DE60221123T2

DE60221123T2 - Krebs-assoziiertes protein

Info

Publication number: DE60221123T2
Application number: DE60221123T
Authority: DE
Inventors: Jonathan A. Oxford Glyco Abingdon TERRETT
Original assignee: UCB SA
Current assignee: UCB SA
Priority date: 2001-06-15
Filing date: 2002-06-14
Publication date: 2008-03-20
Anticipated expiration: 2022-06-15
Also published as: ATE366937T1; EP1395829A2; GB0114644D0; EP1395829B1; WO2002103362A3; US20040166517A1; ES2290298T3; DE60221123D1; WO2002103362A2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Sulfattransportprotein (DTD) und seine Beteiligung an Krebs, insbesondere Brustkrebs, Zusammensetzungen, die das Protein umfassen, und Antikörper, die immunospezifisch für das Protein sind. Die Verwendung des Proteins bei der Diagnose, dem Screening, der Behandlung und der Prophylaxe von Brustkrebs ist ebenfalls vorgesehen.
Brustkrebs
Brustkrebs ist der am häufigsten diagnostizierte Nicht-Hautkrebs bei Frauen in den Vereinigten. Staaten. Bei mit Krebs in Verbindung stehenden Todesfällen folgt er gleich nach Lungenkrebs. Mit 34.600 neuen Fällen im Jahr 1998 ist Brustkrebs bei weitem der häufigste Krebs bei Frauen im Vereinigten Königreich (Cancer Research Campaign, http://www.crc.org.uk, UK, 2000). Zu neunundneunzig Prozent tritt Brustkrebs bei Frauen auf. Das Risiko, Brustkrebs zu entwickeln, steigt mit dem Alter stetig; das Lebenszeitrisiko hinsichtlich der Entwicklung von Brustkrebs beträgt bei Frauen in den Vereinigten Staaten 1 zu 8. Die jährlichen Kosten für eine Brustkrebsbehandlung in den Vereinigten Staaten betragen ungefähr $10 Milliarden (Fuqua, et. al., 2000, American Association for Cancer Research, www.aacr.org, USA). Die Brustkrebshäufigkeit hat in den letzten fünf Jahrzehnten zugenommen, aber in der letzten Zeit hat sie ein Plateau erreicht. Dies könnte einen Zeitraum der früheren Detektion von Brustkrebsarten durch Mammographie widerspiegeln. Das Risiko für eine Frau, an dieser Krankheit zu erkranken, kann von einer Vielzahl erwiesener Faktoren erhöht werden. Diese umfassen höheres Alter, eine bereits bestehende Brustkrebsgeschichte, signifikante Bestrahlung, starke Brustkrebsfamiliengeschichte, obere sozioökonomische Klasse, Nulliparität, frühe erste Regelblutung, späte Menopause oder ein Alter bei der ersten Schwangerschaft von mehr als 30 Jahren. Es scheint, daß die längere Einnahme oraler Verhütungsmittel in jungen Jahren dieses Risiko leicht erhöht. Eine verlängerte Östrogensubstitution nach der Menopause erhöht das Risiko um 20 bis 40 %. Es ist spekuliert worden, daß ein geringeres Alter zum Zeitpunkt der ersten Regelblutung, Änderungen der Geburtsverhaltensmuster oder ein Anstieg der Verwendung exogener Östrogene zur Zunahme der Brustkrebshäufigkeit beiträgt (Fuqua, et. al., 2000, American Association for Cancer Research, www.aacr.org, USA).
Ursachen für Brustkrebs
Brustkrebs ist eine heterogene Erkrankung. Obgleich weibliche Hormone bei der Aktivierung des Ursprungs und der Entwicklung vieler Brusttumore eine signifikante Rolle spielen, gibt es noch viele andere bekannte und unbekannte involvierte Faktoren. Identifizierte Störungen der Onkogene umfassen die Amplifikation der HER-2- und der epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptorgene und die Oberexpression von Cyclin D1. Die Überexpression dieser Onkogene ist mit einer signifikant schlechteren Prognose assoziiert worden. Dem ähnlich sind bei Brustkrebs genetische Veränderungen oder der Verlust von Tumorsuppressorgenen, wie dem p53-Gen, hinlänglich dokumentiert und ebenfalls mit einer schlechteren Prognose assoziiert worden. Forscher haben zwei Gene nachgewiesen, BRCA1 und BRCA2, die auf Familienbrustkrebs vor der Menopause schließen lassen. Nunmehr ist die Einschätzung des genetischen Risikos möglich, wodurch Kandidaten für Chemoprophylaxeversuche besser identifiziert werden können (Fuqua, et. al., 2000, American Association for Cancer Research, www.aacr.org, USA).
Diagnose
Eine frühe Diagnose von Brustkrebs ist lebenswichtig zur Sicherstellung des günstigsten Behandlungsablaufes. Viele Länder mit modernen Gesundheitssystemen haben Screeningprogramme für Brustkrebs eingeführt. Diese umfassen typischerweise das regelmäßige Röntgen der Brust (Mammographie) zwischen dem 50. und 60. Lebensjahr, wo diese Intervention den größten Nutzen bringt. Einige Behörden haben die Erweiterung solcher Programme unter 60 und auf die Gruppe der 40–49jährigen befürwortet. Die Gesundheitsbehörden vieler Länder betonen auch die Wichtigkeit der regelmäßigen Untersuchung der Brust durch die Frauen selbst. Abnormalitäten, die während dieser Screeningvorgänge entdeckt werden, und Fälle, die symptomatisch scheinen, würden typischerweise durch Aspirationszytologie, Kernpunktionsbiopsie mit einer stereotaktischen oder Ultraschalltechnik für nicht-tastbare Läsionen oder Inzisions- oder Exzisionsbiopsie bestätigt. Gleichzeitig würden typischerweise andere Informationen, die für die Behandlungsoptionen und -prognose relevant sind, wie Östrogen-(ER-Status) und Progesteron-Rezeptorstatus (PR-Status) bestimmt (National Cancer Institute, USA, 2000, Breast Cancer PDQ, www.nci.org).
Krankheitsstadiumeinteilung und Prognose
Die Stadiumeinteilung für Brustkrebs ist der Schlüssel zur Auswahl der optimalen Behandlung für jeden Patienten und zur Auswahl der Patienten, denen es mit weniger intensiven Therapieformen gut geht, aus denen, bei denen eine intensive Therapie wesentlich ist. Derzeit umfaßt das Verfahren der Stadiumeinteilung Tumor- und Achsellymphknotenbiopsien, kombiniert mit umfangreicher Histopathologie. Es kann passieren, daß Patienten nicht richtig eingeteilt werden, wobei dies eine Über- oder Unterbehandlung zur Folge hätte. Es besteht der Bedarf nach neuen Markern, die mit dem Krankheitsstadium korreliert und für zuverlässige geführte Behandlungsentscheidungen verwendet werden können. Solche neuen Marker nutzen nicht nur den Patienten und Gesundheitsdienstleistern bei der Auswahl der optimalen Behandlung, sondern könnten auch signifikante Kosten- und Zeitvorteile im Histologielabor bringen.
Einige Brusttumore werden jedoch behandlungsunempfindlich, wenn die Krebszellen Resistenz gegen Chemotherapiearzneimittel entwickeln oder ihre Hormonempfindlichkeit verlieren, was zu einer wiederkehrenden oder metastatischen Krankheit führt, die oftmals unheilbar ist. Kürzlich ist die Aufmerksamkeit auf die Entwicklung immunologischer Therapien (Green, et. al., Cancer Treat. Rev. 26, 269–286 (2000); Davis, I. D., Immunol. Cell Biol. 78, 179–195 (2000); Knuth, et. al., Cancer Chemother. Pharmacol. 46, S. 46–51 (2000); Shiku, et. al., Cancer Chemother. Pharmacol. 46, S. 77–82 (2000); Saffran, et. al., Cancer Metastasis Rev. 18, 437–449 (1999)), wie Krebsimpfstoffe und monoklonale Antikörper (mAbs), als ein Mittel zur Initiierung und zum Targeting einer Wirtsimmunantwort gegen Tumorzellen gerichtet worden. 1998 genehmigte die FDA die Verwendung von Herceptin^TM (Stebbing, et. al., Cancer Treat Rev. 26, 287–290 (2000); Dillman, et al., Cancer Biother. Radiopharm. 14, 5–10 (1999); Miller, et. al., Invest. New Drugs 17, 417–427 (1999)), einem mAb, der das erbB2/HER2-neu-Rezeptorprotein erkennt, als eine Behandlung für metastatischen Brustkrebs. Es ist gezeigt worden, daß Herceptin^TM in Kombination mit Chemotherapie das Fortschreiten der Krankheit im Vergleich zu Patienten, die nur mit Chemotherapie behandelt wurden, verzögert (Baselga, et. al., Cancer Res. 58, 2825–2831 (1998)). Herceptin^TM ist jedoch nur bei der Behandlung der 10–20 % der Patienten, deren Tumore das erbB2-Protein überexprimieren, wirksam. Daher ist die Identifikation anderer geeigneter Targets oder Antigene für die Immuntherapie von Brustkrebs noch wichtiger geworden.
Ein ideales Proteintarget für die Krebsimmunotherapie sollte ein eingeschränktes Expressionsprofil in normalen Geweben haben und in Tumoren überexprimiert werden, so daß die Immunantwort auf Tumorzellen und nicht auf andere Organe gerichtet sein wird. Überdies sollte das Proteintarget auf der Zelloberfläche, wo es therapeutischen Mitteln zugänglich ist, exponiert werden. Unter Verwendung von Techniken wie Differentialscreening von cDNA (Hubert, et. al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 96, 14523–14528 (1999); Lucas, et al. Int. J. Cancer 87, 55–60 (2000)) und der Reinigung von Zelloberflächenproteinen, die von tumorspezifischen Antikörpern erkannt werden (Catimel, et. al., J. Biol. Chem. 271, 25664–25670 (1996)) sind Tumorantigene für viele Krebsarten identifiziert worden.
DTD
Das Gen der diastrophischen Dysplasie (DTD-Gen) wurde 1994 geklont (Hastbacka J, et al. Cell 1994, 78(6): 1073–87). Seine Sequenz ist in der Swiss-Prot-Datenbank (die von dem Swiss Institute of Bioinformatics (SIB) geführt wird und auf http://www.expasy.ch/zugänglich ist) unter der Zugangsnummer P50443 gespeichert und kodiert einen mutmaßlichen 12-Membransulfattransporter von 739 Aminosäuren (1, SEQ ID Nr: 1). Es ist auf Chromosom 5q31-q34 lokalisiert.
Mutationen in DTD stehen mit einer Familie von rezessiv vererbter Osteochondrodysplasien in Verbindung, die diastrophische Dysplasie (Hastbacka et al., oben), Achondrogenesis Typ IB (Superti-Furga A, et al. Nat Genet 1996, 12(1): 100–2) und Atelosteogenesis Typ II (Hastbacka J, et al. Am J Hum Genet 1996, 58(2): 255–62) umfaßt. JP 11146790 offenbart einen neuen Vektor für die Expression von DTD und dessen Verwendung zum Screenen von Mitteln zur Behandlung einer menschlichen Knochen-/Knorpelerkrankung sowie die Verwendung des Vektors bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von menschlichen Knochen-/Knorpelerkrankungen.
WO 00/55351 offenbart 774 Dickdarmkrebs-Antigensequenzen, einschließlich einer Sequenz, die mit DTD identisch ist. Ferner ist die Verwendung von Antikörpern offenbart, die für diese Sequenzen spezifisch sind und die bei der Behandlung und Diagnose eines pathologischen Zustands, der mit der Überexprimierung der Sequenzen verbunden ist, von Nutzen sein können.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, daß das Protein DTD auf einige Gewebe beschränkte Expression zeigt, mit erhöhter Expression in Brusttumoren, was darauf schließen läßt, daß es ein geeignetes Target für die Krebstherapie und -diagnose sein kann.
Daher liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screening auf und/oder Diagnose von Brustkrebs in einem Individuum, wobei man in einem Verfahrensschritt die Menge eines Polypeptids in einer von dem Individuum erhaltenen biologischen Probe nachweist und/oder quantifiziert, wobei das Polypeptid:

a) die in 1 (SEQ ID Nr.: 1) dargestellte Aminosäuresequenz umfaßt oder aus dieser besteht;
b) ein Derivat mit einer oder mehreren Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -insertionen relativ zur in 1 (SEQ ID Nr.: 1) dargestellten Aminosäuresequenz ist, bei dem die DTD-Aktivität erhalten ist, oder
c) ein Fragment eines Polypeptids mit der in a) oder b) angegebenen Bedeutung ist, das eine Länge von mindestens zehn Aminosäuren aufweist und bei dem die DTD-Aktivität erhalten ist.

In der vorliegenden Anmeldung bezieht sich der Ausdruck „Polypeptide zur Verwendung in der Erfindung" auf alle Polypeptide, die in a) bis c) oben beschrieben sind.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auf die Diagnose von Brustkrebs und die Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch an ein DTD-Polypeptid bindet, zur Herstellung eines Medikaments zur Prophylaxe/Behandlung von Brustkrebs bei einem Individuum, das ein Säuger sein kann und bevorzugt ein Mensch ist.
Die Polypeptide zur Verwendung in der Erfindung können in isolierter oder rekombinanter Form bereitgestellt werden und an andere Komponenten fusioniert sein. Genauer gesagt, werden speziell die Fusionen der Polypeptide der Erfindung mit Lokalisations-Reporter-Polypeptiden wie dem grün fluoreszierenden Protein ( US-Patente Nr. 5,625,048 ; 5,777,079 ; 6,054,321 und 5,804,387 ) oder dem DsRed-fluoreszierenden Protein (Matz, et. al., (1999) Nature Biotech. 17: 969–973) in Erwägung gezogen. Die Polypeptide zur Verwendung in der Erfindung können in im wesentlichen reiner Form bereitgestellt werden, das heißt, sie sind im wesentlichen frei von anderen Polypeptiden. Daher kann ein Polypeptid zur Verwen dung in der Erfindung in einer Zusammensetzung bereitgestellt werden, in der es die dominierende Komponente ist (d. h., es liegt in einer Konzentration von mindestens 50 %; bevorzugt mindestens 75 %, mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 % oder mindestens 95 % vor; bestimmt auf einer Gewicht/Gewicht-Basis, ausschließlich Lösungsmitteln oder Trägern).
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung werden die Polypeptide innerhalb des Umfangs von a)–c) oben nunmehr ausführlicher beschrieben.
Polypeptide im Umfang von a)
Ein Polypeptid im Umfang von a) kann aus der in 1 angegebenen speziellen Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.: 1) bestehen oder kann eine zusätzliche N-terminale und/oder eine zusätzliche C-terminale Aminosäuresequenz, bezogen auf die in 1 angegebene Sequenz (SEQ ID Nr.: 1), aufweisen.
Zusätzliche N-terminale oder C-terminale Sequenzen können aus verschiedenen Gründen bereitgestellt werden. Techniken zur Bereitstellung solcher zusätzlicher Sequenzen sind in der Technik allgemein bekannt.
Zusätzliche Sequenzen können zur Veränderung der Merkmale eines speziellen Polypeptids bereitgestellt werden. Dies kann zur Verbesserung der Expression oder Regulierung der Expression in bestimmten Expressionssystemen nützlich sein. Beispielsweise kann eine zusätzliche Sequenz einen gewissen Schutz gegen die proteolytische Spaltung bieten. Dies erfolgte bei dem Hormon Somatostatin, indem es an seinem N-Terminus an einen Teil des β-Galaktosidaseenzyms fusioniert wurde (Itakwa et. al., Science 198: 105–63 (1977)).
Zusätzliche Sequenzen können auch zur Veränderung der Eigenschaften eines Polypeptids zur Erleichterung der Identifikation oder Reinigung nützlich sein. Beispielsweise kann ein Fusionspolypeptid bereitgestellt werden, in dem ein Polypeptid mit einer Komponente verknüpft ist, die durch Affinitätschromatographie isoliert werden kann. Die Komponente kann ein Antigen oder Epitop sein, und die Affinitätssäule kann immobilisierte Antikörper oder immobilisierte Antikörperfragmente umfassen, die an das Antigen oder Epitop (wünschens werterweise mit einem hohen Spezifitätsgrad) binden. Das Fusionspolypeptid kann für gewöhnlich aus der Säule durch Zugabe eines geeigneten Elutionsmittels eluiert werden.
Zusätzliche N-terminale oder C-terminale Sequenzen können jedoch auch einfach nur als ein Ergebnis einer bestimmten Technik, die zum Erhalt eines Polypeptids genutzt wurde, vorliegen, und müssen das Polypeptid nicht unbedingt mit einem besonders vorteilhaften Merkmal ausstatten. Solche Polypeptide liegen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
Was auch immer für eine zusätzliche N-terminale oder C-terminale Sequenz vorliegt, das resultierende Polypeptid sollte bevorzugt die immunologische oder biologische Aktivität des Polypeptids mit der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.: 1) zeigen.
Polypeptide im Umfang von b)
Unter Betracht der in b) oben definierten Polypeptide wird ein Fachmann erkennen, daß diese Polypeptide Derivate des in a) oben angegebenen Polypeptids (SEQ ID Nr.: 1) sind, vorausgesetzt, daß diese Derivate bevorzugt die immunologische oder biologische Aktivität des Polypeptids mit der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.: 1) zeigen. Ein Fachmann wird erkennen, daß die Derivate posttranslationale Modifikationen umfassen können, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, Phosphorylierung, Glycosylierung und Farnesylierung.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Derivat" auf ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz eines Stammpolypeptids umfaßt, das durch die Einführung von Aminosäurerestsubstitutionen, -deletionen oder -additionen und/oder Aminosäuremodifikationen, wie, aber nicht beschränkt auf, Phosphorylierung und Glycosylierung verändert wurde. Das Derivatpolypeptid besitzt eine ähnliche oder identische Aktivität wie das Stammpolypeptid.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Fragment" auf ein Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz von mindestens 5 Aminosäureresten (bevorzugt mindestens 10 Aminosäureresten, mindestens 15 Aminosäureresten, mindestens 20 Aminosäureresten, mindestens 25 Aminosäureresten, mindestens 30 Resten, mindestens 40 Aminosäureresten, mindestens 50 Aminosäureresten, mindestens 60 Aminosäureresten, mindestens 70 Aminosäureresten, mindestens 80 Aminosäureresten, mindestens 90 Aminosäurereste, mindestens 100 Aminosäureresten, mindestens 200 Aminosäureresten oder mindestens 300 Aminosäureresten) der Aminosäuresequenz eines Stammpolypeptids.
Veränderungen in der Aminosäuresequenz eines Polypeptids, die keinen Einfluß auf die Aktivität eines Polypeptids haben, können auftreten. Diese umfassen Aminosäuredeletionen, -insertionen und -substitutionen, und können aus alternativem Splicing und/oder der Gegenwart von mehreren Translationsstartstellen und/oder -stopstellen resultieren. Polymorphismen können als Folge der Untreue des Translationsverfahrens entstehen. Daher können Veränderungen in der Aminosäuresequenz toleriert werden, die keinen Einfluß auf die biologische oder immunologische Aktivität des Proteins haben.
Ein Fachmann wird erkennen, daß oftmals verschiedene Veränderungen an der Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das eine biologische oder bestimmte Aktivität aufweist, zur Erzeugung von Derivaten (auch bekannt als Varianten oder „Muteine") mit zumindest einem Teil der Aktivität, und bevorzugt mit einem wesentlichen Teil der Aktivität, vorgenommen werden können. Solche Derivate der in a) (SEQ ID Nr: 1) oben beschriebenen Polypeptide liegen im Umfang der vorliegenden Erfindung und werden nachstehend ausführlich erörtert. Sie umfassen allele und nicht-allele Derivate.
Ein Beispiel für ein Derivat des Polypeptids zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid, wie in a) (SEQ ID Nr. 1) oben definiert, abgesehen von der Substitution einer oder mehrerer Aminosäure(n) mit einer oder mehreren anderen Aminosäure(n), vorausgesetzt, daß das Derivat die Aktivität von DTD erhält. Ein Fachmann wird wissen, daß verschiedene Aminosäuren ähnliche Eigenschaften haben. Oftmals können eine oder mehrere dieser Aminosäuren eines Polypeptids durch eine oder mehrere andere solcher Aminosäuren substituiert werden, ohne eine gewünschte Aktivität dieses Polypeptids zu eliminieren.
Daher können oftmals die Aminosäuren Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin gegeneinander ausgetauscht werden (Aminosäuren mit aliphatischen Seitenketten). Von diesen möglichen Substitutionen werden bevorzugt Glycin und Alanin (da sie relativ kurze Seitenketten haben) zum Austausch gegeneinander verwendet, und Valin, Leucin und Isoleucin werden (da sie längere aliphatische Seitenketten haben, die hydrophob sind) zum Austausch gegeneinander verwendet.
Andere Aminosäuren, die oftmals gegeneinander ausgetauscht werden können, umfassen:

– Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan (Aminosäuren mit aromatischen Seitenketten);
– Lysin, Arginin und Histidin (Aminosäuren mit basischen Seitenketten);
– Aspartat und Glutamat (Aminosäuren mit sauren Seitenketten);
– Asparagin und Glutamin (Aminosäuren mit Amidseitenketten);
– Cystein und Methionin (Aminosäuren mit Schwefel-enthaltenden Seitenketten); und
– Asparaginsäure und Glutaminsäure können Phosphoserin bzw. Phosphothreonin ersetzen (Aminosäuren mit sauren Seitenketten).

Substitutionen dieser Art werden oftmals als „konservative" oder „semi-konservative" Aminosäuresubstitutionen bezeichnet.
Aminosäuredeletionen oder -insertionen können bezogen auf die in a) oben vorgegebene Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.: 1) ebenso vorgenommen werden. So können beispielsweise Aminosäuren, die keine substantielle Wirkung auf die biologische und/oder immunologische Aktivität des Polypeptids haben oder eine solche Aktivität zumindest nicht eliminieren, deletiert werden. Solche Deletionen können vorteilhaft sein, da sich die Gesamtlänge und das Molekulargewicht eines Polypeptids verringern können, während die Aktivität erhalten bleibt. So kann die Menge an Polypeptid, die für einen bestimmten Zweck erforderlich ist, reduziert werden – zum Beispiel können Dosierkonzentrationen verringert werden.
Aminosäureinsertionen, bezogen auf die in a) oben vorgegebene Sequenz (SEQ ID NR.: 1), können ebenso vorgenommen werden. So können die Eigenschaften eines Polypeptids zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung verändert werden (z. B. um die Identifikation, Reinigung oder Expression zu unterstützen). Der Fachmann wird erkennen, daß oftmals verschiedene Veränderungen an der Aminosäuresequenz eines Polypeptids vorgenommen werden können, wie in bezug auf Fusionsproteine oben erläutert.
Aminosäureveränderungen, bezogen auf die in a) oben vorgegebene Sequenz (SEQ ID NR.: 1), können unter Verwendung irgendeiner geeigneten Technik, z. B. unter Verwendung ortsgerichteter Mutagenese (Hutchinson et. al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551), vorgenommen werden.
Es sollte verständlich sein, daß Aminosäuresubstitutionen oder -insertionen an dem Polypeptid zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung unter Verwendung natürlich vorkommender oder nicht-natürlich vorkommender Aminosäuren vorgenommen werden können. Ob nun natürliche oder synthetische Aminosäuren verwendet werden oder nicht, bevorzugt liegen ausschließlich L-Aminosäuren vor.
Welche Aminosäureveränderung auch vorgenommen wird (mittels Substitution, Modifikation, Insertion oder. Deletion), bevorzugte Polypeptide zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung haben mindestens 50 % Sequenzidentität mit einem wie in a) oben definierten Polypeptid, stärker bevorzugt beträgt der Sequenzidentitätsgrad mindestens 75 %, mindestens 80 %, mindestens 85 %. Sequenzidentitäten von mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 % oder mindestens 99 % sind am stärksten bevorzugt.
Der Ausdruck Identität kann zur Beschreibung der Ähnlichkeit zwischen zwei Polypeptidsequenzen verwendet werden. Der Grad an Aminosäuresequenzidentität kann unter Verwendung eines Programms wie „Bestfit" (Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482–489 (1981)) berechnet werden, um das beste Ähnlichkeitssegment zwischen zwei Sequenzen zu finden. Die Anordnung basiert auf der Maximierung der unter Verwendung einer Matrix von Aminosäureähnlichkeiten erhaltenen Kennzahl, wie der von Schwarz and Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M. O., Hrsg., S. 353–358 beschriebenen.
Ein Software-Paket, das in der Technik zur Durchführung dieses Verfahrens allgemein bekannt ist, ist das CLUSTAL-Programm. Es vergleicht die Aminosäuresequenzen von zwei Polypeptiden und findet die optimale Anordnung, indem es in eine der beiden Sequenzen geeignet Räume einfügt. Die Aminosäureidentität oder -ähnlichkeit (Identität plus Konservierung der Aminosäureart) für eine optimale Anordnung kann auch unter Verwendung eines Software-Pakets wie BLASTX berechnet werden. Dieses Programm ordnet die größte Spanne mit ähnlicher Sequenz an und ordnet der Übereinstimmung einen Wert zu. Für jeden Mustervergleich können mehrere ähnliche Regionen gefunden werden, die alle eine andere Kennzahl haben. Ein Fachmann wird erkennen, daß zwei Polypeptide mit unterschiedlicher Länge über die gesamte Länge des längeren Fragments verglichen werden können. Alternativ können kleine Regionen verglichen werden. Normalerweise werden für einen nützlichen Vergleich gleichlange Sequenzen verglichen.
Liegen hohe Sequenzidentitätsgrade vor, wird es relativ wenige Unterschiede in der Aminosäuresequenz geben. So können diese zum Beispiel weniger als 20, weniger als 10 oder sogar weniger als 5 Unterschiede sein.
Polypeptide im Umfang von c)
Wie oben erläutert, ist die Reduzierung der Länge eines Polypeptids oftmals von Vorteil, vorausgesetzt, daß das resultierende Polypeptid mit verringerter Länge noch eine gewünschte Aktivität aufweist oder nützliche Antikörper hervorbringen kann. Merkmal c) deckt daher Fragmente von Polypeptiden a) (SEQ ID Nr: 1) oder b) oben zur Verwendung in der vorliegende Erfindung ab.
Der Fachmann kann bestimmen, ob ein bestimmtes Fragment Aktivität aufweist oder nicht. Fragmente sind mindestens 10 Aminosäuren lang, bevorzugte Fragmente können mindestens 20, mindestens 30, mindestens 40, mindestens 50, mindestens 75 oder mindestens 100 Aminosäuren lang sein.
Ein Polypeptid, wie hierin definiert, kann als ein antigenes Material nützlich sein und kann bei der Herstellung von Impfstoffen zur Behandlung oder Prophylaxe von Brustkrebs und/oder Bauchspeicheldrüsenkrebs verwendet werden. Solch ein Material kann „antigen" und/oder „immunogen" sein. Im allgemeinen ist unter „antigen" zu verstehen, daß das Protein verwendet werden kann, um Antikörper hervorzurufen oder sogar um eine Antikörperantwort in einem Individuum zu induzieren. Unter „immunogen" ist zu verstehen, daß das Protein eine schützende Immunantwort in einem Individuum auslösen kann. So kann das Protein im letzten Fall nicht nur eine Antikörperantwort, sondern auch Immunantworten, die nicht auf Antikörpern basieren, erzeugen.
Allgemein bekannt ist, daß ein antigenes Protein oder Polypeptid zur Identifizierung epitoper Regionen, d. h., der Regionen, die für die Antigenität oder Immunogenität des Proteins oder Polypeptids verantwortlich sind, gescreent werden kann. Zum Testen von Fragmenten und/oder Homologa und/oder Derivaten auf Antigenität können dem Fachmann allgemein bekannte Verfahren verwendet werden. Daher können die Fragmente zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung eine oder mehrere solcher epitoper Regionen umfassen oder solchen Regionen ausreichend gleichen, damit ihre antigenen/immunogenen Eigenschaften erhalten bleiben. Daher ist der Identitätsgrad für Fragmente zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung vermutlich irrelevant, da sie zu 100 % mit einem bestimmten Teil eines Proteins oder Polypeptids, Homologons oder Derivats, wie hierin beschrieben, identisch sind. Der Kernpunkt ist, daß das Fragment die antigenen/immunogenen Eigenschaften des Polypeptids, von dem es stammt, aufrechterhält.
Homologa, Derivate und Fragmente können zumindest einen gewissen Grad an Antigenität/Immunogenität des Proteins oder Polypeptids, von dem sie stammen, besitzen.
Das Polypeptid zur Verwendung in der Erfindung kann ebenso bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung oder Prophylaxe von Krebs, insbesondere Brustkrebs, verwendet werden, wobei die Zusammensetzung ein Impfstoff ist. Der Impfstoff umfaßt gegebenenfalls ein oder mehrere geeignete Adjuvanzien. In der Technik allgemein bekannte Beispiele von Adjuvanzien umfassen anorganische Gele, wie Aluminiumhydroxid und Wasser-in-Öl-Emulsionen, wie inkomplettes Freund-Adjuvans. Andere nützliche Adjuvanzien werden dem Fachmann allgemein bekannt sein.
Ein Fachmann wird erkennen, daß zur Herstellung von einem oder mehreren Polypeptiden zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung der bevorzugte Ansatz auf rekombinanten DNA-Techniken basieren wird.
Diese Nukleinsäuremoleküle, die die Polypeptide kodieren, können selbstständig verwendet werden. Daher kann ein Verfahren zum Screenen auf und/oder Diagnose von Krebs, insbesondere Brustkrebs, bei einem Individuum den Schritt des Detektierens und/oder Quantifizierens der Menge einer Nukleinsäure in einer biologischen Probe, die aus dem Individuum erhalten wurde, umfassen, wobei das Nukleinsäuremolekül:

d) die DNA-Sequenz, gezeigt in 1 (SEQ ID Nr.: 2), oder ihr RNA-Äquivalent;
e) eine Sequenz, die für ein Aminosäuremolekül kodiert, wie in a) (SEQ ID Nr.: 1), b) oder c) definiert;
f) eine Sequenz, die zu den Sequenzen von d) oder e) komplementär ist;
g) eine Sequenz, die für dasselbe Polypeptid kodiert, wie die Sequenzen von d) oder e) oder
h) eine Sequenz, die substantielle Identität mit irgendeiner aus d), e), f) oder g) zeigt, umfaßt oder daraus besteht.

In der vorliegenden Anmeldung bezieht sich der Ausdruck „Nukleotide zur Verwendung in der Erfindung" auf alle in d) bis h) oben beschriebenen Nukleotide.
Der Ausdruck Identität kann auch zur Beschreibung der Ähnlichkeit zwischen zwei einzelnen DNA-Sequenzen verwendet werden. Das „Bestfit"-Programm (Smith and Waterman, Advances in applied Mathematics, 482–489 (1981)) ist ein Beispiel für eine Art von Computersoftware, die für die Suche nach dem besten Ähnlichkeitssegment zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen verwendet wird, während mit dem GAP-Programm Sequenzen entlang ihrer gesamten Länge abgeglichen und die optimale Anordnung durch die geeignete Einfügung von Räumen in eine der beiden Sequenzen gefunden werden können. Bevorzugt haben Sequenzen, die eine substantielle Identität mit irgendeiner aus d), e) und f) zeigen, zumindest eine 50%ige, zumindest eine 75%ige, zumindest eine 80%ige, zumindest eine 85%ige, zumindest eine 90%ige oder zumindest 95%ige Sequenzidentität.
Diese Nukleinsäuremoleküle werden nunmehr ausführlicher erörtert.
Die in der Erfindung verwendeten Polypeptide können von einer Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen kodiert werden, wobei die allgemein bekannte Degeneriertheit des genetischen Codes berücksichtigt werden sollte. Alle diese Moleküle können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Sie können in Vektoren eingeführt und geklont werden, um große Mengen DNA oder RNA für weitere Untersuchungen bereitzustellen. Geeignete Vektoren können in Wirtszellen eingeführt werden, damit die in der Erfindung verwendeten Polypeptide unter Verwendung von Techniken, die einem Fachmann allgemein bekannt sind, exprimiert werden können.
Der Ausdruck „RNA-Äquivalent", wie oben verwendet, gibt an, daß ein gegebenes RNA-Molekül eine Sequenz aufweist, die komplementär zu der eines gegebenen DNA-Moleküls ist, unter Berücksichtigung der Tatsache, daß in RNA „U"„T” im genetischen Code ersetzt.
Das Nukleinsäuremolekül kann in isolierter, rekombinanter oder chemisch synthetischer Form vorliegen.
Techniken zum Klonen, Exprimieren und Reinigen von Polypeptiden sind einem Fachmann allgemein bekannt. DNA-Konstrukte können unter Verwendung von Verfahren, die in der Technik allgemein bekannt sind, ohne weiteres erzeugt werden. Diese Techniken werden zum Beispiel in J. Sambrook et. al., Molecular Cloning 3. Aufl., Cold Spring Harbour Laboratory Press (2000); in Old & Primrose Principles of Gene Manipulation, 5. Aufl., Blackwell Scientific Publications (1994); und in Stryer, Biochemistry 4. Aufl., W. H. Freeman and Company (1995) offenbart. Modifikationen von DNA-Konstrukten und der exprimierten Polypeptide wie das Hinzufügen von Promotoren, Enhancern, Signalsequenzen, Leader-Sequenzen, Translationsstart- und -stoppsignalen und DNA-Stabilitätskontrollregionen oder das Hinzufügen von Fusionspartnern können so erleichtert werden.
Normalerweise wird das DNA-Konstrukt in einen Vektor eingeführt, der von einem Phagen oder einem Plasmid abstammt. Die Expression des Polypeptids wird durch die Transformation oder Transfektion des Vektors in eine Wirtszelle, die eukaryotischen oder prokaryotischen Ursprungs sein kann, erreicht. Solche Vektoren und geeignete Wirtszellen bilden zusätzliche Aspekte zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung.
Die Nukleotidsequenzen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung, einschließlich DNA und RNA, und umfassend eine Sequenz, die ein Polypeptid zur Verwendung in der Erfindung kodiert, können unter Verwendung von Verfahren, die in der Technik bekannt sind, wie unter Verwendung herkömmlicher chemischer Ansätze oder einer Polymerasekettenreaktions-Amplifikation (PCR-Amplifikation), synthetisiert werden. Die Nukleotidsequenzen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ermöglichen auch die Identifikation und das Klonen des Gens, das ein Polypeptid zur Verwendung in der Erfindung kodiert, aus irgendeiner Spezies, beispielsweise durch Screenen von cDNA-Bibliotheken, Genbibliotheken oder Expressionsbibliotheken.
Zur Hervorrufung von Antikörpern und für die Gentherapie können Fachkenntnisse über die Nukleinsäurestruktur angewandt werden. Techniken hierfür sind einem Fachmann allgemein bekannt, wie hierin ausführlicher erläutert.
Unter Verwendung geeigneter Expressionssysteme können die Polypeptide zur Verwendung in der Erfindung in glycosylierter oder nicht-glycosylierter Form exprimiert werden. Nicht-glycosylierte Formen können durch die Expression in prokaryotischen Wirten wie E. coli erzeugt werden.
Polypeptide, die N-terminales Methionin umfassen, können unter Verwendung bestimmter Expressionssysteme erzeugt werden, während in anderen das reife Polypeptid diesen Rest nicht aufweist.
Bevorzugte Techniken zum Klonen, Exprimieren und Reinigen eines Polypeptids zur Verwendung in der Erfindung werden nachstehend zusammengefaßt:
Polypeptide zur Verwendung in der Erfindung können unter natürlichen oder denaturierten Bedingungen hergestellt und anschließend rückgefaltet werden. Baculovirale Expressionsvektoren umfassen sekretorische Plasmide (wie pACGP67 von Pharmingen), die eine In-Frameklonierte Epitop-Tag-Sequenz (z. B. myc, V5 oder His) aufweisen, um die Detektion zu erleichtern und die anschließende Reinigung des Proteins zu ermöglichen. Säugerexpressionsvektoren können pCDNA3 und pSecTag (beide Invitrogen) und pREP9 und pCEP4 (Invitrogen) umfassen. E.-coli-Systeme umfassen die pBad-Reihe (His-markiert – Invitrogen) oder die pGex-Reihe (Pharmacia).
Neben den Nukleinsäuremolekülen, die für die Polypeptide zur Verwendung in der Erfindung kodieren, hierin als „kodierende" Nukleinsäuremoleküle bezeichnet, umfaßt die vorliegende Beschreibung auch komplementäre Nukleinsäuremoleküle. Daher sind zum Beispiel beide Stränge eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten (ob sie nun miteinander assoziiert sind oder nicht). Ebenso enthalten sind mRNA-Moleküle und komplementäre DNA-Moleküle (z. B. cDNA-Moleküle).
Die Verwendung von Nukleinsäuremolekülen, die an irgendeines der oben erörterten Nukleinsäuremoleküle hybridisieren können, wird von der vorliegenden Beschreibung ebenso erfaßt. Solche Nukleinsäuremoleküle werden hierin als „hybridisierende" Nukleinsäuremole küle bezeichnet. Hybridisierende Nukleinsäuremoleküle können beispielsweise als Sonden oder Primer nützlich sein.
Wünschenswerterweise sind solche hybridisierenden Moleküle mindestens 10 Nukleotide lang und bevorzugt mindestens 25 oder mindestens 50 Nukleotide lang. Die hybridisierenden Nukleinsäuremoleküle hybridisieren bevorzugt speziell mit Nukleinsäuren innerhalb des Umfangs von d), e), f), g) oder h) oben.
Wünschenswerterweise werden die hybridisierenden Moleküle unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit solchen Molekülen hybridisieren. Bin Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist die Durchführung des Hybridisierungsversuches bei einer Temperatur von etwa 35 °C bis etwa 65 °C unter Verwendung einer Salzlösung, die etwa 0,9 molar ist. Ein Fachmann wird solche Bedingungen unter Berücksichtigung von Variablen wie der Sondenlänge, der Grundzusammensetzung, der Art der vorliegenden Ionen usw. jedoch entsprechend variieren können. Für einen hohen Selektivitätsgrad werden zur Bildung von Doppelsträngen relativ stringente Bedingungen wie wenig Salz oder hohe Temperatur verwendet. Wie hierin verwendet, ist unter „hochstringenten Bedingungen" die Hybridisierung mit Filtergebundener DNA in 0,5 M NaHPO₄, 7 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65 °C und Waschen in 0,1 × SSC/0,1 % SDS bei 68 °C zu verstehen (Ausubel F. M. et. al., Hrsg., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Bd. I, Green Publishing Associates, Inc., und John Wiley & Sons, Inc., New York, auf S. 2.10.3). Bei einigen Anwendungen sind weniger stringente Bedingungen für die Doppelstrangbildung erforderlich. Wie hierin verwendet, bezieht sich „mäßig stringente Bedingungen" auf das Waschen in 0,2 × SSC/0,1 % SDS bei 42 °C (Ausubel et. al., 1989, oben). Die Hybridisierungsbedingungen können durch die Zugabe steigender Mengen an Formamid auch noch stringenter gemacht werden, um den Hybriddoppelstrang zu destabilisieren. Daher können bestimmte Hybridisierungsbedingungen ohne weiteres manipuliert werden, und werden im allgemeinen in Abhängigkeit der gewünschten Ergebnisse ausgewählt. Im allgemeinen sind günstige Hybridisierungstemperaturen in Gegenwart von 50 % Formamid: 42 °C für eine Sonde, die zu 95 bis 100 % mit dem Fragment eines Gens, das ein hierin definiertes Polypeptid kodiert, identisch ist, 37 °C für 90 bis 95 % Identität und 32 °C für 70 bis 90 % Identität.
Bei der Herstellung von Genbibliotheken werden DNA-Fragmente erzeugt, von denen einige das hierin definierte Polypeptid teilweise oder vollständig kodieren werden. Die DNA kann an speziellen Stellen unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme gespalten werden. Alternativ kann man DNAse in Gegenwart von Mangan zur Fragmentierung der DNA verwenden oder die DNA kann physikalisch geschnitten werden, wie beispielsweise durch Sonifikation. Die DNA-Fragmente können dann durch Standardtechniken, umfassend, aber nicht beschränkt auf, Agarose- und Polyacrylamidgelelektrophorese, Säulenchromatographie und Saccharosegradientenzentrifugation, nach der Größe getrennt werden. Die DNA-Fragmente können dann in geeignete Vektoren, umfassend, aber nicht beschränkt auf, Plasmide, Kosmide, Bakteriophagen Lambda oder T₄ und künstliche Hefechromosomen (YACs), eingeführt werden. (siehe zum Beispiel Sambrook et. al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1 D. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D. M. (Hrsg.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U. K. Bd. I, II; Ausubel F. M. et. al., Hrsg., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Bd. I, Green Publishing Associates, Inc., und John Wiley & Sons, Inc., New York). Die Genbibliothek kann durch Nukleinsäurehybridisierung an eine markierte Sonde gescreent werden (Genton & Davis, 1977, Science 196: 180; Grunstein & Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72: 3961).
Die Manipulation der DNA, die ein Polypeptid kodiert, ist eine besonders bedeutsame Technik sowohl zur Modifizierung von Proteinen als auch zur Erzeugung großer Mengen an Protein zu Reinigungszwecken. Dies kann die Verwendung von PCR-Techniken zur Amplifikation einer gewünschten Nukleinsäuresequenz umfassen. So können die hierin bereitgestellten Sequenzdaten zur Gestaltung von Primern zur Verwendung in der PCR verwendet werden, so daß eine gewünschte Sequenz targetiert und dann in einem hohen Grad amplifiziert werden kann.
Typischerweise sind Primer mindestens fünf Nukleotide lang und werden im allgemeinen mindestens zehn Nukleotide lang sein (z. B. fünfzehn bis fünfundzwanzig Nukleotide lang). In einigen Fällen können Primer aus mindestens dreißig oder mindestens fünfunddreißig Nukleotiden verwendet werden.
Als eine weitere Alternative kann chemische Synthese verwendet werden. Diese kann automatisiert sein. Relativ kurze Sequenzen können chemisch synthetisiert und aneinander ligiert werden, um so eine längere Sequenz bereitzustellen.
Neben ihrer Verwendung als Primer und/oder Sonden können die hybridisierenden Nukleinsäuremoleküle zur Verwendung in der Beschreibung als Antisensemoleküle verwendet werden, um die Expression der Polypeptide zur Verwendung in der Beschreibung durch das Binden an komplementäre Nukleinsäuremoleküle zu verändern. Diese Technik kann bei der Antisensetherapie verwendet werden.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Antisense"-Nukleinsäure auf eine Nukleinsäure, die auf Grund einer gewissen Sequenzkomplementarität mit einem Teil einer RNA (bevorzugt mRNA), die ein Polypeptid zur Verwendung in der Erfindung kodiert, hybridisieren kann. Die Antisense-Nukleinsäure kann komplementär zu einer kodierenden und/oder nicht-kodierenden Region einer mRNA sein, die solch ein Polypeptid kodiert. Solche Antisense-Nukleinsäuren finden Anwendung als Verbindungen, die die Expression inhibieren, und können bei der Behandlung oder Vorbeugung von Krebs, insbesondere Brustkrebs, verwendet werden.
Ein hybridisierendes Nukleinsäuremolekül zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann einen hohen Grad an Sequenzidentität entlang seiner Länge mit einem Nukleinsäuremolekül innerhalb des Umfangs von d)–h) oben haben (z. B. mindestens 50 %, mindestens 75 %, mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 % oder mindestens 99 % Sequenzidentität). Ein Fachmann wird erkennen, daß je höher die Sequenzidentität, die ein gegebenes einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem anderen Nukleinsäuremolekül hat, desto größer die Wahrscheinlichkeit, daß es unter geeigneten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül hybridisieren wird, daß komplementär zu dem anderen Nukleinsäuremolekül ist.
Wenn der Kontext nichts Anderweitiges angibt, können die Nukleinsäuremoleküle zur Verwendung in der vorliegenden Beschreibung ein oder mehrere der folgenden Merkmale haben:

1) sie können DNA oder RNA sein;
2) sie können einzel- oder doppelsträngig sein;
3) sie können in rekombinanter Form, z. B. kovalent gebunden an eine 5'- und/oder eine 3'-flankierende Sequenz, vorliegen, um ein Molekül bereitzustellen, das nicht in der Natur vorkommt;
4) sie können ohne 5'- und/oder 3'-flankierende Sequenzen, die normalerweise in der Natur vorkommen, vorliegen;
5) sie können in im wesentlichen reiner Form vorliegen. So können sie in einer Form vorliegen, die im wesentlichen frei ist von kontaminierenden Proteinen und/oder von anderen Nukleinsäuren; und
6) sie können mit Introns oder ohne Introns (z. B. als cDNA) vorliegen.

Nach Bedarf können ein Gen, das ein Polypeptid zur Verwendung in der Erfindung kodiert, ein verwandtes Gen oder verwandte Nukleinsäuresequenzen oder Subsequenzen, einschließlich komplementäre Sequenzen, auch in Hybridisierungsassays verwendet werden. Ein Nukleotid, das ein Polypeptid zur Verwendung in der Erfindung kodiert, oder Subsequenzen davon, die mindestens 8 Nukleotide umfassen, können als eine Hybridisierungssonde verwendet werden. Hybridisierungsassays können zur Detektion, Prognose, Diagnose oder Überwachung von Zuständen, Erkrankungen oder Krankheitszuständen, die mit der anomalen Expression von Genen, die ein wie hierin definiertes Polypeptid zur Verwendung in der Erfindung kodieren, verbunden sind, oder für die Differenzialdiagnose von Patienten mit Anzeichen oder Symptomen, die auf Krebs, insbesondere Brustkrebs schließen lassen, verwendet werden. Genauer gesagt, kann ein solcher Hybridisierungsassay mittels eines Verfahrens durchgeführt werden, das das Kontaktieren einer Patientenprobe, die Nukleinsäure enthält, mit einer Nukleinsäuresonde, die mit einer DNA oder RNA, die ein Polypeptid, wie hierin definiert, kodiert, unter derartigen Bedingungen, das eine Hybridisierung stattfinden kann, hybridisieren kann, und Detektieren oder Messen der resultierenden Hybridisierung umfaßt. Die Nukleotide können zur Therapie von Patienten mit Krebs, insbesondere Brustkrebs, wie nachstehend beschrieben, verwendet werden.
Ein günstiges Mittel zum Detektieren8/Quantifizieren der Polypeptide zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfaßt die Verwendung von Antikörpern. Daher finden die Polypeptide zur Verwendung in der Erfindung ebenso Verwendung zum Hervorrufen von Antikörpern.
So stellt in einem weiteren Aspekt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Antikörpers, der an mindestens ein Polypeptid zur Verwendung in der Erfindung bindet, zum Screenen auf und/oder Diagnose von Brustkrebs in einem Individuum bereit. Der Antikörper wird zum Detektieren und/oder Quantifizieren der Menge eines Polypeptids zur Verwendung in der Erfindung in einer biologischen Probe, die aus dem Individuum erhalten wird, verwendet.
In einer Ausführungsform kann das Binden von Antikörpern in Gewebesektionen zur Detektion anomaler Polypeptidlokalisierung oder einer anomalen Konzentration an Polypeptid verwendet werden. In einer speziellen Ausführungsform kann ein Antikörper gegen ein Polypeptid zur Verwendung in der Erfindung zur Untersuchung des Gewebes eines Patienten (z. B. eine Brustbiopsie) hinsichtlich der Konzentration des Polypeptids verwendet werden, wobei eine anomale Konzentration an Polypeptid auf Krebs, insbesondere Brustkrebs, schließen läßt. Wie hierin verwendet, ist unter einer „anomalen Konzentration" eine Konzentration zu verstehen, die im Vergleich zu der Konzentration in einem Individuum, das keinen Krebs hat, oder einer Referenzkonzentration, erhöht ist. Nach Bedarf kann der Vergleich mit einer entsprechenden Probe aus demselben Individuum, die aus einem Teil des Körpers, der nicht von Krebs befallen ist, entnommen wird, durchgeführt werden.
Geeignete Immunoassays umfassen ohne Einschränkung kompetitive und nicht-kompetitive Assaysysteme unter Verwendung von Techniken wie Western-Blots, Radioimmunoassays, ELISA (enzymgekoppelter Immunadsorptionstest), „Sandwich"-Immunoassays, Immunopräzipitationsassays, Präzipitinreaktionen, Geldiffusionspräzipitinreaktionen, Immunodiffusionsassays, Agglutinationsassays, Komplement-Fixationsassays, immunoradiometrische Assays, Fluoreszenzimmunoassays und Protein A-Immunoassays.
In einem anderen Aspekt liefert die vorliegende Beschreibung ein Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Krebs, insbesondere Brustkrebs, bei einem Individuum, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Antikörpers, der an mindestens ein Polypeptid zur Verwendung in der Erfindung bindet, an ein Individuum umfaßt.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch an mindestens ein Polypeptid zur Verwendung in der Erfindung bindet, bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung bei der Prophylaxe und/oder Behandlung von Brustkrebs bereit.
Antikörper binden spezifisch an die Polypeptide zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung, so daß sie zur Reinigung und/oder Inhibierung der Aktivität solcher Polypeptide verwendet werden können.
Daher kann das Polypeptid zur Verwendung in der Beschreibung als ein Immunogen zur Erzeugung von Antikörpern, die ein solches Immunogen immunospezifisch binden, verwendet werden. Die Antikörper der Erfindung umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, polyklonale, monoklonale, bispezifische, humanisierte oder chimäre Antikörper, Einkettenantikörper, Fab-Fragmente und F(ab')-Fragmente, Fragmente, produziert von einer Fab-Expressionsbibliothek, anti-idiotypische (anti-Id-) Antikörper und Epitopbindungsfragmente der obigen. Der Ausdruck „Antikörper", bezieht sich, wie hierin verwendet, auf Immunoglobulinmoleküle und immunologisch aktive Teile von Immunoglobulinmolekülen, d. h., Moleküle, die eine Antigenbindungsstelle enthalten, die spezifisch an ein Antigen bindet. Die Immunoglobulinmoleküle der Erfindung können aus jeder Klasse (z. B., IgG, IgE, IgM, IgD und IgA) oder Unterklasse von Immunoglobulinmolekülen stammen.
Bei der Produktion von Antikörpern kann das Screenen auf den gewünschten Antikörper durch in der Technik bekannte Techniken, wie ELISA (enzymgekoppelter Immunadsorptionstest), erfolgen. Um beispielsweise Antikörper auszuwählen, die eine spezielle Domäne eines Polypeptids, das in der Erfindung verwendet wird, erkennen, kann man die für ein Produkt, das an ein Polypeptidfragment bindet, das eine solche Domäne enthält, erzeugten Hybridome untersuchen. Zur Auswahl eines Antikörpers, der spezifisch ein erstes Polypeptidhomolog bindet, der aber nicht spezifisch (oder weniger eifrig) an ein zweites Polypeptidhomolog bindet, kann einer auf der Basis der positiven Bindung an das erste Polypeptidhomolog und einer fehlenden Bindung (oder reduzierten Bindung) an das zweite Polypeptidhomolog ausgewählt werden.
Zur Herstellung monoklonaler Antikörper (mAbs), die gegen ein Polypeptid zur Verwendung in der Erfindung gerichtet sind, kann jede Technik, mit der Antikörpermoleküle durch kontinuierliche Zellinien in Kultur produziert werden können, verwendet werden. Zum Beispiel die Hybridomtechnik, ursprünglich entwickelt von Kohler und Milstein (1975, Nature 256: 495–497), sowie die Triomtechnik, die humane B-Zell-Hybridomtechnik (Kozbor et. al., 1983, Immunology Today 4: 72) und die EBV-Hybridomtechnik zur Produktion menschlicher monoklonaler Antikörper (Cole et. al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96). Solche Antikörper können aus irgendeiner Immunoglobulinklasse, einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA, IgD und irgendeiner Unterklasse davon stammen. Das Hybridom, das die mAbs, die in der Erfindung verwendet werden, produziert, kann in-vitro oder in-vivo kultiviert werden. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können monoklonale Antikörper in keimfreien Tieren unter Nutzung bekannter Techniken produziert werden (PCT/US90/02545).
Die mAbs umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, humane mAbs und chimäre mAbs (z. B. Mensch-Maus-Chimäre). Ein chimärer Antikörper ist ein Molekül, in dem unterschiedliche Teile aus unterschiedlichen Tierspezies stammen, wie die mit einer humanen konstanten Immunoglobulinregion und einer variablen Region aus einem Maus-mAb. (siehe z. B. US-Patent 4,816,567 und US-Patent 4,816,397 ). Humanisierte Antikörper sind Antikörpermoleküle aus nicht-humanen Spezies mit einer oder mehreren komplementätsbestimmenden Bereichen (CDRs) aus den nicht-humanen Spezies und einer Gerüstregion aus einem humanen Immunoglobulinmolekül (siehe z. B. US 5,585,089 ).
Chimäre und humanisierte mAbs können durch rekombinante DNA-Techniken, die in der Technik bekannt sind, zum Beispiel unter Verwendung von Verfahren, die in WO 87/02671 ; EP-A-184,187 ; EP-A-171,496 ; EP-A-173,494 ; WO 86/01533 ; US-Patent Nr. 4,816,567 ; EP-A-125,023 ; Retter et al., 1988, Science 240: 1041–1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139: 3521–3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214–218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47: 999–1005; Wood et al., 1985, Nature 314: 446–449; Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553–1559, Morrison, 1985, Science 229: 1202–1207; Oi et al., 1986, Bio/Techniques 4: 214; US-Patent 5,225,539 ; Jones et al., 1986, Nature 321: 552–525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534; und Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141: 4053–4060 beschrieben sind, hergestellt werden.
Vollständig humane Antikörper sind zur therapeutischen Behandlung menschlicher Patienten besonders wünschenswert. Solche Antikörper können unter Verwendung transgener Mäuse, die endogene Immunoglobulin-Schwer- und -Leichtkettengene nicht exprimieren können, die aber humane Schwer- und Leichtkettengene exprimieren können, produziert werden. Die transgenen Mäuse werden wie üblich mit einem ausgewählten Antigen, z. B. dem gesamten oder einem Teil eines Polypeptids zur Verwendung in der Erfindung, immunisiert. Gegen das Antigen gerichtete mAbs können unter Verwendung herkömmlicher Hybridomtechnologie erhalten werden. Die humanen Immunoglobulintransgene, die transgene Mäuse tragen, ordnen sich während der B-Zellendifferenzierung um und unterliegen anschließend dem Klassenwechsel und somatischer Mutation. So können unter Verwendung einer solchen Technik therapeutisch nützliche IgG-, IgA-, IgM-, IgD- und IgE-Antikörper produziert werden. Für eine Übersicht der Technologien zur Produktion humaner Antikörper siehe Lonberg und Huszar (1995), Int. Rev. Immunol. 13: 65–93. Für eine ausführliche Erläuterung dieser Technologie zur Produktion humaner Antikörper und humaner monoklonaler Antikörper und Protokolle zur Produktion solcher Antikörper, siehe z. B. US-Patent 5,625,126 ; US-Patent 5,633,425 ; US-Patent 5,569,825 ; US-Patent 5,661,016 und US-Patent 5,545,806 .
Vollständig humane Antikörper, die ein ausgewähltes Epitop erkennen, können unter Verwendung einer Technik, die als „gesteuerte Auswahl" bezeichnet wird, erzeugt werden. in diesem Ansatz wird ein ausgewählter nicht-humaner monoklonaler Antikörper, z. B. ein Maus-Antikörper, zur Steuerung der Auswahl eines vollständig humanen Antikörpers, der dasselbe Epitop erkennt, verwendet. (Jespers et. al., (1994) Bio/technology 12: 899–903).
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Antikörper können auch unter Verwendung verschiedener Phagendisplay-Verfahren, die in der Technik bekannt sind, erzeugt werden. In Phagendisplay-Verfahren werden funktionale Antikörperdomänen auf der Oberfläche von Phagenpartikeln, die diese kodierende Polynukleotidsequenzen tragen, gezeigt. Genauer gesagt, kann ein solcher Phage zum Aufzeigen Antigen-bindender Domänen, die aus einer Repertoire- oder kombinatorischen Antikörperbibliothek (z. B. Mensch oder Maus) exprimiert werden, genutzt werden. Ein Phage, der eine Antigen-bindende Domäne, die das in Frage stehende Antigen bindet, exprimiert, kann mit Antigen ausgewählt oder identifiziert werden, z. B. unter Verwendung eines markierten Antigens oder eines Antigens, daß an eine feste Oberfläche oder ein Kügelchen gebunden oder von diesen gefangen ist. Phagen, die in diesen Verfahren verwendet werden, sind typischerweise filamentartige Phagen, die fd- und M13-bindende Domänen, die aus Phagen mit Fab-, Fv- oder Disulfid-stabilisierten Fv-Antikörperdomänen exprimiert werden, die rekombinant entweder an das Phage-GenIII- oder -GenVIII-Protein fusioniert sind, umfassen. Phagendisplay-Verfahren, die zur Erzeugung der Antikörper, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, verwendet werden können, umfassen die in Brinkman et. al., J. Immunol. Methods 182: 41–50 (1995); Ames et. al., J. Immunol. Methods 184: 177–186 (1995); Kettleborough et. al., Eur. J. Immunol. 24: 952–958 (1994); Persic et. al., Gene 187 9–18 (1997); Burton et. al., Advances in Immunology 57: 191–280 (1994); PCT/GB91/01134; WO 90/02809 ; WO 91/10737 ; WO 92/01047 ; WO 92/18619 ; WO 93/11236 ; WO 95/15982 ; WO 95/20401 und den US-Patenten Nr. 5,698,426 ; 5,223,409 ; 5,403,484 ; 5,580,717 ; 5,427,908 ; 5,750,753 ; 5,821,047 ; 5,571,698 ; 5,427,908 ; 5,516,637 ; 5,780,225 ; 5,658,727 ; 5,733,743 und 5,969,108 offenbarten.
Wie in den obigen Referenzen offenbart, können nach der Phagenselektion die Antikörperkodierenden Regionen aus den Phagen isoliert und zur Erzeugung vollständiger Antikörper, einschließlich humaner Antikörper, oder irgendeines anderen gewünschten Antigen-bindenden Fragments verwendet und in irgendeinem gewünschten Wirt, einschließlich Säugerzellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen, Hefe und Bakterien, wie nachstehend ausführlich beschrieben, exprimiert werden. Beispielsweise können auch Techniken zur rekombinanten Produktion von Fab-, Fab'- und F(ab')2-Fragmenten unter Verwendung von Verfahren, die in der Technik bekannt sind, wie der in WO 92/22324 ; Mullinax et. al., BioTechniques 12 (6): 864–869 (1992) und Sawai et. al., AJRI 34: 26–34 (1995) und Retter et. al., Science 240: 1041–1043 (1988) offenbarten, eingesetzt werden.
Beispiele für Techniken, die zur Produktion von Einketten-Fvs und Antikörpern verwendet werden können, umfassen die in den US-Patenten 4,946,778 und 5,258,498 ; Huston et. al., Methods in Enzymology 203: 46–88 (1991); Shu et. al., PNAS 90: 7995–7999 (1993) und Skerra et.al., Science 240: 1038–1040 (1988) offenbarten.
Die Erfindung sieht ferner die Verwendung bispezifischer Antikörper vor, die durch Verfahren, die in der Technik bekannt sind, erzeugt werden können. Die herkömmliche Produktion bispezifischer Vollängen-Antikörper basiert auf der Coexpression zweier Immunoglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paare, wobei die beiden Ketten unterschiedliche Spezifitäten ha ben (Milstein et. al., 1983, Nature 305: 537–539). Wegen der willkürlichen Sortierung der Immunoglobulin-Schwer- und -Leichtketten produzieren Hybridome (Quadrome) ein potentielles Gemisch aus 10 verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur hat. Die Reinigung des korrekten Moleküls, die üblicherweise durch Affinitätschromatographieschritte erfolgt, ist eher hinderlich, und die Produktausbeuten sind gering. Ähnliche Verfahren werden in WO 93/08829 und in Traunecker et. al., 1991, EMBO J. 10: 3655–3659 offenbart.
Gemäß einem anderen und stärker bevorzugten Ansatz werden variable Antikörperdomänen mit den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Bindungsstellen) an konstante Immunoglobulindomänsequenzen fusioniert. Die Fusion erfolgt bevorzugt mit einer konstanten Immunglobulin-Schwerketten-Domäne, die zumindest einen Teil der Gelenk-, CH2- und CH3-Regionen umfaßt. Bevorzugt enthält die erste konstante Schwerkettenregion (CH1) die Stelle, die für eine Leichtkettenbindung notwendig ist, die bei mindestens einer der Fusionen vorkommt. DNAs, die die Immunoglobulin-Schwerketten-Fusionen kodieren, und nach Bedarf die Immunoglobulin-Leichtkette, werden in separate Expressionsvektoren eingeführt und in einen geeigneten Wirtsorganismus cotransfiziert. Dies sorgt für eine große Flexibilität bei der Einstellung der äquivalenten Anteile der drei Polypeptidfragmente in den Ausführungsformen, bei denen ungleiche Verhältnisse der drei Polypeptidketten, die zur Konstruktion verwendet werden, die optimalen Ausbeuten liefern. Es ist jedoch möglich, die kodierenden Sequenzen für zwei oder alle drei Polypeptidketten in einen Expressionsvektor einzuführen, wenn die Expression von mindestens zwei Polypeptidketten in gleichen Verhältnissen zu hohen Ausbeuten führt, oder wenn die Verhältnisse von keiner besonderen Signifikanz sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Ansatzes bestehen die bispezifischen Antikörper aus einer Hybrid-Immunoglobulin-Schwerkette mit einer ersten Bindungsspezifität in einem Arm, und einem Hybrid-Immunoglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paar (das eine zweite Bindungsspezifität liefert) in dem anderen Arm. Es wurde herausgefunden, daß diese asymmetrische Struktur die Trennung der gewünschten bispezifischen Verbindung aus unerwünschten Immunoglobulinkettenkombinationen erleichtert, da die Gegenwart einer Immunoglobulin-Leichtkette in nur einer Hälfte des bispezifischen Moleküls für einen leichten Trennungsweg sorgt. Dieser Ansatz wird in WO 94/04690 offenbart. Für weitere Ausführun gen zur Erzeugung bispezifischer Antikörper, siehe zum Beispiel Suresh et. al., Methods in Enzymology, 1986, 121: 210.
Die Erfindung stellt die Verwendung von funktional aktiven Fragmenten, Derivaten oder Analoga der Antipolypeptidimmunoglobulinmoleküle bereit. „Funktional aktiv" bedeutet, daß das Fragment, Derivat oder Analogon anti-anti-idiotypische Antikörper (d. h., tertiäre Antikörper), die dasselbe Antigen wie der Antikörper, aus dem das Fragment, Derivat oder Analogon stammt, erkennt, hervorrufen kann. Genauer gesagt kann in einer bevorzugten Ausführungsform die Antigenität des Idiotyps des Immunoglobulinmoleküls durch Deletion von Gerüst- und CDR-Sequenzen, die C-terminal zur CDR-Sequenz sind, die das Antigen spezifisch erkennt, verstärkt werden. Zur Bestimmung, welche CDR-Sequenzen das Antigen binden, können synthetische Peptide, die die CDR-Sequenzen enthalten, in Bindungsassays mit dem Antigen durch irgendein Bindungsassayverfahren, das in der Technik bekannt ist, verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung liefert die Verwendung von Antikörperfragmenten wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, F(ab')2-Fragmenten und Fab-Fragmenten. Antikörperfragmente, die spezielle Epitope erkennen, können durch bekannte Techniken erzeugt werden. F(ab')2-Fragmente bestehen aus der variablen Region, der konstanten Leichtkettenregion und der CH1-Domäne der schweren Kette und werden durch Pepsinspaltung des Antikörpermoleküls erzeugt. Fab-Fragmente werden durch die Reduktion der Disulfidbrücken der F(ab')2-Fragmente erzeugt. Die Erfindung liefert ebenso Schwerketten- und Leichtkettendimere der Antikörper der Erfindung oder irgendeines minimalen Fragments davon, wie Fvs oder Einkettenantikörper (SCAs) (wie beispielsweise in US-Patent 4,946,778 ; Bird, 1988, Science 242: 423–42; Huston et. al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879–5883 und Ward et. al., 1989, Nature 334: 544–54 beschrieben) oder irgendeines anderen Moleküls mit derselben Spezifität wie der Antikörper der Erfindung. Einkettenantikörper werden durch Verknüpfung der Schwerketten- und Leichtkettenfragmente der Fv-Region über eine Aminosäurebrücke gebildet, was zu einem Einkettenpolypeptid führt. Techniken zur Anordnung funktionaler Fv-Fragmente in E. coli können verwendet werden (Skerra et. al., 1988, Science 242: 1038–1041).
Die vorliegende Beschreibung liefert Fusionspolypeptide der Immunoglobuline der Erfindung (oder funktional aktiver Fragmente davon), in denen zum Beispiel das Immunoglobulin über eine kovalente Bindung (z. B. eine Peptidbindung) entweder am N-Terminus oder C-Terminus an eine Aminosäuresequenz eines anderen Polypeptids (oder eines Teils davon, bevorzugt einen Teil mit mindestens 10, 20 oder 50 Aminosäuren des Polypeptids), das nicht das Immunoglobulin ist, fusioniert wird. Bevorzugt ist das Immunoglobulin oder ein Fragment davon kovalent mit dem anderen Polypeptid am N-Terminus der konstanten Domäne verknüpft. Wie oben angegeben, können solche Fusionspolypeptide die Reinigung erleichtern, die Halbwertszeit in-vivo erhöhen und die Abgabe eines Antigens durch eine Epithelbarriere an das Immunsystem verstärken.
Die Immunoglobuline der Erfindung umfassen Analoga und Derivate, die beide modifiziert sind, d. h., durch die kovalente Anlagerung irgendeiner Art von Molekül, so lange eine solche kovalente Anlagerung das immunospezifische Binden nicht beeinträchtigt. Beispielsweise umfassen die Derivate und Analoga der Immunoglobuline die, die zum Beispiel durch Glycosylierung, Acetylierung, Pegylierung, Phosphylierung, Amidierung, Derivatisierung durch bekannte Schutz/Blockierungsgruppen, proteolytische Spaltung, Verknüpfen mit einem zellulären Liganden oder einem anderen Protein usw. weiter modifiziert wurden, ohne darauf beschränkt zu sein. Die zahlreichen chemischen Modifikationen können durch bekannte Techniken, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, spezifische chemische Spaltung, Acetylierung, Formylierung usw. durchgeführt werden. Überdies kann das Analogon oder Derivat eine oder mehre nicht-klassische Aminosäuren enthalten.
Die vorstehenden Antikörper können in in der Technik bekannten Verfahren, die sich auf die Lokalisierung und Aktivität der Polypeptide der Erfindung beziehen, z. B. zur Bildgebung oder Radiobildgebung dieser Proteine, Messen ihrer Konzentrationen in geeigneten physiologischen Proben, in Diagnoseverfahren usw. und für die Radiotherapie verwendet werden.
Die Antikörper der Beschreibung können durch irgendein in der Technik für die Synthese von Antikörpern bekanntes Verfahren, insbesondere durch chemische Synthese oder durch rekombinante Expression produziert werden, und werden bevorzugt durch die rekombinante Expressionstechnik produziert.
Die rekombinante Expression von Antikörpern oder Fragmenten, Derivaten oder Analoga davon erfordert die Konstruktion einer Nukleinsäure, die den Antikörper kodiert. Ist die Nukleotidsequenz des Antikörpers bekannt, kann eine Nukleinsäure, die den Antikörper kodiert, aus chemisch synthetisierten Oligonukleotiden konstruiert werden (wie beispielsweise in Kutmeier et. al., 1994, BioTechniques 17: 242 beschrieben), was kurz gesagt die Synthese überlappender Oligonukleotide, die Teile der Antikörper-kodierenden Sequenz enthalten, Annealing und Ligation dieser Oligonukleotide und dann Amplifikation der ligierten Oligonukleotide durch PCR umfaßt.
Alternativ kann die den Antikörper kodierende Nukleinsäure durch Klonen des Antikörpers erhalten werden. Ist ein Klon, der die den bestimmten Antikörper kodierende Nukleinsäure enthält, nicht verfügbar, die Sequenz des Antikörpermoleküls jedoch bekannt, kann eine den Antikörper kodierende Nukleinsäure aus einer geeigneten Quelle (z. B. einer Antikörper-cDNA-Bibliothek oder cDNA-Bibliothek, erzeugt aus irgendeinem Gewebe oder Zellen, die den Antikörper exprimieren) durch PCR-Amplifikation unter Verwendung synthetischer Primer, die an den 3'- und 5'-Enden der Sequenz hybridisierbar sind, oder durch Klonen unter Verwendung einer Oligonukleotidsonde, die für die jeweilige Gensequenz spezifisch ist, erhalten werden.
Ist ein Antikörpermolekül, das spezifisch ein bestimmtes Antigen erkennt, nicht verfügbar (oder eine Quelle für eine cDNA-Bibliothek zum Klonen einer einen solchen Antikörper kodierenden Nukleinsäure), können für ein bestimmtes Antigen spezifische Antikörper durch irgendein in der Technik bekanntes Verfahren, zum Beispiel durch Immunisierung eines Tiers wie eines Kaninchens, zur Erzeugung polyklonaler Antikörper oder stärker bevorzugt durch Erzeugung monoklonaler Antikörper erzeugt werden. Alternativ kann ein Klon, der zumindest den Fab-Teil des Antikörpers kodiert, durch Screenen von Fab-Expressionsbibliotheken (wie beispielsweise in Huse et. al., 1989, Science 246: 1275–1281 beschrieben) auf Klone von Fab-Fragmenten, die das spezifische Antigen binden, oder durch Screenen von Antikörperbibliotheken (siehe z. B. Clackson et. al., 1991, Nature 352: 624; Hane et. al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4937) erhalten werden.
Nach dem Erhalt einer Nukleinsäure, die zumindest die variable Domäne des Antikörpermoleküls kodiert, kann sie in einen Vektor, der die die konstante Region des Antikörpermoleküls kodierende Nukleotidesequenz enthält, eingeführt werden (siehe z. B. WO 86/05807 ; WO 89/01036 und US-Patent Nr. 5,122,464 ). Vektoren, die die vollständige leichte oder schwere Kette zur Coexpression mit der Nukleinsäure enthalten, um die Expression eines vollständigen Antikörpermoleküls zu ermöglichen, sind ebenso verfügbar. Dann kann die den Antikörper kodierende Nukleinsäure zur Einführung der Nukleotidsubstitution(en) oder -deletion(en) verwendet werden, die zur Substitution (oder Deletion) des einen oder mehrerer Cysteinreste der variablen Region, die an einer Disulfidspange mit einem Aminosäurerest beteiligt sind, der keine Sulfhydrylgruppe enthält, notwendig sind. Solche Modifikationen können durch irgendein in der Technik bekanntes Verfahren zur Einführung spezieller Mutationen oder Deletionen in eine Nukleotidsequenz, zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, chemische Mutagenese, ortsgerichtete In-vitro-Mutagenese (Hutchinson et. al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551), PCR-basierende Verfahren usw., durchgeführt werden.
Außerdem können Techniken verwendet werden, die zur Produktion „chimärer Antikörper" (Morrison et. al., 1984, PNAS. 81: 851–855; Neuberger et. al., 1984, Nature 312: 604–608; Takeda et. al., 1985, Nature 314: 452–454) durch das Spleißen von Genen aus einem Maus-Antikörpermolekül mit der geeigneten Antigenspezifität zusammen mit Genen aus einem humanen Antikörpermolekül mit der geeigneten biologischen Aktivität entwickelt wurden. Wie oben beschrieben, ist ein chimärer Antikörper ein Molekül, in dem verschiedene Teile aus unterschiedlichen Lebewesenspezies stammen, wie denen mit einer variablen Region aus einem Maus-mAb und einer humanen konstanten Antikörperregion, z. B. humanisierte Antikörper.
Nach dem Erhalt einer eine Antikörpermolekül kodierenden Nukleinsäure kann der Vektor zur Produktion des Antikörpermoleküls durch rekombinante DNA-Technologie unter Verwendung von Techniken, die in der Technik allgemein bekannt sind, produziert werden. Daher werden hierin Verfahren zur Herstellung der Polypeptide zur Verwendung in der Erfindung durch die Expression einer die Antikörpermolekülsequenzen enthaltenden Nukleinsäure beschrieben. Verfahren, die einem Fachmann allgemein bekannt sind, können zur Konstruktion von Expressionsvektoren, die ein Antikörpermolekül kodierende Sequenzen und geeignete transkriptionale und translationale Kontrollsignale enthalten, verwendet werden. Diese Verfahren umfassen zum Beispiel rekombinante In-vitro-DNA-Techniken, Synthesetechniken und genetische In-vivo-Rekombination. Siehe zum Beispiel die in Sambrook et. al., (1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) und Ausubel et. al., (Hrsg., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY) beschriebenen.
Der Expressionsvektor wird durch herkömmliche Techniken in eine Wirtszelle transferiert, und die transfizierten Zellen werden dann durch herkömmliche Techniken zur Produktion eines Antikörpers der Erfindung kultiviert.
Die Wirtszellen, die zur Expression eines rekombinanten Antikörpers der Erfindung verwendet werden, können entweder bakterielle Zellen, E. coli, oder bevorzugt eukaryotische Zellen, insbesondere zur Expression des gesamten rekombinanten Antikörpermoleküls sein. Genauer gesagt, sind Säugerzellen wie die Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO) in Verbindung mit einem Vektor wie dem Major-Intermediate-Early-Gen-Promotorelement aus dem humanen Cytomegalovirus ein effektives Expressionssystem für Antikörper (Foecking et. al., 1986, Gene 45: 101; Cockett et. al., 1990, Bio/Technology 8: 2).
Es kann eine Vielzahl von Wirt-Expressionsvektorsystemen zur Expression eines Antikörpermoleküls der Erfindung genutzt werden. Solche Wirt-Expressionssysteme repräsentieren Vehikel, durch die die in Frage stehenden kodierenden Sequenzen produziert und anschließend gereinigt werden können, repräsentieren aber auch Zellen, die, wenn sie mit den geeigneten Nukleotid-kodierenden Sequenzen transformiert oder transfiziert werden, das Antikörpermolekül der Erfindung in situ exprimieren. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Mikroorganismen wie Bakterien (z. B. E. coli, B. subtilis), transformiert mit rekombinanten Bakteriophagen-DNA-, Plasmid-DNA- oder Kosmid-DNA-Expressionsvektoren, die Antikörper-kodierende Sequenzen enthalten; Hefe (z. B. Saccharomyces, Pichia), transformiert mit rekombinanten Hefeexpressionsvektoren, die die Antikörper-kodierenden Sequenzen enthalten; Insektenzellsysteme, infiziert mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (z. B. Baculovirus), die Antikörper-kodierende Sequenzen enthalten; Pflanzenzellsysteme, infiziert mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (z. B. Blumenkohlmosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) oder transformiert mit rekombinanten Plasmidexpressionsvektoren (z. B. Ti-Plasmid), die Antikörper-kodierende Sequenzen enthalten; oder Säugerzellsysteme (z. B. COS-, CHO-, BHK-, HEK 293-, 3T3-Zellen), die rekombinante Expressionskonstrukte beherbergen, die Promotoren aus dem Genom von Säugerzellen (z. B. den Metallothionein promotor) oder aus Säugerviren (z. B. den späten Adenoviruspromotor; den Impfstoffvirus 7.5K-Promotor) enthalten.
In bakteriellen Systemen können mehrere Expressionsvektoren vorteilhafterweise in Abhängigkeit der für das exprimierte Antikörpermolekül vorgesehenen Verwendung ausgewählt werden. Wenn beispielsweise eine große Menge eines solchen Polypeptids für die Erzeugung pharmazeutischer Zusammensetzungen, die ein Antikörpermolekül umfassen, produziert werden soll, sind Vektoren, die die Expression hoher Konzentrationen an Fusionspolypeptidprodukten, die leicht zu reinigen sind, steuern, wünschenswert. Solche Vektoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, den E. coli-Expressionsvektor pUR278 (Ruther et. al., 1983, EMBO J. 2: 1791), in dem die Antikörper-kodierende Sequenz einzeln in den Vektor zusammen mit der lac Z-kodierenden Region ligiert werden kann, so daß ein Fusionspolypeptid produziert wird; pIN-Vektoren (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101–3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 5503–5509) und dergleichen. Auch pGEX-Vektoren können zur Expression fremder Polypeptide als Fusionspolypeptide mit Glutathion-S-transferase (GST) verwendet werden. Im allgemeinen sind solche Fusionspolypeptide löslich und können leicht aus lysierten Zellen durch Adsorption und Binden an eine Matrix aus Glutathion-Agarose-Kügelchen, gefolgt von der Flution in Gegenwart von freiem Glutathion gereinigt werden. Die pGEX-Vektoren umfassen Thrombin- oder Faktor-Xa-Protease-Spaltstellen, so daß das geklonte Zielgenprodukt aus der GST-Komponente freigesetzt werden kann.
In einem Insektensystem wird das Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) als ein Vektor zur Expression von Fremdgenen verwendet. Das Virus wächst in Spodoptera frugiperda-Zellen. Die Antikörper-kodierende Sequenz kann einzeln in nicht-essentielle Regionen (zum Beispiel das Polyhedringen) des Virus geklont und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors (zum Beispiel des Polyhedrinpromotors) gestellt werden. In Säugerwirtszellen können mehrere Virus-basierende Expressionssysteme (z. B. ein Adenovirusexpressionssystem) genutzt werden.
Wie oben erörtert, kann ein Wirtszellenstamm ausgewählt werden, der die Expression der eingeführten Sequenzen moduliert oder modifiziert und das Genprodukt in der gewünschten speziellen Art und Weise verarbeitet. Solche Modifikationen (z. B. Glycosylierung) und die Prozessierung (z. B. Spaltung) von Polypeptidprodukten können für die Aktivität des Polypeptids wichtig sein.
Für eine Langzeitproduktion rekombinanter Antikörper mit hoher Ausbeute ist eine stabile Expression bevorzugt. Beispielsweise können Zellinien, die einen in Frage stehenden Antikörper stabil exprimieren, durch Transfektion der Zellen mit einem Expressionsvektor, der die Nukleotidsequenz des Antikörpers und die Nukleotidsequenz eines selektierbaren Markers (z. B. Neomycin oder Hygromycin) umfaßt, und Selektieren in bezug auf die Expression des selektierbaren Markers, produziert werden. Solche genetisch hergestellten Zellinien können insbesondere beim Screenen und der Bewertung von Mitteln, die direkt oder indirekt mit dem Antikörpermolekül interagieren, nützlich sein.
Die Expressionsstärken des Antikörpermoleküls können durch Vektoramplifikation erhöht werden (für eine Übersicht, siehe Bebbington and Hentschel, The use of vectors based an gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Bd. 3. (Academic Press, New York, 1987)). Ist ein Marker in dem Antikörper-exprimierenden Vektorsystem amplifizierbar, wird die Erhöhung der Konzentration an Inhibitor, der in der Kultur der Wirtszelle vorliegt, die Anzahl an Kopien des Markergens erhöhen. Da die amplifizierte Region mit dem Antikörpergen assoziiert ist, wird auch die Produktion des Antikörpers steigen (Crouse et. al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 257).
Die Wirtszelle kann mit zwei Expressionsvektoren zur Verwendung in der Erfindung cotransfiziert werden, wobei der erste Vektor ein Schwerketten-abgeleitetes Polypeptid kodiert und der zweite Vektor ein Leichtketten-abgeleitetes Polypeptid kodiert. Die beiden Vektoren können identische selektierbare Marker enthalten, die die gleiche Expression von Schwer- und Leichtkettenpolypeptiden ermöglicht. Alternativ kann ein einzelner Vektor verwendet werden, der sowohl das Schwer- als auch das Leichtkettenpolypeptid kodiert. In solchen Situationen sollte die leichte Kette vor der schweren Kette plaziert werden, um einen Überschuß der toxischen freien schweren Kette zu vermeiden (Proudfoot, 1986, Nature 322: 52; Kohler, 1980, PNAS 77: 2197). Die kodierenden Sequenzen für die schweren und leichten Ketten können cDNA oder genomische DNA umfassen.
Nach der rekombinanten Expression des in der Erfindung verwendeten Antikörpermoleküls kann es durch irgendein in der Technik bekanntes Verfahren zur Reinigung eines Antikörpermoleküls, zum Beispiel durch Chromatographie (z. B. Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie wie beispielsweise mit Protein A oder spezifischem Antigen, und größenabhängige Säulenchromatographie), Zentrifugation, differentielle Solubilität oder durch irgendeine andere Standardtechnik zur Reinigung von Polypeptiden gereinigt werden.
Alternativ kann jedes Fusionspolypeptid ohne weiteres unter Nutzung eines Antikörpers, der für das exprimierte Polypeptid spezifisch ist, gereinigt werden. Zum Beispiel ermöglicht ein von Janknecht et. al. beschriebenes System die leichte Reinigung nicht denaturierter Fusionspolypeptide, die in menschlichen Zellinien exprimiert werden (Janknecht et. al., 1991, PNAS USA 88: 8972–897). In diesem System wird das in Frage stehende Gen in ein Vaccinia-Rekombinationsplasmid subkloniert, so daß das offene Leseraster des Gens translational an eine Amino-terminale Markierung, bestehend aus sechs Histidinresten, fusioniert wird. Die Markierung dient als eine Matrix-bindende Domäne für das Fusionsprotein. Extrakte aus Zellen, die mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus infiziert sind, werden auf Ni²⁺-Nitriloessigsäure-Agarosesäulen geladen, und Histidin-markierte Proteine werden selektiv mit Imidazol-enthaltenden Puffern eluiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Antikörper, die in der Erfindung verwendet werden, oder Fragmente davon an eine diagnostische oder therapeutische Komponente konjugiert. Die Antikörper können zur Diagnose oder Bestimmung der Wirksamkeit eines gegebenen Behandlungsregimes verwendet werden. Die Detektion kann durch das Koppeln der Antikörper an eine detektierbare Substanz erleichtert werden. Beispiele für detektierbare Substanzen umfassen verschiedene Enzyme, prothetische Gruppen, fluoreszierende Materialien, lumineszierende Materialien, biolumineszierende Materialien, radioaktive Nuclide, Positronen-emittierende Metalle (zur Verwendung bei der Positron-Emissionstomographie) und nicht-radioaktive paramagnetische Metallionen. Siehe allgemein US-Patent Nr. 4,741,900 , für Metallionen, die zur Verwendung als Diagnostika gemäß der vorliegenden Erfindung an Antikörper konjugiert werden können. Geeignete Enzyme umfassen Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, Betagalactosidase oder Acetylcholinesterase; geeignete prothetische Gruppen umfassen Streptavidin, Avidin und Biotin; geeignete fluoreszierende Materialien umfassen Umbelliferon, Fluorescein, Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Dichlortriazinyl aminfluorescein, Dansylchlorid und Phycoerythrin; geeignete lumineszierende Materialien umfassen Luminol; geeignete biolumineszierende Materialien umfassen Luciferase, Luciferin und Aequorin; und geeignete radioaktive Nuclide umfassen ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹¹¹In und ⁹⁹Tc.
Die Antikörper, die in der Erfindung verwendet werden, oder Fragmente davon können an ein therapeutisches Mittel oder eine Arzneimittelkomponente konjugiert werden, um eine gegebene biologische Reaktion zu modifizieren. Das therapeutische Mittel oder die Arzneimittelkomponente soll nicht auf die klassischen chemischen therapeutischen Mittel beschränkt sein. Beispielsweise kann die Arzneimittelkomponente ein Polypeptid, das eine gewünschte biologische Aktivität besitzt, sein. Solche Polypeptide können zum Beispiel ein Toxin wie Abrin, Ricin A, Pseudomonas-Exotoxin, oder Diphtherietoxin; ein Polypeptid wie den Tumor-Nekrose-Faktor, α-Interferon, β-Interferon, den Nervenwachstumsfaktor, den aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktor, den Gewebe-Plasminogen-Aktivator, ein Thrombosemittel oder ein anti-angiogenes Mittel, z. B. Angiostatin oder Endostatin; oder einen Modifikator der biologischen Reaktion wie ein Lymphokin, Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-6 (IL-6), Granulozytenmacrophagenkolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF), Granulozytenkolonie-stimulierenden Faktor (GCSF), Nervenwachstumsfaktor (NGF) oder einen anderen Wachstumsfaktor umfassen.
Techniken zur Konjugation solcher therapeutischen Komponenten an Antikörper sind allgemein bekannt, siehe z. B. Arnon et. al., „Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et. al., (Hrsg.), S. 243–56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et. al., „Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2. Aufl.), Robinson et. al., (Hrsg.), S. 623–53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, „Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et. al., (Hrsg.), S. 475–506 (1985); „Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibodies In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et. al., (Hrsg.), S. 303–16 (Academic Press 1985) und Thorpe et. al., „The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119–58 (1982).
Alternativ kann ein Antikörper zur Bildung eines Antikörperheterokonjugats an einen zweiten Antikörper konjugiert werden, wie in US 4,676,980 beschrieben.
Ein Antikörper mit oder ohne eine daran konjugierte therapeutische Komponente kann als ein Therapeutikum verwendet werden, das allein oder in Kombination mit einem oder mehreren zytotoxischen Faktoren und/oder Zytokinen verabreicht wird.
Beispiele
Die Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele, die den Umfang der vorliegenden Erfindung in keinster Weise einschränken sollen, beschrieben. Die Beispiele beziehen sich auf die Figuren, in denen:
1: die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.: 1) und Nukleinsäuresequenz (SEQ ID Nr.: 2) von DTD zeigt, wobei die Sequenz in der Swiss-Prot-Datenbank (die von dem Swiss Institute of Bioinformatics (SIB) geführt wird und auf http://www.expasy.ch/ zugänglich ist) unter der Zugangsnummer P50443 gespeichert ist.
2: die Verteilung von DTD-mRNA in normalen humanen Geweben und eine Vielzahl von humanen Tumour-abgeleiteten Zellinien zeigt. Die Expression wurde durch Echtzeit-RT-PCR quantifiziert und mRNA-Konzentrationen werden als die Anzahl von Kopien ng^–1 cDNA ausgedrückt.
3: die Expression von DTD-mRNA in Patienten-übereinstimmenden benachbarten normalen und Tumorbrustgeweben zeigt. Konzentrationen von DTD-mRNA in übereinstimmenden normalen und Tumorgeweben von sieben Brustkrebspatienten wurden durch Echtzeit-RT-PCR gemessen. mRNA-Konzentrationen werden als die Anzahl von Kopien ng^–1 cDNA ausgedrückt.
4: die Expression von DTD in normalen und Tumorbrustgeweben zeigt. Proben 1–25 sind Tumorproben, die keine Metastase in den Lymphknoten umfassen. Proben 26–50 sind Tumorproben, die Metastasen in mehreren Lymphknoten umfassen. Die letzten 3 Proben stammen aus normalem Brustgewebe (Reduktion von Mammoplastiken). Die mRNA-Konzentrationen werden als die Anzahl von Kopien ng^–1 cDNA ausgedrückt. Es gibt einen stati stisch signifikanten Unterschied zwischen allen Tumorproben und normalen Proben (T-Test, p < 0,05).
5: In-situ-RT-PCR-Analyse von DTD-mRNA-Expression in Sektionen von invasivem duktalem Brustkarzinomgewebe (obere Darstellung) und einer fortlaufenden Negativkontrollsektion, in der die DTD-Primer durch Primer für ein Kontrollgen (Prostate Specific Antigen) ersetzt wurden (untere Darstellung). Man beachte die hohe DTD-Expression (Dunkelfärbung) in einem Teil von Epithelhyperplasie (typisch für Brustkarzinom), umgeben von zwei Pfeilen in jeder Darstellung.
6: Western-Blot-Analyse von endogenem DTD-Protein in mehreren Zellinien unter Verwendung peptidspezifischer Einzelketten-Fv-Antikörpern (ScFv-Antikörpern). Zwei ScFv-Antikörper, die denaturiertes DTD binden, wurden durch Waschen von Phage gegen Kügelchen, konjugiert an Sammlungen DTD-abgeleiteter Peptide, isoliert. A, Spezifisches Binden von beiden Anti-DTD ScFv's (1 und 2) wird durch die Feststellung nachgewiesen, daß das Binden an denaturiertes DTD durch Vorinkubation mit den gesammelten Peptiden, die für die Phagenselektion verwendet werden, inhibiert wird. B, Expression von DTD-Protein in mehreren Zellinien unter Verwendung von Anti-DTD-ScFv1.
Beispiel 1: Klonen von DTD
Das Gen für DTD wurde auf Chromosom 5q31–q34 lokalisiert (Hastbacka J, et al. Genomics 1991, 11: 968–73). Eine Blast-Suche (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST mit dem DTD-Gen gegen Hochdurchsatz-Genomsequenzen (HTGS) ergibt den GenBank-Klon: AC011406. Die DTD-Sequenz wurde unter Verwendung von PCR aus einer Dickdarm-cDNA-Bibliothek unter Verwendung des folgenden Primerpaars amplifiziert:

Sense: 5' aggaagctgaaccatctatctc 3 (SEQ ID Nr.: 3)
Antisense: 5' actgggaaatgttggacacttg 3' (SEQ ID Nr.: 4)

Die Anordnung der Nukleotidsequenz von 1 (SEQ ID Nr.: 2) und ein Teil des genomischen Klons AC011406 zeigte die Gegenwart von 2 Exons, wobei die Grenze zwischen jedem Exon etwa bp 724 bis bp 729 in der in 1 gezeigten Sequenz (SEQ ID Nr.: 2) ist.
Dotlet, zugänglich unter http://www.isrec.isb-sib.ch/java/dotlet/Dotlet.html, wurde zur Anordnung der zwei Sequenzen verwendet.
Beispiel 2: Expression von DTD-mRNA in humanen Geweben und Zellinien
Quantitative Echtzeit-RT-PCR wurde (Neid, CA., Stevens, J., Livak, K. J. & Williams, P. M. Genome Res. 6, 986–994 (1996); Morrison, TB., et al. Biotechniques 24, 954–958 (1998)) zur Analyse der Verteilung von DTD-mRNA in normalen humanen Geweben und Tumorabgeleiteten Zellinien (2) verwendet.
Quantifikation von DTD-mRNA durch Echtzeit-RT-PCR
Echtzeit-RT-PCR wurde zur quantitativen Messung der DTD-Expression in cDNA-Proben verwendet, abgeleitet von: normalen humanen Geweben (Clontech), Tumor-abgeleiteten Zelllinien, Brustkarzinomgeweben, die während eines chirurgischen Eingriffs entfernt wurden und normalem Brustgewebe, das während Brusterkleinerungsmammoplastiken entfernt wurde. Die ethische Zulassung der normalen und Tumorbrustproben wurde in der Chirurgie erhalten (Universität Oxford, UK). Die Primer, die für die PCR verwendet wurden, waren die folgenden:

Sense: 5 ccagtccattgettattccctg 3' (SEQ ID Nr.: 5)
Antisense: 5' gttctcggtcaactgtctcacc 3' (SEQ ID Nr.: 6)

Die Reaktionen enthielten 10 ng cDNA, SYBR-Grün-Sequenzdetektionsreagenzien (PE Biosystems), und die Sense- und Antisenseprimer wurden auf einem AB17700-Sequenzdetektionssystem (PE Biosystems) untersucht. Die PCR-Bedingungen waren 1 Zyklus bei 50 °C für 2 min, 1 Zyklus bei 95 °C für 10 min und 40 Zyklen bei 95 °C für 15 s, 65 °C für 1 min. Die Akkumulation des PCR-Produktes wurde in Echtzeit als eine Steigerung der SYBR-Grünfluoreszenz gemessen und die Daten wurden unter Verwendung des Sequenz Detector-Programms v1.6.3 (PE Biosystems) analysiert. Standardkurven, die die anfängliche Matrizen-Kopienzahl mit der Fluoreszenz und dem Amplifikationszyklus in Verbindung bringen, wurden unter Verwendung des amplifizierten PCR-Produktes als eine Matrize erzeugt und zur Berechnung der DTD-Kopienzahl pro ng cDNA in jeder Probe verwendet.
2 zeigt, daß die Verteilung von DTD-mRNA-Expression in normalen Geweben auf Testis, Dickdarm und Nebenniere beschränkt war, mit nur geringen Konzentrationen an DTD-Signal, detektiert in anderen normalen Geweben, einschließlich Brustdrüse. Im Gegensatz dazu war DTD-mRNA in der MDA-MB-435-Brusttumor-abgeleiteten Zellinie und in einen geringeren Grad in den MDA-MB-468-Brusttumor- und PC3-Prostatatumorzellinien erhöht (2).
In Anbetracht der Feststellung, daß DTD-mRNA in der MDA-MB-435-Brustkrebs-abgeleiteten Zellinie erhöht war, wurde die DTD-mRNA-Expression in sieben Patientenübereinstimmenden benachbarten normalen und Tumorgewebeproben verglichen (3). Die DTD-Expression war in allen Brusttumorproben bezogen auf ihre entsprechenden normalen Gewebe erhöht, wobei fünf der Proben eine achtmal so hohe Expression zeigten. Um die Verbindung der DTD-mRNA-Expression mit Brusttumorgeweben weiter zu untersuchen, erweiterten wir die Quantifikation von DTD-mRNA-Konzentrationen auf weitere 40 Tumorproben, von denen 20 von Patienten mit Lymphknotenmetastasen und 20 von Patienten ohne Metastasen stammten (4). DTD-mRNA-Expression war in der Mehrheit der Brustkrebsproben bezogen auf die normalen Brustgewebekontrollen erhöht, es gab jedoch keine signifikante Verbindung der Expression mit Lymphknotenmetastasen gegen Nicht-Lymphknotenmetastasen (4).
Beispiel 3 In-situ-RT-PCR
Um die Beteiligung von DTD an Brustkrebs weiter zu veranschaulichen, wurde die In-situ-RT-PCR-Analyse der DTD-Expression an Sektionen von invasiven duktalen Brustkarzinomgeweben durchgeführt.
Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete Brustgewebe aus Patienten mit duktalem Karzinom wurden auf Objektträgern seziert (5 μm dick) (bereitgestellt von Human Research Tissue Bank, Department of Cellular Pathology, Peterborough District Hospital, Thorpe Road, Peterborough PE3 6DA). Kurz gesagt, das Gewebe wurde in Xylol entwachst, allmählich durch Alkohol rehydratisiert und in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) vor der Permeabilisierung in 0,01 % Triton X-100 für 3 Minuten gewaschen, gefolgt von der Behandlung mit Proteinase K für 30 Minuten bei 37 °C.
Direkte In-situ-RT-PCR wurde in einem GeneAmp In Situ PCR System 1000 (Perkin Elmer Biosystems) unter Verwendung eines GeneAmp Thermostable rTth RT PCR Kits (Perkin Elmer Biosystems) durchgeführt. Die Primer, die zum Amplifizieren von DTD verwendet wurden, sind folgendermaßen:

Sense: 5'-gctggagtttatcaggtagcga-3' (SEQ ID Nr.: 7)
Antisense: 5'-ttgcatctacagccacactagg-3' (SEQ ID Nr.: 8)

Die Parameter der thermischen Zyklussequenzierung waren: 1 Zyklus bei 94 °C für 2,5 Minute, gefolgt von 20 Zyklen bei 94 °C für 40 Sekunden, 60 °C für 50 Sekunden und 72 °C für 30 Sekunden. Das amplifizierte Produkt war durch die direkte Einführung von alkalistabilem Digoxigenin-11-dUTP (Roche Diagnostics Ltd.), das dem Reaktionsgemisch zugegeben wurde, detektierbar. Nach dem Waschen in PBS wurde ein Anti-Digoxigenin-Gold-Antikörper (Roche Diagnostics Ltd.) 30 Minuten bei Raumtemperatur auf der Gewebesektion inkubiert, wonach ein Silberverstärkungsschritt folgte (Roche Diagnostics Ltd., Silberverstärkungsreagenzien), wobei während dessen das amplifizierte Expressionsprodukt durch Lichtmikroskopie sichtbar wurde. Das Gewebe wurde mit Hematoxylin (Dako Ltd.) gegengefärbt, und es wurden Bilder mit einer Digitalkamera, die an dem Lichtmikroskop angebracht ist, aufgenommen (x10-Objektes).
In den beiden Bildern aus 6 zeigt die obere Darstellung die DTD-Expression im Brustkrebsgewebe, die untere Darstellung stellt eine negative Kontrollfolgesektion dar, in der die DTD-Primer durch nicht-spezifische Primer ersetzt wurden. Aus diesen Figuren ist deutlich erkennbar, daß DTD in den karzinösen duktalen Epithelzellen dieses Brustkrebsgewebes spezifisch exprimiert wird (im Vergleich mit dem umliegenden Brustgewebe und dem Negativkontrollexperiment). Zum Beispiel ist ein Teil von Epithelhyperplasie (typisch für Brustkarzinom) durch zwei Pfeile gekennzeichnet (obere Darstellung); dies zeigt, daß die Fläche der Dunkelfärbung (die die BCMP 101-Expression darstellt) auf die Krebszellen beschränkt ist (5).
Zusammenfassend zeigt DTD ein begrenztes Muster der mRNA-Expression in normalen humanen Geweben, ist aber in einigen Brustkrebs-abgeleiteten Zellinien und mehreren Brusttumorgeweben erhöht, was darauf schließen läßt, daß dieses Protein Potential als ein therapeutisches Target aufweist.
Beispiel 4: DTD-Protein-Expression in der MDA-MB-435-Brusttumor-abgeleiteten Zellinie
Zur Untersuchung der DTD-Proteinexpression wurden Anti-DTD-Einzelketten-Fv-Antikörper (ScFv-Antikörper) erzeugt. Kurz, Sammlungen DTD-abgeleiteter Peptide wurden an Kügelchen konjugiert und mit Phage, der ScFv's zeigte, zur Isolation einer kleinen Anzahl von Anti-DTD-Bindern mit hoher Affinität gewaschen. Die Western-Blot-Analyse in 6A zeigt spezifische Bindung von zwei der isolierten ScFv's (1 und 2). In diesem Experiment wird die Bindung von beiden ScFv's durch Vorinkubation mit den gesammelten Peptiden, die für die Phagenselektion verwendet werden, inhibiert.
6B zeigt ein Western-Blot der endogenen DTD-Proteinexpression in mehreren Zellinien unter Verwendung der Anti-DTD-ScFv's. Bei den getesteten Zellinien wurde die höchste DTD-Proteinexpression in der MDA-MB-435-Brusttumorzellinie und in einer geringeren Konzentration in der PC3-Prostatatumorzellinie identifiziert. Diese Daten stimmen vollständig mit den Ergebnissen von 3 überein, wo die MDA-MB-435-Zellinie die höchsten mRNA-Expressionsniveaus aufwies.

Claims

Verfahren zum Screening auf und/oder zur Diagnose von Brustkrebs in einem Individuum, wobei man in einem Verfahrensschritt in einer von dem Individuum erhaltenen biologischen Probe folgendes nachweist und/oder quantifiziert: (i) ein DTD-Polypeptid, das a) die in 1 (SEQ ID NO: 1) dargestellte Aminosäuresequenz umfaßt oder aus dieser besteht; b) ein Derivat mit einer oder mehreren Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -insertionen relativ zur in 1 (SEQ ID NO: 1) dargestellten Aminosäuresequenz ist, bei dem die DTD-Aktivität erhalten ist; oder c) ein Fragment eines Polypeptids mit der in a) oder b) oben angegebenen Bedeutung ist, das eine Länge von mindestens 10 Aminosäuren aufweist und bei dem die DTD-Aktivität erhalten ist; wobei der genannte Schritt die Verwendung eines spezifisch an das DTD-Polypeptid bindenden Antikörpers umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Spiegel des DTD-Polypeptids in einer biologischen Probe mit einem vorbestimmten Referenzbereich oder einer Kontrolle verglichen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper an einer Festphase immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Nachweisschritt die Verwendung eines markierten Bindungspartners für den Antikörper umfaßt oder wobei der Antikörper mit einem nachweisbaren Marker markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen, polyklonalen, chimären, humanisierten oder bispezifischen Antikörper oder ein epitopbindendes Fragment eines dieser Antikörper handelt.
Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch an ein DTD-Polypeptid mit der in Anspruch 1 angegebenen Bedeutung bindet, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Brustkrebs.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen, polyklonalen, chimären, humanisierten oder bispezifischen Antikörper oder ein epitopbindendes Fragment eines dieser Antikörper handelt.
Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei der Antikörper an ein Therapeutikum oder eine Arzneistoffgruppierung konjugiert ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei es sich bei der Arzneistoffgruppierung um ein Toxin handelt.