DE60113968T2 - Diagnose von brustkrebs unter verwendung von bcmp-7 als marker - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Diagnose, Prophylaxe und Behandlung von Brustkrebs, und insbesondere die Verwendung eines aus Membranpräparationen einer Brustkrebs-Zelllinie isolierten Proteins, die Verwendung von Zusammensetzungen, die das Protein enthalten, einschließlich Impfstoffen, sowie die Verwendung von Antikörpern, die für das Protein immunspezifisch sind, bei einer solchen Diagnose, Prophylaxe oder Behandlung.
  • Brustkrebs die am häufigsten diagnostizierte Krebserkrankung bei Frauen. Die Durchführung von Untersuchungsprogrammen zur Früherkennung von Brustkrebs und das Aufkommen von Anti-Krebs-Behandlungen, wie beispielsweise Chemotherapie, Bestrahlungstherapie und Anti-Östrogentherapien zur Unterstützung der chirurgischen Resektion haben das Überleben von Brustkrebspatienten verbessert.
  • Einige Brusttumoren jedoch werden gegenüber solchen Behandlungen unempfindlich, da die Krebszellen eine Resistenz gegen chemotherapeutische Wirkstoffe entwickeln oder ihre Hormonsensitivität verlieren, was zu einer wiederkehrenden oder metastatischen Erkrankung führt, die oftmals unheilbar ist. Kürzlich erlangte die Entwicklung von immunologischen Therapien (Green, et al., Cancer Treat. Rev. 26, 269–286 (2000); Davis, Immunol. Cell Biol. 78, 179–195 (2000); Knuth, et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 46, 546–51 (2000); Shiku, et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 46, S77–82 (2000); Saffran, et al., Cancer Metastasis Rev. 18, 437–449 (1999)), wie beispielsweise Krebsimpfstoffe und monoklonale Antikörper (mAbs) als Mittel zur Initiierung und Ausrichtung einer Immunantwort des Wirts gegen Tumorzellen, verstärkte Aufmerksamkeit. Im Jahr 1998 erteilte die FDA eine Zulassung für die Verwendung von Herceptin (Stebbing, et al., Cancer Treat. Rev. 26, 287–290 (2000); Dillman, Cancer Biother. Radiopharm. 14, 5–10 (1999); Miller & Sledge, Invest. New Drugs 17, 417–427 (1999)), einen das erbB2/HER2-neu-Rezeptorprotein erkennenden mAb, als Behandlungsmittel für metastatischen Brustkrebs. Es wurde gezeigt, dass Herceptin in Verbindung mit einer Chemotherapie die Zeit bis zum Fortschreiten der Krankheit im Vergleich zu Patienten, die nur eine Chemotherapie erhalten, verlängert (Baselga, et al., Cancer Res. 58, 2825–2831 (1998)). Herceptin ist jedoch lediglich bei der Behandlung der 10 bis 20% Patienten wirksam, deren Tumoren das erbB2-Protein überexprimieren. Aus diesem Grunde ist die Identifizierung weiterer geeigneter Ziele oder Antigene für die Immuntherapie von Brustkrebs zunehmend wichtig geworden.
  • Ein ideales Zielprotein für die Immuntherapie von Krebs sollte ein begrenztes Expressionsprofil in normalen Geweben aufweisen und in Tumoren überexprimiert werden, sodass die Immunantwort gegen Tumorzellen gerichtet wird und nicht gegen andere Organe. Zusätzlich sollte das Zielprotein an der Zelloberfläche exponiert sein, wo es für die therapeutischen Mittel zugänglich ist. Tumor-Antigene wurden für eine Vielzahl von Krebsarten durch Anwendung von Methoden, wie beispielsweise dem differentiellen Screening von cDNA (Hubert, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 96, 14523–14528 (1999); Lucas, et al., Int. J. Cancer 87, 55–60 (2000)), sowie durch Aufreinigen von Zell-Oberflächen-Antigenen, die durch Tumor-spezifische Antikörper erkannt werden (Catimel, et al., J. Biol. Chem. 271, 25664– 25670 (1996)), identifiziert. Als alternativen Ansatz zur Identifizierung von Brusttumor-Antigenen haben wir Proteomik-Analysen verwendet, um die Gegenstücke von Proteinen in Zellmembranen zu charakterisieren, die aus der Brustkrebs-Zelllinie T-47D (ATCC:HTB-133) isoliert wurden. Auf diese Weise haben wir ein Protein identifiziert, das als BCMP 7 bezeichnet wird und eine erhöhte Expression in einigen Brustkrebslinien aufweist, was darauf hindeutet, dass es ein geeignetes Ziel für Krebstherapie und Krebsdiagnose sein könnte.
  • BCMP 7 ist bekannt. WO 98/07749 offenbart beispielsweise neue humane Wachstumsfaktoren. Diese umfassen eine als HuXAG-1 identifizierte Sequenz, die dem vorliegend besprochenen BCMP 7 entspricht. WO 99/53040 offenbart eine große Anzahl von Sequenzen, die aus einer EST-Datenbank stammen, einschließlich Sequenzen, die als Sequenzen ID 265 und 288 identifiziert werden und dem vorliegend besprochenen BCMP 7 entsprechen. Es wird darauf hingewiesen, dass diese Sequenzen im Krebsgewebe der Ovarien verstärkt exprimiert werden. WO 99/55858 offenbart eine große Anzahl von Sequenzen, die aus einer EST-Datenbank stammen. Diese umfassen Sequenzen, die als Sequenzen ID 8 und 181 identifiziert werden, und dem vorliegend besprochenen BCMP 7 entsprechen; es wird darauf hingewiesen, dass diese Sequenzen im Pankreas-Krebsgewebe verstärkt exprimiert werden. WO09841627 offenbart mehrere Sequenzen, insbesondere die SEQ ID Nrn. 1 und 2, die dem vorliegend besprochenen BCMP 7 entsprechen. WO98211217 offenbart ebenfalls Sequenzen (SEQ ID Nrn. 9 und 27), die dem vorliegend besprochenen BCMP 7 entsprechen und von Magenkrebs erhalten wurden. WO0053755 offenbart eine Sequenz (PRO 1030), die dem vorliegend beschriebenen BCMP 7 entspricht. Es wurde eine Gen-Kopien-Amplifikation ("gene copy amplification") verwendet, um die Bedeutung des Proteins für eine Gruppe von Tumoren zu quantifizieren. Die Anzahl der Gen-Kopien war im primären Lungentumor sowie im primären Dickdarmtumor erhöht. Sequenzen, die BCMP 7 entsprechen, sind auch in WO9940189 vorhanden. Es wurde ferner gezeigt, dass BCMP 7 in Brustkrebs-Zelllinien mit dem Östrogen-Rezeptor co-exprimiert wird (Thompson & Weigel, 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 251, 111–116).
  • Diese Dokumente aus dem Stand der Technik zeigen jedoch nicht die Beteiligung von BCMP 7 an Brustkrebs und/oder sie zeigen nicht, dass BCMP 7 an der peripheren Membran lokalisiert und daher nützlich bei einem immuntherapeutischen Ansatz gegen Brustkrebs ist.
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung gemäß eines ersten Aspekts ein Verfahren zum Screening nach und/oder zur Diagnose von Brustkrebs in einem Subjekt bereit, wobei das Verfahren den Schritt des Detektierens und/oder des Quantifizierens der Menge eines Polypeptids in einer biologischen Probe umfasst, die von einem Subjekt erhalten wurde, und wobei das Polypeptid:
    • a) die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst oder aus dieser besteht;
    • b) ein Derivat mit einer oder mit mehreren Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen oder -Insertionen in Bezug auf die in1 gezeigte Aminosäuresequenz ist; oder
    • c) ein Fragment eines wie oben in a) oder b) definierten Polypeptids ist, das mindestens 10 Aminosäuren lang ist.
  • Gemäß eines zweiten Aspekts stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Prophylaxe und/oder zur Behandlung von Brustkrebs in einem Subjekt bereit, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge von mindestens einem wie im ersten Aspekt der Erfindung definierten Polypeptid an das Subjekt umfasst.
  • Gemäß eines dritten Aspekts stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung mindestens eines wie im ersten Aspekt der Erfindung definierten Polypeptids bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung bei der Prophylaxe und/oder bei der Behandlung von Brustkrebs bereit.
  • Wie vorliegend verwendet, bezieht sich Brustgewebe auf die Brust selbst sowie auf das Gewebe, das angrenzend zu den Schichten liegt und/oder innerhalb der Schichten liegt, welche der Brust zugrundeliegen. Das Subjekt kann ein Säugetier sein und ist vorzugsweise ein Mensch, obgleich Affen, Menschenaffen, Katzen, Hunde, Kühe, Pferde und Kaninchen von der vorliegenden Erfindung umfasst sind.
  • Beim zweiten oder dritten Aspekt können die Polypeptide oder Fragmente derselben in isolierter oder rekombinanter Form bereitgestellt werden, und sie können an andere Reste fusioniert sein. Es werden insbesondere Fusionen der Polypeptide oder der Fragmente derselben mit Lokalisierungs-Reporterproteinen, wie beispielsweise dem Green Fluorescent Protein (U.S. Patent Nrn. 5,625,048, 5,777,079, 6,054,321 und 5,804,387) oder dem DsRed Fluorescent Protein (Matz, et al. (1999) Nature Biotech. 17: 969–973), vorgeschlagen. Die Polypeptide oder Fragmente derselben können in einer im Wesentlichen reinen Form bereitgestellt werden, d.h. zu einem wesentlichen Grad frei von anderen Proteinen. Somit kann ein Polypeptid in einer Zusammensetzung bereitgestellt werden, in der es den vorherrschenden Bestandteil darstellt (d.h. es liegt in einem Gehalt von mindestens 50% vor, vorzugsweise mindestens 75%, mindestens 90% oder mindestens 95%; sofern auf einer Gewicht/Gewicht-Basis bestimmt, bei der Lösungsmittel und Träger ausgeschlossen werden).
  • Um die vorliegende Erfindung umfassend verstehen zu können, werden die Polypeptide, die von a)–c) umfasst sind, nunmehr genauer besprochen.
  • Polypeptide, die von a) umfasst sind
  • Ein Polypeptid, das von a) umfasst ist, kann aus der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz bestehen, oder es kann eine zusätzliche N-terminale und/oder eine zusätzliche C-terminale Aminosäuresequenz in Bezug auf die in 1 gezeigte Sequenz aufweisen.
  • Zusätzliche N-terminale oder C-terminale Sequenzen können aus verschiedenen Gründen vorgesehen werden. Methoden zur Bereitstellung solcher zusätzlicher Sequenzen sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Zusätzliche Sequenzen können bereitgestellt werden, um die Eigenschaften eines bestimmten Polypeptids zu verändern. Dies kann bei der Verbesserung der Expression oder Regulation der Expression in bestimmten Expressionssystemen nützlich sein. Eine zusätzliche Sequenz kann beispielsweise für ein gewisses Maß an Schutz gegen proteoly tische Spaltung sorgen. Dies wurde bei dem Hormon Somatostatin erreicht, indem man es an seinem N-Terminus mit einem Teil des Enzyms β-Galaktosidase fusionierte (Itakwa et al., Science 198: 105–63 (1977)).
  • Zusätzliche Sequenzen können ferner bei einer Veränderung der Eigenschaften eines Polypeptids zur Unterstützung bei der Identifizierung oder Aufreinigung nützlich sein. Es kann beispielsweise ein Fusionsprotein bereitgestellt werden, in dem ein Polypeptid mit einem Rest verbunden ist, der sich durch Affinitäts-Chromatographie aufreinigen lässt. Der Rest kann ein Antigen oder Epitop sein, und die Affinitäts-Säule kann immobilisierte Antikörper oder immobilisierte Antikörperfragmente umfassen, die an das Antigen oder das Epitop binden (vorzugsweise mit einem hohen Mass an Spezifität). Das Fusionsprotein kann üblicherweise durch Zugabe eines geeigneten Puffers von der Säule eluiert werden.
  • Zusätzliche N-terminale oder C-terminale Sequenzen können jedoch einfach als Folge des jeweiligen Verfahrens vorhanden sein, das verwendet wurde, um ein Polypeptid zu erhalten, und brauchen für keine bestimmte vorteilhafte Eigenschaft des Polypeptids zu sorgen. Solche Polypeptide sind von der vorliegenden Erfindung umfasst.
  • Unabhängig davon, welche zusätzliche N-terminale oder C-terminale Sequenz vorliegt, ist es bevorzugt, dass das resultierende Polypeptid die immunologische oder biologische Aktivität des Polypeptids mit der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz aufweisen sollte.
  • Polypeptide, die von b) umfasst sind
  • Wenn man sich nunmehr den oben in b) definierten Polypeptiden zuwendet, wird es dem Fachmann bewußt sein, dass diese Polypeptide Varianten des oben in a) beschriebenen Polypeptids sind. Solche Varianten weisen vorzugsweise die immunologische oder biologische Aktivität des Polypeptids mit der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz auf.
  • Es können Veränderungen der Aminosäuresequenz eines Proteins auftreten, die die Funktion eines Proteins nicht beeinflussen. Diese umfassen Aminosäure-Deletionen, Insertionen und Substitutionen und können aus alternativem Spleißen und/oder dem Vorhandensein von multiplen Translationsstartpunkten und Translationsstopppunkten resultieren. Als Resultat der Ungenauigkeit des Translationsprozesses können Polymorphismen auftreten. Somit können Änderungen der Aminosäuresequenz toleriert werden, die die biologische oder immunologische Funktion des Proteins nicht beeinflussen.
  • Dem Fachmann wird bewußt sein, dass oftmals verschiedene Änderungen der Aminosäuresequenz eines Polypeptids mit einer bestimmter Aktivität vorgenommen werden können, um Varianten herzustellen (manchmal als "Muteine" bezeichnet), die mindestens einen Teil der besagten Aktivität aufweisen und vorzugsweise einen wesentlichen Teil der Aktivität aufweisen. Solche Varianten der oben in a) beschriebenen Polypeptide sind von der vorliegenden Erfindung umfasst und werden nachfolgend genauer diskutiert. Sie umfassen allelische und nicht-allelische Varianten.
  • Ein Beispiel einer erfindungsgemäßen Variante ist ein wie oben in a) definiertes Polypeptid, mit Ausnahme des Austausches einer oder mehrerer Aminosäuren gegen eine oder mehrere andere Aminosäuren. Dem Fachmann ist bewußt, dass verschiedene Aminosäuren ähnliche Eigenschaften aufweisen. Eine oder mehrere solcher Aminosäuren eines Polypeptids können oftmals gegen eine oder mehrere andere solcher Aminosäuren ausgetauscht werden, ohne die gewünschte Aktivität des Polypeptids zu beseitigen.
  • Daher können die Aminosäuren Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin oftmals gegeneinander ausgetauscht werden (Aminosäuren mit aliphatischer Seitenkette). Bei diesen möglichen Substitutionen ist es bevorzugt, dass Glycin und Alanin verwendet werden, um gegeneinander ausgetauscht zu werden (da sie verhältnismäßig kurze Seitenketten aufweisen), und dass Valin, Leucin und Isoleucin verwendet werden, um gegeneinander ausgetauscht zu werden (da sie längere aliphatische Seitenketten aufweisen, die hydrophob sind).
  • Andere Aminosäuren, die oftmals gegeneinander ausgetauscht werden können, umfassen:
    • – Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan (Aminosäuren mit aromatischen Seitenketten);
    • – Lysin, Arginin und Histidin (Aminosäuren mit basischen Seitenketten);
    • – Aspartat und Glutamat (Aminosäuren mit sauren Seitenketten);
    • – Asparagin und Glutamin (Aminosäuren mit Amid-Seitenketten); und
    • – Cystein und Methionin (Aminosäuren mit Schwefelenthaltenden Seitenketten).
  • Substitutionen dieser Art werden oftmals als "konservative" oder "semi-konservative" Aminosäuresubstitutionen bezeichnet.
  • Aminosäure-Deletionen oder -Insertionen können ebenfalls in Bezug auf die oben in a) angegebene Aminosäuresequenz durchgeführt werden. So können beispielsweise Aminosäuren, die keine wesentliche Auswirkung auf die biologische und/oder immunologische Aktivität des Polypeptids haben, oder die zumindest eine solche Aktivität nicht eliminieren, deletiert werden. Solche Deletionen können vorteilhaft sein, da die Gesamtlänge und das Gesamtmolekulargewicht des Polypeptids reduziert werden kann, während die Aktivität weiterhin erhalten bleibt. Dies ermöglicht, dass die Menge des Polypeptids, die für einen bestimmten Zweck erforderlich ist, reduziert werden kann, – beispielsweise können die Dosis-Mengen verringert werden.
  • Aminosäure-Insertionen in Bezug auf die oben in a) angegebene Sequenz können ebenfalls durchgeführt werden. Dies kann durchgeführt werden, um die Eigenschaften eines erfindungsgemäß verwendeten Polypeptids zu verändern (z.B. um bei der Identifizierung, Aufreinigung oder Expression unterstützend zu wirken, wie oben im Zusammenhang mit Fusionsproteinen beschrieben ist).
  • Aminosäureänderung in Bezug auf die oben in a) angegebene Sequenz können unter Verwendung jeder geeigneten Methode durchgeführt werden, z.B. durch zielgerichtete Mutagenese (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551).
  • Es sollte verstanden werden, dass Aminosäure-Substitutionen oder -Insertionen im Rahmen der vorliegenden Erfindung unter Verwendung natürlich vorkommender oder nicht-natürlich vorkommender Aminosäuren durchgeführt werden können. Unabhängig davon, ob natürliche oder synthetische Aminosäuren verwendet werden oder nicht, ist es bevorzugt, dass ausschließlich L-Aminosäuren vorhanden sind.
  • Unabhängig davon, welche Aminosäure-Änderungen vorgenommen werden (entweder durch Substitution, Insertion oder Deletion), weisen bevorzugte Polypeptide der vorliegenden Erfindung mindestens 50% Sequenzidentität mit dem oben in a) definierten Polypeptid auf, wobei der Grad an Sequenzidentität vorzugsweise mindestens 75% beträgt. Sequenzidentitäten von mindestens 90% oder mindestens 95% werden am meisten bevorzugt.
  • Die prozentuale Identität von zwei Aminosäuresequenzen oder von zwei Nukleinsäuresequenzen wird durch Abgleich der Sequenzen zum Zwecke eines optimalen Vergleichs (z.B. können Lücken in die erste Sequenz eingefügt werden, um den besten Abgleich mit der Sequenz zu erzielen) und Vergleichen der Aminosäurereste oder Nukleotide an den entsprechenden Positionen bestimmt. Der "beste Abgleich" (best alignment) ist ein Abgleich von zwei Sequenzen, der zur höchsten prozentualen Identität führt. Die prozentuale Identität wird durch die Anzahl von identischen Aminosäureresten oder Nukleotiden in den Sequenzen, die verglichen werden, bestimmt (d.h. % Identität = # der identischen Positionen/insgesamt # der Positionen × 100).
  • Die Bestimmung der prozentualen Identität zwischen zwei Sequenzen kann unter Verwendung eines dem Fachmann bekannten mathematischen Algorithmus erreicht werden. Ein Beispiel für einen mathematischen Algorithmus zum Vergleich zweier Sequenzen ist der Algorithmus von Karlin und Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264–2268, modifiziert wie in Karlin und Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873–5877, beschrieben. Die Programme NBLAST und XBLAST von Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410, beinhalten einen solchen Algorithmus. BLAST-Nukleotidrecherchen können mit dem Programm NBLAST, Score = 100, Wortlänge = 12, durchgeführt werden, um Nukleotidsequenzen zu erhalten, die homolog zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen sind. BLAST-Proteinrecherchen können mit dem Programm XBLAST, Score = 50, Wortlänge = 3, durchgeführt werden, um Aminosäuresequenzen zu erhalten, die homolog zu den erfindungsgemäßen Proteinmolekülen sind. Um eine Abgleich mit Lücken zum Zwecke des Vergleichs zu erhalten, kann BLAST mit Lücken ("Gapped BLAST") verwendet werden, wie es in Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402, beschrieben wird. Alternativ dazu kann PSI-Blast verwendet werden, um eine wiederholte Recherche durchzuführen, die entfernte Verwandtschaften zwischen Molekülen detektiert (Id.). Wenn die Programme BLAST, BLAST mit Lücken („Gapped BLAST") und PSI-Blast verwendet werden, können die vorgegebenen Parameter der entsprechenden Programme (z.B. XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
  • Ein weiteres Beispiel für einen mathematischen Algorithmus, der beim Vergleich von Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus von Myers & Miller, CABIOS (1989). Das Programm ALIGN (Version 2.0), welches Teil des „CGC sequence alignment" Soft ware-Pakets ist, beinhaltet einen solchen Algorithmus. Andere im Stand der Technik bekannte Algorithmen zur Sequenzanalyse umfassen ADVANCE und ADAM, die in Torellis & Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10: 3–5, beschrieben werden; und FASTA, das in Pearson & Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444–8, beschrieben wird. Bei FASTA ist ktup eine Kontrolloption, die die Sensitivität und Geschwindigkeit der Recherche festlegt.
  • Wo ein hoher Grad an Sequenzidentität vorliegt, werden verhältnismäßig wenige Unterschiede hinsichtlich der Aminosäuresequenz bestehen. Somit können beispielsweise weniger als 20, weniger als 10 oder sogar weniger als 5 Unterschiede vorhanden sein.
  • Polypeptide, die von c) umfasst sind
  • Wie oben erwähnt ist es oftmals vorteilhaft, die Länge eines Polypeptids zu verringern, vorausgesetzt, dass das resultierende Polypeptid von geringerer Länge weiterhin die erwünschte Aktivität aufweist oder zu nützlichen Antikörper führt. Merkmal c) der vorliegenden Erfindung deckt daher Fragmente der obigen Polypeptide a) oder b) ab.
  • Der Fachmann kann unter Verwendung der oben offenbarten Methoden bestimmen, ob ein bestimmtes Fragment eine Aktivität aufweist oder nicht. Bevorzugte Fragmente sind mindestens 10 Aminosäuren lang. Sie können mindestens 20, mindestens 50 oder mindestens 100 Aminosäuren lang sein.
  • Ein wie vorliegend definiertes Polypeptid kann als antigenes Material nützlich sein, und kann bei der Herstellung von Impfstoffen zur Behandlung oder Prophylaxe von Brustkrebs verwendet werden. Solches Material kann "antigen" und/oder "immunogen" sein. Im Allgemeinen wird der Begriff "antigen" gewählt, um auszudrücken, dass das Protein zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden kann, oder tatsächlich dazu in der Lage ist, eine Antikörperantwort in einem Subjekt zu induzieren. "Immunogen" wird gewählt um auszudrücken, dass das Protein in der Lage ist, eine protektive Immunantwort in einem Subjekt auszulösen. Im letztgenannten Fall kann das Protein daher nicht nur dazu in der Lage sein, eine Antikörperreaktion hervorzurufen, sondern zusätzlich auch Immunantworten, die nicht auf Antikörpern basieren.
  • Es ist hinreichend bekannt, dass es möglich ist, ein antigenes Protein oder Polypeptid zu untersuchen, um Epitop-Regionen zu identifizieren, d.h. diejenigen Regionen, die für die Antigenität oder Immunogenität des Proteins oder Polypeptids verantwortlich sind. Es können dem Fachmann hinreichend bekannte Verfahren verwendet werden, um Fragmente und/oder Homologe und/oder Derivate auf Antigenität zu testen. Die erfindungsgemäßen Fragmente können somit eine oder mehrere solche Epitop-Regionen umfassen oder solchen Regionen ausreichend ähnlich sein, um ihre antigenen/immunogenen Eigenschaften beizubehalten. Daher ist der Grad der Identität bei den erfindungsgemäßen Fragmenten möglicherweise irrelevant, da sie zu 100% identisch mit einem bestimmten Teil eines vorliegend beschriebenen Proteins oder Polypeptids, Homologs oder Derivats sind. Der wesentliche Punkt kann darin bestehen, dass die Fragmente die antigenen/immunogenen Eigenschaften des Proteins, von dem sie abgeleitet sind, beibehalten.
  • Homologe, Derivate und Fragmente können zumindest einen gewißen Grad der Antigenität/Immunogenität des Proteins oder Polypeptids besitzen, von dem sie abgeleitet sind.
  • Gemäß eines weiteren Aspekts stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines wie vorliegend definierten Polypeptids bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Prophylaxe von Brustkrebs bereit, wobei das Medikament ein Impfstoff ist. Der Impfstoff umfasst wahlweise ein oder mehrere geeignete Adjuvantien. Beispiele für im Stand der Technik hinreichend bekannte Adjuvantien umfassen inorganische Gele, wie beispielsweise Aluminiumhydroxid und Wasser-in-Öl-Emulsionen, wie beispielsweise inkomplettes Freud'sches Adjuvans. Andere nützliche Adjuvantien werden dem Fachmann hinreichend bekannt sein.
  • Gemäß weiteren Aspekten stellt die vorliegende Erfindung bereit:
    • (a) die Verwendung eines wie vorliegend definierten Polypeptids bei der Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung, vorzugsweise eines Impfstoffs;
    • (b) die Verwendung einer solchen immunogenen Zusammensetzung bei der Induktion einer Immunantwort in einem Subjekt; und
    • (c) ein Verfahren zur Behandlung oder Prophylaxe von Brustkrebs in einem Subjekt, oder ein Verfahren zur Impfung eines Subjekts gegen Brustkrebs, das den Schritt der Verabreichung einer wirksamen Menge eines wie vorliegend definierten Polypeptids (vorzugsweise als Impfstoff) an das Subjekt umfasst.
  • Wie nachfolgend erörtert werden die erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide Anwendung bei einem immuntherapeutischen Ansatz gegen Brustkrebs finden. Dem Fachmann wird bewußt sein, dass der bevorzugte Ansatz zur Herstellung eines oder mehrerer solcher Polypeptide auf Methoden mit rekombinanter DNA basieren wird. Zusätzlich können Nukleinsäuremoleküle, die für Polypeptide oder Fragmente derselben kodieren, selbstständig verwendet werden. Somit stellt die Erfindung gemäß eines vierten Aspekts ein Verfahren zum Screening nach und/oder zur Diagnose von Brustkrebs in einem Subjekt bereit, das den Schritt des Detektierens und/oder des Quantifizierens der Menge einer Nukleinsäure in einer biologischen Probe umfasst, die von dem Subjekt erhalten wurde, wobei das Nukleinsäuremolekül:
    • a) die in 1 gezeigte DNA-Sequenz oder ihr entsprechendes RNA-Äquivalent umfasst oder aus dieser besteht;
    • b) eine Sequenz aufweist, die komplementär zu den Sequenzen von a) ist;
    • c) eine Sequenz aufweist, die für dasselbe Polypeptid kodiert wie die Sequenzen von a) oder b);
    • d) eine Sequenz aufweist, die eine wesentliche Identität mit irgendeiner der Sequenzen von a), b) oder c) aufweist; oder
    • e) eine Sequenz, die für ein Derivat oder Fragment des in 1 gezeigten Aminosäuremoleküls kodiert.
  • Gemäß eines fünften Aspekts stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Prophylaxe und/oder zur Behandlung von Brustkrebs in einem Subjekt bereit, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge mindestens einer wie im vierten Aspekt der Erfindung definierten Nukleinsäure umfasst.
  • Gemäß eines sechsten Aspekts stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung mindestens einer wie im vierten Aspekt der Erfindung definierten Nukleinsäure bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung bei der Prophylaxe und/oder der Behandlung von Brustkrebs bereit.
  • Die Nukleinsäuremoleküle werden nunmehr genauer besprochen.
  • Es wird bevorzugt, dass Sequenzen, die eine wesentliche Identität mit irgendeiner der Sequenzen von a), b) und c) zeigen, beispielsweise mindestens 50%, mindestens 75% oder mindestens 90% oder 95% Sequenzidentität aufweisen.
  • Die erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide können durch eine große Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen kodiert werden, wenn man die hinreichend bekannte Tatsache in Betracht zieht, dass der genetische Code degeneriert ist. Alle diese Moleküle sind von der vorliegenden Erfindung umfasst. Sie können in Vektoren insertiert und kloniert werden, um große Mengen DNA oder RNA für weitere Studien bereitzustellen. Geeignete Vektoren können in Wirtszellen eingebracht werden, um die Expression von erfindungsgemäß verwendeten Polypeptiden zu ermöglichen, wobei Methoden verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind.
  • Sofern wie oben verwendet verweist der Begriff "RNA-Äquivalent" darauf, dass ein gegebenes RNA-Molekül eine Sequenz aufweist, die komplementär zu der Sequenz eines gegebenen DNA-Moleküls ist, wobei berücksichtigt wird, dass in RNA "U" das "T" im genetischen Code ersetzt. Die Nukleinsäuremoleküle können in isolierter, rekombinanter oder chemischsynthetischer Form vorliegen.
  • Methoden zur Klonierung, Expression und Aufreinigung von Proteinen und Polypeptiden sind dem Fachmann hinreichend bekannt. DNA-Konstrukte können auf einfache Weise erzeugt werden, wobei im Stand der Technik hinreichend bekannte Methoden verwendet werden. Dieses Methoden werden beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning 2. Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989); in Old & Primrose Principles of Gene Manipulation 5. Auflage, Blackwell Scientific Publikations (1994); sowie in Stryer, Biochemistry 4. Auflage, W. H. Freeman and Company (1995), offenbart. Modifikationen von DNA-Konstrukten und den exprimierten Proteinen, wie beispielsweise das Hinzufügen von Promotoren, Verstärker-Elemente ("enhancer"), Signalsequenzen, Leadersequenzen, Translations-Startsignalen und -Stoppsignalen sowie von Regionen, welche die Stabilität der DNA kontrollieren, oder das Hinzufügen von Fusionspartnern, können vorgenommen werden.
  • Normalerweise wird das DNA-Konstrukt in einen Vektor insertiert werden, der von einem Phagen oder einem Plasmid stammt. Die Expression des Proteins wird durch Transformation oder Transfektion des Vektors in eine Wirtszelle erreicht, die eukaryotischer oder prokaryotischer Herkunft sein kann. Solche Vektoren und geeignete Wirtszellen bilden Aspekte der vorliegenden Erfindung.
  • Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen, die DNA und RNA einschließen und eine Sequenz umfassen, die für ein wie vorliegend definiertes Polypeptid (oder ein Fragment, Homolog oder Analog desselben) kodiert, können unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren synthetisiert werden, wie beispielsweise unter Verwendung konventioneller chemischer Ansätze oder Polymerasekettenreaktion (PCR)-Amplifikation. Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen erlauben ferner die Identifizierung und Klonierung des Gens, das für ein wie vorliegend definiertes Polypeptid kodiert, aus jeglicher Spezies, beispielsweise durch Durchsuchen von cDNA-Bibliotheken, genomischen Bibliotheken oder Expressions-Bibliotheken.
  • Die Kenntnis der Nukleinsäurestruktur kann dazu verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen; sie kann ferner für die Gentherapie verwendet werden. Methoden dafür sind dem Fachmann hinreichend bekannt, wie vorliegend genauer erörtert wird.
  • Durch Verwendung geeigneter Expressionssysteme können erfindungsgemäße Polypeptide in glykosylierter oder nicht-glykosylierter Form exprimiert werden. Nicht-glykosylierte Formen können durch Expression in prokaryotischen Wirten, wie beispielsweise E. coli, hergestellt werden.
  • Polypeptide, die N-terminales Methionin umfassen, können unter Verwendung geeigneter Expressionssysteme hergestellt werden, während bei anderen das reife Polypeptid diesen Rest nicht aufweisen wird.
  • Bevorzugte Methoden zur Klonierung, Expression und Aufreinigung eines erfindungsgemäß verwendeten Polypeptids sind nachfolgend zusammengefasst:
    Polypeptide können nativ oder unter denaturierenden Bedingungen mit anschließendem Rückfalten hergestellt werden. Baculovirale Expressionsvektoren umfassen sekretorische Plasmide (wie beispielsweise pACGP67 von Pharmingen), die eine im glaichen Leserahmen („in frame") klonierte Epitop-tag-Sequenz (z.B. myc, V5 oder His) aufweisen können, um die Detektion zu unterstützen und die anschließende Aufreinigung des Proteins zu ermöglichen. Säugetier-Expressionsvektoren können pCDNA3 und pSecTag (beide Invitrogen), sowie pREP9 und pCEP4 (Invitrogen) umfassen. E. coli-Systeme umfassen die pBad-Serie (mit His-tag versehen – Invitrogen) oder die pGex-Serie (Pharmacia).
  • Zusätzlich zu Nukleinsäuremolekülen, die für Polypeptide kodieren, welche im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet und vorliegend als "kodierende" Nukleinsäuremoleküle bezeichnet werden, umfasst die vorliegende Erfindung ferner Nukleinsäuremoleküle, die komplementär zu diesen sind. Daher sind beispielsweise beide Stränge eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls von der vorliegenden Erfindung umfasst (unabhängig davon, ob sie miteinander verbunden sind oder nicht). Fer ner sind mRNA-Moleküle und komplementäre DNA-Moleküle (z.B. cDNA-Moleküle) umfasst.
  • Nukleinsäuremoleküle, die an irgendeines der oben besprochenen Nukleinsäuremoleküle hybridisieren können, sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst. Solche Nukleinsäuremoleküle werden vorliegend als "hybridisierende" Nukleinsäuremoleküle bezeichnet. Hybridisierende Nukleinsäuremoleküle können beispielsweise als Sonden oder Primer nützlich sein.
  • Es ist erstrebenswert, dass solche hybridisierenden Moleküle mindestens 10 Nukleotide lang sind, vorzugsweise mindestens 25 oder mindestens 50 Nukleotide lang. Die hybridisierenden Nukleinsäuremoleküle hybridisieren vorzugsweise spezifisch mit Nukleinsäuren, die von den obigen (a), (b), (c), (d) oder (e) umfasst sind.
  • Es ist ferner erstrebenswert, dass die hybridisierenden Moleküle mit solchen Molekülen unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren werden. Ein Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen besteht darin, dass der Hybridisierungsversuch bei einer Temperatur von etwa 35°C bis etwa 65°C unter Verwendung einer etwa 0,9 molaren Salzlösung durchgeführt wird. Der Fachmann wird jedoch in der Lage sein, solche Bedingungen in geeigneter Weise zu variieren, um Variable, wie beispielsweise die Länge der Sonde, die Basenzusammensetzung, die Art der vorhandenen Ionen, usw. in Betracht zu ziehen. Für einen hohen Grad an Selektivität werden verhältnismäßig stringente Bedingungen zur Bildung der Duplex-Moleküle verwendet, wie beispielsweise geringe Salz-Bedingungen oder hohe Temperatur-Bedingungen. Wie vorliegend verwendet bedeutet "in hohem Maß stringente Bedingungen" eine Hybridisierung an Filtergebundene DNA in 0,5 M NaHPO4, 7% Natriumdodecylsulfat (SDS) 1 mM EDTA bei 65°C und Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 68°C (Ausubel F. M., et al., Hersg., 1989, Current Protocols in Molekular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., und John Wiley & Sons, Inc., New York, auf S. 2.10.3). Bei einigen Anwendungen sind weniger stringente Bedingungen zur Duplex-Bildung erforderlich. Wie vorliegend verwendet bedeutet "gemäßigt-stringente Bedingungen" das Waschen in 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 42°C (Ausubel et al., 1989, oben). Die Hybridisierungsbedingungen können darüber hinaus durch Zusatz von ansteigenden Mengen Formamid zur Destabilisierung des hybriden Duplexes stringenter gemacht werden. Somit können bestimmte Hybridisierungsbedingungen auf einfache Weise manipuliert werden; sie werden üblicherweise in Abhängigkeit von den gewünschten Ergebnissen gewählt werden. Üblicherweise sind angebrachte Hybridisierungstemperaturen in Gegenwart von 50% Formamid: 42°C für eine Sonde, die zu 95 bis 100% identisch zu dem Fragment eines Gens ist, das für ein wie vorliegende definiertes Polypeptid kodiert, 37°C für 90 bis 95%ige Identität und 32°C für 70 bis 90%ige Identität. Bei der Herstellung genomischer Bibliotheken werden DNA-Fragmente erzeugt, wobei einige dieser DNA-Fragmente für Teile des wie vorliegend definierten Polypeptids oder für das gesamte wie vorliegend definierte Polypeptid kodieren. Die DNA kann an spezifischen Stellen unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme gespalten werden. Alternativ dazu kann man DNAse in Gegenwart von Mangan verwenden, um die DNA zu fragmentieren, oder die DNA kann physikalisch geschoren werden, beispielsweise durch Beschallung. Die DNA-Fragmente können anschließend ihrer Größe nach durch Standardverfahren getrennt werden, einschließlich (jedoch nicht beschränkt auf) Agarose- und Polyacrylamidgelelektrophorese, Säulenchromatographie und Saccharose-Gradientenzentrifugation. Die DNA-Fragmente können anschließend in geeignete Vektoren insertiert werden, einschließlich (jedoch nicht beschränkt auf) Plasmide, Cosmide, Bakteriophagen Lambda oder T4, sowie künstliche Hefe-Chromosomen (YACs). (Vergleiche beispielsweise Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1D Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D. M. (Hersg.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U. K. Vol. I, II; Ausubel F. M. et al., Hersg., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., und John Wiley & sons, Inc., New York). Die genomische Bibliothek kann mittels Nukleinsäure-Hybridisierung mit einer markierten Sonde untersucht werden (Benton & Davis, 1977, Science 196: 180; Grunstein & Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72: 3961).
  • Die Manipulation der für ein Protein kodierenden DNA, ist eine besonders geeignete Methode, sowohl zur Modifikation Proteinen, als auch zur Herstellung großer Mengen Protein zu Aufreinigungszwecken. Dies kann die Verwendung von PCR-Methoden zur Amplifikation einer gewünschten Nukleinsäuresequenz einschließen. Die vorliegend bereitgestellten Sequenzdaten können somit verwendet werden, um Primer zur Verwendung bei einer PCR herzustellen, sodass eine gewünschte Sequenz gewählt und anschließend zu einem hohen Grad amplifiziert werden kann.
  • Typische Primer werden mindestens 5 Nukleotide lang sein, üblicherweise mindestens 10 Nukleotide lang (z.B. 15 bis 25 Nukleotide lang). In einigen Fällen können Primer einer Länge von mindestens 30 oder mindestens 35 Nukleotiden verwendet werden.
  • Als weitere Alternative kann die chemische Synthese verwendet werden. Diese kann automatisiert sein. Relativ kurze Sequenzen können chemisch synthetisiert und aneinander ligiert werden, um eine längere Sequenz bereitzustellen.
  • Neben ihrer Verwendbarkeit als Primer und/oder Sonden können erfindungsgemäße, hybridisierende Nukleinsäuremoleküle als Antisense-Moleküle verwendet werden, um die Expression von erfindungsgemäßen Substanzen durch Bindung an komplementäre Nukleinsäuremoleküle zu verändern. Diese Methode kann in der Antisense-Therapie verwendet werden.
  • Gemäß einer bestimmten Ausführungsform wird die Expression eines wie vorliegend definierten Polypeptids durch Verwendung von Antisense-Nukleinsäuren inhibiert. Die vorliegende Erfindung stellt die therapeutische oder prophylaktische Verwendung von Nukleinsäuren bereit, die mindestens 6 Nukleotide umfassen, welche in Bezug auf ein Gen oder eine cDNA, welche für ein wie vorliegend definiertes Polypeptid oder für einen Teil desselben kodiert, gegensätzlich („antisense") sind. Wie vorliegend verwendet bezieht sich "Antisense"-Nukleinsäure auf eine Nukleinsäure, die in der Lage ist aufgrund einer gewissen Sequenzkomplementarität mit einem Teil einer RNA (vorzugsweise einer mRNA) zu hybridisieren, welche für ein wie vorliegend definiertes Polypeptid kodiert. Die Antisense-Nukleinsäure kann komplementär zu einem kodierenden und/oder einem nicht-kodierenden Bereich der mRNA sein, die für ein solches Polypeptid kodiert. Solche Antisense-Nukleinsäuren sind als die Expression inhibierende Verbindungen nützlich und können bei der Behandlung oder Prävention von Brustkrebs verwendet werden.
  • Ein erfindungsgemäßes hybridisierendes Nukleinsäuremolekül kann über seine Länge einen hohen Grad von Sequenzidentität mit einem Nukleinsäuremolekül aufweisen, das von den oben erwähnten (a)–(e) umfasst ist (z.B. mindestens 50%, mindestens 75% oder mindestens 90% oder 95% Sequenzidentität). Dem Fachmann wird bewußt sein, dass je höher die Sequenzidentität eines gegebenen einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls zu einem anderen Nukleinsäuremolekül ist, die Wahrscheinlichkeit umso größer ist, dass es unter geeigneten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül hybridisiert, welches komplementär zu diesem anderen Nukleinsäuremolekül ist.
  • Im Hinblick auf die oben aufgeführte Beschreibung wird es dem Fachmann bewußt sein, dass eine große Anzahl von Nukleinsäuremolekülen von der vorliegenden Erfindung umfasst ist. Sofern sich aus dem Kontext nichts anderes ergibt, können Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweisen:
    • 1) sie können DNA oder RNA sein;
    • 2) sie können einzel- oder doppelsträngig sein;
    • 3) sie können in rekombinanter Form bereit gestellt werden, z.B. kovalent gebunden an eine 5'- und/oder 3'-flankierende Sequenz, wobei ein Molekül bereitgestellt wird, das in der Natur nicht vorkommt;
    • 4) sie können ohne 5'- und/oder 3'-flankierende Sequenzen, die normalerweise in der Natur vorkommen, bereitgestellt werden;
    • 5) sie können in im Wesentlichen reiner Form zur Verfügung gestellt werden. Sie können somit in einer Form bereitgestellt werden, die im Wesentlichen frei von kontaminierenden Proteinen und/oder von anderen Nukleinsäuren ist; und
    • 6) sie können mit Introns oder ohne Introns bereitgestellt werden (z.B. als cDNA).
  • Sofern es gewünscht ist, kann ein Gen, das für ein wie vorliegende definiertes Polypeptid kodiert, ein verwandtes Gen, oder verwandte Nukleinsäuresequenzen oder Subsequenzen, einschließlich komplementärer Sequenzen, ferner in Hydribisierungsassays verwendet werden. Eine Nukleotidsequenz, die für ein wie vorliegend definiertes Polypeptid kodiert, oder Subsequenzen derselben, welche mindestens 8 Nukleotide umfassen, können als Hybridisierungssonde verwendet werden. Hybridisierungsassays können zur Detektion, Prognose, Diagnose oder zum Verfolgen von Bedingungen, Störungen oder Erkrankungszuständen, die mit einer anormalen Expression von Genen, welche für ein wie vorliegend definiertes Polypeptid kodieren, assoziiert sind, verwendet werden, oder sie können für die Differentialdiagnose von Patienten mit Anzeichen oder Symptomen, die auf Brustkrebs schließen lassen, verwendet werden. Ein solcher Hybridisierungsassay kann insbesondere mittels eines Verfahrens durchgeführt werden, das ein Inkontaktbringen einer Nukleinsäurehaltigen Patientenprobe mit einer Nukleinsäuresonde, die in der Lage ist, mit einer DNA oder RNA zu hybridisieren, die für ein wie vorliegend definiertes Polypeptid kodiert, unter Be dingungen umfasst, die die Hybridisierung erlauben, sowie das Detektieren und Messen jeglicher resultierender Hybridisierung umfasst. Wie nachfolgend beschrieben können die Nukleotide für die Therapie von Patienten mit Brustkrebs verwendet werden.
  • Eine weitere Ausführungsform betrifft eine Zusammensetzung von Oligonukleotiden, die 10 oder mehr aufeinanderfolgende Nukleotide umfasst, welche komplentär zu einer Nukleotidsequenz sind, welche für ein wie vorliegend definiertes Polypeptid oder ein Fragment desselben kodiert, zur Verwendung als Impfstoff zur Behandlung von Brustkrebs. Solche Zusammensetzungen können Adjuvantien oder andere Vehikel umfassen.
  • Gemäß einer spezifischen Ausführungsform werden Nukleinsäuren, die eine Sequenz umfassen, welche für ein wie vorliegend definiertes Polypeptid oder für ein funktionelles Derivat desselben kodiert, verabreicht, um die Polypeptidfunktion durch eine Gentherapie zu fördern. Gentherapie bezieht sich auf die Verabreichung einer exprimierten oder exprimierbaren Nukleinsäure an ein Subjekt. Gemäß dieser Ausführungsform produziert die Nukleinsäure das von ihr kodierte Protein, welches die therapeutische Wirkung durch Förderung der Polypeptidfunktion bewirkt. Jedes der im Stand der Technik verfügbaren Verfahren zur Gentherapie kann erfindungsgemäß verwendet werden.
  • Gemäß eines bevorzugten Aspekts umfasst die Verbindung eine wie vorliegend definierte Nukleinsäure, wie beispielsweise eine Nukleinsäure, die für ein wie vorliegend definiertes Polypeptid oder ein Fragment oder ein chimäres Protein desselben kodiert, wobei die Nukleinsäure Teil eines Expressionsvektors ist, welcher ein wie vorliegend definiertes Polypeptid oder ein Fragment oder ein chimäres Protein desselben in einem geeigneten Wirt exprimiert. Eine solche Nukleinsäure weist insbesondere einen Promotor auf, der in operativer Weise mit der für das Polypeptid kodierenden Region verbunden ist, wobei der Promotor induzierbar oder konstitutiv (und wahlweise gewebespezifisch) ist. Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform wird ein Nukleinsäuremolekül verwendet, in dem die kodierenden Sequenzen und sämtliche übrigen gewünschten Sequenzen von Regionen flankiert werden, die eine homologe Rekombination an einer gewünschten Stelle im Genom unterstützen und somit eine intrachromosomale Expression einer Nukleinsäure ermöglichen (Koller & Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932–8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342: 435–438).
  • Die Bereitstellung einer Nukleinsäure in einem Patienten kann direkt erfolgen, wobei der Patient in diesem Fall direkt einer Nukleinsäure oder einem Nukleinsäure-tragenden Vektor ausgesetzt wird; dieser Ansatz ist als in vivo-Gentherapie bekannt. Alternativ dazu kann das Bereitstellen der Nukleinsäure in dem Patienten indirekt erfolgen, wobei in diesem Fall die Zellen zunächst mit einer Nukleinsäure in vitro transformiert und anschließend in den Patienten transplantiert werden; dieser Ansatz ist als ex vivo-Gentherapie bekannt.
  • Geeignete Mittel zur Detektion/Quantifizierung der erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide schließen die Verwendung von Antikörpern ein. Somit können die erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide ferner Anwendung bei der Erzeugung von Antikörpern finden.
  • Gemäß eines siebten Aspekts stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Antikörpers, der an mindestens ein wie im ersten Aspekt der Erfindung definiertes Polypeptid bindet, für das Screening nach und/oder die Diagnose von Brustkrebs in einem Subjekt bereit. Vorzugsweise wird der Antikörper zur Detektion und/oder Quantifizierung der Menge eines wie im ersten Aspekt der Erfindung definierten Polypeptids in einer von einem Subjekt erhaltenden biologischen Probe verwendet.
  • Gemäß einer Ausführungsform kann die Bindung eines Antikörpers in Gewebeschnitten dazu verwendet werden, eine anormale Lokalisierung des Polypeptids oder einen anormalen Gehalt des Polypeptids zu detektieren. Gemäß einer spezifischen Ausführungsform können Antikörper gegen ein wie vorliegend definiertes Polypeptid dazu verwendet werden, um ein Patientengewebe (z.B. eine Brustbiopsie) auf den Gehalt eines Polypeptids zu untersuchen, wobei ein anormaler Gehalt des Polypeptids indikativ für Brustkrebs ist. Wie vorliegend verwendet bedeutet ein "anormaler Gehalt" einen Gehalt, der im Vergleich mit dem Gehalt in einem Subjekt, das frei von Brustkrebs ist, oder im Vergleich mit einem Referenzgehalt erhöht oder erniedrigt ist. Sofern es erwünscht ist, kann der Vergleich mit einer angepassten Probe (matched sample) von demselben Subjekt durchgeführt werden, die aus einem Teil des Körpers entnommen wurde, der nicht von Brustkrebs betroffen ist.
  • Geeignete Immunassays umfassen (ohne Einschränkung) kompetitive und nicht-kompetitive Assay-Systeme, wobei Methoden wie beispielsweise Westernblots, Radioimmunassays, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), "Sandwich"-Immunassays, Immunpräzipitationsassays, Präzipitinreaktionen, Geldiffusions- Präzipitinreaktionen, Immundiffusionsassays, Agglutinationsassays, Komplement-Fixierungsassays, immunradiometrische Assays, fluoreszente Immunassays und Protein-A-Immunassays verwendet werden.
  • Gemäß eines achten Aspekts betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Brustkrebs in einem Subjekt, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Antikörpers umfasst, der an mindestens ein wie im ersten Aspekt der Erfindung definiertes Polypeptid bindet.
  • Gemäß eines neunten Aspekts betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Antikörpers, der an mindestens ein wie im ersten Aspekt der Erfindung definiertes Polypeptid bindet, bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung bei der Prophylaxe und/oder der Behandlung von Brustkrebs.
  • Bevorzugte Antikörper binden spezifisch an Polypeptide der vorliegenden Erfindung, sodass sie dazu verwendet werden können, solche Polypeptide aufzureinigen und/oder die Aktivität solcher Polypeptide zu inhibieren. Die Antikörper können monoklonal oder polyklonal sein.
  • Somit kann das im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete Polypeptid, seine Fragmente oder andere Derivate oder Analoga desselben als Immunogen verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, die immunspezifisch ein solches Immunogen binden. Erfindungsgemäße Antikörper umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) polyklonale, monoklonale, bispezifische, humanisierte oder chimäre Antikörper, einzelkettige Antikörper, Fab- Fragmente und F(ab')-Fragmente, Fragmente, die aus einer Fab-Expressionsbibliothek hergestellt worden sind, anti-idiotypische (anti-Id)-Antikörper sowie Epitop-bindende Fragmente der obigen. Der Begriff "Antikörper" betrifft wie vorliegend verwendet Immunglobulinmoleküle und immunologischaktive Teile von Immunglobulinmolekülen, d.h. Moleküle, die eine Antigenbindungsstelle enthalten, welche spezifisch ein Antigen bindet. Die erfindungsgemäßen Immunglobulinmoleküle können aus jeder Klasse (z.B. IgG, IgE, IgM, IgD und IgA) oder Subklasse von Immunglobulinmolekülen stammen.
  • Bei der Herstellung von Antikörpern kann das Screening nach dem gewünschten Antikörper mittels im Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden, z.B. mittels eines ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). Um beispielsweise Antikörper zu selektieren, die eine spezifische Domäne erfindungsgemäß verwendeten Polypeptids erkennen, kann man erzeugte Hybridome auf ein Produkt untersuchen, das an ein Polypeptidfragment bindet, welches eine solche Domäne umfasst. Zur Selektion eines Antikörpers, der spezifisch ein erstes Polypeptid-Homolog bindet, jedoch nicht spezifisch an ein zweites Polypeptid-Homolog bindet (oder weniger stark), kann man auf Basis der positiven Bindung an das erste Polypeptid-Homolog und dem Ausbleiben einer Bindung (oder der reduzierten Bindung) an das zweite Polypeptid-Homolog eine Auswahl treffen.
  • Für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern (mAbs), die gegen ein erfindungsgemäß verwendetes Polypeptid gerichtet sind, kann jede Methode verwendet werden, die die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur gewährleistet. Es kann beispielsweise die ursprünglich von Kohler und Milstein (1975, Nature 256: 495–497) entwickelte Hybridom-Methode, sowie auch die Triom-Methode, die humane B-Zell-Hybridom-Methode (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72) und die EBV-Hybridom-Methode zur Herstellung humaner monoklonaler Antikörper verwendet werden (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96). Solche Antikörper können aus jeder Immunglobulinklasse, einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA, IgD und jeder Subklasse derselben stammen. Die Hybridome, die die erfindungsgemäß verwendeten mAbs produzieren, können in vitro oder in vivo kultiviert werden. Gemäß einer zusätzlichen Ausführungsform der Erfindung können monoklonale Antikörper in keimfreien Tieren unter Verwendung bekannter Verfahren hergestellt werden (PCT/US90/02545).
  • Die monoklonalen Antikörper umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) humane monoklonale Antikörper und chimäre monoklonale Antikörper (z.B. Mensch-Maus-Chimären). Ein chimärer Antikörper ist ein Molekül, bei dem verschiedene Teile von verschiedenen tierischen Spezies abgeleitet sind, wie beispielsweise diejenigen, die eine humane konstante Region des Immunglobulins aufweisen und eine variable Region, die von einem murinen mAb abgeleitet ist (siehe z.B. US-Patent Nr. 4,816,567; und US-Patent Nr. 4,816,397). Humanisierte Antikörper sind Antikörpermoleküle von nicht-humanen Spezies, die eine oder mehrere Komplemantaritäts-bestimmende Regionen (CDRs) der nicht-humanen Spezies und eine Gerüst-Region eines humanen Immunglobulinmoleküls aufweisen (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5,585,089).
  • Chimäre und humanisierte monoklonale Antikörper können durch im Stand der Technik bekannte, rekombinante DNA-Methoden hergestellt werden, beispielsweise unter Verwendung von Verfahren, die in WO 87/02671; EP-A-184,187; EP-A-171,496; EP-A-173 494; WO 86/01533, US-Patent Nr. 4,816,567, EP-A-125,023; Better et al., 1988, Science 240: 1041–1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439–3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139: 3521–3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214–218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47: 999–1005; Wood et al., 1985, Nature 314: 446–449; Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553–1559; Morrison, 1985, Science 229: 1202–1207; Oi et al., 1986, Bio/Techniques 4: 214; US-Patent 5,225,539; Jones et al., 1986, Nature 321: 552–525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534 und Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141: 4053–4060, beschrieben sind.
  • Vollständig humane Antikörper sind insbesondere bei der therapeutischen Behandlung von humanen Patienten wünschenswert. Solche Antikörper können unter Verwendung transgener Mäuse hergestellt werden, die nicht in der Lage sind, endogene Gene für die schwere und leichte Immunglobulinkette zu exprimieren, die jedoch humane Gene für die schwere und leichte Kette exprimieren können. Die transgenen Mäuse werden auf herkömmliche Weise mit einem ausgewählten Antigen immunisiert, z.B. mit dem gesamten oder mit einem Teil eines erfindungsgemäß verwendeten Polypeptids. Monoklonale Antikörper, die gegen das Antigen gerichtet sind, können unter Verwendung herkömmlicher Hybridom-Verfahren erhalten werden. Die humanen Immunglobulin-Transgene, die in den transgenen Mäusen vorliegen, lagern sich während der B-Zell-Differenzierung um und durchlaufen anschließend einen Wechsel der Klasse sowie eine somatische Mu tation. Unter Verwendung einer solchen Methode ist es somit möglich, therapeutisch nützliche IgG-, IgA-, IgM- und IgE-Antikörper zu erzeugen. Für einen Überblick über diese Technologie zur Herstellung humaner Antikörper, siehe Lonberg & Huszar (1995), Int. Rev. Immunol. 13: 65–93. Für eine detaillierte Erörterung dieser Technologie zur Herstellung humaner Antikörper und humaner monoklonaler Antikörper sowie für Protokolle zur Herstellung solcher Antikörper, siehe beispielsweise US-Patent 5,625,126; US-Patent 5,633,425; US-Patent 5,569,825; US-Patent 5,661,016 und US-Patent 5,545,806. Zusätzlich können Firmen wie Abgenix, Inc. (Freemont, CA) und Genpharm (San Jose, CA) damit befasst werden, humane Antikörper bereitzustellen, die gegen ein ausgewähltes Antigen gerichtet sind, wobei Verfahren verwendet werden, die den oben beschriebenen ähneln.
  • Vollständig humane Antikörper, die ein ausgewähltes Epitop erkennen, können unter Verwendung einer Methode, die als "gerichtete Selektion" (guided selection) bezeichnet wird, erzeugt werden. Bei diesem Ansatz wird ein ausgewählter nicht-humaner monoklonaler Antikörper, z.B. ein Maus-Antikörper, verwendet, um die Selektion eines vollständig humanen Antikörpers, der dasselbe Epitop erkennt, zu steuern (Jespers et al. (1994) Bio/technology 12: 899–903).
  • Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Antikörper können ferner unter Verwendung verschiedener im Stand der Technik bekannter Phagen-Display-Verfahren erzeugt werden. Bei Phagen-Display-Verfahren werden funktionelle Antikörperdomänen auf der Oberfläche von Phagenpartikeln präsentiert, welche die Polynukleotidsequenzen enthalten, die für diese kodieren. Solche Phagen können insbesondere verwendet werden, um Antigen bindende Domänen zu präsentieren, die aus einem Repertoire oder einer kombinatorischen Antikörper-Bibliothek (z.B. human oder murin) exprimiert werden. Ein Phage, der eine Antigenbindende Domäne exprimiert, die das Antigen von Interesse bindet, kann mit einem Antigen selektiert oder identifiziert werden, z.B. unter Verwendung von markiertem Antigen oder von Antigen, das gebunden oder angebunden (captured) an eine feste Oberfläche oder an ein Kügelchen (bead) vorliegt. Phagen, die im Zuge dieser Verfahren verwendet werden, sind üblicherweise filamentöse Phagen, die fd- und M13-Bindungsdomänen umfassen, welche von den Phagen mit Fab-, Fv-, oder Disulphidstabilisierten Fv-Antikörperdomänen exprimiert werden, welche entweder an das Gen III-Protein oder das Gen-VIII-Protein rekombinant fusioniert sind. Die Phagen-Display-Verfahren, die verwendet werden können, um die erfindungsgemäß verwendeten Antikörper herzustellen, umfassen diejenigen, die in Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182: 41–50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184: 177–186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24: 952–958 (1994); Persic et al., Gene 187: 9–18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57: 191–280 (1994); PCT/GB91/01134; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; und US-Patent Nrn. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 und 5,969,108 offenbart werden.
  • Wie in den obigen Literaturhinweisen beschrieben, können die Antikörper-kodierenden Regionen aus dem Phagen nach Phagenselektion isoliert und dazu verwendet werden, vollständige Antikörper, einschließlich humane Antikörper, oder jedes andere gewünschte Antigen-bindende Fragment zu erzeugen und in jedem gewünschten Wirt zu exprimieren, einschließlich in Säugetierzellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen, Hefe und Bakterien, wie z.B. im folgenden genauer beschrieben wird. Beispielsweise können Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Fab-, Fab'- und F(ab')2-Fragmenten unter Anwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie beispielsweise denjenigen, die in WO 92/22324; Mullinax et al., Bio Techniques 12(6): 864–869 (1992); und Sawai et al., AJRI 34: 26–34 (1995) und Better et al., Science 240: 1041–1043 (1988) offenbart werden, angewendet werden.
  • Beispiele für Methoden, die verwendet werden können, um einzelkettige Fvs und Antikörper herzustellen, umfassen diejenigen, die in den US-Patenten 4,946,778 und 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology 203: 46–88 (1991); Shu et al., PNAS 90: 7995–7999 (1993) und Skerra et al., Science 240: 1038–1040 (1988) beschrieben werden.
  • Die Erfindung ermöglicht ferner die Verwendung von bispezifischen Antikörpern, die nach im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden können. Die übliche Herstellung von bispezifischen Antikörpern vollständiger Länge basiert auf der Co-Experession von zwei Paaren aus schwerer-Kette-leichter Kette des Immunglobulin, wobei die zwei Ketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen (Milstein et al., 1983, Nature 305: 537–539). Aufgrund der zufälligen Auswahl von schweren und leichten Immunglobulin-Ketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein potentielles Gemisch von 10 verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen lediglich eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Aufreinigung des korrekten Moleküls, die in der Regel durch Affinitätschromatographie-Schritte durchgeführt wird, ist verhältnismäßig mühsam, und die Produktausbeuten sind gering. Ähnliche Vorgehensweisen werden in WO 93/08829 und in Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10: 3655-3659 beschrieben.
  • Gemäß eines anderen und stärker bevorzugten Ansatzes werden die variablen Domänen eines Antikörpers, die die gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Haftstellen; antibody-antigen combining sites) aufweisen, an Sequenzen für die konstante Domäne eines Immunglobulins fusioniert. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer konstanten Domäne der schweren Kette eines Immunglobulins, welche mindestens einen Teil der Hinge-, CH2- und CH3-Regionen umfasst. Es ist bevorzugt, dass die erste konstante Region der schweren Kette (CH1), die die für die Bindung der leichten Kette notwendige Stelle enthält, in mindestens einer der Fusionen vorgeliegt. DNAs, die für die Fusionen der schweren Kette des Immunglobulins sowie (falls gewünscht) für die leichte Kette des Immunglobulins kodieren, werden in getrennte Expressionsvektoren insertiert und in einem geeigneten Wirtsorganismus co-transfiziert. Dies gewährleistet eine große Flexibilität bei der Anpassung der gemeinsamen Anteile der drei Polypeptidfragmente in Ausführungsformen, bei denen ungleiche Verhältnisse der drei bei der Konstruktion verwendeten Polypeptidketten für eine optimale Ausbeute sorgen. Es ist jedoch möglich, die kodierenden Sequenzen für zwei oder alle drei Polypeptidketten in einen Expressionsvektor zu insertieren, wenn die Expression von mindestens zwei Polypeptidketten im gleichen Verhältnis zu hohen Ausbeuten führt, oder wenn das jeweilige Verhältnis nicht von besonderer Bedeutung ist.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Ansatzes sind die bispezifischen Antikörper aus einer hybriden schweren Kette eines Immunglobulins mit einer ersten Bindungsspezifität in einem Arm und einem hybriden schwere Kette-leichte Kette-Paar eines Immunglobulins (das für eine zweite Bindungsspezifität sorgt) im anderen Arm zusammengesetzt. Es wurde herausgefunden, dass diese asymmetrische Struktur die Trennung der gewünschten bispezifischen Verbindung von unerwünschten Kombinationen von Immunglobulinketten ermöglicht, da das Vorhandensein einer leichten Kette eines Immunglobulins in nur einer Hälfte der bispezifischen Moleküle einen mühelosen Weg der Trennung gewährleistet. Dieser Ansatz wird in WO 94/04690 offenbart. Für weitere Details zur Erzeugung bispezifischer Antikörper, siehe beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology, 1986, 121: 210.
  • Die Erfindung gewährleistet die Verwendung von funktionellaktiven Fragmenten, Derivaten oder Analoga der Anti-Polypeptid-Immunglobulinmoleküle. "Funktionell-aktiv" bedeutet, dass das Fragment, Derivat oder Analog in der Lage ist, anti-anti-idiotypische Antikörper (d.h. tertiäre Antikörper) hervorzurufen, die dasselbe Antigen erkennen, das von dem Antikörper erkannt wird, von dem das Fragment, Derivat oder Analog abgeleitet ist. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann die Antigenität des Ideotyps des Immunglobulinmoleküls durch Deletieren von Gerüst- und CDR-Sequenzen, die C-terminal zu den CDR-Sequenzen liegen, welche spezifisch das Antigen erkennen, verstärkt werden. Um zu bestimmen, welche CDR-Sequenzen das Antigen binden, können synthetische Peptide, die die CDR-Sequenzen enthalten, mit dem Antigen in Bin dungsassays verwendet werden, wobei jeder im Stand der Technik bekannte Bindungsassay verwendet werden kann.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Antikörperfragmente, wie beispielsweise F(ab')2-Fragmente und Fab-Fragmente bereit, ist jedoch nicht auf diese beschränkt. Antikörperfragmente, die spezifische Epitope erkennen, können mittels bekannter Verfahren hergestellt werden. F(ab')2-Fragmente bestehen aus der variablen Region, der konstanten Region der leichten Kette und der CH1-Domäne der schweren Kette und werden durch Pepsinverdau des Antikörpermoleküls hergestellt. Fab-Fragmente werden durch Reduktion der Disulfidbrücken der F(ab')2-Fragmente hergestellt. Die Erfindung stellt ferner Dimere der erfindungsgemäßen Antikörper aus schwerer Kette und leichter Kette, oder ein beliebiges minimales Fragment derselben, wie beispielsweise Fvs oder einzelsträngige Antikörper (SCAs) (wie z.B. in US-Patent 4,946,778; Bird, 1988, Science 242: 423–42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879–5883; und Ward et al., 1989, Nature 334: 544–54 beschrieben), oder ein beliebiges anderes Molekül mit derselben Spezifität wie der erfindungsgemäße Antikörper bereit. Einzelketten-Antikörper werden durch Verbinden der Fragmente der Fv-Region von schwerer und leichter Kette über eine Aminosäurebrücke gebildet, was zu einem einzelsträngigen Polypeptid führt. Es können Methoden für den Zusammenbau von funktionellen Fv-Fragmenten in E. coli verwendet werden (Skerra et al., 1988, Science 242: 1038–1041).
  • Gemäß weiterer Ausführungsformen stellt die Erfindung Fusionsproteine der erfindungsgemäßen Immunglobuline (oder funktionell aktive Fragmente derselben) bereit, in denen beispielsweise das Immunglobulin über eine kovalente Bindung (z.B. über eine Peptidbindung) entweder an den N-Terminus oder den C-Terminus einer Aminosäuresequenz eines anderen Proteins (oder eines Teils desselben, vorzugsweise eines Teils des Proteins von mindestens 10, 20 oder 50 Aminosäuren), das nicht dem Immunglobulin entspricht, fusioniert ist. Vorzugsweise wird das Immunglobulin, oder das Fragment desselben, am N-Terminus der konstanten Region kovalent an ein anderes Protein gebunden. Wie oben erwähnt, können solche Fusionsproteine die Aufreinigung ermöglichen, die Halbwertszeit in vivo erhöhen und die Abgabe eines Antigens über eine epitheliale Barriere an das Immunsystem verstärken.
  • Die Immunglobuline, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, umfassen Analoga und Derivate, die entweder modifiziert sind, z.B. durch kovalente Anheftung irgendeiner Molekülart, solange diese kovalente Anheftung die immunspezifische Bindung nicht beeinflusst. Die Derivate und Analoga der Immunglobuline umfassen beispielsweise diejenigen, die weiter modifziert worden sind, z.B. durch Glykosylierung, Acetylierung, Pegylierung, Phosphorylierung, Amidierung, Derivatisieren durch bekannte Schutz-/Blockierungs-Gruppen, proteolytische Spaltung, Bindung an einen zellulären Liganden oder ein anderes Protein, etc), sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Jede der zahlreichen chemischen Modifikationen kann durch bekannte Verfahren ausgeführt werden, einschließlich (jedoch nicht beschränkt auf) spezifische chemische Spaltung, Acetylierung, Formylierung etc. Darüber hinaus kann das Analog oder Derivat eine oder mehrere nicht-klassische Aminosäuren umfassen.
  • Die zuvor genannten Antikörper können in Verfahren verwendet werden, die im Stand der Technik bekannt sind, und die Lokalisierung und Aktivität der erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide betreffen, z.B. solche zur Abbildung oder Szintigraphie (radioimaging) dieser Proteine, zur Messung der Mengen derselben in geeigneten physiologischen Proben, bei diagnostischen Verfahren etc. sowie zur Radiotherapie.
  • Die erfindungsgemäßen Antikörper können durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren zur Synthese von Antikörpern hergestellt werden, insbesondere durch chemische Synthese oder durch rekombinante Expression, und werden vorzugsweise durch rekombinante Expressionsverfahren hergestellt.
  • Die rekombinante Expression von Antikörpern oder Fragmenten, Derivaten oder Analoga derselben erfordert die Konstruktion einer Nukleinsäure, die für den Antikörper kodiert. Sofern die Nukleotidsequenz des Antikörpers bekannt ist, kann eine für den Antikörper-kodierende Nukleinsäure aus chemisch synthetisierten Oligonukleotiden zusammengesetzt werden (wie z.B. in Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17: 242 beschrieben), was die Synthese von überlappenden Oligonukleotiden, welche Teile der für den Antikörper kodierenden Sequenz enthalten, sowie das Anlagern und Ligieren dieser Oligonukleotide und eine nachfolgende Amplifikation der ligierten Oligonukleotide durch PCR umfasst.
  • Alternativ dazu kann die für den Antikörper kodierende Nukleinsäure durch Klonierung des Antikörpers erhalten werden. Sofern ein Klon, der eine für den bestimmten Antikörper kodierende Nukleinsäure enthält, nicht verfügbar ist, die Sequenz des Antikörpermoleküls jedoch bekannt ist, kann eine für den Antikörper kodierende Nukleinsäure aus geeigneter Quelle (z.B. einer Antikörper-cDNA-Bibliothek oder einer cDNA-Bibliothek, die ausgehend von irgendeinem Gewebe oder von Zellen, die den Antikörper exprimieren, hergestellt worden ist) durch PCR-Amplifikation unter Verwendung synthetischer Primer, die an die 3'- und 5'-Enden der Sequenz zu hybridisieren vermögen, oder durch Klonierung unter Verwendung einer Oligonukleotidsonde, die für die bestimmte Gensequenz spezifisch ist, erhalten werden.
  • Sofern ein Antikörpermolekül, das spezifisch ein bestimmtes Antigen erkennt (oder eine Quelle für eine cDNA-Bibliothek zur Klonierung einer Nukleinsäure, die für einen solchen Antikörper kodiert), nicht verfügbar ist, können Antikörper, die für ein bestimmtes Antigen spezifisch sind, durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren erzeugt werden, beispielsweise durch Immunisieren eines Tieres, wie beispielsweise eines Kaninchens, zur Erzeugung polyklonaler Antikörper, oder vorzugsweise durch Erzeugung monoklonaler Antikörper. Alternativ dazu kann ein Klon, der mindestens den Fab-Teil des Antikörpers kodiert, durch Screening von Fab-Expressions-Bibliotheken (wie z.B. in Huse et al., 1989, Science 246: 1275–1281 beschrieben) nach Klonen von Fab-Fragmenten, die das spezifische Antigen binden, oder durch Screening von Antikörper-Bibliotheken (siehe z.B. Clackson et al., 1991, Nature 352: 624; Hane et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sic. USA 94: 4937) erhalten werden.
  • Sobald eine Nukleinsäure, die für mindestens die variable Domäne des Antikörpermoleküls kodiert, erhalten wird, kann sie in einen Vektor eingebracht werden, der die für die konstante Region des Antikörpersmoleküls kodierende Nukleinsäuresequenz enthält (vgl. z.B. WO 86/05807; WO 89/01036 und US-Patent Nr. 5,122,464). Vektoren, die die vollständige leichte oder schwere Kette für die Co-Expression mit der Nukleinsäure enthalten, um die Expression eines vollständigen Antikörpermoleküls zu gewährleisten, sind ebenfalls verfügbar. Die für den Antikörper kodierende Nukleinsäure kann verwendet werden, um die Nukleotidsubstitution(en) oder -Deletion(en) einzubringen, die notwendig ist (sind), um einen oder mehrere Cystein-Reste der variablen Region, der (die) an der Disulfidbindung zwischen den Ketten beteiligt ist (sind), gegen einen Aminosäure-Rest auszutauschen der keine Sulfhydrylgruppe enthält. Solche Modifikationen können durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren zur Einbringung von spezifischen Mutationen oder Deletionen in Nukleotidsequenzen erreicht werden, beispielsweise durch chemische Mutagenese, zielgerichtete in vitro-Mutagenese (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551), auf PCR basierende Verfahren etc., wobei die Verfahren nicht auf die genannten beschränkt sind.
  • Zusätzlich können Methoden verwendet werden, die zur Herstellung von "chimären Antikörpern" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 851–855; Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604–608; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452–454) durch Spleißen von Genen eines Maus-Antikörpermoleküls von geeigneter Antigenspezifität zusammen mit Genen eines humanen Antikörpermoleküls von geeigneter biologischer Aktivität entwikkelt wurden. Wie oben beschrieben ist ein chimärer Antikörper ein Molekül, in dem verschiedene Teile von verschiedenen tierischen Spezies abgeleitet sind, wie beispielsweise diejenigen, die eine variable Region aufweisen, welche von einem mu rinen mAb abgeleitet ist, und eine konstante Region eines humanen Antikörpers, z.B. humanisierte Antikörper.
  • Sobald eine für ein Antikörpermolekül kodierende Nukleinsäure erhalten worden ist, kann der Vektor für die Produktion des Antikörpermoleküls durch rekombinante DNA-Verfahren unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Methoden hergestellt werden. Somit werden vorliegend Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide durch Expression von Nukleinsäuren beschrieben, die die Antikörpermolekül-Sequenzen enthalten. Es können dem Fachmann hinreichend bekannte Verfahren verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die für das Antikörpermolekül kodierende Sequenzen und geeignete transkriptionale und translationale Kontrollsignale enthalten. Diese Verfahren umfassen beispielsweise rekombinante in vitro-DNA-Methoden, synthetische Methoden und genetische in vivo-Rekombination. Siehe beispielsweise die Methoden, die in Sambrook et al. (1990), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) und Ausubel et al. (Hersg. 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY) beschrieben werden.
  • Der Expressionsvektor wird durch herkömmliche Methoden in eine Wirtszelle transferiert, und die transfizierte Wirtszelle wird anschließend durch herkömmliche Methoden kultiviert, um einen erfindungsgemäßen Antikörper herzustellen.
  • Bei den zur Expression eines rekombinanten, erfindungsgemäßen Antikörpers verwendeten Wirtszellen kann es sich entweder um bakterielle Zellen, wie beispielsweise Escherichia coli, oder vorzugsweise um eukaryotische Zellen handeln, insbesondere für die Expression von vollständigen rekombinanten Antikörpermolekülen. Säugetierzellen, wie beispielsweise Zellen von Ovarien des Chinesischen Hamsters (CHO) in Verbindung mit einem Vektor, wie beispielsweise dem Haupt-Promotorelement mittelfrüher Gene (major intermediate early gene promotor elememt) des humanen Cytomegalie-Virus stellen ein wirksames Expressionssystem für Antikörper dar (Foecking et al., 1986, Gene 45: 101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8: 2).
  • Eine Vielzahl von Systemen aus Wirt und Expressionsvektor kann verwendet werden, um ein erfindungsgemäßes Antikörpermolekül zu exprimieren. Solche Systeme aus Wirt und Expressionsvektor stellen Vehikel dar, durch die die kodierenden Sequenzen von Interesse hergestellt und anschließend auf gereinigt werden können. Sie stellen jedoch auch Zellen dar, die sofern sie mit geeigneten kodierenden Nukleotidsequenzen transformiert oder transfiziert sind, das erfindungsgemäße Antikörpermolekül in situ exprimieren können. Diese umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) Mikroorganismen, wie beispielsweise Bakterien (z.B. E. coli, B. subtilis), die mit rekombinanten Expressionsvektoren aus Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA transformiert sind, welche für den Antikörper kodierende Sequenzen enthalten; Hefe (z.B. Saccharomyces, Pichia), die mit rekombinanten Hefe-Expressionsvektoren transformiert ist, welche für den Antikörper-kodierende Sequenzen enthalten; Insektenzell-Systeme, die mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren (z.B. Baculovirus) infiziert sind, welche für den Antikörper kodierende Sequenzen enthalten; Pflanzenzell-Systeme, die mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren (z.B. Cauliflower Mosaik-Virus, CaMV; Tabak Mosaik-Virus, TMV) infiziert oder mit rekombinanten Plasmid-Expressionsvektoren (z.B. Ti-Plasmid) transformiert sind, welche für den Antikörper kodierende Sequenzen enthalten; oder Säugetierzell-Systeme (z.B. COS-, CHO-, BHK-, 293-, 3T3-Zellen), die rekombinante Expressionskonstrukte beinhalten, welche Promotoren enthalten, die aus dem Genom von Säugetierzellen (z.B. Metallothionin-Promotor) oder von Säugetierviren (z.B. Adenovirus Late Promotor, Vaccinia Virus 7,5K Promotor) abgeleitet sind.
  • In bakteriellen Systemen kann eine Vielzahl von Expressionsvektoren in vorteilhafter Weise in Abhängigkeit von der angestrebten Verwendung des zu exprimierenden Antikörpermoleküls ausgewählt werden. Wenn beispielsweise eine große Menge eines solchen Proteins zur Erzeugung einer ein Antikörpermolekül enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzung hergestellt werden soll, können Vektoren vorteilhaft sein, die die Expression großer Mengen von einfach zu reinigenden Fusionsprotein-Produkten steuern. Solche Vektoren umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) den E. coli-Expressionsvektor pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J 2: 1791), in dem die für den Antikörper kodierende Sequenz individuell im gleichen Leserahmen mit der für lac Z kodierenden Region in den Vektor ligiert werden kann, sodass ein Fusionsprotein erzeugt wird; pIN-Vektoren (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids. Res. 13: 3101–3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 5503–5509) und ähnliche. Es können ferner pGEX-Vektoren verwendet werden, um Fremd-Polypeptide als Fusionsproteine mit Glutathion S-Transferase (GST) zu exprimieren. Im Allgemeinen sind solche Fusionsproteine löslich und können problemlos durch Adsorption und Bindung an eine Matrix aus Glutathion-Agarose-Kügelchen (beads) und nachfolgender Elution in Gegenwart von freiem Glutathion aus lysierten Zellen gereinigt werden. Die pGEX-Vektoren sind so konstruiert, dass sie Thrombin- oder Faktor Xa-Protease-Schnittstellen enthalten, sodass das klonierte Zielgenprodukt von dem GST-Rest entfernt werden kann.
  • In einem Insektensystem wird das Autographa californica Kernpolyeder-Virus (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus; AcNPV) als Vektor verwendet, um fremde Gene zu exprimieren. Das Virus wächst in Spodoptera frugiperda-Zellen. Die für den Antikörper kodierende Sequenz kann individuell in nicht-essentielle Regionen (beispielsweise in das Polyhedrin-Gen) des Virus kloniert werden und unter Kontrolle eines AcNPV-Promotors (beispielsweise des Polyhedrin-Promotors) gebracht werden. In Säugetier-Wirtszellen kann eine Vielzahl von Expressionssystemen, die auf Viren basieren (z.B. ein Adenovirus-Expressionssystem), verwendet werden.
  • Wie oben besprochen kann ein Wirtszellstamm verwendet werden, der die Expression der insertierten Sequenzen moduliert oder das Genprodukt in bestimmter Weise modifiziert und prozessiert. Solche Modifikationen (z.B. Glykosylierung) und Prozessierung (z.B. Spaltung) der Proteinprodukte können für die Funktion des Proteins wichtig sein. Für die lang andauernde Produktion von rekombinanten Antikörpern mit hoher Ausbeute ist eine stabile Expression bevorzugt. Beispielsweise können Zelllinien produziert werden, die in stabiler Weise einen Antikörper von Interesse exprimieren, indem man Zellen mit einem Expressionsvektor transfiziert, der die Nukleotidsequenz des Antikörpers und die Nukleotidsequenz eines selektierbaren Markers (z.B. Neomycin oder Hygromycin) umfasst, und anhand der Expression des selektiverbaren Markers selektiert. Solche konstruierten Zelllinien können insbesondere beim Screening nach und bei der Beurteilung von Verbindungen, die direkt oder indirekt mit den Antikörpermolekülen interagieren, nützlich sein.
  • Das Expressionsniveau des Antikörpermoleküls kann durch Vektor-Amplifikation erhöht werden (für einen Review, vgl. Bebbington und Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3, (Academic Press, New York, 1987)). Wenn ein Marker in dem Vektor-System, das den Antikörper exprimiert, amplifizierbar ist, wird ein Ansteigen des Gehalts des in der Kultur der Wirtszelle befindlichen Inhibitors die Anzahl von Kopien des Marker-Gens erhöhen. Da die amplifizierte Region mit dem Antikörper-Gen assoziiert ist, wird sich die Produktion des Antkörpers ebenfalls erhöhen (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 257).
  • Die Wirtszelle kann mit zwei erfindungsgemäßen Expressionsvektoren co-transfiziert werden, wobei der erste Vektor für ein von einer schweren Kette abgeleitetes Polypeptid kodiert und der zweite Vektor für ein von einer leichten Kette ableiteten Polypeptid kodiert. Die beiden Vektoren können identische selektierbare Marker enthalten, die die gleichmäßige Expression der Polypeptide der schweren und leichten Kette ermöglichen. Alternativ dazu kann ein einzelner Vektor verwendet werden, der sowohl für das Polypeptid der schweren als auch für das der leichten Kette kodiert. In einer solchen Situation sollte die leichte Kette vor der schweren Kette angeordnet werden, um ein Überschuss an toxischer freier schwerer Kette zu vermeiden (Proudfoot, 1986, Nature 322: 52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci USA 77: 2197). Die kodierenden Sequenzen für die schweren und leichten Ketten können cDNA oder genomische DNA umfassen.
  • Sobald das erfindungsgemäß verwendete Antikörpermolekül rekombinant exprimiert worden ist, kann es durch jedes im Stand der Technik zur Aufreinigung eines Antikörpermoleküls bekannte Verfahren auf gereinigt werden, beispielsweise durch Chromatographie (z.B. Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, wie beispielsweise mit Protein A oder spezifischem Antigen, und "sizing column"-Chromatographie), Zentrifugation, unterschiedliche Löslichkeit oder mittels jeder anderen Standardmethode zur Aufreinigung von Proteinen.
  • Alternativ dazu kann jedes Fusionsprotein problemlos durch Benutzung eines für das zu exprimierende Fusionsprotein spezifischen Antikörpers aufgereinigt werden. Beispielsweise erlaubt ein von Janknecht et al. beschriebenes System die einfache Aufreinigung von nicht-denaturierten Fusionsproteinen, welche in humanen Zelllinien exprimiert wurden (Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972–897). In diesem System wird das betreffende Gen in ein Vaccinia-Recombinantionsplasmid subkloniert, sodass der offene Leserahmen des Gens translational an einen Amino-terminalen Anhang ("tag") aus 6 Histidinresten fusioniert wird. Der tag dient als Matrixbindungsdomäne für das Fusionsprotein. Extrakte von Zellen, die mit rekombinantem Vaccinia-Virus infiziert sind, werden auf Ni2+-Nitriloessigsäure-Agarose-Säulen geladen, und mit Histidin-tag versehene Proteine werden selektiv mit Imidazol-enthaltenden Puffern eluiert.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind erfindungsgemäße Antikörper oder Fragmente derselben an einen diagnostischen oder therapeutischen Rest konjugiert. Diese Antikörper können für die Diagnose verwendet werden, oder sie können dazu verwendet werden, um die Wirksamkeit einer gegebenen Behandlungskur zu bestimmen. Die Detektion kann durch Kopplung des Antikörpers an eine detektierbare Substanz erreicht werden. Beispiele für detektierbare Substanzen umfassen verschiedene Enzyme, prosthetische Gruppen, fluoreszente Materialien, lumineszente Materialien, biolumineszente Materialien, radioaktive Nuklide, Positronen-emittierende Metalle (zur Verwendung in der Positronen-Emissionstomographie) und nicht-radioaktive paramagnetische Metall-Ionen. Vergleiche hauptsächlich US-Patent Nr. 4,741,900 für Metall-Ionen, die an Antikörper konjugiert werden können, zur Verwendung als diagnostische Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung. Geeignete Enzyme umfassen Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, β-Galaktosidase oder Acetylcholinesterase; geeignete prosthetische Gruppen umfassen Streptavidin, Avidin und Biotin; geeignete fluoreszente Materialien umfassen Umbelliferon, Fluorescein, Fluorescein-Isothiocyanat, Rhodamin, Dichlortriazinylamin-Fluorescein, Dansylchlorid und Phycoerythrin; geeignete lumineszente Materialien umfassen Luminol; geeignete biolumineszente Materialien umfassen Luciferase, Luciferin und Aequorin und geeignete radioaktive Nuklide umfassen 125I, 131I, 111In und 90Tc.
  • Die erfindungsgemäß verwendeten Antikörper oder Fragmente derselben können an ein therapeutisches Mittel oder an einen therapeutischen Wirkstoffrest konjugiert sein, um eine gegebene biologische Antwort zu modifizieren. Das therapeutische Mittel oder der therapeutische Wirkstoffrest darf nicht dahingehend ausgelegt werden, dass er auf klassische chemische therapeutische Mittel beschränkt wäre. Beispielsweise kann ein Wirkstoffrest ein Protein oder Polypeptid sein, das eine bestimmte biologische Aktivität aufweist. Solche Proteine können beispielsweise umfassen: ein Toxin, wie beispielsweise Abrin, Ricin A, das Pseudomonas-Exotoxin oder das Diphtherie-Toxin; ein Protein, wie beispielsweise den Tumor-Nekrosefaktor, α-Interferon, β-Interferon, den Nerven-Wachstumsfaktor, den von Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor (platlet derived growth factor), den Gewebe-Plasminogenaktivator, ein thrombotisches Mittel oder ein anti-angiogenes Mittel, z.B. Angiostatin oder Endostatin; oder eine die biologische Antwort modifizierende Substanz, wie beispielsweise ein Lymphokin, Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-6 (IL-6), den Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF), den Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF), den Nervenwachstumsfaktor (NGF) oder andere Wachstumsfaktoren.
  • Methoden zum Konjugieren eines solchen therapeutischen Rests an Antikörper sind hinreichend bekannt, vgl. beispielsweise Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in: Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (Hrsg.), S. 243–56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery" in: Controlled Drug Delivery (2. Auflage), Robinson et al. (Hrsg.), S. 623–53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in: Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications; Pinchera et al. (Hrsg.), S. 475–506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic use Of Radiolabelled Antibody In Cancer Therapy" in: Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (Hrsg.), S. 303–16 (Academic Press 1985), und Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol Rev., 62: 119–58 (1982).
  • Alternativ dazu kann ein Antikörper an einen zweiten Antikörper konjugiert werden, um ein Antikörper-Heterokonjugat zu bilden, wie beispielsweise in US-Patent Nr. 4,676,980 beschrieben wird.
  • Ein Antikörper kann mit oder ohne konjugierten therapeutischen Rest als Therapeutikum verwendet werden, das allein oder in Kombination mit (einem) cytotoxischen Faktor(en) und/oder (einem) Zytokin(en) verabreicht wird.
  • Wie vorliegend besprochen, finden bestimmte Polypeptide, Nukleinsäuremoleküle und Antikörper bei der Behandlung oder Prophylaxe von Brustkrebs Verwendung. Es können pharmazeutische Formulierungen formuliert werden, die mindestens ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder Fragment desselben, ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül oder einen erfindungsgemäßes Antikörper umfassen, das (der) in pharmazeutischen Formulierungen verwendbar ist, wahlweise zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Arzneistoffträgern, Trägern oder Verdünnungsmitteln. Die pharmazeutische Formulierung dient vorzugsweise zur Verwendung als Impfstoff, und somit sind alle zusätzliche Komponenten im Hinblick auf. die Verwendung in Impfstoffen akzeptabel. Darüber hinaus wird es dem Fachmann bewußt sein, dass solchen Impfstoff-Zubereitungen ein oder mehrere geeignete Adjuvantien zugesetzt werden können.
  • Das Medikament wird üblicherweise als Teil einer sterilen, pharmazeutischen Zusammensetzung geliefert werden, die üblichweise einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen wird. Diese pharmazeutische Zusammensetzung kann in jeder geeigneten Form vorliegen (abhängig von dem gewünschten Verfahren der Verabreichung an einen Patienten).
  • Sie kann in Einheits-Dosierungs-Form bereitgestellt werden; im Allgemeinen wird sie in einem verschlossenen Behälter bereitgestellt und kann darüber hinaus als Teil eines Kits bereitgestellt werden. Ein solches Kit würde normalerweise (jedoch nicht zwangsweise) Gebrauchsanweisungen umfassen. Es kann eine Vielzahl der Einheits-Dosierungs-Formen umfassen.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung kann an die Verabreichung über einen beliebigen, geeigneten Weg angepasst sein, beispielsweise an die Verabreichung über den oralen (einschließlich bukkalen und sublingualen), rektalen, nasalen, topischen (einschließlich bukkalen, sublingualen oder transdermalen), vaginalen oder parenteralen (einschließlich subkutanen, intramuskulären, intravenösen oder intradermalen) Weg. Solche Zusammensetzungen können durch jedes im Stand der Technik auf dem Gebiet der Pharmazie bekannte Verfahren hergestellt werden, beispielsweise durch Mischen der Wirkstoffe mit dem (den) Träger(n) oder dem (den) Arzneistoffträger(n) unter sterilen Bedingungen.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, die an eine orale Verabreichung angepasst sind, können als einzelne Einheiten, wie beispielsweise als Kapseln oder Tabletten; als Puder oder Körn chen, als Lösungen, Sirups oder Suspensionen (in wässrigen oder nicht-wässrigen Flüssigkeiten; oder als eßbare Schäume oder Aufschäumung; oder als Emulsionen) vorliegen.
  • Geeignete Arzneistoffträger für Tabletten oder Hartgelatine-Kapseln umfassen Lactose, Maisstärke oder Derivate derselben, Stearinsäure oder Salze derselben.
  • Geeignete Arzneistoffträger zur Verwendung mit Weichgelatinekapseln umfassen beispielsweise pflanzliche Öle, Wachse, Fette, halbfeste Substanzen oder flüssige Polyole etc.
  • Zur Herstellung von Lösungen und Sirups können die verwendbaren Arzneiträgerstoffe beispielsweise Wasser, Polyole und Zukker umfassen. Zur Herstellung von Suspensionen können Öle (z.B. pflanzliche Öle) verwendet werden, um Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Suspensionen bereitzustellen.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen die an eine transdermale Verabreichung angepasst sind, können als einzelne Pflaster vorliegen, die für einen längeren Zeitraum im engen Kontakt mit der Epidermis des Empfängers verweilen sollen. Beispielsweise kann der Wirkstoff aus dem Pflaster durch Iontophorese bereitgestellt werden, wie allgemein in Pharmaceutical Research, 3(6): 318 (1986) beschrieben wird.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, die an eine topische Verabreichung angepasst sind, können als Salben, Cremes, Suspensionen, Lotionen, Puder, Lösungen, Pasten, Gele, Sprays, Aerosole oder Öle formuliert sein. Bei Infektionen des Auges oder anderer externer Gewebe, z.B. des Mundes oder der Haut, werden die Zusammensetzungen vorzugsweise als topische Salbe oder Creme angewendet. Wenn der Wirkstoff in einer Salbe formuliert ist, kann er entweder mit einer paraffinartigen oder wassermischbaren Salbengrundlage verwendet werden. Alternativ dazu kann der Wirkstoff in einer Creme mit einer Öl-in-Wasser-Cremegrundlage oder einer Wasser-in-Öl-Grundlage formuliert sein. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die an eine topische Verabreichung an das Auge angepasst sind, umfassen Augentropfen, wobei der Wirkstoff in einem geeigneten Träger, insbesondere in einem wässrigen Lösungsmittel, gelöst oder suspendiert ist. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die an eine topische Verabreichung in den Mund angepasst sind, umfassen Lutschtabletten, Pastillen oder Mundspül-Lösungen.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, die an eine rektale Verabreichung angepasst sind, können als Zäpfchen oder Einläufe vorliegen.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, die an eine nasale Verabreichung angepasst sind, und in denen der Träger ein Feststoff ist, umfassen einen groben Puder mit einer beispielhaften Partikelgröße im Bereich von 20 bis 500 μm, der geschnupft wird, z.B. durch schnelle Inhalation durch den Nasenkanal aus einem Puderbehälter der dicht an die Nase gehalten wird. Geeignete Zusammensetzungen, bei denen der Träger eine Flüssigkeit ist, und die als Nasenspray oder Nasentropfen verabreicht werden, umfassen wässrige Lösungen oder Öl-Lösungen des Wirkstoffs.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, die an eine Verabreichung durch Inhalation angepasst sind, umfassen Feinpartikelstäube oder -Nebel, die durch verschiedene Arten von Messdosierungs- Druckaerosolen, Zerstäubern oder Insufflations-Vorichtungen (isufflators) erzeugt werden können.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, die an eine vaginale Verabreichung angepasst sind, können als Pessarien, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Spray-Formulierungen vorliegen.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, die an eine parenterale Verabreichung angepasst sind, umfassen: wässrige und nichtwässrige sterile Injektionslösungen, die Antioxidantien, Puffer, bakteriostatische Substanzen und gelöste Stoffe, welche die Formulierung im wesentlichen isotonisch in Bezug auf das Blut des angestrebten Patienten machen, enthalten können; sowie wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen, die suspendierende Mittel und Verdickungsmittel enthalten können. Arzneiträgerstoffe, die für injizierbare Lösungen verwendet werden können, umfassen beispielsweise Wasser, Alkohole, Polyole, Glycerin und pflanzliche Öle. Die Zusammensetzungen können in Einheits-Dosierungs- oder Multi-Dosierungs-Behältern, beispielsweise in geschlossenen Ampullen und Fläschchen, vorliegen und können gefriergetrocknet (lyophilisiert) gelagert werden, sodass lediglich die Zugabe von steriler Flüssigkeit, (z.B. Wasser) unmittelbar vor Verwendung als Injektion erforderlich ist. Extemporierte Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pudern, Körnchen und -Tabletten hergestellt werden.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können Konservierungsmittel, lösungsfördernde Mittel, stabilisierende Mittel, Befeuchtungsmittel, Emulgatoren, Süßstoffe, Färbemittel, Duft stoffe, Salze (die erfindungsgemäßen Substanzen können ihrerseits in Form eines pharmazeutisch verträglichen Salzes bereitgestellt werden), Puffer, Beschichtungsmittel oder Antioxidantien enthalten. Sie können darüber hinaus zusätzlich zu der erfindungsgemäßen Substanz therapeutisch aktive Mittel umfassen.
  • Die Dosierungen der erfindungsgemäßen Polypeptide, Nukleinsäure oder Antikörper können in weiten Grenzen variieren, abhängig von der zu behandelnden Krankheit oder Störung, dem Alter und dem Zustand des zu behandelnden Individuums etc; ein Arzt wird letztlich die geeigneten, zu verwendenden Dosierungen bestimmen. Diese Dosierung kann so oft wie angemessen wiederholt werden. Sofern sich Nebenwirkungen entwickeln, kann die Menge und/oder die Häufigkeit der Dosierung im Einklang mit der normalen klinischen Praxis reduziert werden.
  • Im Hinblick auf die Bedeutung von BCMP 7 bei Brustkrebs bildet das nachstehend aufgeführte zusätzliche Aspekte der vorliegenden Erfindung:
    • i) ein Screening-Verfahren nach Verbindungen, die die Expression eines erfindungsgemäß verwendeten Polypeptids modulieren, d.h. hochregulieren oder herunterregulieren, wobei das Verfahren den Schritt der Bestimmung des Vorhandenseins oder Fehlens und/oder des Quantifizierens von mindestens einem erfindungsgemäßen Polypeptid oder Antikörper in einer biologischen Probe umfasst;
    • ii) ein Verfahren zum Verfolgen/Beurteilen einer Brustkrebsbehandlung in einem Patienten, das den Schritt der Bestimmung des Vorhandenseins oder Fehlens und/oder des Quantifizierens von mindestens einem erfindungsgemäß verwendeten Polypeptid in einer biologischen Probe, die von dem Patienten erhalten wurde, umfasst;
    • iii) Verfahren zur Identifizierung metastatischer Brustkrebszellen in einer biologischen Probe, die von einem Subjekt erhalten wurde, wobei das Verfahren den Schritt der Bestimmung des Vorhandenseins oder Fehlens und/oder des Quantifizierens von mindestens einem erfindungsgemäßen Polypeptid umfasst;
    • iv) Verfahren zur Behandlung von Brustkrebs, das das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung umfasst, welche die Expression oder die biologische Aktivität (oder beides) eines wie vorliegend definierten Polypeptids in einem Patienten mit Brustkrebs moduliert (z.B. hochreguliert oder herunterreguliert) oder komplementiert, um (a) den Beginn oder die Entwicklung von Brustkrebs zu verhindern; (b) das Fortschreiten von Brustkrebs zu verhindern; oder (c) die Symptome von Brustkrebs zu mildern.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die biologische Probe von einer beliebigen Quelle erhalten werden, wie beispielsweise eine Serumprobe oder eine Gewebeprobe, z.B. Brustgewebe. Wenn nach einem Beweis für Metastasen gesucht wird, würde man auf die hauptsächlichen Stellen der Brustmetastase schauen, wie beispielsweise Lymphknoten, Leber, Lunge und/oder Knochen.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird das Brustgewebe eines Subjekts auf die quantitative Detektion eines wie vorliegend definierten Polypeptids analysiert, wobei eine Veränderung der Menge des Polypeptids im Brustgewebe des Subjekts im Verhältnis zu Brustgewebe von einem Subjekt oder von Subjekten, die frei von Brustkrebs sind (z.B. zu einer Kontrollprobe oder einem zuvor bestimmten Referenzbereich) auf das Vorliegen von Brustkrebs hindeutet.
  • Die Erfindung stellt ferner diagnostische Kits bereit, die einen Antikörper gegen ein wie vorliegend definiertes Polypeptid umfassen. Zusätzlich kann ein solches Kit wahlweise eine oder mehrere der nachfolgenden Dinge umfassen: (1) Anweisungen zur Verwendung des Antikörpers bei der Diagnose, Prognose, dem therapeutischen Verfolgen oder einer beliebigen Kombination dieser Anwendungen; (2) einen markierten Bindungspartner für den Antikörper; (3) eine feste Phase (wie beispielsweise ein Reagenzstreifen), auf der der Antikörper immobilisiert ist; und (4) eine Markierung oder Beilage, die auf die behördliche Zulassung für diagnostische, prognostische oder therapeutische Verwendung oder eine beliebige Kombination derselben hinweist. Sofern kein markierter Bindungspartner zu dem Antikörper bereitgestellt wird, kann der Anti-Polypeptid-Antikörper selbst mit einem detektierbaren Marker markiert sein, z.B. mit einem chemilumineszenten, enzymatischen, fluoreszenten oder radioaktiven Rest.
  • Die Erfindung stellt ferner ein Kit bereit, das eine Nukleinsäure-Sonde umfasst, die in der Lage ist, mit RNA zu hybridisieren, die für ein wie vorliegend definiertes Polypeptid kodiert. Gemäß einer spezifischen Ausführungsform umfasst ein Kit in einem oder in mehreren Behältern ein Primer-Paar (z.B. jeder im Größenbereich von 6 bis 30 Nukleotiden, mehr bevorzugt 10 bis 30 Nukleotiden und noch mehr bevorzugt 10 bis 20 Nukleotiden), das unter geeigneten Reaktionsbedingungen der Amplifikation von mindestens einem Teil einer Nukleinsäure, die für ein wie vorliegend definiertes Polypeptid kodiert, als Ausgangspunkt dienen kann, wie beispielsweise durch Polymerasekettenreaktion (vgl. z.B. Innis et al., 1990, PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego, CA), Ligasekettenreaktion (vgl. EP 320 308 ), Verwendung von Qβ-Replicase, zyklische Sondenreaktion und andere im Stand der Technik bekannte Verfahren.
  • Die Erfindung stellt Verfahren zur Identifizierung von Mitteln, Kandidaten-Verbindungen oder Test-Verbindungen bereit, die an ein wie vorliegend definiertes Polypeptid binden oder eine stimulatorische oder inhibitorisch Wirkung auf die Expression oder Aktivität eines wie vorliegend definierten Polypeptids ausüben.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner Assays zur Verwendung bei der Wirkstoffsuche bereit, um die Wirksamkeit von Verbindungen bei der Behandlung oder Prävention von Brustkrebs zu identifizieren oder zu verifizieren. Testverbindungen können auf ihre Fähigkeit untersucht werden, die Mengen eines wie vorliegend definierten Polypeptids in einem Subjekt mit Brustkrebs zu modulieren. Verbindungen, die in der Lage sind, die Mengen eines wie vorliegend definierten Polypeptids in einem Subjekt mit Brustkrebs dahingehend zu modulieren, dass sie Mengen entsprechen, die in Subjekten gefunden werden, die frei von Brustkrebs sind, oder ähnliche Veränderungen in experimen tellen Tiermodellen für Brustkrebs hervorrufen, können als Leitverbindungen für die weitere Wirkstoffentwicklung verwendet werden oder therapeutische Anwendung finden. Die Expression eines wie vorliegend definierten Polypeptids kann beispielsweise durch Immunassays, Gelelektrophorese gefolgt von Visualisierung, Detektion der Aktivität oder mit jeder anderen Methode untersucht werden, die vorliegend gelehrt wird oder dem Fachmann bekannt ist. Solche Assays können bei der Suche nach Kandidaten-Wirkstoffen, bei der klinischen Überwachung oder bei der Wirkstoffentwicklung verwendet werden, wo die Menge eines wie vorliegend definierten Polypeptids als Surrogatmarker für eine klinische Erkrankungen dienen kann.
  • Die Erfindung stellt ferner neuartige Mittel bereit, die mittels des oben beschriebenen Screening-Assays identifiziert wurden, sowie Verwendungen derselben bei der wie vorliegend beschriebenen Behandlung. Zusätztlich stellt die Erfindung ferner die Verwendung eines Mittels, das mit einem wie vorliegend definierten Polypeptid interagiert oder die Aktivität eines wie vorliegend definierten Polypeptids moduliert, bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Brustkrebs bereit.
  • Die Erfindung ermöglicht durch Verabreichung einer therapeutischen Verbindung die Behandlung oder Prävention von verschiedenen Erkrankungen oder Störungen. Solche Verbindungen umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf): ein wie vorliegend definiertes Polypeptid sowie Analoga und Derivate (einschließlich Fragmente) derselben; Antikörper dagegen; Nukleinsäuren, die für ein wie vorliegend definiertes Polypeptid kodieren, Analoga oder Derivate; Antisense-Nukleinsäuren gegen ein Gen, das für ein wie vorliegend definiertes Polypeptid kodiert, sowie Agonisten und Antagonisten eines Gens, das für ein wie vorliegend definiertes Polypeptid kodiert, oder Agonisten und Antagonisten eines wie vorliegend definierten Polypeptids. Ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Identifizierung eines Gens, das für ein wie vorliegend definiertes Polypeptid kodiert, welches am Brustkrebs beteiligt ist. Brustkrebs kann durch Verabreichung einer therapeutischen Verbindung, die die Funktion oder Expression eines wie vorliegend definierten Polypeptids im Brustgewebe des Brustkrebspatienten moduliert, behandelt oder verhindert werden.
  • Gemäß einer Ausführungsform werden ein oder mehrere Antikörper, von denen jeder spezifisch an ein wie vorliegend definiertes Polypeptid bindet, allein oder in Kombination mit einem oder mehreren zusätzlichen therapeutischen Verbindungen oder Behandlungen verabreicht. Beispiele solcher Behandlungen umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) Taxol, Cyclophosphamid, Tamoxifen und Doxorubacin.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) jede Verbindung, z.B. ein kleines organisches Molekül, ein Protein, ein Peptid, ein Antikörper, eine Nukleinsäure etc., die das Profil ungefähr normal erhält, unter der Voraussetzung, dass solche Verbindungen oder Behandlungen Taxol, Cyclophosphamid, Tamoxifen und Doxorubacin umfassen, jedoch nicht auf diese beschränkt sind.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform können Symptome des Brustkrebses durch Verringerung der Mengen oder der Aktivität eines wie vorliegend definierten Polypeptids durch Verwendung von Gensequenzen, die für ein wie vorliegend definiertes Polypeptide kodieren, in Verbindung mit hinreichend bekannten Gen-"knock-out"-, Ribozym- oder Tripel-Helix-Verfahren zur Verringerung Genexpression des Polypeptids, gemildert werden. In diesem Ansatz werden Ribozym- oder Tripel-Helix-Moleküle verwendet, um die Aktivität, Expression oder Synthese des Gens zu modulieren und somit die Symptome von Brustkrebs zu mildern. Solche Moleküle können dazu ausgestaltet sein, die Expression eines mutierten oder nicht-mutierten Ziel-Gens zu reduzieren oder zu inhibieren. Methoden zur Herstellung und Verwendung solcher Moleküle sind dem Fachmann hinreichend bekannt.
  • Eine endogene Polypeptidexpression kann ferner durch Inaktivierung oder "knock out" des für das Polypeptid kodierenden Gens oder des Promotors eines solchen Gens mittels zielgerichteter homologer Rekombination verringert werden (vgl. beispielsweise Smithies, et al., 1985, Nature 317: 230–234; Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51: 503–512; Thompson et al., 1989, Cell 5: 313–321; und Zijlstra et al., 1989, Nature 342: 435–438). Es kann beispielsweise ein mutiertes Gen, das für ein nicht-funktionelles Polypeptid kodiert (oder eine vollständig unverwandte DNA-Sequenz), und von DNA flankiert ist, welche homolog zu dem endogenen Gen (entweder zu der kodierenden Region oder der regulatorischen Regionen des Gens, das für das Polypeptid kodiert) ist, mit oder ohne einen selektierbaren Marker und/oder einen negativ selektierbaren Marker verwendet werden, um Zellen zu transfizieren die das Ziel-Gen in vivo exprimieren. Die Insertion des DNA-Konstrukts über zielgerichtete homologe Rekombination führt zur Inaktivierung des Ziel-Gens. Solche Ansätze sind insbesondere auf dem Gebiet der Landwirtschaft geeignet, wo Modifikationen an ES (embryonalen Stamm zellen) verwendet werden können, um tierische Nachkommen mit einem inaktiven Ziel-Gen zu erzeugen (z.B. siehe Thomas & Capecchi, 1987, und Thompson, 1989, oben aufgeführt). Dieser Ansatz kann an die Verwendung bei Menschen angepasst werden, vorausgesetzt, dass die rekombinanten DNA-Konstrukte unmittelbar verabreicht oder in vivo unter Verwendung geeigneter viraler Vektoren zielgerichtet an die erforderliche Stelle gebracht wird.
  • Es wurde festgestellt, dass BCMP 7 in Prostatakrebs-Zelllinien stark exprimiert wird. Daher lässt sich BCMP 7 in gleicher Weise wie oben im Zusammenhang mit Brustkrebs besprochen auch auf Prostatakrebs anwenden.
  • Bevorzugte Merkmale eines jeden Aspekts der Erfindung gelten entsprechend für jeden anderen Aspekt. Die vorliegend erwähnten Dokumente aus dem Stand der Technik sind im stärksten vom Gesetz erlaubten Ausmaß eingeschlossen.
  • Beispiele
  • Die Erfindung wird nunmehr mit Bezug auf die nachfolgenden Beispiele beschrieben, die nicht dahingehend verstanden werden sollten, dass sie den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränken. Die Beispiele beziehen sich auf die Figuren, in denen:
  • 1 die Nukleotidsequenz und die vorausgesagte Aminosäuresequenz von BCMP 7 zeigt. Die vorausgesagte N-terminale Signalsequenz ist unterstrichen. Massenspektren, die dem vorher gesagten Protein zugewiesen sind, sind fett und unterstrichen dargestellt. Tandem-Massenspektren sind fett und kursiv dargestellt; und
  • 2 die Gewebeverteilung von BCMP 7-mRNA zeigt. Die Mengen von mRNA in normalen Geweben und in Brustkarzinom- und Prostatakarzinom-Zelllinien wurden mittels Echtzeit- (real time) RT-PCR quantifiziert. Die mRNA-Mengen werden als Anzahl Kopien ng–1 cDNA ausgedrückt.
  • 3 die Expression von BCMP 7 in angepassten (matched) normalen Geweben und in Tumor-Brustgeweben zeigt. Die BCMP 7-mRNA-Mengen in angepassten (matched) normalen Geweben und Tumorgeweben von 7 Brustkrebs-Patienten wurden mittels Echtzeit- (real time) RT-PCR gemessen. Die mRNA-Mengen werden als Anzahl Kopien ng–1 cDNA ausgedrückt.
  • Beispiel 1: Identifizierung und Klonierung von BCMP 7
  • Die Brustkarzinom-Zellline T-47D wurde in DMF12-Medien kultiviert, die mit 10% fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin, 1% Penicillin und 1% Streptomycin supplementiert waren. Die Zellen wurden bei 37°C in einer angefeuchteten Atmosphäre von 95% Luft und 5% Co2 angezüchtet.
  • 108 Zellen wurden durch Trypsinisierung und Zentrifugation geerntet und dazu verwendet, Membranproteine für die Trennung durch 1D-PAGE herzustellen (Bennett, J. P., Techniques in lipid and membrane biochemistry, Holland: Elsevier, (1982); Fujiki, Y., Fowler, S., Shio, H., Hubbard, A. L. & Lazarow, P. B. Polypeptide and phospholipid composition of the membrane of rat liver peroxisomes: comparison with endoplasmic reticulum and mitochondrial membranes. J. Cell. Biol. 93, 103–110 (1982). Nach Beschallung der geernteten Zellen (MSE Soniprep 150, Sonde mit flachem Boden (flat bottom probe) für 10 Sekunden bei einer Amplitude von 5 μm) wurde das Zellhomogenisat bei 4°C und 1000 × g für 10 Minuten zentrifugiert. Die Zellmembranen wurden durch Zentrifugation des Überstandes bei 4°C und 100000 × g für 1 Stunde sedimentiert, und das Pellet wurde durch Zentrifugation in 1 M NaCl gewaschen.
  • Die Membranproteine wurden durch Homogenisieren in Tx114-Detergens (50 M Tris HCl, 0,2 mM EDTA, 1,5% Tx114) (pH 7,4) solubilisiert, und die Proteinmischung wurde bei 13000 × g für 3 Minuten zentrifugiert, gefolgt von der Extraktion der löslichen Fraktion mit einer Mischung aus Methanol und Chloroform (Boyd, R. S., Duggan, M. J., Shone, C. C. & Foster, K. A. The effect of botulinum neurotoxins on the release of insulin from the insulinoma cell lines HIT-15 and RINm5F. J. Biol. Chem. 270, 18216–18218 (1995)). Die extrahierte Proteinprobe wurde schließlich in 1D Lysispuffer solubilisiert, und die Proteine wurden durch 1D PAGE getrennt.
  • Massenspekrometrie
  • Proteine, die aus dem 1D-Gel ausgeschnitten worden waren, wurden mit Trypsin verdaut und durch MALDITOF-MS (Voyager STR, Applied Biosystems) unter Verwendung eines Lasers mit einer Wellenlänge von 337 nm für die Desorptions- und Reflektions-Untersuchungsart analysiert. Zwei ausgewählte Massen für BCMP 7 ([M + H] = 1293.7 und 1268.6) wurden durch Tandem-Massenspektrometrie unter Verwendung eines QTOF-MS weiter un tersucht, das mit einer Nanospray-Ionenquelle ausgestattet war (Micromass UK Ltd.). Vor der MALDI-Analyse wurden die Proben von Salz befreit und unter Verwendung von C18 Zip TipsTM (Millipore) auf konzentriert. Die Proben für die Tandem-MS wurden unter Verwendung eines nano-LC-Systems (LC Packings) aufgereinigt, welches C18 SPE-Material eingebaut enthielt.
  • Die uninterpretierten Tandem-Massenspektren von tryptischen Peptiden wurden unter Verwendung des SEQUEST-Rechercheprogramms untersucht (Eng et al., 1994, J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 5: 976–989), Version v.C.1. Die Kriterien für die Datenbankidentifizierung umfassten: die Spaltungsspezifität von Trypsin; den Nachweis einer Folge von a-, b- und y-Ionen in Peptiden, die von der Datenbank wiedergegeben wurden, und eine Massenerhöhung für alle Cysteinreste bedingt durch die Carbamidomethylierung. Die durchsuchte Datenbank war eine Datenbank, die durch Proteineinträge in die nicht-redundante Datenbank erstellt wurde, die vom National Centre for Biotechnology Information (NCBI) unterhalten wird und unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. zugänglich ist.
  • Es wurde herausgefunden, dass drei Spektren des Proteins BCMP 7 (zwei Tandem-Spektren, Tabelle 1, und ein MALDI-Massenspektrum, 1) den folgenden mRNA-Einträgen entsprachen: Zugriffsnummer (accession number) AF007791, AF038451 bei http:www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/, die einen offenen Leserahmen (ORF) von 175 Aminosäuren definieren (1).
  • Tabelle 1. Aminosäuresequenzinformation, die durch Tandem-Massenspektrometrie-Analyse von BCMP 7 erhalten wurde
    Figure 00680001
  • Ein Klon vollständiger Länge wurde durch PCR von cDNA aus dem Dickdarm amplifiziert (1).
  • Gesamt-RNA-Präparation und cDNA-Synthese
  • Gesamt-RNA wurde aus kultivierten Zellen und Gewebeproben unter Verwendung des Trizol-Reagenz (Life Technologies) gemäß den Anweisungen des Herstellers präpariert und in RNAse-freiem Wasser in einer Konzentration von 1 μg/ml resuspentiert. 1 bis 5 μg Gesamt-RNA wurden als Matrize für die cDNA-Synthese verwendet, wobei ein oligo-dT-Primer und das Superscript II-Reverse Transkriptions-Kit (Life Technologies) verwendet wurden. Die cDNAs wurden mit Säulen gereinigt (Qiagen) und bei einer Konzentration von 10 ng/μl eluiert.
  • Klonierung von BCMP 7-cDNA
  • Der vorhergesagte offene Leserahmen (ORF) von BCMP 7 vollständiger Länge wurde durch PCR von cDNAs aus dem Dickdarm unter Verwendung der nachfolgenden Primer amplifiziert:
  • Figure 00680002
  • (Restriktionstellen sind fett dargestellt, nicht-homolog zu BCMP 7-Sequenzen). Die Reaktionen enthielten 10 ng cDNA und Reagenzien für die PCR (Qiagen). Die nachfolgenden Zyklusparameter wurden verwendet: 40 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 50°C für 30 Sekunden, 72°C für 30 Sekunden. Die PCR-Produkte wurden mittels Säulen gereinigt (Qiagen), in einen T/A-Vektor (Invitrogen) kloniert, und die Nukleotidsequenz wurde anschließend verifiziert (University of Oxford, Sequencing Facility, UK).
  • Das vorhergesagte BCMP 7 Protein ist zu 100% identisch mit hAG-2, einem neuen humanen Protein, das von einer cDNA kodiert wird, die aus der MCF-7 Brustkrebs-Zelllinie kloniert wurde (Thompson, D. A. & Weigel, R. J., hAG-2, the human homologue of the Xenopus laevis cement gland gene XAG-2, is co-expressed with estrogen receptor in breast cancer cell lines. Biochem. Biophys, Res. Commun. 251, 111–116 (1998)). hAG-2 ist das humane Homolog von XAG-2, einem Xenopus laevis-Protein, das während der Froschentwicklung in der Zement-Drüse exprimiert wird (Aberger, F., Weidinger, G., Grunz, H. & Richter, K. Anterior specification of embryonic ectoderm: the role of the Xenopus cement glang-specific gene XAG-2. Mech. Dev. 72, 115–130 (1998)).
  • Es wird vorausgesagt, das BCMP 7 ein extrazelluläres Protein mit einer N-terminalen Signalsequenz ist (http://psort.nibb.ac.jp.) (1).
  • Beispiel 2: Expression von BCMP 7-mRNA in humanen Geweben
  • Wir verwendeten eine quantitative Echtzeit-(real time) RT-PCR (Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J. & Williams, P. M. Real Time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986–994 (1996); Morrison, T. B., Weis, J. J. & Wittwer, C. T. Quantification of lowcopy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification. Biotechniques 24, 954–958 (1998), um die Verteilung von BCMP 7-mRNA innerhalb der mRNAs zu analysieren, die aus normalem humanem Gewebe (Clontech), aus Brust- sowie Prostatakrebs-Zelllinien (2), aus normalem Brustgewebe, das von kosmetischen Reduktions-Mammoplastiken stammte, sowie aus kanzerösem Brustgewebe, das aus einem chirurgischen Eingriff erhalten wurde (3). Die ethische Zulassung für die normalen und die kanzerösen Brustproben wurden von der Chirurgie erhalten (Oxford, UK). Primer, die für die PCR verwendet wurden, waren die folgenden:
  • Figure 00700001
  • Die Reaktionen, die 10 ng wie oben beschrieben präparierte cDNA, SYBR Green Sequenz-Detektions-Reagenzien (PE Biosystems) sowie Sense- und Antisense-Primer enthielten, wurden mit einem ABI7700-Sequenz-Detektionssystem (PE Biosystems) untersucht. Die PCR-Bedingungen waren: 1 Zyklus bei 50°C für 2 Minuten, 1 Zyklus bei 95°C für 10 Minuten und 40 Zyklen bei 95°C für 15 Sekunden, 60°C für 1 Minute. Die Akkumulation des PCR-Produktes wurde in Echtzeit (real time) als Steigerung der SYBR Green-Fluoreszenz gemessen, und die Daten wurden unter Verwendung des Sequenzdetektorprogramms v1.6.3 (PE Biosystems) analysiert. Standardkurven, die die anfängliche Matrizen-Kopienzahl in Beziehung zu der Fluoreszenz und zu den Amplifikationszyklen setzen, wurden unter Verwendung des amplifizierten PCR-Produkts als Matrize erzeugt und dazu verwendet, die BCMP 7-Kopienzahl in jeder Probe zu berechnen.
  • Die höchsten BCMP 7-Expressionsniveaus wurden im Dickdarm beobachtet, niedrigere Expressionsniveaus in den Brustdrüsen, in der Prostata, in der Speicheldrüse, im Dünndarm, im Magen und in der Trachea (2). BCMP 7-mRNA wurde ferner in T-47D-Zellen detektiert, die im Rahmen dieser Studie als Quelle für das BCMP 7-Proteins verwendet wurden, und die Expression dieser Zelllinie war im Vergleich zu normalem Brustgewebe erhöht. BCMP 7-mRNA wurde ferner in den Prostatakrebs-Zelllinien PC3 und PC3M detektiert: die Expression in PC3-Zellen war im Verhältnis zur normalen Prostata erhöht. Geringe oder keine BCMP 7-mRNA wurde in anderen Zelllinien oder in normalen untersuchten Geweben nachgewiesen.
  • Um zu untersuchen, ob sich die beobachtete Erhöhung der BCMP 7-Expression in einigen Brustkarzinomlinien auch in klinischen Proben widerspiegelt, haben wir ferner die Expression von mRNA in angepassten (matched) normalen Proben und in Tumorgewebeproben von 7 Brustkrebspatienten gemessen (3). Die BCMP 7-Expression war in 6 der 7 Tumorproben im Verhältnis zu ihren angepassten (matched) normalen Proben erhöht, wobei 4 der Proben eine mehr als 4-fache Erhöhung der Expression aufwiesen. Diese Beobachtungen legen nahe, dass dieses Protein Potential als therapeutisches Ziel hat.
  • Es wurde gezeigt, dass die hAG-2 Expression mit der Expression des ER einhergeht, und die hAG-2-mRNA-Mengen in MCF7-Zellen erhöhten sich, sobald die Zellen mit Estradiol behandelt werden (Thompson und Weigel, siehe oben). Im Einklang mit diesen Daten wurde BCMP 7-mRNA in ER-positiven T-47D-Zellen nachgewiesen, hingegen wurde keine Expression in den ER-negativen Zelllinien CAL51, BT20 und MDA-MB-468 beobachtet (2).
  • Chromosomale Lokalisation
  • Bei einer Blast-Recherche mit der BCMP 7-cDNA-Sequenz (1) in einer humanen genomischen Datenbank wurde herausgefunden, dass der Genbank-Eintrag AC073333 das gesamte BCMP 7-Gen enthielt. AC073333 enthält Sequenzen vom humanen Chromosom Nr. 7. Das BCMP 7-Gen wurde ferner in chr7p21.3 lokalisiert (Petek, E., Windpassinger, C., Egger, H., Kroisel, P. M. & Wagner, K. Localization of the human anterior gradient-2 gene (AGR2) to chromsome 7p21.3 by radiation hybrid mapping and fluorescence in situ hybridisation. Cytogenet. Cell. Genet. 89, 141–142 (2000)).
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00730001
  • Figure 00740001
  • Figure 00750001
  • Figure 00760001
  • Figure 00770001

Claims (15)

  1. Verfahren zum Screening nach und/oder zur Diagnose von Brustkrebs in einem Subjekt, das den Schritt des Detektierens und/oder des Quantifizierens der Menge eines Polypeptids in einer biologischen Probe umfasst, welche von dem Subjekt erhalten wurde, wobei das Polypeptid: a) aus der in 1 (SEQ ID NO: 8) gezeigten Aminosäuresequenz besteht oder diese umfasst; b) ein Derivat mit einer oder mehreren Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen oder -Insertionen in Bezug auf die in 1 (SEQ ID NO: 8) gezeigte Aminosäuresequenz ist; oder c) ein Fragment eines wie oben in a) oder b) definierten Polypeptids ist, das mindestens 10 Aminosäuren lang ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Polypeptid: a) aus der in 1 (SEQ ID NO: 8) gezeigten Aminosäuresequenz besteht; oder b) ein Derivat mit einer Aminosäuresequenzidentität von mindestens 90% zu der in 1 (SEQ ID NO: 8) gezeigte Aminosäuresequenz ist.
  3. Verwendung von mindestens einem wie in Anspruch 1 oder 2 definierten Polypeptid bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung bei der Prophylaxe und/oder bei der Behandlung von Brustkrebs.
  4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament ein Impfstoff ist.
  5. Verfahren zum Screening nach und/oder zur Diagnose von Brustkrebs in einem Subjekt, das den Schritt des Detektierens und/oder des Quantifizierens der Menge einer Nukleinsäure in einer biologischen Probe umfasst, welche von dem Subjekt erhalten wurde, und wobei das Nukleinsäure-Molekül: a) aus der in 1 (SEQ ID NO: 7) gezeigten DNA-Sequenz oder ihrem RNA-Äquivalent besteht oder dieses) umfasst oder; b) eine Sequenz aufweist, die komplementär zu den Sequenzen von a) ist; c) eine Sequenz aufweist, die für das gleiche Polypeptid kodiert wie die Sequenzen in a) oder b); d) eine Sequenz aufweist, die eine wesentliche Identität zu irgendeiner der in a), b) und c) dargestellten Sequenzen zeigt; oder e) eine Sequenz aufweist, die für ein Derivat oder Fragment eines in 1 (SEQ ID NO: 8) gezeigten Aminosäure-Moleküls kodiert.
  6. Verwendung von mindestens einer wie in Anspruch 5 definierten Nukleinsäure bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung bei der Prophylaxe und/oder der Behandlung von Brustkrebs.
  7. Verwendung eines Antikörpers, der an mindestens ein wie in Anspruch 1 oder 2 definiertes Polypeptid bindet, zum Screening nach und/oder zur Diagnose von Brustkrebs in einem Subjekt nach Anspruch 1.
  8. Verwendung eines Antikörpers, der an mindestens ein wie in Anspruch 1 oder 2 definiertes Polypeptid bindet, bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung bei der Prophylaxe und/oder bei der Behandlung von Brustkrebs.
  9. Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper spezifisch an ein wie in Anspruch 1 oder 2 definiertes Polypeptid bindet.
  10. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper monoklonal ist.
  11. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper an einen therapeutischen Rest konjugiert ist.
  12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der therapeutische Rest ausgewählt ist aus einem sekundären Antikörper oder einem Fragment oder einem Derivat desselben, einem zytotoxischen Mittel oder einem Zytokin.
  13. Verfahren zum Screening nach Anti-Brustkrebs-Verbindungen, die die Expression eines wie in Anspruch 1 oder 2 definierten Polypeptids modulieren, wobei das Verfahren den Schritt der Bestimmung des Vorhandenseins oder Fehlens und/oder des Quantifizierens von mindestens einem wie in Anspruch 1 oder 2 definierten Polypeptid oder von mindestens einem wie in Anspruch 8 oder 9 definierten Antikörper in einer biologischen Probe umfasst.
  14. Verfahren zum Verfolgen/Beurteilen der Brustkrebsbehandlung in einem Patienten, das den Schritt der Bestimmung des Vorhandenseins oder Fehlens und/oder des Quantifizierens von mindestens einem wie in Anspruch 1 oder 2 definierten Polypeptid oder von mindestens einem wie in Anspruch 8 oder 9 definierten Antikörper in einer biologischen Probe umfasst, welche von dem Patienten erhalten wurde.
  15. Verfahren zur Identifizierung von metastatischen Brustkrebszellen in einer biologischen Probe, die von einem Subjekt erhalten wurde, wobei das Verfahren den Schritt der Bestimmung des Vorhandenseins oder Fehlens und/oder des Quantifizierens von mindestens einem wie in Anspruch 1 oder 2 definierten Polypeptid oder von mindestens einem wie in Anspruch 8 oder 9 definierten Antikörper umfasst.
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