponenten im Blut, Serum oder Plasma ab, um ein potentiell tödliches Ereignis, das Notfallmaßnahmen erfordert, von nicht lebensbedrohenden Zuständen wie z.B. Angina und nicht-kardialen Brustschmerzen wie z.B. Dyspepsie zu unterscheiden. Frühe Veränderungen im Elektrokardiogramm sind weder hinreichend spezifisch noch empfindlich genug, und die medizinischen Berufe vertrauen mittlerweile auf biochemische Marker einer Herzgewebeverletzung im Serum zur Frühdiagnose. Anfänglich wurden die Serum-Marker Creatinkinase (CK) und insbesondere die herzspezifische CK-MB-Isoform und anschließend Myoglobin als ein empfindlicher Frühindikator für eine Herzschädigung verwendet. In jüngerer Zeit wurden der kardiale Troponin-Komplex und seine Untereinheiten auf Grund ihrer hohen Spezifität zu den bevorzugten Marker für eine myokardiale Schädigung. Diese kombinierten Tests erbringen in Verbindung mit anderen Marker für Skelettmuskelverletzungen einen hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit. Wenn sie in einer Notaufnahme durchgeführt werden, stellt eine frühe und genaue Diagnose einer myokardialen Schädigung einen großen Vorteil für ein mögliches Herzinfarktopfer dar.
Diagnostische Tests, die kardiale Marker verwenden, wurden beispielsweise in den U.S.-Patenten Nr. 5,604,105 und 5,290,678 beschrieben. Diese und weitere Verfahren ermöglichen eine schnelle Diagnose eines Myokardinfarktes im Bereich einer Notaufnahme und bringen erhebliche medizinische Vorteile für die Patienten mit sich. Diagnostische Tests, in denen die Menge an Troponin-Untereinheiten oder -Komplexen in Körperflüssigkeiten ge messen wird, verwenden häufig gereinigte Troponin-Untereinheiten oder -Komplexe als Antigene zur Herstellung von Antikörpern, die im Assay-Verfahren verwendet werden, sowie gereinigte Troponin-Untereinheiten oder -Komplexe als Kontrollsubstanzen und Kalibratoren zur Durchführung der Assays. Assay-Kalibratoren werden verwendet, um eine Verdünnungsreihe herzustellen, mit der eine Standardkurve innerhalb des Betriebsbereichs des Assays erstellt wird; Assay-Kontrollsubstanzen werden verwendet, um zu bestätigen, dass ein Assay ordnungsgemäß arbeitet, indem sicher gestellt wird, dass die Messwerte von im Voraus festgelegten Proben innerhalb akzeptabler, für das jeweilige Assay festgelegter Bereiche liegen. Um ein Assay ordnungsgemäß zu kalibrieren, müssen die Troponin-Kontrollsubstanzen und -Kalibratoren stabil sein und in einer Form bleiben, die vom Antikörper immundetektierbar ist.
Troponin ist ein Muskelprotein, das in der Kalzium-abhängigen Regulation der Muskelkontraktion integriert ist. Troponin existiert sowohl im Herzmuskel als auch in Skelettmuskeln als nicht-kovalent gebundener Komplex dreier Untereinheiten, nämlich den Isoformen Troponin C, der Kalzium bindenden Untereinheit, Troponin I, der Inhibitor-Untereinheit, und Troponin T, das den Troponin-Komplex am Tropomyosin verankert. Unter geeigneten Bedingungen assoziieren die Troponin-Untereinheiten spontan in vitro unter Bildung nicht-kovalent gebundener Komplexe wie z.B. Troponin I und C sowie Troponin I, C und T. Es existieren Unterschiede zwischen den Aminosäuresequenzen der Troponin-Isoformen des Herzmuskels und der Skelettmuskeln.
Bei einer Herzmuskelverletzung und -Nekrose tritt Troponin aus dem Herzgewebe in den Blutstrom über, wo seine empfindliche Bestimmung die Diagnose eines Herzinfarktes erleichtern kann. Die Unterschiede zwischen den Aminosäuresequenzen der Isoformen des Herzmuskels und der Skelettmuskeln der Troponin-Untereinheiten werden in diagnostischen Tests ausgenutzt, die spezifisch die kardiale Isoform der Troponin-Untereinheiten und -Komplexe messen. Es stehen diagnostische Tests für kardiales Troponin I zur Verfügung.
Es wurden zahlreiche Troponin-Präparate sowohl aus natürlichen als auch aus rekombinanten Quellen beschrieben, die Troponin I zusammen mit Troponin C enthalten. Malnic und Reinach (1994, Eur. J. Biochem., Bd. 222, S. 49–54) produzierten in vivo einen rekombinanten Komplex, indem sie alle drei Troponin-Untereinheiten des Hühner-Skelettmuskels in ein oder mehrere Expressionsplasmide klonierten. Innerhalb des Expressionsvektors hatte jedes Troponin-Gen seinen eigenen Promotor und die Proteine wurden im Bakterium als individuelle Troponin-Untereinheiten exprimiert, welche im Bakterium anschließend Komplexe bildeten. Fujita-Becker et al. (1993, J. Biochem., Bd. 114, S. 438–444) beschrieben die Rekonstruktion des Troponin-Komplexes des Kaninchen-Skelettmuskels aus rekombinanten Untereinheiten in E. coli. Bei keinem dieser rekombinanten Produkte konnte gezeigt werden, dass es eine zur Verwendung als diagnostischer Teststandard oder -Kalibrator adäquate Stabilität aufweist. Wie oben erwähnt wurde, sind selbst die Komplexe der Troponin-Untereinheiten nicht stabil und bleiben in Lösung nicht in nennenswertem Umfang intakt und aneinander gebunden.
Troponin I besitzt eine inhärent schlechte strukturelle Stabilität und unterliegt der proteolytischen Spaltung durch die in biologischen Proben vorhandenen Proteasen. Ein Troponin I-Material, welches in der Matrix einer Körperflüssigkeit hergestellt wurde, unterliegt somit Konformationsänderung und Abbau und ist als Kalibrator oder Kontrollsubstanz ungeeignet. Weiterhin ist bekannt, dass die inhärent stabileren Troponin-Komplexe bei Lagerung und Verdünnung dissoziieren und so einem proteolytischen Abbau zugänglich werden. Im Falle von Troponin I muss dieses mit Troponin C komplexiert werden, um zu helfen, seine Konformationsstruktur und -Stabilität zu erhalten; indessen hängt auf Grund der Natur der Affinität der Untereinheiten im Komplex der Anteil des im Komplexform vorliegenden Troponin I von der Konzentration ab. Dies schränkt seine Verwendbarkeit als Assay-Kalibrator oder Kontrollsubstanz ein. Das Ausmaß an Wechselwirkungen zwischen den Untereinheiten kann anhand der Dissoziationskonstante K_d berechnet werden [wie dies z.B. in Biochemistry 33:12729 [1994] berichtet wird]. Gemäß Berechnung und experimenteller Messung ist nur eine beschränkte Menge an Troponin I innerhalb des Bereichs an Troponin C gebunden, der in Serumproben von Patienten gefundenen wird und daher die Mengen vorgibt, in welchen die Kalibratoren und Kontrollsubstanzen verwendet werden müssen. Beispielsweise sind bei 50 ng/ml, dem oberen Bereich der meisten Troponin I-Assays, nur 10 % des Troponin I an Troponin C gebunden, wenn die beiden Untereinheiten im Verhältnis 1:1 vorliegen. Im Falle des Vorliegens eines 10-fachen Überschusses von Troponin C gegenüber Troponin I sowie der Anwesenheit von zweiwertigen Kationen (Larue et al., U.S.-Patent 5,583,200 ) wurde eine minimale Stabilität des Komplexes in der Kalte, d.h. von "zumindest einem Tag", beansprucht. Wenn höhere Konzentrationen des Komplexes aufrecht erhalten werden, sinkt das Ausmaß an Dissoziation; nach der zur Kalibrierung des Assays erforderlichen Verdünnung dissoziieren die Untereinheiten indessen und werden immunologisch instabil. Die Dissoziation unterwirft die Untereinheiten anschließend dem proteolytischen Angriff, was die Stabilität dieser Kalibratoren und Kontrollsubstanzen weiter verringert. Wie in der oben angegebenen Anmeldung beschrieben wird, sind stabile N-terminale Fragmente von Troponin I, gegebenenfalls mit einem intakten N-Terminus, immunstabil und als Kalibratoren und Kontrollsubstanzen für optimierte Troponin I-Assays verwendbar.
Wie weiterhin im gleichfalls anhängigen U.S.-Patent 6,077,676 beschrieben wurde, umfasst ein stabiles Troponin-Präparat für Assay- und andere Anwendungen Troponin I und Troponin C in einem einkettigen Polypeptid, welches als rekombinantes Konstrukt hergestellt und in einem bakteriellen Expressionssystem als einzelnes Polypeptid exprimiert wurde. Wie oben erwähnt wurde, schützt die Assoziation von Troponin I und Troponin C das Troponin I-Molekül vor Konformationsänderungen und proteolytischen Angriffen; im einkettigen Konstrukt können die Troponin-Untereinheiten nicht dissoziieren und das Troponin I ist immunstabil und gegen proteolytische Angriffe resistent.
WO 99/31235 betrifft einkettige Polypeptide und ihre genetischen Sequenzen, welche kardiales Human-Troponin I und Troponin C umfassen. Das einkettige Polypeptid kann rekombinant exprimiert werden und ein Verbindungspeptid (Linker-Peptid) kann zwischen den Troponin-Sequenzen angeordnet werden. Ein Verbindungspeptid mit etwa 6 bis etwa 30 Aminosäuren wird bevorzugt. Das einkettige Polypeptid eignet sich als eine Kontrollsubstanz oder ein Kalibrator für Troponin-Assays, zur Reinigung von Troponin-Untereinheiten und als Antigen zur Herstellung von Antikörpern.
WO 98/54219 beschreibt stabilisierte Zusammensetzungen zur Verwendung in klinischen Troponin-Assays, wie z.B. eine Zusammensetzung zur Verwendung in einem Assay zur Bestimmung der Anwesenheit oder Konzentration von kardialem Troponin I, wobei die Zusammensetzung umfasst: einen Komplex von kardialem Troponin I oder einem Fragment davon und Troponin C oder einem Fragment davon, wobei das kardiale Troponin I kovalent an das Troponin C gekoppelt ist. Es wird angegeben, dass die kovalente Kopplung eine Quervernetzung zwischen diesen Proteinen darstellt, die mit Hilfe geeigneter Kopplungsreagenzien eingeführt wurde.
Die vorliegende Erfindung ist auf die Entwicklung einer immunstabilen und immundetektierbaren Troponin I-Zusammensetzung gerichtet.
GLOSSAR
Der Begriff "N-terminales Troponin I-Fragment" betrifft einen Teil des Troponin I-Moleküls, der sich vom N-terminalen Teil des nativen Moleküls ableitet, wobei es sich um ein beliebiges Fragment ab dem N-Terminus (Aminosäure 1) bis etwa zur Mitte des nativen Moleküls (etwa Aminosäure 110) handeln kann. Das N-terminale Fragment kann den nativen N-Terminus enthalten, braucht dies aber nicht zu tun. Ein nicht-limitierendes Beispiel ist ein Fragment mit 82 Aminosäuren, das den Aminosäuren 28 bis 110 des nativen kardialen Human-Troponin I entspricht.
"N-Terminus" ist die N-terminale Aminosäure 1 des nativen Troponin I.
"Linker" (bzw. "Verbindungs-") betrifft eine Sequenz von etwa 5 bis etwa 50 Aminosäuren (sowie die betreffende Polynukleotid-Sequenz), die erfindungsgemäß zwischen dem Troponin I-Fragment und Troponin C angeordnet ist, was den Troponin-Molekülen erlaubt, sich auf eine Art und Weise zu assoziieren, die ihrer Assoziation im nativen, nicht-kovalenten Troponin I-Troponin C-Komplex ähnlich ist.
"Spacer" betrifft eine kurze Aminosäuresequenz von etwa 4 oder weniger Aminosäuren (sowie die betreffende Polynukleotid-Sequenz), die zwischen dem Troponin I-Fragment und Troponin C angeordnet ist, um die Herstellung des rekombinanten Konstruktes unter Verwendung einer kurzen Restriktionsstelle zu erleichtern.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist eine prinzipielle Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einkettige Polypeptide bereitzustellen, die ein N-terminales Troponin I-Fragment und Troponin C umfassen. Die Anwesenheit des N-terminalen Troponin I-Fragments and Troponin C in derselben Polypeptidkette verleiht dem Produkt Konformationsstabilität und Immunstabilität. Die Teile des einkettigen Polypeptids, die ein N-terminales Troponin I-Fragment umfassen, dem gegebenenfalls der N-Terminus fehlt, entsprechen der stabilen Troponin I-Form im Blutkreislauf, welche teilweise durch Proteasen entweder am Amino-Ende, am Carboxyl-Ende oder an beiden Enden abgebaut wurde, und ähneln der hauptsächlichen Serumform, welche in der Blutprobe eines Patienten gemessen wird, um den Grund seiner Brustschmerzen zu ermitteln und insbesondere um einen Herzinfarkt zu diagnostizieren. Die zirkulierende, teilweise abgebaute Form von Troponin I, die im selben Polypeptid mit Troponin C verbunden ist, ergibt stabile Zusammensetzungen, die dem zu messenden Analyten strukturell im Wesentlichen ähneln, wobei die Epitope mit dem Analyten kompatibel sind. Sie ergeben immunstabile und immundetektierbare Zusammensetzungen, die sich zur Verwendung als Kalibratoren und Kontrollsubstanzen für Troponin I-Immunoasays sowie zur Affinitätsreinigung von Troponin-Antikörpern eignen.
Das einkettige Polypeptid kann vorzugsweise eine Verbindungssequenz enthalten, die zwischen den Sequenzen des N-terminalen Troponin I-Fragments und Troponin C angeordnet ist. Die Sequenz des Linkers ist so gewählt, dass sie mit der Tertiärstruktur des Produktes und daher mit dessen oben genannten nützlichen Eigenschaften nicht interferiert. Ein einkettiges Polypeptid, in dem ein N-terminales Troponin I-Fragment und Troponin C gegebenenfalls durch ein Verbindungspeptid verbunden sind, ergibt ein stabiles, reproduzierbares und leicht zu reinigendes Material zur Entwicklung von Troponin-Assays, ein Antigen zur Herstellung von Troponin-Antikörpern sowie ein Material zur Verwendung als Kontrollsubstanzen und Kalibratoren für Troponin-Assays. In einem nicht-limitierenden Beispiel eines N-terminalen Troponin I-Fragments, welches über eine Verbindungssequenz mit Troponin C verbunden ist, umfasst das Troponin I-Fragment die Reste 28 bis 110 des nativen Troponin I, welches durch eine Verbindungssequenz von 19 Aminosäuren mit dem nativen Troponin C verbunden ist. In einem weiteren Beispiel umfasst ein einkettiges Polypeptid ein N-terminales Troponin I-Fragment mit den Resten 28 bis 110 des nativen Troponin I, welches ohne Linker mit der nativen Troponin C-Sequenz verbunden ist. Um dieses Konstrukt zu konstruieren, wird eine Sequenz mit zwei Aminosäuren zwischen den Troponin-Teilen angeordnet.
Dem N-terminalen Troponin I-Fragment fehlt der N-Terminus. In einer Ausführungsform fehlen etwa 20 bis etwa 30 Aminosäuren des N-terminalen Teils. Daher stellt das N-termi nale Troponin I-Fragment des erfindungsgemäßen einkettigen Polypeptids ein N-terminales Troponin I-Fragment mit etwa 65 bis etwa 85 Aminosäuren dar. Im Rahmen eines nicht-limitierenden Beispiels weisen die einkettigen Polypeptide die Aminosäuren 28 bis 110 des native Troponin I auf.
Das erfindungsgemäße einkettige Polypeptid wird am einfachsten mittels Rekombinationstechniken hergestellt, indem ein replizierbares Klonierungs- oder Expressionsvehikel wie z.B. ein Plasmid konstruiert wird, das die genetische Sequenz des einkettigen Polypeptids trägt, eine Wirtszelle wie z.B. E. coli mit dem Vehikel wie z.B. dem Plasmid transformiert wird und das Polypeptid durch die Wirtszelle exprimiert wird. Das einkettige Konstrukt kann eine Verbindungspeptidsequenz zwischen den Aminosäuresequenzen des Troponin I-Fragments und des Troponin C enthalten, wobei diese Sequenz mittels Rekombinationstechniken eingeführt wird. Wenn kein Linker-Peptid bereitgestellt wird, kann eine optionale kurze Sequenz von etwa zwei Aminosäuren zwischen den Troponin-Sequenzen bereitgestellt werden, um das Konstrukt zu konstruieren. Es können bestimmte Modifikationen der genetischen Sequenz des Polynukleotids mit oder ohne Änderungen der nachfolgenden Aminosäuresequenz des Polypeptids vorgenommen werden, um des Expression des Polypeptids in der Wirtszelle zu verbessern. Diese Veränderungen ändern nicht die Eigenschaften oder Verwendbarkeiten des einkettigen Polypeptids für die oben genannten Zwecke.
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, Verfahren zur Verwendung der oben beschriebenen einkettigen Polypeptide als Kalibratoren oder Kontrollsubstanzen für Troponin I-Assays bereitzustellen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine genetische Sequenz für ein einkettiges Polypeptid bereitzustellen, umfassend eine genetische Sequenz eines N-terminalen Troponin I-Fragments, dem der N-Terminus fehlt, sowie Troponin C. Die genetische Sequenz kann auch eine genetische Linker-Sequenz beinhalten, die zwischen den genetischen Sequenzen von Troponin I und Troponin C angeordnet ist. Wenn die Linker-Sequenz fehlt, kann eine kurze Sequenz, die zwei Aminosäuren entspricht, an der dortigen Stelle dazwischen angeordnet werden, um die Konstruktion des Konstruktes zu ermöglichen. Eine Wirtszelle kann mit dem replizierbaren Klonierungs- oder Expressionsvehikel transformiert werden, das die oben genannten genetischen Sequenzen enthält. Wie oben erwähnt wurde, können bestimmte Veränderungen an der genetischen Sequenz der Troponin vorgenommen werden, um die Expression in der Wirtszelle zu erleichtern.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Wirtszelle bereitzustellen, die Klonierungs- oder Expressionsvehikel wie z.B. ein Plasmid enthält, welches die genetische Sequenz eines einkettigen Polypeptids trägt, umfassend die genetischen Sequenzen eines N-terminalen Troponin I-Fragments und Troponin C, und zur Expression eines einkettigen Polypeptids befähigt ist, das Troponin I und Troponin C umfasst.
Diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme auf die nachfolgende detaillierte Beschreibung näher erläutert.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Zur Verwendung als stabile Kalibratoren und Kontrollsubstanzen für Troponin I-Assays verbessern die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung die inhärente Konformations-Instabilität und proteolytische Anfälligkeit des freien Troponin I, die Assoziations-Instabilität des Troponin I-Troponin C-Komplexes und die geringe Ähnlichkeit zwischen der vorwiegend zirkulierenden Form des Troponin I in einer Probe und des nativen Troponin I-Analyten. Die Verbesserung besteht in einem einkettigen Polypeptid, welches ein N-terminales Fragment des kardialen Human-Troponin I und kardiales Troponin C umfasst. Die Troponin-Untereinheiten sind durch eine Peptidbindung kovalent verbunden und liegen auf demselben linearen Polypeptid, was ein stabiles einkettiges Troponin I-Fragment-Troponin C-Polypeptid ergibt, welches den Bedarf der Industrie befriedigt. Das N-terminale Fragment des Troponin I im Polypeptid entspricht der Hauptform des Troponin I im Blutkreislauf auf Grund eines teilweisen Abbaus durch intrazelluläre Proteasen und Serumproteasen, welche den C-terminalen Teil des Troponin I abspalten und ein intaktes N-terminales Fragment zurücklassen, welches am N-terminalen Teil dann weiter abgebaut werden kann. Das verbleibende Troponin I-Fragment, das etwa zwischen den Aminosäuren 28 und 110 liegt, ist auf Grund seiner Primarstruktur sehr beständig gegen einen weiteren proteolytischen Abbau. Die Stabilität der Tertiärstruktur des Troponin I-Fragments wird durch die Assoziierung mit Troponin C bewirkt. Somit ergibt ein einkettiges N-terminales Troponin I-Fragment/Troponin C-Konstrukt ein abbauresistentes und strukturell stabiles Polypeptid, das in einer dem hauptsächlichen Serum-Analyten ähnlichen Form vorliegt.
Das einkettige Polypeptid kann mittels Rekombinationstechniken hergestellt werden und wahlweise eine Linker-Polypeptid- oder eine Spacer-Polypeptid-Sequenz beinhalten, die zwischen den Troponin I- und Troponin C-Sequenzen angeordnet sind.
Beispielsweise kann eine Ausführungsform des einkettigen Troponin I-Fragment-Troponin C-Polypeptids ein Troponin I-Fragment am N-terminalen Teil des Polypeptids umfassen, wobei der C-Terminus der Troponin I-Fragment-Sequenz in einer Peptidbindung mit dem N-Terminus der Troponin C-Sequenz verbunden ist. In einem nicht-limitierenden Beispiel wird, um ein solches Konstrukt zu konstruieren, eine kurze Aminosäuresequenz von etwa 2 Aminosäuren zwischen den Troponin-Molekülen bereitgestellt. Dies erlaubt die Verwendung von Restriktionsendonukleasen zur Herstellung des Konstruktes. Beispielsweise kodiert die Sphl-Endonukleasenstelle Ala Cys. In einer weiteren Ausführungsform kann ein Konstrukt des Polynukleotids oder des Proteins, in welchem das Troponin I-Fragment direkt mit Troponin C verbunden ist, mit Techniken wie der Festphasen-Synthese oder unter Verwendung des weiter unten beschriebenen SOE-Verfahrens hergestellt werden. In einer zweiten Ausführungsform, in der eine Verbindungspeptidsequenz zwischen den Aminosäuresequenzen des Troponin I-Fragments und des Troponin C angeordnet ist, umfasst eine bevorzugte Anordnung die Troponin I-Fragment-Sequenz am N-terminalen Teil des Polypeptids, dessen C-Terminus in einer Peptidbindung mit dem N-Terminus des Linker-Peptids verbunden ist und der C-Terminus des Linker-Peptids dann in einer Peptidbindung mit dem N-Terminus der Troponin C-Sequenz verbunden ist. In einem Beispiel dieses Konstruktes enthält die Aminosäuresequenz des Linkers 19 Aminosäuren. Es sollte beachtet werden, dass zur Konstruktion eines Konstruktes mit Linker an jedem Ende des Linker-Polynukleotids Nukleotide eingeführt werden, die zu weiteren zwei Aminosäuren äquivalent sind, um dieses Konstrukt herzustellen. Die Linker-Sequenz, auf die hier Bezug genommen wird, umfasst die (eigentliche) Linker-Sequenz und die beiden Aminosäuren an jedem Ende, welche die Konstruktion des Produktes erleichtern. Wie oben erwähnt wurde, können die zwischengeschalteten Aminosäuren vermieden werden, falls alternative Verfahren zur Herstellung des Produktes verwendet werden wie beispielsweise die Festphasen-Synthese der Polynukleotid- oder Aminosäuresequenz, das SOE-Verfahren (siehe unten) oder indem Restriktionsendo nukleasen gefunden werden, die genau die Enden der Troponin-Spezies und der verbindenden Linker-Sequenzen erkennen.
Die Aminosäuresequenzen im obigen Beispiel entsprechen den Nukleotidsequenzen der diese Polypeptide kodierenden cDNA. Die genetische Sequenz im ersten Beispiel umfasst die genetische Sequenz des Troponin I-Fragments am 5'-Ende der cDNA, auf deren 3'-Ende unmittelbar zwei dazwischenliegende Kodons folgen, und anschließend das 5'-Ende der genetischen Sequenz des Troponin C. In der bevorzugten Ausführungsform, in welcher zwichen der Troponin I- und der Troponin C-Sequenz ein Linker angeordnet ist, beginnt das 5'-Ende der cDNA-Sequenz mit der genetischen Sequenz des Troponin I, auf dessen 3'-Ende das 5'-Ende der optional dazwischenliegend angeordneten genetischen Linker-Sequenz folgt, und auf dessen 3'-Ende das 5'-Ende der genetischen Sequenz des Troponin C folgt, die mit dem 3'-Ende der cDNA endet.
Wie oben beschrieben wurde, ist die Auswahl der Länge und der spezifischen Sequenz des optionalen Linker-Polypeptids nur dadurch limitiert, dass dieses die Immundetektierbarkeit des Troponin I-Fragments im einkettigen Polypeptid nicht stören darf. Es wird vermutet, dass bei einer geeigneten Linker-Sequenz das Troponin I-Fragment und das Troponin C der einkettigen Polypeptidkette miteinander auf ähnliche Art und Weise assoziieren, wie sie dies in einem nicht-kovalenten Troponin I-Troponin C-Komplex tun, und dass die Bindung der Untereinheiten in der einkettigen Polypeptidkette die Assoziationskonformation und somit eine gleichbleibende Immundetektierbarkeit des Troponins beibehält. Darüber hinaus ist ein auf diese Art und Weise stabilisierter Troponin I-Fragment-Troponin C-Komplex in geringerem Maße gegenüber einem proteolytischen Angriff in Anwesenheit von Körperflüssigkeiten und anderen Komponenten anfällig. In dieser Ausführungsform wird ein Linker mit etwa 6 bis etwa 50 Aminosäuren (und einer entsprechenden Anzahl von Kodons in der cDNA) bevorzugt, um die Herstellung einfach und ökonomisch zu gestalten.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein einkettiges Troponin I-Fragment-Troponin C-Polypeptid mit einem relativ kurzen Spacer-Segment von etwa 5 bis etwa 50 Aminosäuren zur Verfügung. Eine nützliche Linker-Polypeptidsequenz ist beispielsweise (Gly₄Ser)₃, welches eine flexible Peptidsequenz zur Verfügung stellt, die es den zwei Untereinheiten ermöglicht zu assoziieren. Um die genetische Sequenz mit einem Linker-Polynukleotid zu konstruieren, sind 2 zusätzliche Kodons an jedem Ende des Linker-Polynukleotids vorhanden, welche benötigt werden, um eindeutige Restriktionsstellen zur Schaffung des genetischen Konstrukts des gewünschten einkettigen Polypeptids zur Verfügung zu stellen. In einem Beispiel können Kodons eingefügt werden, die Thr-Ser am N-Terminus und Ala-Cys am C-Terminus des Linkers entsprechen. So kann ein geeigneter Linker mit 19 Resten hergestellt werden. Das obige Beispiel ist für die verlinkten Produkte der vorliegenden Erfindung lediglich charakteristisch, da auch andere Linker geeignet sind.
Zur Herstellung der DNA-Sequenz, welche die Troponin-Untereinheiten und die optionale Linker-Sequenz umfasst, und zur Einführung dieser Sequenz in eine Wirtszelle können rekombinante Verfahren verwendet werden; zur Exprimierung und Reinigung des rekombinanten Polypeptids werden standardisierte Expressionsverfahren verwendet. Diese Verfahren ähneln Verfahren, die zur Herstellung von Fusionsproteinen verwendet werden, wie z.B. denen, die für zwei metabolisch gekoppelte Hefeenzyme beschrieben werden, nämlich Citratsynthase und Malatdehydrogenase (Lindbladh et al., Biochemistry 33: 11692–11698 [1994]); zur Herstellung von einkettigen, die Antigenbindungsstellen von Antikörpern umfassenden Polypeptiden ( U.S.-Patent 4,946,778 ); sowie zur Herstellung von Fusionsproteinen zum Phagen-Display ( U.S.-Patent 5,516,637 ). Diese Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
Für den Fall, dass keine Linker-Sequenz oder nur eine kleine Linker-Sequenz gewünscht wird, können die Troponin I-Fragment- und Troponin C-cDNA-Sequenzen mit geeigneten, im Stand der Technik bekannten Techniken wie z.B. dem SOE-Verfahren miteinander verbunden werden, in welchem Paare von teilweise überlappenden Primern verwendet werden, z.B. solche, wie sie von Hu et al. (1996, Protein Expression and Purification 7: 289–293) beschrieben werden, wobei seltene Kodons des kardialen Human-Troponin T durch synonyme häufigere Kodons ersetzt wurden. Diese Verfahren sind dem Fachmann wohlbekannt.
Das rekombinante Konstrukt wird als Expressions- oder Klonierungsvehikel oder Plasmid hergestellt und zur Expression in eine Wirtszelle eingebracht. Verfahren zur Expression rekombinanter Proteine sind im Stand der Technik bekannt. Nach seiner Expression kann das einkettige Polypeptid mittels standardisierter Proteinreinigungsverfahren gereinigt werden.
Darüber hinaus können die genetischen Sequenzen des Troponin I-Fragments und des Troponin C modifiziert werden, um die Expression des einkettigen Polypeptids in einem bakteriellen Expressionssystem zu verbessern. Diese genetischen Änderungen können, brauchen aber nicht, die Aminosäuresequenz des Polypeptids zu verändern. Wie im Stand der Technik bekannt ist, reduzieren bestimmte seltene Kodons, die in einem Expressionsvehikel vorhanden sind, die Expressionseffizienz, und durch einen Austausch dieser Kodons durch synonyme häufigere Kodons wird die bakterielle Expression verbessert (wie dies z.B. von Hu et al. beschrieben wird, siehe oben). Zusätzlich erhöht die Aufnahme einer kurzen Nukleotidsequenz am 5'-Ende der Troponin I-cDNA die bakterielle Expression und ergibt ein Troponin I-Polypeptid mit sechs zusätzlichen N-terminalen Aminosäuren. Diese optionalen Modifikationen zur Erhöhung der bakteriellen Expression beeinträchtigen nicht die Verwendbarkeit des einkettigen Polypeptids für die oben genannten Zwecke. Der kurze Anhang am 5'-Ende der cDNA zur Expressionsverbesserung kann auch an den N-Terminus eines Troponin I-Fragments angehängt werden, welches keinen nativen N-Terminus aufweist, wie z.B. an das in den hier angegebenen Beispielen beschriebene Troponin I-Fragment.
Es sind verschiedene Troponin I-Assays kommerziell erhältlich, die alle unter Verwendung unterschiedlicher Formate, Instrumente sowie Assay-Kontrollsubstanzen und Kalibratoren arbeiten. Beispielsweise verwendet das Stratus(R)-Troponin I-Assay von Dade einen monoklonalen Einfangantikörper und einen monoklonalen Detektionsantikörper. Das Kalibrator/Kontrollmaterial ist ein N-terminales Peptid aus kardialem Human-Troponin I. Der Arbeitsbereich des Assays beträgt 0–50 ng/ml bei einer Empfindlichkeit von 0,6 ng/ml und einem Cut-off-Wert von 1,5 ng/ml. Das Access(R)-Troponin I-Assay von Sanofi verwendet ebenfalls einen monoklonalen Einfangantikörper und einen monoklonalen Detektionsantikörper, aber sein Kalibrator/Kontrollmaterial ist ein Komplex aus nativem kardialem Troponin I und Troponin C. Dieses Assay hat einen Arbeitsbereich von 0–50 ng/ml, eine Empfindlichkeit von 0,03 ng/ml und einen Cut-off-Wert von 0,1 ng/ml. Das Opus(R)-Troponin I-Assay von Behring verwendet polyklonale Antikörper als Einfangantikörper und Detektionsantikörper, weist einen Bereich von 0–300 ng/ml, eine Empfindlichkeit von 1 ng/ml und einen Cut-off-Wert von 2 ng/ml auf.
Aufgrund der unterschiedlichen Verfahren und Komponenten bei den oben genannten Assays können kommerziell erhältliche Troponin I-Kalibratoren/Kontrollmaterialien oft nicht zwischen diesen Assays ausgetauscht werden. So sind beispielsweise die Stratus(R)- Kalibratoren/Kontrollmaterialien, welche ein N-terminales Peptid aus kardialem Troponin I verwenden, mit dem Access(R)- und dem Opus(R)-Assay nicht detektierbar, da die Antikörper der letztgenannten Assays nicht auf denselben N-terminalen Peptidteil des als Kontrollmaterial/Kalibrator verwendeten Troponin I gerichtet sind. Andererseits werden die Kontrollmaterialien des Access(R)-Assays, die im Access(R)-Assay mit höchster Empfindlichkeit und bestem Cut-off-Wert aller drei Assays detektierbar sind, im Opus(R)-Assay etwa vierfach höher gemessen. Demgegenüber werden die Kontrollmaterialien des Opus(R)-Assays im Stratus(R)-Assay nur schlecht detektiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass es schwierig ist, die Assay-Kalibratoren/Kontrollmaterialien zwischen den Assays auszutauschen, und dass die Ergebnisse der Kontrollmaterialien des Assays eines Herstellers lediglich dazu verwendet werden können, um Assayläufe zu interpretieren, die mit eben diesem Assay durchgeführt wurden. Indessen wären bei den erfindungsgemäßen Konstrukten, bei denen der C-terminale Anteil des Troponin I fehlt, Assays wie beispielsweise das Access-Assay, die diesen Teil des Troponin I-Moleküls detektieren, nicht zur Verwendung mit eben diesen Zusammensetzungen geeignet.
Ein erfindungsgemäßes einkettiges Polypeptid, welches ein Troponin I-Fragment und Troponin C umfasst, kann auch für die Reinigung von Proteinen und anderen Substanzen einschließlich Antikörpern mit einer Bindungsaffinität für Troponin I oder Troponin C verwendet werden. Wie oben erwähnt wurde, wird vermutet, dass der Troponin I-Teil der hier vorliegenden Zusammensetzungen der vorwiegend zirkulierenden Form des Troponin I nach dessen partiellem Abbau durch Serumproteasen und möglicherweise intrazelluläre kardiale Enzyme ähnelt. So kann beispielsweise das erfindungsgemäße einkettige Polypeptid kovalent an eine unlösliche Matrix oder ein Polymer gebunden werden und in eine Chromatographiesäule platziert werden. Ein Zell- oder Gewebeextrakt, von dem vermutet wird, dass er ein Material enthält, das Troponin bindet, oder ein gegen Troponin herangezogenes Antikörperpräparat kann durch die Säule geleitet werden, wobei es sich an das kovalent gebundene Polypeptid anheften würde. Nach dem Waschen der Matrix kann das anhaftende Material unter Verwendung einer konzentrierten Salzlösung, eines chaotropen Mittels oder anderer Standardverfahren zur Proteinreinigung eluiert werden. Von einem Material, das an das Troponin I-Fragment der vorliegenden Zusammensetzung bindet, würde man erwarten, dass es für die Detektion der zirkulierenden Form des Troponin I besser geeignet ist.
Ein erfindungsgemäßes einkettiges Polypeptid kann auch für die Herstellung von monoklonalen und polyklonalen Anti-Troponin-Antikörpern unter Verwendung von standardisierten Verfahren zur Tier-Immunisierung und Hybridoma-Herstellung nützlich sein. Aufgrund der oben erwähnten Gründe wird erwartet, dass die resultierenden Antikörper die zirkulierende Form des Troponin I erkennen und so die Empfindlichkeit eines daraus entwickelten Assays verbessern.
Das erfindungsgemäße einkettige Polypeptid, das einen N-terminalen Teil des Troponin I sowie Troponin C umfasst, eignet sich zur Herstellung empfindlicher Troponin-Assays und zur Kalibrierung solcher Assays. Zum Beispiel kann Troponin I mit einem speziellen analytischen Verfahren wie z.B. mit einem wie oben beschriebenem Immunassay quantitativ erfasst werden. Der Troponin I-Gehalt in einer Probe und der Troponin I-Gehalt in einem Standard, der das erfindungsgemäße einkettige Polypeptid umfasst, werden unter Verwendung dieses bestimmten Verfahrens gemessen, wobei die Menge an Troponin I im Standard bekannt ist. Die Menge an Troponin I in der Probe wird dann berechnet, indem der Messwert der Probe mit dem Messwert des Standards auf der Grundlage der bekannten Menge an Troponin I in diesem Kalibrator korreliert wird. Wie aus den nachfolgenden nicht-limitierenden Beispielen ersichtlich wird, zeigt das einkettige Polypeptid eine im Vergleich mit anderen Troponin-Kalibratoren bessere Leistung.
Beispiel 1
Expression eines einkettigen kardialen Human-Troponin I-Fragment-Troponin C-Polypeptides mit einem Linker in E. coli
cDNAs eines kardialen Human-Troponin I-Fragments entsprechend den Aminosäuren 28–110 des nativen Proteins und Troponin C-cDNAs wurden mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern kloniert, die anhand der veröffentlichten kardialen Troponin I-cDNA-Sequenz (Vallins et al., FEBS Letters 270, 57–61 [1990]) und der Troponin C-Sequenz (GenBank AC: X07897) entwickelt wurden. Der C-Terminus der Troponin I-Fragment-cDNA wurde mit dem N-Terminus der Troponin C-cDNA mittels eines synthetischen, für (Gly₄Ser)₃ kodierenden Linkers mit einer an jedem Ende konstruierten eindeutigen Restriktionsstelle verbunden. Das einkettige Troponin I-Fragment-C-cDNA-Konstrukt wurde mittels DNA-Sequenzierung bestätigt und in den Expressionsvektor pET21 (Novagen) kloniert. E. coli-BL21(DE3)-Zellen, die ebenfalls von Novagen erhältlich sind, wurden mit dem resultierenden Plasmid transformiert, und die Proteinexpression wurde sowohl mit SDS-PAGE als auch mit Immunoassays verifiziert. Das oben beschriebene einkettige Polypeptid weist ein Molekulargewicht von 29 200 Dalton auf.
Der E. coli-Stamm, der das einkettige Troponin I-Fragment-Troponin C-Polypeptid mit einem Linker exprimiert, wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 deponiert und hat die Nummer PTA-396 erhalten.
Beispiel 2
Expression eines einkettigen kardialen Human-Troponin I-Fragment-Troponin C-Polypeptides ohne Linker in E. coli
cDNA eines kardialen Human-Troponin I-Fragments entsprechend den Aminosäuren 28–110 des nativen Proteins und von Troponin C wurden mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern kloniert, die anhand der veröffentlichten kardialen Troponin I-cDNA-Sequenz (Vallins et al., FEBS Letters 270, 57–61 [1990]) und der Troponin C-Sequenz (GenBank AC: X07897) entwickelt wurden. Der C-Terminus der Troponin I-Fragment-cDNA wurde mit dem N-Terminus der Troponin C-cDNA mittels einer SphI-Stelle verbunden, die für Ala und Cys kodiert. Das einkettige Troponin I-Fragment-C-cDNA-Konstrukt wurde mittels DNA-Sequenzierung bestätigt und in den Expressionsvektor pET21 (Novagen) kloniert. E. coli-BL21(DE3)-Zellen, die ebenfalls von Novagen erhältlich sind, wurden mit dem resultierenden Plasmid transformiert, und die Proteinexpression wurde sowohl mit SDS-PAGE als auch mit Immunoassays verifiziert. Das oben beschriebene einkettige Polypeptid weist ein Molekulargewicht von 28 100 Dalton auf.
Der E. coli-Stamm, der das einkettige Troponin I-Fragment-Troponin C-Polypeptid exprimiert, wurde bei der ATCC deponiert und hat die Nummer PTA-395 erhalten.
Beispiel 3
Stabilität und Verwendbarkeit des Polypeptids im Troponin-Assay
Die Immundetektierbarkeiten der in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen einkettigen Troponin I-Fragment-Troponin C-Polypeptide, eines aus nativem kardialem Troponin I und Troponin C gebildeten Komplexes und von nativem Troponin I wurden im Stratus^®- und Opus^®-Assay gemäß den Anweisungen der Hersteller der einzelnen Assays bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Immundetektierbarkeit einer äquivalenten molaren Menge an Troponin I gleich oder besser als die von Troponin I im nicht-kovalenten Komplex und als die von nativem, nicht-komplexiertem Troponin I war.
Beispiel 4
Stabilität des einkettigen Troponin I-Fragment-Troponin C-Polypeptids
Die Stabilität der drei im obigen Beispiel 3 verwendeten, Troponin I oder Fragment enthaltenden Präparate wurde während einer Inkubation in Serum bei 37°C zu verschiedenen Zeitpunkten überprüft, indem das Molekulargewicht mittels eines Western Blots bestimmt wurde. Es wurden gegen den N-terminalen Teil des Troponin I gerichtete Antikörper verwendet. Die Präparate waren (1) rekombinantes, nach Standardverfahren hergestelltes Troponin I; (2) ein nicht-kovalent gebundener Komplex von rekombinantem Troponin I und rekombinantem Troponin C; und (3) das einkettige Polypeptid, welches ein Troponin I-Fragment und Troponin C mit einem dazwischen angeordneten Verbindungspeptid (Linker-Peptid) umfasste. Der nicht-kovalent gebundene Komplex von rekombinantem Troponin I und rekombinantem Troponin C wurde nach dem Verfahren unserer US 5,834,210 hergestellt. Kurz gesagt wurden kardiales Human-Troponin C und ein modifiziertes Troponin I in E. coli exprimiert. Das Troponin I wurde als rekombinantes Produkt mit sechs zusätzlichen N-terminalen Aminosäureresten konstruiert, um seine Expression zu verbessern; das Troponin C wurde in seiner nativen Aminosäuresequenz exprimiert. Das modifizierte Troponin I wurde in Gegenwart von Harnstoff mit Troponin C, CaCl₂ und MgCl₂ kombiniert und vorsichtig geschüttelt, um die Bildung von Troponin I-Troponin C-Komplexen zu fördern.
Die Ergebnisse zeigten, dass das native Troponin I beim Kontakt mit Serum gegenüber einer proteolytischen Zersetzung am empfindlichsten war. Der nicht-kovalente Troponin I-Troponin C-Komplex war stabiler und das erfindungsgemäße einkettige Polypeptid war am stabilsten. SEQUENCE LISTING

Claims

Polynukleotid, das ein einkettiges Polypeptid kodiert, welches ein N-terminales Fragment des kardialen Troponin I und ein kardiales Troponin C umfasst, wobei das N-terminale Fragment von Troponin I aus einer Sequenz besteht, die bei Aminosäure Nummer 20 bis Aminosäure Nummer 30 des nativen kardialen Human-Troponin I beginnt und bis zu Aminosäure Nummer 95 bis Aminosäure Nummer 115 des nativen kardialen Human-Troponin I reicht.
Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei zwischen dem Polynukleotid für das N-terminale Fragment des kardialen Troponin I und dem Polynukleotid für das kardiale Troponin C ein Verbindungspolynukleotid angeordnet ist, das eine Verbindungspeptidsequenz von 5 bis 50 Aminosäuren kodiert.
Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2, wobei das N-terminale Fragment des kardialen Troponin I aus den Aminosäuren Nummer 28 bis 110 des nativen kardialen Human-Troponin I besteht.
Polynukleotid nach Anspruch 1, das ein einkettiges Polypeptid kodiert, bestehend aus: a) einem Polypeptid, das den N-terminalen Abschnitt des kardialen Human-Troponin I mit 65 bis 110 Aminosäuren umfasst; und b) einem kardialen Human-Troponin C.
Replizierbares Klonierungs- oder Expressionsvehikel, das ein Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfasst.
Vehikel nach Anspruch 5, das ein Plasmid ist.
Wirtszelle, die mit einem Vehikel nach Anspruch 5 transformiert ist.
Wirtszelle nach Anspruch 7, die E. coli ist.
Wirtszelle nach Anspruch 7, die E. coli ist, welches bei der American Type Culture Collection hinterlegt ist und dem die Nummer PTA-395 oder die Nummer PTA-396 zugeordnet ist.
Einkettiges Polypeptid, das ein N-terminales Fragment des kardialen Troponin I und ein kardiales Troponin C umfasst, wobei das N-terminale Fragment von Troponin I aus einer Sequenz besteht, die bei Aminosäure Nummer 20 bis Aminosäure Nummer 30 des nativen kardialen Human-Troponin I beginnt und bis zu Aminosäure Nummer 95 bis Aminosäure Nummer 115 des nativen kardialen Human-Troponin I reicht.
Polypeptid nach Anspruch 10, wobei zwischen dem N-terminalen Fragment des kardialen Troponin I und dem kardialen Troponin C-Polypeptid eine Verbindungspeptidsequenz von 5 bis 50 Aminosäuren angeordnet ist.
Polypeptid nach Anspruch 10 oder 11, wobei das N-terminale Fragment des kardialen Troponin I aus den Aminosäuren Nummer 28 bis 110 des nativen kardialen Human-Troponin I besteht.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die Verbindungspeptidsequenz (Gly₄Ser)₃ umfasst.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 10 bis 13 in Form des Expressionsprodukts, das durch Kultivierung des E. coli nach Anspruch 9 erhalten werden kann.
Zusammensetzung, umfassend ein einkettiges Polypeptid nach einem der Ansprüche 10 bis 13 zur Verwendung als Kontrollsubstanz oder Kalibrator für ein Troponin I-Assay.
Verfahren zum quantitativen Bestimmen von Troponin I in einer Probe, das folgende Schritte umfasst: i) Messen von Troponin I in der Probe; ii) Messen eines einkettigen Polypeptids nach einem der Ansprüche 10 bis 13 in einem Standard, wobei der Standard eine bekannte Menge Troponin I enthält; iii) Korrelieren des Troponin I, das in der Probe gemessen wurde, mit der bekannten Menge von Troponin I, die im Standard gemessen wurde, um die Menge von Troponin I in der Probe zu erhalten.