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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung ist auf das Gebiet der Diagnose eines Belastungszustands
bzw. von Stressbeschwerden des zentralen Nervensystems (ZNS) gerichtet.
Insbesondere betrifft die Erfindung die Bewertung der Konzentrationen
von Acetylcholinesterase und Fragmenten davon zur Bestimmung des
ZNS-Belastungszustands. Der ZNS-Belastungszustand umfasst das Durchdringen
von Substanzen mit hohem Molekulargewicht durch die Blut-Hirn-Schranke
und eine Belastung aufgrund von psychologischen, chemischen oder
physischen Verletzungen.
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Einleitung
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Das
Enzym Acetylcholinesterase (AChE) wird im Gehirngewebe exprimiert,
aber auch in den meisten hämatopoetischen
Zelllinien. AChE wird in vielen Teilen des Vertebratenembryos exprimiert,
mit einem durch die Entwicklung regulierten Muster in speziellen
Zelltypen und Geweben während
der Embryonalstadien und adulten Stadien. Die Verschiedenheit von
AChE wird bei mehreren pathologischen Zuständen, wie etwa der Alzheimer-Krankheit
festgestellt, wobei gezeigt wurde, dass AChE-Tetramere im Gehirn
abnehmen.
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AChE-prä-mRNA wird
einem alternativen Spleißen
unterzogen. Die synaptische Speißvariante AChE-S-mRNRA wird
durch Spleißen
von Exon 4 bis Exon 6 gebildet. AChE-E-mRNA wird durch Spleißen von
Exon 4 bis Exon 5 gebildet. AChE-R-mRNA
wird durch fehlendes Spleißens
des Pseudointrons 4 gebildet, wodurch sich das E1-E2-E3-E4-I4-E5-mRNA-Transkript
ergibt.
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WO
98/22132 beschreibt Zusammensetzungen mit Mitteln zur Erleichterung
der Passage von Verbindungen durch die Blut-Hirn-Schranke (BBB, "blood brain barrier") in das zentrale
Nervensystem. Die Zusammensetzung umfasst das Protein der durchgelesenen
AChE-I4-Spleißvariante
oder das I4-Peptid oder alternativ cholinerge Arzneimittel. Diese
Zusammensetzungen erleichtern die Öffnung der BBB, wodurch der Transport
von Verbindungen durch die BBB ermöglicht wird.
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WO
97/35962 offenbart ein biologisch aktives Peptid, welches von dem
AChE-Enzym abgeleitet
ist und begleitende Antikörper,
welche dieses Peptid erkennen. Die Autoren beschreiben, dass das
von AChE abgeleitete Peptid möglicherweise
eine Öffnungsaktivität eines
Calciumkanals in der BBB modulieren kann, welche möglicherweise
durch Antikörper
gegen dieses Peptid gehemmt (und gesteuert bzw. kontrolliert) werden kann.
Folglich wird ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung
zur Steuerung der zytoplasmatischen Calciumionenkonzentration in
vivo ebenso wird ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung zur
Behandlung von Erkrankungen des zentralen Nervensystems oder von
Schlaganfall oder Krebs beschrieben.
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In
der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise gefunden,
dass AChE-R-mRNA und das AChE-R-Protein als Reaktion auf ZNS-Verletzungen
erhöht
ist. Diese Verletzungen umfassen psychologische, chemische und physische
Verletzungen. Es ist weiterhin gefunden worden, dass die Blut-Hirn-Schranke
nach Belastungsverletzungen beeinträchtigt ist und dass das Auftreten
des AChE-R-Proteins
in Fluiden des zentralen Nervensystems als ein Indikator für eine Belastung
des zentralen Nervensystems und einer Beeinträchtigung der Blut-Hirn-Schranke
dienen kann.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft einen Antikörper,
welcher eine "durchgelesene" Acetylcholinesterase
erkennt und insbesondere ein C-terminales Peptid, welches von Acetylcholinesterase
abgeleitet ist, zur Verwendung bei der Diagnose einer Belastung
des zentralen Nervensystems (ZNS) oder einer Beeinträchtigung
der Blut-Hirn-Schranke.
Die ZNS-Belastung ist bevorzugt eine ZNS-Belastung, welche durch
eine psychologische, chemische oder physische Verletzung verursacht
wurde. Der Antikörper
erkennt bevorzugt ein C-terminales Peptid, welches von Acetylcholinesterase
abgeleitet ist, welches die mit SEQ ID NO:1 bezeichnete Aminosäuresequenz
aufweist. Weiterhin ist der Antikörper bevorzugt monoklonal.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Diagnose einer Belastung
des zentralen Nervensystems (ZNS) oder einer Beeinträchtigung
der Blut-Hirn-Schranke in einem Säuger bereit, umfassend Inkontaktbringen
einer Probe, welche von einem Säuger
entnommen wurde, mit einem erfindungsgemäßen Antikörper, Entfernen von ungebundenem
Antikörper
und Nachweisen des Ausmaßes
der Reaktion zwischen dem Antikörper und
in der Probe vorliegender Acetylcholinesterase oder eines Fragments
davon. Die ZNS-Belastung ist bevorzugt eine ZNS-Belastung, welche
durch eine physische, chemische oder eine psychologische Verletzung verursacht
wurde. In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist die physische Verletzung eine Kopfverletzung,
ein Schädeltrauma
oder eine Strahlenbelastung. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der
Erfindung ist die chemische Verletzung eine Exposition gegenüber einem
Insektizid oder einem Nervengas.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose der Alzheimer-Krankheit,
umfassend Inkontaktbringen einer Probe, welche einem Patienten entnommen
wurde, mit einem erfindungsgemäßen Antikörper, Entfernen
von ungebundenem Antikörper
und Nachweisen des Ausmaßes
der Reaktion zwischen dem Antikörper
und in der Probe vorliegender Acetylcholinesterase oder eines Fragments
davon.
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Die
Probe ist bevorzugt Serum oder eine Zerebrospinalflüssigkeitsprobe.
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Kurze Beschreibung
der Figuren
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1 – AChE-Expression
in CSF unter Stress
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Proben
von humaner Zerebrospinalflüssigkeit
(CSF) von Patienten mit Belastung (+) und ohne Belastung (–) wurden
einer SDS-PAGE unterzogen. Die Blots wurden mit Antikörpern gegen
die gemeinsame Domäne
von AChE (Com Abs) (links) oder mit Anti-ARP-Antikörpern (α-I4) (rechts)
inkubiert. Als Kontrollen dienten Extrakte (ext) von Xenopus-Oozyten
(I4) und rekombinante AChE-S (rE6).
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2A und 2B – Nachweis
von AChE in Hirngeweben von transgenen Mäusen, die humane AChE-Konstrukte
exprimieren.
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2A – zeigt
eine Western Blot-Analyse von Extrakten aus der Cortex-Region (cort)
und der Region der Basalganglien (bas nuc), welche entnommen wurden
aus dem Hirn einer Kontrollmaus (C) und einer transgenen FVB/N-Maus,
welche humane AChE-Varianten expiimiert, E6 exprimiert humane AChE-S, "In" bezeichnet eine
transgene Maus, welche durch Insertion inaktivierte humane AChE-S
exprimiert, I445 und I470A
bezeichnen eine transgene Maus, welche verschiedene AChE-R-Konstrukte
exprimiert. Die Gewebe wurden extrahiert, auf 8%-igen SDS- PAGE-Gelen gefahren
und unter Verwendung von Antikörpern
gegen die gemeinsame Domäne
geblottet. Als eine Kontrolle wurden parallel Extrakte (ext) von
Xenopus-Oozyten gefahren, welche humane AChE-S (E6), AChE-R (I4)
oder AChE-E (E4)
exprimieren.
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2B – zeigt
eine Western Blot-Analyse der entsprechenden Proben, welche auf
einem 4-20%-igen SDS-PAGE- Gradientengel aufgetrennt wurden und
unter Verwendung von Antikörpern
gegen GST-I4 geblottet wurden.
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3 – ARP häuft sich
unter Stress im Serum an
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Mit
PSLoinceau gefärbte
Polyacrylamidgradientengele (4–20%)
(oben), welche beladen wurden mit einem Proteinextrakt von COS-Zellen,
welche mit einem für
AChE-R codierenden Plasmid transfiziert wurden und mit synthetischem
ARP gemischt wurden (ARP+AChE-R); rekombinante AChE-S (Sigma), gemischt
mit synthetischem ASP (ASP+AChE-S); Serum (2 μl) von einer mit Saline injizierten
Maus, 24 h nach der Behandlung als Kontrolle (Cont) entnommen; Serum
von einer Maus, welche einer Belastung unterzogen wurde (Str). Molekulargewichtsmarker
(kDa) sind auf der linken Seite gezeigt. Das Gel wurde dann geblottet
und mit affinitätsgereinigten
Kaninchen-Antikörpern
inkubiert, welche durch ein rekombinantes GST-ARP ausgelöst wurden (unten).
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4 – Begrenzter
Schwimmsfress induziert innerhalb von „Ihr" eine feine Verzögerung der LTP-Induktion
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Es
wurde der Schaffer-Kollateralen-CA1-Synapsenweg bei Schnitten des
Hippocampus von einer Maus mit Belastung (str) gegenüber einer
Kontrollmaus (cont) nach einer LTP-Induktion untersucht. Die Veränderungen
in der Steigung (SL) des postsynaptischen Feldpotenzials wurden
für 3 h
verfolgt (angegeben als Zeit = T in Minuten).
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5 – Schnitte
von transgenen Tieren, die AChE-R überexprimieren, zeigen auch
einen langsamen Beginn von LTP
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Es
wurde der Schaffer-Kollateralen-CA1-Synapsenweg bei Schnitten des
Hippocampus von einer transgenen Maus, welche die "durchgelesene" Isoform AChE-R (trans) überexprimiert
im Vergleich mit einer Kontrollmaus (cont) wurden nach LTP-Induktion untersucht.
Die Veränderungen
in der Steigung (SL) des postsynaptischen Feldpotenzials wurden
für 3 h
verfolgt (angegeben durch Zeit = T in Minuten).
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6A – 6C – Durchdringung
der Blut-Hirn-Schranke unter einer Belastung
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6A – zeigt
die Farbstoffdurchdringung in das Gehirn von belasteten Mäusen (str)
im Vergleich mit nicht belasteten Kontrollmäusen (cont).
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6B – zeigt
Computertomographiescans von Patienten mit (OMN) und ohne (PR INJEC
= vor Injektion) Verabreichung von Omnipaque (Nycomed AS), einem
löslichen
iodhaltigen Kontrastmittel. Die Proben sind wie folgt: NOR (normal),
ECLA (Eklampsie) und FOC SE (fokaler Anfall).
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6C – zeigt
die klinische Konelation (clin corr) der BBB mit Belastungsindikatoren
wie etwa Herzfrequenz (hr Ra), Leukozytenzahl (leuk) und Serumcortisol-
(cort) und Testosteronspiegel (testos), Blutdruck (bI pres) und
Körpertemperatur
(temp).
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7A und 7B – CT Scans
von Patienten und statistische Analyse von Regionen, welche dabei ein
verstärktes
Signal zeigen
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7A – zeigt
ein Beispiel eines verstärkten
Omnipaque-Signals, gezeigt durch einen CT-Scan einer Eklampsie (ECLA),
einem fokalen Anfall (FOC SE) im Vergleich mit Kontrollpatienten
(NOR) und auch bei Patienten nach einer Ischämie (PO ISCH).
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7B – zeigt
eine Analyse der Region des Gehirns, welche die größte Signalverstärkung (Enhanc) zeigt,
eine signifikante Signalverstärkung
wurde in der Corona radiata (Cor Rad), der grauen Substanz (Gr Ma) und
Weichteilregionen (S. Tis) gefunden. Es wurde eine sehr geringe
Verstärkung
der Durchdringung des Kontrastmittels in die Thalamusregion (Thal)
gefunden, und die Regionen des Cerebellum (Cereb) und des Pons (Pon)
scheinen unbeeinflusst.
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8A und 8B – Expression
von AChE in AD-Patienten
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8A – zeigt
eine Immundetektion von AChE in AD- und Kontroll-CSF. CSF-Proben von Patienten mit
Alzheimer-Krankheit (AD) oder von gesunden Kontrollen (Cont) wurden
einer elektrophoretischen Trennung unterzogen, gefolgt von einer
Immunoblotanalyse. Die Blots wurden mit einem Antikörper gegen
das C-terminale Peptid, welches für AChE-R einzigartig ist (a-ARP – oberes
Feld) oder mit einem Antikörper,
welcher gegen die gemeinsame Domäne
aller AChE-Isoformen gerichtet ist (a-cor; unteres Feld) inkubiert.
ARP, humane rekombinante AChE-S und AChE-R wurden als positive oder
negative Kontrollen rechts an den Filtern verwendet. Die Molekulargewichtsmarker
sind mit M bezeichnet.
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8B – zeigt
die Quantifizierung der Immundetektionssignale durch eine densitometrische
Analyse. AChE-R (links)- und Gesamt-AChE (rechts)-Proteinspiegel
(Tot AChE Lev) werden als relative Intensitäten jedes Bandes innerhalb
einzelner Bahnen der Filter von 8A dargestellt,
nach der Inkubation mit Anti-ARP (a-ARP) bzw. Anti-Core (a-co).
Mit Anti-ARP werden drei Proteine beobachtet [oben (To), mitte (Inter)
und unten (Bot)], mit Anti-Core aber nur zwei (oben und unten).
Die Werte werden als Mittelwert ± SEM dargestellt, berechnet
als Durchschnitt aus sechs unabhängigen
Bestimmungen. *p < 0,05
signifikanter Unterschied einer Gruppe, bestimmt durch den Student-Test.
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9A bis 9H – Immunomarkierung
von ARP in normalen Hirnschnitten verglichen mit AD-Hirnschnitten
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9A – zeigt
in Paraffin eingebettete Schnitte eines Hippocampus eines Alzheimer-Kranken
(als AD-hipp bezeichnet). Die Neuronen (links) und Mikroglia (rechts)
sind in der gleichen Region gefärbt.
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9B – zeigt
in Paraffin eingebettete Schnitte des Cingulat Cortex (Cin-cort)
einer Kontrolle (Cont, links) und eines Alzheimer-Kranken (AD, rechts).
Blutgefäße in den
Kontrollschnitten sind stark gefärbt.
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9C – zeigt
eine Färbung
von Blutgefäßen (BLV)
bei in Paraffin eingebetteten Schnitten des Cingulat Cortex bei
Kontrollen (Cont, oben) und bei Alzheimer-Krankheit (AD, unten). In den Kontrollschnitten
sind Blutgefäße stark
gefärbt.
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9D – zeigt
in Paraffin eingebettete Schnitte des Temporalcortex (Temp-Cort)
bei Alzheimer-Krankheit (AD). Sowohl Mikroglia (migli, links) als
auch Knäuelzellen
(„tangle
cells") (tang, rechts)
sind stark gefärbt.
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9E – zeigt
eine mittlere Vergrößerung (int
mag) von in Paraffin eingebetteten Schnitten des Temporallappens
(Temp-Lo) einer Kontrolle (Cont, links) und eines Alzheimer-Kranken
(AD, rechts). Bei den normalen Kontrollschnitten sind nur Pyramidenneuronen
gefärbt.
Bei den AD-Schnitten wird die Färbung
von Mikrogliazellen wahrgenommen, welche in der Kontrolle nicht
vorhanden ist.
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9F – zeigt
eine geringe Vergrößerung (Io
mag) der 9E. Bei den normalen Kontrollschnitten (links)
erscheint die Färbung
in Schichten, während
die Mikrogliazellen in den AD-Schnitten erscheinen (rechts).
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9G – zeigt
eine Färbung
von in Paraffin eingebetteten Schnitten des Corpus callosum (Corp-Call) einer
Kontrolle (Cont, oben) und eines Alzheimer-Kranken (AD, rechts).
Bei den AD-Schnitten wird die Färbung entlang
der neuronalen Ausdehnung wahrgenommen.
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9H – zeigt
eine ARP-Färbung
von Neuronen und Mikroglia bei in Paraffin eingebetteten Schnitten des
Temporallappens (Temp-Io) einer normalen Kontrolle (Cont, links)
und eines Alzheimer-Kranken (AD, rechts). Bei den normalen Kontrollschnitten
sind Neuronen und Blutgefäße gefärbt, während bei
den AD-Schnitten Mikrogliazellen gefärbt sind.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Eine
Anzahl von Begriffen, welche hierin verwendet werden, sind nachfolgend
definiert:
- AChE,
- Acetylcholinesterase;
- ARP,
- "durchgelesenes" Acetylcholinesterasepeptid;
- ASP,
- "synaptisches" Acetylcholinesterasepeptid;
- BuChE,
- Butyrylcholinesterase;
- CNS,
- zentrales Nervensystem;
gemeinsame Domäne,
die Region von AChE, welche allen Speißvarianten gemeinsam ist, umfasst
die Exons 1–4;
- CSF,
- Zerebrospinalflüssigkeit;
- GST,
- Glutathion-S-Transferase;
- ODN,
- Oligodesoxynukleotid;
- ORF,
- offener Leserahmen;
- RT,
- Raumtemperatur;
- UTR,
- nicht translatierte
Terminalregion;
- WBC,
- weiße Blutzellen.
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Eine
Anzahl von Verfahren des Fachgebiets der Molekularbiologie wird
hierin nicht ausführlich
erläutert,
da sie einem Fachmann bekannt sind. Solche Verfahren umfassen eine
ortsgerichtete Mutagenese, PCR-Klonierung, Expression von cDNAs,
Analyse von rekombinanten Proteinen oder Peptiden, Transformation
von Bakterien- und
Hefezellen, Transfektion von Säugerzellen
und dergleichen. Lehrbücher,
welche solche Verfahren beschreiben, sind beispielsweise Sambrook
et al., "Molecular
Cloning: A Laboratory Manual",
Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN: 0879693096, 1989, "Current Protocols
in Molecular Biology" von
F. M. Ausubel, ISBN: 047150338X, John Wiley & Sons, Inc:, 1988 und "Short Protocols in
Molecular Biology" von
F. M. Ausubel et al., (Ed.) 3. Auflage, John Wiley & Sons, ISBN: 0471137812,
1995. Weiterhin wird eine Vielzahl von immunologischen Verfahren
nicht in jedem Fall hierin ausführlich
beschrieben, da sie einem Fachmann bekannt sind. Siehe beispielsweise "Current Protocols
in Immunology",
Coligan et al. (Ed.), John Wiley & Sons, Inc.,
New York, NY.
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Die
Erfindung umfasst Anti-AChE-Antikörper und deren Verwendung für die Diagnose
von pathologischen Beschwerden des ZNS. Polyklonale Antikörper können in
Kaninchen, Hühnern,
Mäusen,
Ratten, Schafen oder ähnlichen
Säugern
erzeugt werden. Für
die Erzeugung von Antikörpern
gegen ein erfindungsgemäßes Peptid
wird das Peptid durch rekombinante DNA-Technologie in Säugerzellen
hergestellt, wie es in den obigen allgemeinen Verweisen auf die
Molekularbiologie beschrieben wird. Alternativ kann das Peptid durch organische
Chemie synthetisch hergestellt werden. Das Peptid kann auch in Bakterienzellen
oder Insektenzellen hergestellt werden, wie im oben erwähnten "Current Protocols
in Molecular Biology",
Kapitel 16 ausführlich beschrieben
wird.
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Das
Peptid wird aus den Zellen, in welchen es hergestellt wurde, gereinigt.
Verfahren zur Peptidreinigung sind einem Fachmann bekannt und werden
beispielsweise in den oben erwähnten "Current Protocols
in Molecular Biology",
Kapitel 16 und in "Current
Protocols in Protein Science",
Wiley & Sons,
Inc., Kapitel 5 und 6 ausführlich
beschrieben. Vorteilhafterweise kann das Peptid als eine Fusion
mit einem zweiten Protein hergestellt werden, wie etwa Glutathion-S-transferase
oder dergleichen, oder einem Sequenz-Tag, wie etwa der Histidin-Tag-Sequenz.
Die Verwendung von Fusionsproteinen oder markierten Proteinen vereinfacht
das Reinigungsverfahren, wie ausführlich in den oben erwähnten "Current Protocols
in Molecular Biology",
Kapitel 16 und in den Anweisungen für die His-Tag-Proteinexpression
und im Reinigungskit, erhältlich
von der Qiagen GmbH, 40724 Hilden, Deutschland ausführlich beschrieben
wird.
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Wenn
das Protein oder Peptid als ein Fusionsprotein exprimiert wurde,
kann es erwünscht
sein, den Fusionspartner vor der Verwendung des Proteins für die Bildung
von Antikörpern
zu spalten, um eine Bildung von Antikörpern gegen den Fusionspartner
zu vermeiden. Die Spaltung von Fusionspartnern und die Isolierung des gewünschten
Proteins wird in den oben genannten "Current Protocols in Molecular Biology", Kapitel 16 beschrieben.
Vektoren, Protokolle und Reagenzien zur Expression und Reinigung
von rekombinanten Proteinen, welche mit einem Maltose bindenden
Protein fusioniert sind, sind auch kommerziell erhältlich.
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Wenn
ein Peptid erzeugt wird, kann es erwünscht sein, den Fusionspartner
nicht zu entfernen, da das Fusionsprotein die Herstellung von Antikörpern gegen
das Peptid stimulieren kann. Im Allgemeinen kann diese Betrachtung
relevant sein bei der Erzeugung von Antikörpern durch Peptide, welche
weniger als 50 Aminosäuren
lang sind. Insbesondere wurde gefunden, dass das ARP-Peptid bei
Injektion praktisch nicht immunogen ist. Es wurde gefunden, dass
ein mit Hämocyanin
der Napfschnecke (KLH, "keyhole
limpet hemocyanin")
konjugiertes ARP-Peptid Antikörper
auslöst,
welche ARP oder Acetylcholinesterase nicht erkennen können. Antikörper, welche
ARP erkennen können,
wurden erfolgreich unter Verwendung eines Glutathion-S-Transferase-ARP-Fusionsproteins
erzeugt (nachstehend ausführlich
erläutert).
Entsprechend werden in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung Antikörper unter
Verwendung eines Konjugats oder Fusionsproteins des erfindungsgemäßen Peptids
als Antigen ausgelöst.
Ein bevorzugter Fusionspartner ist Glutathion-S-Transferase.
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Wie
oben weiterhin angemerkt wird, kann das Peptid auch durch chemische
Verfahren synthetisiert werden, welche im Fachgebiet der Chemie
bekannt sind.
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Die
Erzeugung von polyklonalen Antikörpern
gegen Proteine wird in Kapitel 2 von "Current Protocols in Immunology", Wiley & Sons, Inc. beschrieben.
Die Erzeugung von Antikörpern
gegen Peptide kann aufgrund der im Allgemeinen geringeren Antigenizität von Peptiden
im Vergleich zu Proteinen einige Veränderungen des Protokolls erforderlich
machen. Die Erzeugung von polyklonalen Antikörpern gegen Peptide wird im
oben genannten "Current
Protocols in Immunology",
Kapitel 9 beschrieben und hierin nachfolgend erläutert.
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Monoklonale
Antikörper
können
aus B-Zellen hergestellt werden, welche aus der Milz oder den Lymphknoten
von immunisierten Tieren, insbesondere Ratten oder Mäusen, entnommen
werden, durch Fusion mit immortalisierten B-Zellen unter Bedingungen,
welche das Wachstum von Hybridzellen begünstigen. Für die Fusion von murinen B-Zellen
ist die Zelllinie Ag-8 bevorzugt.
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Das
Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper wird in vielen Artikeln
und Lehrbüchern
beschrieben, wie etwa dem oben genannten Kapitel 2 von "Current Protocols
in Immunology".
Kapitel 9 davon beschreibt die Immunisienung von Tieren mit Peptiden.
Milz- oder Lymphknotenzellen dieser Tiere können auf die gleiche Art verwendet
werden wie Milz- oder Lymphknotenzellen von mit Protein immunisierten
Tieren für die
Erzeugung von monoklonalen Antikörpern,
wie in Kapitel 2 darin beschrieben wird.
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Die
bei der Erzeugung von monoklonalen Antikörpern verwendeten Verfahren
werden weiterhin beschrieben von Kohler und Milstein, Nature, 256,
495-497, 1975 und im US-Patent 4,376,110.
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Bei
der Herstellung von Antikörpern
aus einer Genbank von humanen Antikörpern werden deren hypervariable
Regionen durch fast willkürliche
Sequenzen ersetzt, wie im US-Patent 5,840,479 beschrieben wird. Dieses
Verfahren zur Antikörpererzeugung
wird bevorzugt, wenn es schwer ist, ein Tier mit einem bestimmten Peptid
oder Protein zu immunisieren. Das erfindungsgemäße Peptid kann schwach immunogen
sein, sogar als ein Konjugat. Die im US-Patent 5,840,479 beschriebenen
Antikörper
sind weiter bevorzugt, wenn es erwünscht ist, Antikörper mit
einer Struktur zu verwenden, welche humanen Antikörpern ähnlich ist,
beispielsweise, wenn Antikörper
erwünscht
sind, welche bei Menschen eine niedrige Immunogenizität aufweisen.
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Wenn
ein geeigneter Antikörper
identifiziert worden ist, kann es wünschenswert sein, die Eigenschaften
des Antikörpers
zu verändern.
Beispielsweise kann ein chimärer
Antikörper
bei der Herstellung höhere Ausbeuten
erreichen. Chimäre
Antikörper,
bei welchen die konstanten Regionen durch konstante Regionen von
humanen Antikörpern
ersetzt werden, sind weiterhin wünschenswert,
wenn es erwünscht
ist, dass der Antikörper
bei Menschen eine geringe Immunogenizität aufweist. Die Erzeugung von
chimären
Antikörpern
wird in einer Vielzahl von Publikationen beschrieben, wie etwa von
Cabilly et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, von Morrison
et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, von Boulianne et
al. in Nature 312, 643, 1984, in
EP
125023 ,
EP 171496 ,
EP 173494 ,
EP 184187 , WO 86/01533, WO 87/02671
und von Harlow und Lane in "Antibodies:
A Laboratory Manual",
Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.
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Der
Begriff "Antikörper" soll auch sowohl
intakte Moleküle
als auch Fragmente von Antikörpern
umfassen, wie etwa beispielsweise Fab und F(ab')2, welche ein
Antigen binden können.
Fab- und F(ab')2-Fragmenten fehlt das Fc-Fragment eines
intakten Antikörpers,
sie werden schneller aus dem Kreislauf beseitigt und können eine
geringere nicht spezifische Gewebebindung als ein intakter Antikörper aufweisen
(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24, 316-325, 1983).
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Es
ist verständlich,
dass Fab und F(ab')2 und andere Fragmente der Antikörper, welche
in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, für den Nachweis und die Quantifizierung
des erfindungsgemäßen Peptids und
von intakter AChE oder Isoformen davon verwendet werden können, gemäß den hierin
offenbarten Verfahren für
intakte Antikörpermoleküle. Solche
Fragmente werden normalerweise durch proteolytische Spaltung erzeugt,
unter Verwendung von Enzymen wie etwa Papain (um Fab-Fragmente zu
erzeugen) oder Pepsin (um F(ab')2-Fragmente zu erzeugen).
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Ein
Antikörper
ist mit einem Molekül "bindungsfähig", wenn er spezifisch
mit dem Molekül
reagieren kann und dabei das Molekül an den Antikörper bindet.
Der Begriff "Epitop" soll sich auf das
Teil eines beliebigen Moleküls
beziehen, welches durch einen Antikörper gebunden werden kann,
welches auch durch den Antikörper
erkannt werden kann. Epitope oder "antigene Determinanten" bestehen normalerweise
aus chemisch aktiven Oberflächengruppen
von Molekülen
wie etwa Aminosäuren
oder Zuckerseitenketten und besitzen dreidimensionale Strukturmerkmale
ebenso wie spezielle Ladungsmerkmale.
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Ein "Antigen" ist ein Molekül oder ein
Teil eines Moleküls,
welches durch einen Antikörper
gebunden werden kann, welches außerdem in einem Tier die Produktion
eines Antikörpers
induzieren kann, welcher an ein Epitop dieses Antigens binden kann.
Ein Antigen kann ein oder mehr als ein Epitop aufweisen. Die spezielle Reaktion,
auf welche oben hingewiesen wird, soll besagen, dass das Antigen
auf hochselektive Art und Weise mit seinem entsprechenden Antikörper reagiert
und nicht mit der Vielzahl anderer Antikörper, welche durch andere Antigene
hervorgerufen werden können.
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Die
in der vorliegenden Erfindung verwendbaren Antikörper, einschließlich Fragmenten
von Antikörpern,
können
verwendet werden, um das erfindungsgemäße Peptid in einer Probe quantitativ
oder qualitativ nachzuweisen. Dies kann durch Immunfluoreszenzverfahren
durchgeführt
werden, welche einen fluoreszierenden oder mit Farbe markierten
Antikörper
(siehe unten) verwenden, verbunden mit Lichtmikroskopie, Durchflusszytometrie
oder fluorometrischem Nachweis.
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Die
in der vorliegenden Erfindung verwendbaren Antikörper (oder Fragmente davon)
können
für einen in
situ-Nachweis eines erfindungsgemäßen Peptids histologisch verwendet
werden, wie bei der Immunfluoreszenz- oder Immunelektronenmikroskopie.
Der in situ-Nachweis kann durchgeführt werden durch Entnahme einer
histologischen Probe von einem Säuger
und Bereitstellen des erfindungsgemäßen markierten Antikörpers für solch
eine Probe. Der Antikörper
(oder das Fragment) wird bevorzugt bereitgestellt durch Auftragen
oder durch Überschichten
des markierten Antikörpers
(oder Fragments) auf eine biologische Probe. Durch die Verwendung
eines solchen Verfahrens ist es möglich, nicht nur das Vorliegen
des Peptids sondern auch seine Verteilung im untersuchten Gewebe
zu bestimmen. Bei Anwendung der vorliegenden Erfindung wird ein
Durchschnittsfachmann leicht erkennen, dass ein beliebiges Verfahren
aus einer großen
Vielfalt histologischer Verfahren (wie etwa Färbeverfahren) modifiziert werden
kann, um solch einen Nachweis in situ zu erreichen.
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Solche
Assays für
das erfindungsgemäße Protein
umfassen normalerweise eine Inkubation einer biologischen Probe,
wie etwa eines biologischen Fluids, eines Gewebeextrakts, frisch
geernteter Zellen wie etwa Lymphozyten oder Leukozyten oder Zellen,
welche in Gewebekultur inkubiert wurden, in Gegenwart eines ausgewählten Antikörpers, welcher
das Peptid identifizieren kann, und Nachweisen des Antikörpers durch
ein beliebiges Verfahren aus einer Vielzahl von im Fachgebiet bekannten
Verfahren.
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Die
biologische Probe kann mit einem Festphasenträger oder einer -trägersubstanz
wie etwa Nitrocellulose oder einem anderen festen Träger oder
einer -trägersubstanz,
welche Zellen, Zellpartikel oder lösliche Proteine immobilisieren
können,
behandelt werden. Der Träger
oder die Trägersubstanz
können
dann mit geeigneten Puffern gewaschen werden, gefolgt von einer
Behandlung mit einem nachweisbar markierten Antikörper, gemäß der vorliegenden
Erfindung, wie oben beschrieben. Der Festphasenträger oder
die -trägersubstanz
können
dann ein zweites Mal mit dem Puffer gewaschen werden, um nicht gebundenen
Antikörper
zu entfernen. Die Menge der gebundenen Markierung auf dem festen
Träger
oder der festen Trägersubstanz
können
dann durch konventionelle Mittel nachgewiesen werden.
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Ein "Festphasenträger", "Festphasenträgersubstanz", "fester Träger", 'feste Trägersubstanz", "Träger" oder "Trägersubstanz" bedeutet einen beliebigen
Träger
oder eine Trägersubstanz,
welche Antigen oder Antikörper
binden können.
Bekannte Träger
oder Trägersubstanzen
umfassen Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylonamylasen,
natürliche
und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide und Magnetit. Die Art
des Trägers
kann für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung entweder bis zu einem gewissen
Ausmaß löslich oder
unlöslich
sein. Das Trägermaterial
kann praktisch jede beliebige mögliche
Strukturkonfiguration aufweisen, solange das gekoppelte Molekül an ein
Antigen oder einen Antikörper
binden kann. Folglich kann die Konfiguration eines Trägers oder
einer Trägersubstanz
kugelförmig
sein wie bei einem Bead, zylindrisch wie bei der Innenfläche eines
Teströhrchens
oder der Außenfläche eines
Stabs. Alternativ kann die Oberfläche flach sein wie in einer
Platte, einem Teststreifen usw. Bevorzugte Träger oder Trägersubstanzen umfassen Polystyrolbeads.
Fachleuten sind viele andere geeignete Träger für die Bindung von Antikörper oder
Antigen bekannt, oder sie können
diese durch Routineexperimente ermitteln.
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Die
Bindungsaktivität
einer bestimmten Charge eines erfindungsgemäßen Antikörpers, wie oben beschrieben,
kann durch bekannte Verfahren bestimmt werden. Fachleute können die
operativen und optimalen Assaybedingungen für jede Bestimmung durch Anwendung
von Routineexperimenten bestimmen.
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Andere
Schritte wie etwa Waschen, Rühren,
Schütteln,
Filtrieren und dergleichen können
zu den Assays hinzugefügt
werden, wie es gebräuchlich
oder für
die besondere Situation erforderlich ist.
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Einer
der Wege, auf welchem ein Antikörper
gemäß der vorliegenden
Erfindung nachweisbar markiert werden kann, ist die Verbindung des
Antikörpers
mit einem Enzym und eine Verwendung in einem Enzymlmmunoassay (EIA).
Dieses Enzym wiederum reagiert bei einer späteren Exposition gegenüber einem
geeigneten Substrat mit dem Substrat auf eine solche Art und Weise,
dass ein chemischer Anteil erzeugt wird, welcher beispielsweise
durch spektrophotometrische, fluorometrische oder durch optische
Mittel nachgewiesen werden kann. Enzyme, welche zur nachweisbaren
Markierung des Antikörpers
verwendet werden können,
um fassen, sind aber nicht beschränkt
auf Malatdehydrogenase, Nuclease von Staphylococcus, Delta-5-Steroidisomerase,
Alkoholdehydrogenase aus Hefe, Alpha-Glycerophosphatdehydrogenase,
Triosephosphatisomerase, Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase,
Asparaginase, Glucoseoxidase, Beta-Galactosidase, Ribonuclease,
Urease, Catalase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Glucoamylase
und Acetylcholinesterase. Der Nachweis kann durch kolorimetrische
Verfahren durchgeführt
werden, welche ein chromogenes Substrat für das Enzym verwenden. Der
Nachweis kann auch durch optischen Vergleich des Ausmaßes der
enzymatischen Reaktion eines Substrats im Vergleich mit Standards
durchgeführt
werden, welche auf die gleiche Art und Weise hergestellt wurden.
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Der
Nachweis kann unter Verwendung eines beliebigen Verfahrens aus einer
Vielzahl von anderen Immunoassays durchgeführt werden. Beispielsweise
ist es möglich,
durch radioaktive Markierung der Antikörper oder Antikörperfragmente
den Rezeptor Tyrosinphosphatase (R-PTPase) durch die Verwendung
eines Radio-Immunoassays
(RIA) nachzuweisen. Eine gute Beschreibung eines RIA ist in "Laboratory Techniques
and Biochemistry in Molecular Biology" von Work, T. S. et al., North Holland
Publishing Company, NY (1978) zu finden, mit besonderem Verweis
auf das Kapitel mit dem Titel "An
Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" von Chard, T., hierin
durch Verweis enthalten. Das radioaktive Isotop kann durch solche
Mittel wie die Verwendung eines g-Counters oder eines Szintillation-Counters
oder durch Autoradiographie nachgewiesen werden.
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Es
ist auch möglich,
einen Antikörper
gemäß der vorliegenden
Erfindung mit einer fluoreszierenden Verbindung zu markieren. Wenn
der fluoreszierend markierte Antikörper gegenüber Licht der geeigneten Wellenlänge exponiert
wird, kann dessen Vorliegen aufgrund der Fluoreszenz nachgewiesen
werden. Unter den geläufigsten
fluoreszierenden Markierungsverbindungen sind Fluoresceinisothiocyanat,
Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthalaldehyd
und Fluorescamin.
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Der
Antikörper
kann auch unter Verwendung von Fluoreszenz emittierenden Metallen
wie etwa 152E oder anderen Metalle der Lanthanidenreihe
nachweisbar markiert werden. Diese Metalle können unter Verwendung von Metallchelatgruppen
wie etwa Diethylentriaminpentaessigsäure (ETPA) an den Antikörper angeheftet
werden.
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Der
Antikörper
kann auch nachweisbar markiert werden durch Kopplung des Antikörpers an
eine chemilumineszente Verbindung. Das Vorliegen des chemilumineszent
markierten Antikörpers
wird dann bestimmt durch Nachweis des Auftretens von Lumineszenz,
welche während
des Verlaufs einer chemischen Reaktion auftritt. Beispiele für besonders
nützliche
chemilumineszente Markierungsverbindungen sind Luminol, Isoluminol,
theromatischer bzw. "theromatic" Acridiniumester,
Imidazol, Acridiniumsalz oder Oxalatester.
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Ebenso
kann eine biolumineszente Verbindung verwendet werden, um den erfindungsgemäßen Antikörper zu
markieren. Biolumineszenz ist eine Art der Chemilumineszenz, welche
in biologischen Systemen zu finden ist, in welchen ein katalytisches
Protein die Effizienz der chemilumineszenten Reaktion verstärkt. Das Vorliegen
eines biolumineszenten Proteins wird bestimmt durch Nachweis des
Auftretens von Lumineszenz. Wichtige biolumineszente Verbindungen
für die
Zwecke der Markierung sind Luciferin, Luciferase und Aequorin.
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Ein
Antikörpermolekül der vorliegenden
Erfindung kann zur Verwendung in einem immunometrischen Assay, welcher
auch als "Zweiseiten-" oder "Sandwich"-Assay bekannt ist,
angepasst werden. In einem typischen immunometrischen Assay wird
eine Menge eines nicht markierten Antikörpers (oder Antikörperfragments)
an einen festen Träger
oder eine Trägersubstanz
gebunden und eine Menge eines nachweisbar markierten löslichen
Antikörpers
wird zugegeben, um den Nachweis und/oder die Quantifizierung des
ternären Komplexes
zu ermöglichen,
welcher zwischen Festphasenantikörper,
Antigen und markiertem Antikörper
gebildet wurde.
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Normalerweise
und bevorzugt umfassen immunometrische Assays "Forward"-Assays, bei welchen der an die Festphase
gebundene Antikörper
zuerst mit der zu untersuchenden Probe in Kontakt gebracht wird, um
das Antigen aus der Probe zu extrahieren durch Bildung eines binären Festphasenantikörper-Antigen-Komplexes. Nach einer
geeigneten Inkubationsdauer wird der feste Träger oder die Trägersubstanz
gewaschen, um den Rest der flüssigen
Probe einschließlich
nicht gebundenem Antigen, falls vorhanden, zu entfernen und dann
mit der Lösung
in Kontakt gebracht, welche eine unbekannte Menge eines markierten
Antikörpers
enthält
(welcher als ein "Reportermolekül" fungiert). Nach
einer zweiten Inkubationszeit, um eine Komplexierung des markierten
Antikörpers
mit dem an den festen Träger
oder die Trägersubstanz
gebundenen Antigen durch den nicht markierten Antikörper zu
ermöglichen,
wird der feste Träger
ein zweites Mal gewaschen, um den nicht umgesetzten markierten Antikörper zu
entfernen.
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In
einer anderen Art eines "Sandwich"-Assays, welcher
auch für
die erfindungsgemäßen Antigene
verwendbar ist, werden die sogenannten "simultanen" und "reversen" Assays verwendet. Ein simultaner Assay betrifft
einen einzelnen Inkubationsschritt, da der an den festen Träger oder
die Trägersubstanz
gebundene Antikörper
und der markierte Antikörper
beide gleichzeitig zu der untersuchten Probe zugegeben werden. Nachdem
die Inkubation abgeschlossen ist, wird der feste Träger oder
die Trägersubstanz
gewaschen, um den Rest der flüssigen
Probe und nicht komplexierten markierten Antikörper zu entfernen. Das Vorliegen
von markiertem Antikörper,
welcher mit dem festen Träger
oder der Trägersubstanz
verbunden ist, wird dann so bestimmt, wie in einem konventionellen "Forward"-Sandwichassay.
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In
dem "reversen" Assay wird eine
schrittweise Zugabe zuerst von einer Lösung mit markiertem Antikörper zu
der flüssigen
Probe, gefolgt von der Zugabe von nicht markiertem Antikörper, gebunden
an einen festen Träger
oder eine Trägersubstanz
nach einer geeigneten Inkubationsdauer angewendet. Nach einer zweiten
Inkubation wird die Festphase auf konventionelle Art und Weise gewaschen,
um sie von dem Rest der untersuchten Probe und der Lösung mit
nicht umgesetztem, markiertem Antikörper zu befreien. Die Bestimmung
des markierten Antikörpers
in Verbindung mit einem festen Träger oder einer Trägersubstanz
wird dann wie in den "simultanen" und "Forward"-Assays bestimmt.
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Die
vorliegende Erfindung stellt einen Immunoassay für den Nachweis und die Quantifizierung
eines erfindungsgemäßen Peptids
bereit. Die Erstellung von Immunoassays, wie etwa RIA oder ELISA,
ist in vielen Artikeln, Lehrbüchern
und anderen Veröffentlichungen
beschrieben worden. Es wird auf WO 97/03998, Seite 48, Zeile 4 bis
Seite 52, Zeile 27 hingewiesen. Die Immunoassays der Erfindung können zwei
allgemeine Arten darstellen: Erstens können Immunoassays unter Verwendung
eines immobilisierten erfindungsgemäßen Peptids verwendet werden.
Zweitens können
Immunoassays unter Verwendung von immobilisierten Antikörpern, welche
gegen ein Epitop eines erfindungsgemäßen Peptids gerichtet sind,
verwendet werden, um das erfindungsgemäße Peptid zu quantifizieren.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist der Assay ein Immunoblotassay. Die Probe, beispielsweise
eine Probe einer Zerebrospinalflüssigkeit
(CSF) wird verdünnt,
beispielsweise 1:10, um eine Überladung
zu vermeiden. Die Probe wird dann auf ein Polyacrylamidgel, optional
ein Gradientengel, geladen und einer Elektrophorese unterzogen.
Synthetisches oder rekombinant erzeugtes Peptid, bevorzugt SEQ ID NO:1,
SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:3, können
in getrennten Spuren oder untergemischt in den Spuren der Proben
als Kontrollen zugegeben werden. Das Gel wird dann geblottet, bevorzugt
auf eine Nitrocellulose- oder Nylonmembran. Der Blot wird mit Antikörpern gegen
das von Acetylcholin abgeleitete Peptid umgesetzt, Antikörper, welche
gegenüber
SEQ ID NO:1 reaktiv sind. Ein mehr bevorzugter Antikörper ist
der hierin beschriebene Kaninchen-Anti-GST-ARP-Antikörper. Gebundener Antikörper kann
dann durch Antikörper
nachgewiesen werden, welche gegenüber dem erfindungsgemäßen Antikörper reaktiv
sind, beispielsweise durch Anti-Kaninchen-Immunglobuline. Diese
Immunglobuline sind bevorzugt markiert, beispielsweise durch eine
Verbindung mit Peroxidase. Der Nachweis der Markierung wird dann
durch im Fachgebiet bekannte Verfahren durchgeführt. Bevorzugt werden mit Peroxidase
konjugierte Immunglobuline unter Verwendung des ECLTM-Detektionssystems
(Amersham Pharmacia Biotech, UK) nachgewiesen.
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Wie
oben beschrieben, ist eine bevorzugte Probe Serum. Aber es können andere
Körperflüssigkeiten verwendet
werden, einschließlich
Zerebrospinalflüssigkeit,
Liquor, Speichel und dergleichen. Es können auch flüssige Extrakte
von Körpergewebe
analysiert werden. Alternativ kann ein Körpergewebe ohne Extraktion
unter Verwendung einer zytochemischen Färbung oder einer Immunfärbung wie
hierin beschrieben analysier werden.
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Eine
bevorzugte Körperflüssigkeit
ist Zerebrospinalflüssigkeit.
Beispielsweise können
erhöhte
Spiegel von AChE oder eines erfindungsgemäßen Peptids in Zerebrospinalflüssigkeit
auf erhöhte
Blutcortisolspiegel hinweisen, und können weiterhin auf eine Belastung
bzw. Stress hinweisen.
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Solche
Assays, wie hierin oben beschrieben werden, können in der Diagnose Verwendung
finden, da die Spiegel des erfindungsgemäßen Peptids bei einer Vielzahl
von Beschwerden bewertet werden müssen. Beispielsweise können solche
Assays nützlich
sein, um die Wirkung der Behandlung eines Patienten mit einem erfindungsgemäßen Peptid
zu kontrollieren. Weiterhin können
solche Assays verwen det werden bei der Bestimmung einer Belastung
aufgrund einer psychologischen, chemischen oder physischen Verletzung
des ZNS (siehe Beispiele hierin nachfolgend).
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
stellt die Erfindung somit ein Verfahren für die Diagnose einer psychologischen,
chemischen oder physikalischen Verletzung des ZNS bereit, umfassend
Entnehmen einer Probe von dem Säuger,
Inkontaktbringen der Probe mit einem erfindungsgemäßen Antikörper, Entfernen
von ungebundenem Antikörper
und Nachweisen des Ausmaßes
der Reaktion zwischen dem Antikörper
und in der Probe vorliegender Acetylcholinesterase oder eines Fragments
davon. Die Probe ist bevorzugt Zerebrospinalflüssigkeit.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose der Alzheimer-Krankheit
bei einem Patienten, umfassend Inkontaktbringen einer Probe des
Patienten mit einem erfindungsgemäßen Antikörper, Entfernen von ungebundenem
Antikörper
und Nachweisen des Ausmaßes
der Reaktion zwischen dem Antikörper
und in der Probe vorliegender Acetylcholinesterase oder eines Fragments davon.
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Experimentelle
Verfahren
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In
situ-Hybridisierung: Verfahren der in situ-Hybridisierung wurden
mit kultivierten Zellen und Geweben durchgeführt, wie ausführlich an
anderer Stelle beschrieben wird (Grisaru et al., Mol. Cell. Biol.
19, 788-95, 1999, Kaufer et al., Nature 393, 373-7, 1998). Kultivierte
Zellen wurden bei 300 × g
zentrifugiert und fixiert unter Verwendung von 4% Paraformaldehyd
auf mit Collagen beschichteten Deckgläschen, welche auf dem Boden von
Kulturwells platziert wurden. Es wurden 5'-biotinylierte, 2'-O-methylierte AChEcRNA-Sonden verwendet, welche
zu den 3'-alternativen
humanen AChE-Exons komplementär
sind. Der Nachweis und die Quantifizierung der verschiedenen AChEmRNA-Transkripte
in Fötalgeweben
wurden durchgeführt
wie zuvor beschrieben (Grisaru et al., oben). Konfokale Mikroskopscans
der aus der Kultur stammenden Zellen wurden erhalten unter Verwendung
eines konfokalen MRC-1024 Bio-Rad-Mikroskops (Hemel Hempstead, Herts,
UK). Von jedem Zellbild wurde eine Projektion gebildet, und für Größe und Intensität der schnellen
roten Fluoreszenz wurden spezielle Kriterien festgelegt. Es wurde
die Image-Pro 3.0-Software (Media Cybernetics, Silver Spring, MD,
USA) verwendet, um die erhaltenen Signale zu analysieren. Zur Berechnung
der p-Werte wurde ein ANOVA (Analyse der Varianz)-Test verwendet.
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Immunoblot:
Mauserum wurde 1:10 verdünnt.
ARP, ASP, rekombinante AChE-S (Sigma Chemical Co.) und rekombinante
AChE-R, extrahiert aus transfizierten COS-Zellen (Ben Aziz-Aloya
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2471-5, 1993, Seidman et
al., Mol. Cell. Biol. 15, 2993-3002, 1995) dienten als Positivkontrollen. Eine
Proteinelektrophorese in SDS-Gradienten (4-20%)-Polyacrylamidgelen
(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) wurde von einer Immundetektion
unter Verwendung der Kaninchen-Anti-GST ARP-Antikörper, der
mit Peroxidase konjugierten Anti-Kaninchen-Immunglobuline und einer
ECLTM-Detektion (Amersham Pharmacia Biotech,
UK) gefolgt.
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Tiermodelle
und in vivo-Experimente: Transgene FVB/N-Mausstämme, welche humane AChE-Varianten
expnmieren, wurden anderswo beschrieben, ebenso wie die biochemischen
Verfahren zur Messung der AChE-Aktivität (Sternfeld et al., J. Physiol.,
Paris, 92, 249-55, 1998). Die begrenzten Schwimmprotokolle zur Anwendung
einer akuten psychologischen Belastung wurden durchgeführt, wie
es detailliert beschrieben ist (Kaufer et al., Nature 393, 373-7,
1998). Unmittelbar nach der Belastung wurden die behandelten Mäuse intraperitoneal
mit 0,03 ng AS1 pro g Körpergewicht
injiziert (AS1 ist ein 2'-O-Methyl-geschütztes Antisense-Oligodesoxynukleotid,
gerichtet auf das ACHE-Exon 2, welches AChE-S- und AChE-R-mRNA gemeinsam
ist). Eine andere Gruppe von nicht belasteten Mäusen wurde mit normaler Salzlösung injiziert.
24 h später
wurden die Tiere getötet
und peripheres Blut wurde in mit EDTA ausgelegten Röhrchen gesammelt
(Becton Dickinson Immunocytochemistry System, Inc., San Jose, CA),
präpariert
mit 25 Einheiten Heparinnatnum USP (Kamada LTD, Kibbutz Beit-Kama,
Israel). Die AChE-Aktivität
des Gesamtbluts wurde analysiert und WBC und Plättchenzahlen wurden unter Verwendung
eines AcT-DifF Hämatologieanalysegeräts (Beckman
Coulter, Inc., Fullerton, CA) bestimmt.
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Beispiel 1
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Expression
von rekombinantem ARP
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Die
für die
C-terminale Region von I4 codierende Sequenz (d.h. die "durchgelesene" Variante der Acetylcholinesterase
umfassend die ARP-Peptidsequenz) wurde durch PCR unter Verwendung
der folgenden Oligonukleotidprimer amplifiziert: GCT GGA TCC ATC
GAG GGG CGA GGT ATG CAG GGG CCA GCG GGC (I4-up), auch als SEQ ID
NO:4 bezeichnet, und TAT AAG CTT CTA GGG GGA GAA GAG AGG GGT (I4-down), auch
als SEQ ID NO:5 bezeichnet, und in das Plasmid pGEX-KG (ATCC-Signatur
ATCC77103, siehe auch Anal. Biochem. 192:262-267, 1991) eingebracht.
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Antikörperproduktion
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GST
und das I4-GST-Fusionsprotein wurden aus dem Überstand eines E.coli-Lysats durch Affinitätschromatographie
auf Glutathion-Sepharose (Pharmacia) gereinigt, mit 10 mM reduziertem
Glutathion in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 eluiert, gegen 0,1 M Ammoniumacetatpuffer,
pH 7,0 dialyisiert, aliquotisiert und lyophilisiert. Die Stabilität und Identität des Proteins
wurde durch SDS-PAGE bestätigt.
Die folgenden Proteaseinhibitoren wurden während der Präparation
verwendet: Aprotinin (10 μg/ml),
Benzamidin (5 mM), Pefabloc SC (0,2 mM) und EDTA (1 mM). Vor der
Affinitätschromatographie
wurde das E.coli-Lysat für
20 min bei 37 °C
mit 0,2 mM Mg-ATP inkubiert, um die Fusionsproteine von einer Kontamination
baktierieller Proteine zu trennen. Das Verfahren wurde gemäß den Empfehlungen
von Pharmacia durchgeführt.
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Zwei
weibliche New Zealand-Kaninchen wurden subkutan mit 0,3 mg Fusionsprotein
in komplettem Freund-Adjuvans immunisiert und dann monatlich mit
0,2 mg Protein in nicht komplettem Freund-Adjuvans erneut immunisiert.
Blutproben wurden 10 Tage nach der Immunisierung entnommen. Die
speziellen Antikörper in
den Seren wurden durch ELISA auf immobilisiertem Fusionsprotein
nachgewiesen, in Gegenwart eines Überschusses an löslichem
GST (20 μg/ml).
Die reagierenden Seren wurden für
eine Antikörpeneinigung
ausgewählt.
Die immobilisierten I4-GST, GST und das E.coli-Lysat wurden unter
Verwendung von Affigel 10 (Bio-Rad) gemäß den Empfehlungen des Herstellers
hergestellt.
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Die
IgG-Rohfraktion wurde aus dem Serum hergestellt durch 50% gesättigte (NH4)2SO4-Präzipitation und
in 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, dialysiert. Um die Anti-GST-Antikörper loszuwerden,
wurde die IgG-Fraktion mit GST-Beads (Affigel 10, Bio-Rad) über Nacht
bei 4 °C
inkubiert. Das gebundene Material wurde mit 4,5 M MgCl2 eluiert.
Das Verfahren wurde mehrere Male mit dem nicht gebundenen Material
wiederholt, bis keine Antikörper
mehr von den GST-Beads eluiert wurden. Um die Antikörper gegen
eine mögliche
Kontamination bakterieller Proteine loszu werden, wurde das gleiche
Verfahren mit immobilisierten Hitzeschockproteinen des E.coli-Lysats
durchgeführt.
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Das
nicht gebundene Material wurde dann auf I4-GST-Beads aufgetragen
(Affigel 10, Bio-Rad), 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht
bei 4 °C
inkubiert und das gebundene Material wurde mit 3,5 M MgCl2 eluiert. Die eluierten Antikörper wurden
gegen 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 und dann gegen PBS, welches 0,025% NaN3 enthielt, dialysiert.
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Beispiel 2
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Anhebung der
AchE-Spiegel in CSF bei einer ZNS-Belastung
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Die
Erfinder haben gefunden, dass ARP und AChE-R nach einer psychologischen,
chemischen oder physischen Verletzung des ZNS sowohl auf dem Niveau
der mRNA als auch dem Enzymniveau reguliert werden. Beispiele für eine chemische
Verletzung umfassen die Exposition gegenüber schädlichen Substanzen wie etwa
Nervengas oder in einem Insektizid. Beispiele für eine physische Verletzung
umfassen eine Kopfverletzung, ein Schädeltrauma, Strahlenbelastung
und dergleichen.
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Unter
Verwendung einer hoch auflösenden
in situ-Hybridisierung (im Wesentlichen durchgeführt, wie in den experimentellen
Verfahren beschrieben) von in Paraffin eingebetteten humanen Tumorschnitten
haben die Erfinder eine starke Überexpression
des AChE-R-mRNA-Transknpts in polymorphen Gliobastomtumoren und
insbesondere in deren hoch proliferativen Rändern im Vergleich zu benignem
Gehirngewebe festgestellt, welches diese chirurgisch entfernten
Tumore umgibt. Außerdem
stiegen die AChE-R-Expressionsspiegel beträchtlich in Hirnschnitten nach
einer Chirurgie, insbesondere nach einer Bestrahlung. Pathologisch
klassifizierte Tumorproben ergaben weiterhin ausgeprägte Anstiege
im Ausmaß und
in der Häufigkeit
einer AChE-Überproduktion
bei Glioblastom im Vergleich zum Tumorgrading. Diese Befunde tragen
zum allgemeinen Verständnis
der Molekularbiologie von Glioblastomtumoren bei und können zu
neuen, weniger schädlichen
Behandlungsmustern führen.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung haben durch eine in situ-Hybridisierung,
wie hierin oben beschrieben, auch gefunden, dass AChE-R-mRNA unter
einer Belastung die subzelluläre
Lokalisation verändert. Während die
mRNA unter Kontrollbedingungen ausschließlich im Soma von Cortexneuronen
nachgewiesen wird, erstreckt sich die AChE-R-mRNA nach Belastungsbehandlungen
in die proximale Domäne
der Dendriten.
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Die
AChE-Expression wurde in transgenen FVB/N-Mausrassen untersucht,
die humane AChE-Spleißvarianten
exprimieren. Als Kontrollen wurden Oozytenextrakte von Xenopus laevis
verwendet, die verschiedene humane AChE-Spleißvarianten exprimieren. Die
transgenen Mauslinien und die Xenopus-Expressionssysteme sind von
Sternfeld et al., J. Physiol., Paris, 92, 249-55, 1998 beschrieben,
diese Publikation ist hierin in ihrer Gesamtheit durch Verweis enthalten.
Der Einfluss einer Belastung wurde unter Verwendung des begrenzten
Schwimmprotokolls zum Ausüben
einer akuten psychologischen Belastung untersucht, welches von Kaufer
et al., Nature 393, 373-7, 1998 detailliert beschrieben wird.
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Polyklonale
Kaninchen-Antikörper
gegen ARP (SEQ ID NO:1) wurden wie hierin oben beschrieben erhalten.
Antikörper
gegen die gemeinsame Domäne
von AChE wurden von einem kommerziellen Lieferanten erhalten.
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Extrakte
von Xenopus-Oozyten oder Maus-Gehirngewebe (Cortex oder Basalganglien)
oder humane Zerebrospinalflüssigkeit
(CSF) wurden einer SDS-PAGE unterzogen. 1 zeigt
Immunoblots von Zerebrospinalflüssigkeit
(CSF), rekombinanter AChE-S (rE6, Sigma) oder AChE-R (I4-Extrakte,
hergestellt in Xenopus-Oozyten wie hierin nachfolgend ausgeführt). Die
gegen das C-terminale Peptid von AChE-R gerichteten Antikörper ARP
(Anti-I4, 1, rechte Seite) reagieren nicht
mit dem AChE-S-Protein, da die Region des Introns 4 in dieser mRNA
herausgespleißt
ist. Andererseits identifizieren die Antikörper das AChE-R-Protein deutlich.
Antikörper
gegen die gemeinsame Domäne
der AChE (1, linke Seite) können sowohl
AChE-R als auch AChE-S-Proteine identifizieren.
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Im
Folgenden beziehen sich "nicht
belastete Menschen" auf
Patienten, bei welchen kein verstärktes Omnipaque-Signal mittels
CT-Hirnscan nachgewiesen wurde, während "belastete Menschen" Patienten bezeichnen, bei welchen ein
verstärktes
Omnipaque-Signal durch CT-Hirnscan nachgewiesen wurde (für Einzelheiten
siehe nachfolgenden Abschnitt betreffend CT-Scans).
-
In
der Zerebrospinalflüssigkeit
von nicht belasteten Menschen (1 "–") kann AChE durch keinen der Antikörper nachgewiesen
werden. Im Gegensatz dazu weisen beide Antikörper das AChE-Protein in der CSF
von belasteten Menschen (1, "+")
leicht nach. Der Antikörper
gegen die gemeinsame Domäne
weist auch ein kleineres Fragment von AChE (1, linke
Seite) nach. Dieses Fragment entspricht in der Größe einem
C-terminalen trunkierten AChE-R-Protein. Allerdings kann der Antikörper gegen
das C-terminale Peptid diese Bande nicht nachweisen (1,
linke Seite).
-
Diese
Experimente zeigen, dass AChE in CSF bei einer ZNS-Belastung in
erhöhten
Mengen auftritt.
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AChE
kann auch in Maus-Gehirngewebe nachgewiesen werden. 2 zeigt
Extrakte aus der Cortex-Region und Region der Basalganglien aus
dem Gehirn von Kontrollmäusen
und transgenen Mäusen
mit humaner AChE. Hierin verwendete transgene FVB/N-Mausrassen,
welche humane AChE-Varianten exprimieren, wurden von Sternfeld et
al., J. Physiol., Paris 92, 249-55, 1998 beschrieben. E6 in 2 bezeichnet
eine transgene Maus, welche eine humane AChE-S exprimiert, In ist
eine transgene Maus, welche eine durch Insertion inaktivierte humane
AChE-S exprimiert, I445 und I470A
bezeichnen transgene Mäuse,
welche verschiedene AChE-R-Konstrukte
exprimieren. Die Gewebe wurden extrahiert, auf SDS-PAGE-Gelen gefahren
und geblottet, wie im oben genannten Sternfeld et al. beschrieben.
Als eine Kontrolle wurden Extrakte von Xenopus-Oozyten parallel
gefahren, welche humane AChE-S (E6), AChE-R (I4) oder AChE-E (E4)
exprimieren. 2A zeigt den Nachweis von humanen
AChE-Isoformen in Gehirngeweben einer transgenen Maus durch den
Antikörper
gegen die gemeinsame Domäne
von AChE. AChE wird im Cortex und in den Basalganglien nachgewiesen.
Die transgenen Mäuse,
welche das durch Insertion inaktivierte AChE-S-Konstrukt (In) exprmieren,
zeigen eine schwache Expression von AChE in den Basalganglien und
exprimieren AChE nicht über
den Spiegel der Kontrollmäuse
(nicht transgen) im Cortex (2A).
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Bei
Verwendung der Anti-ARP-Antikörper
wurden ähnlich
Ergebnisse erhalten mit der Ausnahme, dass keine kleineren Fragmente
nachgewiesen werden konnten (2B).
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Beispiel 3
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ARP-Efifekfe in vivo
-
ARP akkumuliert
unter Belastung im Serum
-
Um
herauszufinden, ob das ARP-Peptid natürlich im Blut vorkommt und
ob dessen Spiegel unter einer physiologischem Belastung ansteigen,
wurden FVB/N-Mäuse (n=12)
einem begrenztem Schwimmprotokoll zum Ausüben einer akuten psychologischen
Belastung unterzogen, wie an anderer Stelle beschrieben wird (Kaufer
et al., siehe oben). 24 h später
entnommene Serumproben wurden einer Gradientengelektrophorese unterzogen. 3,
oben, zeigt ein mit Poinceau gefärbtes
Polyacrylamidgradientengel (4–20%,
Bio-Rad), beladen mit: (1) Proteinextrakt aus COS-Zellen, transfiziert
mit einem für
AChE codierenen Plasmid (Ben Aziz-Aloya et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90, 2471-5, 1993; Seidman et al., Mol. Cell. Biol. 15, 2993-3002, 1995)
und gemischt mit synthetischem ARP (ARP+AChE-R); (2) rekombinantes
AChE-S (Sigma), gemischt mit synthetischem ASP (ASP+AChE-S); (3) Serum (2 μl) aus einer
mit Saline injizierten Maus, 24 h nach der Behandlung entnommen
(Kontrolle); (4) Serum von einer Maus, welche einer begrenzten Schwimmbelastung unterzogen
wurde, wie oben beschrieben, 24 h nach der Behandlung entnommen
(Stress). Die Positionen der Molekulargewichtsmarker sind links
gezeigt. Das Gel wurde dann elektrogeblottet und einer Immundetektion (für Einzelheiten
siehe "Immunoblot" im Abschnitt Experimentelles
Verfahren) mit affinitätsgereinigtern
Kaninchen-Antikörper
unterzogen, welche gegen ein rekombinantes GST-ARP-Fusionsprotein
(3, unten) gebildet wurden. Ein 67 kD-Protein, übereinstimmend
mit der erwarteten Größe von AChE-R,
wird im Serum nachgewiesen (oberer Pfeil). Weiterhin wird eine selektive
Markierung von synthetischem ARP (aber nicht von AChE-S oder ASP)
durch diesen Antikörper
nachgewiesen. Die Akkumulierung von ARP im Serum von belasteten
Mäusen
ist offensichtlich aufgrund der intensiven Markierung von nativem
ARP in dem Serum einer belasteten Maus (unterer Pfeil).
-
ARP Akkumulierung
im Serum unter Belastung
-
Die
intensive Markierung von ARP in dem nicht fraktionierten Mausserum,
welches 24 h nach der Belastungsbehandlung entnommen wurde, ergibt
ausgeprägtere
Anstiege dieses Peptids als beim nativen Protein AChE-R. Dies kann
eine erhöhte
proteolytische Aktivität
unter einer Belastung widerspiegeln. Kombiniert mit der Abwesenheit
von Spaltstellen für
gewöhnliche
Proteasen innerhalb der ARP-Sequenz
erklärt
dies weiterhin den reproduzierbaren Ablauf von proteolytischen Abbauprodukten
von Serum-AChE-R, welche in den belasteten Serumproben intensiviert
wurden. Die physiologischen Auswirkungen dieses Befunds sind die, dass
katalytische AChE-Aktivitätsmessungen
zu geringe Schätzungen
des Ausmaßes
der Überproduktion
im Blut unter einer Belastung darstellen. Ähnlich können Messungen der Acetylcholinhydrolyse
die tatsächlichen Mengen
des AChE-Proteins und dessen Abbauprodukte im Gehirn oder im Muskel
unterschätzen.
Die beschriebenen Abnahmen der AChE-Aktivität bei der Alzheimer-Krankheit
können
folglich Wissenschaftler und Kliniker gleichermaßen durch Maskierung der Akkumulation
von morphologisch aktiven, von AChE stammenden Peptiden mit Langzeitwirkungen
irreführen.
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Beispiel 4
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AChE-R-Wirkungen auf Hippocampus-LTP
legen eine kausale Beteiligung in neuronalen Belastungsreaktionen
nahe
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Auf
molekularem Niveau führt
eine psychologische Belastung insbesondere zu einer schnellen und doch
lang anhaltenden Modulation der Expression. Wie bei den Genen, welche
das cholinerge System betreffen, ist gezeigt worden, dass innerhalb
von einer Stunde nach einer akuten Belastung lang anhaltende Veränderungen
der cholinergen Genexpression ermöglicht werden (Kaufer et al.,
siehe oben, 1998). Dies betrifft besonders eine drastische Erhöhung in
den Spiegeln der normalerweise seltenen "durchgelesenen" Variante der Acetylcholinesterase (AChE-R),
gekoppelt mit einer Herunterregulation von Acetylcholin synthetisierenden und
verpackenden Proteinen, des Enzyms ChAT und dem verbundenen vesikulären Acetylcholintransporter (vAChT).
Diese Rückkopplungsreaktion
trägt wahrscheinlich
zur Verringerung der ACh-Spiegel nach einer Belastung bei. Eine
andere Folge von Stressreaktionen betrifft einen plötzlichen
Anstieg der proteolytischen Aktivitäten. Dies führt, neben anderen Effekten,
zur Spaltung des C-terminalen Peptids (ARP = AChE Readthrough Peptide)
von dem "durchgelesenen" Kernenzym. Eine
Immundetektion unter Verwendung von Anti-ARP-Antikörpern ergibt
einen Anstieg von AChE-R-Abbauprodukten in der Zerebrospinalflüssigkeit
von Patienten unter Belastung (Kaufer, Doktorarbeit, 2000). Außerdem induziert
die Injektion von synthetischem ARP selbst eine Proliferation von
hämatopoetischen
Vorläuferzellen
und eine Überexpression von
Knochenmarks-AChE-R innerhalb von 24 h (Grisaru et al., eingereicht,
2000). Diese neuen Beobachtungen brachten die faszinierende Möglichkeit
auf, dass AChE-R auch physiologische und Verhaltensfunktionen besitzt.
Um diese Arbeitshypothese zu untersuchen, wurden die Wirkungen von
LTP auf begrenzten Schwimmstress (1 h nach der Induktion) mit den
Wirkungen verglichen, welche bei transgenen Mäusen, welche AChE-R überexprimieren,
induziert weden.
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Differenzielle Eigenschaften
von AChE-Varianten bei synaptischer Plastizität – Belastungseffekte
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Die "durchgelesene" AChE-Variante ist
die einzige AChE-Variante, welche unter einer psychologischen Belastung
hochreguliert ist. Deshalb wurde die Möglichkeit untersucht, dass
die sofortige Besserung der psychologischen Belastung im Licht der Überexpression
der "durchgelesenen" AChE-Form das Muster
von LTP beeinflusst.
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Eine
Belastung wurde dadurch induziert, dass Mäuse gezwungen wurden, für 4 min
mit einem 4-Minuten-Intervall zu schwimmen, und 1 h später wurden
Schnitte für
LTP-Experimente entnommen. Es wurde der Schaffer-Kollateralen-CA1-Synapsenweg
untersucht. Basisfeldpotenziale wurden für 15 min bei 0,033 Hz aufgezeichnet.
Dann wurde durch drei aufeinanderfolgende tetanischen Stimulationen,
jeweils von 1 sek Dauer und mit 50 Hz mit 20 sek Intervallen zwischen
den Stimuli LTP induziert. Nach der Tetanisierung wurde die Veränderung
der Steigung des postsynaptischen Feldpotenzials (PSP) für bis zu
3 h verfolgt.
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Während Schnitte
von Kontrollmäusen
eine schrittweise Potenzierung von 235 ± 27% (n = 3) aufweisen, zeigen
die Schnitte von belasteten Mäusen
ein unterschiedliches Muster, wie in 4 gezeigt
wird. LTP besaß einen
langsamen Beginn, verzögert
von 5 auf 20 min und erreichte ein Plateau einer Potenzierung von 238 ± 18% (n
= 8), in dieser Hinsicht ähnlich
wie die Kontrollspiegel.
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Deshalb
verändert
eine Belastung den Beginn von LTP, durch Verzögerung der frühen Phase,
wobei dennoch eine nachfolgende stabile Potenzierung erreicht wird.
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AChE-R-Effekte
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Transgene
Mäuse,
welche die "durchgelesene" AChE-R-Isoform überexprimieren,
ermöglichten
eine direkte Untersuchung der Frage, ob eine Belastung durch Erhöhung der
AChE-R LTP beeinflusst. Es wurden Schnitte von adulten Kontrollmäusen und
transgenen Mäusen,
3–5 Monate
alt, präpariert
und LTP-Experimente
wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
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Wie
in 5 gezeigt ist, zeigt LTP in Schnitten von transgenen
Mäusen,
welche AChE-R überexprimieren,
das gleiche Muster eines langsamen Beginns wie bei den durch Belastung
induzierten Mäusen
(vgl. mit 4).
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Beispiel 5
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Beeinträchtigung
der Blut-Hirn-Schranke ist verbunden mit einer Belastungsreaktion
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Bei
der Suche nach molekularen Parametern, welche mit einer Beeinträchtigung
der Blut-Hirn-Schranke (BBB) verbunden sind, wurde ein quantitativer
Ansatz zur Analyse von humanen Gehirnbildern entwickelt, welche
durch Computertomographie (CT), Magnetresonanz-Imaging (MRI) oder
Single-Photon-Emissions-CT (SPECT) erhalten wurden. 6B zeigt
Computertomographiescans von Patienten mit und ohne Verabreichung
von Omnipaque (Nycomed AS), einem löslichen iodhaltigen Kontrastmittel.
Die Figur zeigt, dass bei normalen Patienten wenig Kontrastmittel
in das Gehirn eindringt. Aber bei Patienten, welche während einer Schwangerschaft
an Eklampsie leiden oder bei Patienten, welche an fokalen epileptischen
Anfällen
leiden, wurde eine signifikant erhöhte Durchdringung von Omnipaque
in das Gehirn gefunden (siehe Pfeile in 6B). Bei
17 von 34 Patienten mit unterschiedlichen, das ZNS betreffenden
Symptomen wurde ein Anstieg von mehr als 50% der Durchdringung der
entsprechenden Kontrastmittel, Omnipaque, Gadolinium oder DTPA ins
Gehirn beobachtet.
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7A zeigt
ein Beispiel eines erhöhten
Omnipaque-Signals, gezeigt durch einen CT-Scan im Vergleich mit
Kontrollpatienten, auch bei Patienten nach Ischämie.
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Bei
der Analyse der oben beschriebenen Daten der Region des Gehirns,
welche die höchste
Signalerhöhung
zeigt, wurde eine signifikante Verstärkung des Signals in der Corona
Radiata, in der grauen Substanz und in Weichteilregionen gefunden.
Es wurde eine sehr geringe Erhöhung
der Durchdringung des Kontrastmittels in die Thalamusregion gefunden
und das Cerebellum und die Pons-Regionen schienen nicht betroffen.
Die prozentuale Erhöhung
des Kontrastmittelsignals war am größten (durchschnittlich 30%)
in den Weichteilen (7B).
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Diese
Daten zeigen eine Beeinträchtigung
der BBB bei Patienten mit ZNS-Pathologien.
Die Daten zeigen weiterhin, dass die Beeinträchtigung des ZNS mit einer
Belastung verbunden ist und dass das größte Ausmaß einer Beeinträchtigung
der BBB in Regionen der Weichteile, der grauen Substanz und der
Corona Radiata aufzutreten scheinen.
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Um
herauszufinden, ob solch eine Beeinträchtigung mit einer ZNS-Belastung
verbunden ist, wurde die Signalerhöhung (d.h. prozentual erhöhte Durchdringung
von Omnipaque in das Gehirn, wie durch CT-Scans gezeigt) mit verschiedenen
Belastungsparametern korreliert. 6C zeigt,
dass die Beeinträchtigung
der BBB in der Tat mit Belastungsindikatoren wie etwa Herzfrequenz,
Leukozytenzahl und Serumcortisolspiegel korrelierte. Blutdruck und
Körpertemperatur
andererseits schienen nicht mit einer gesteigerten Durchdringung
von Kontrastmitteln wie Omnipaque korreliert zu sein.
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CSF-Proben,
welche von Patienten entnommen wurden, wurden auf SDS-PAGE-Gelen gefahren,
geblottet und mit Anit-AChE-Antikörpern gefärbt. Die Immunoblots ergaben
bei Proben von belasteten Patienten erhöhte AChE-R-Spiegel.
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Die
obigen Ergebnisse wurden in Tierexperimenten bestätigt. Mäuse, welche
einem begrenzten Schwimmbelastungsprotokoll wie oben beschrieben
unterzogen wurden, wurden mit Evans Blue injiziert, einem Farbstoff,
welcher normalerweise die BBB nicht durchdringt aufgrund seiner
Verbindung mit Blutalbumin. 6A zeigt,
dass eine große
Menge des Farbstoffs in das Gehirn von belasteten Mäusen eindringt,
im Vergleich zu sehr geringen Spiegeln bei nicht belasteten Kontrollmäusen.
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Beispiel 6
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Selektiver Anstieg des
AChE-R-Proteins in CSF von Patienten mit Alzheimer-Krankheit
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Um
die mögliche
Beteiligung von speziellen Acetylcholinesterase (AChE)-Isoformen an der
Alzheimer-Krankheit (AD) zu untersuchen, wurden Proben von Zerebrospinalflüssigkeit
(CSF) von AD-Patienten und angeglichene Kontrollen Messungen der
katalytischen Aktivitäten
und einer elektrophoretischen Trennung unterzogen, gefolgt von Immunoblotanalysen
und einer densitometrischen Quantifizierung der Markierungssignale.
Wie erwartet und wie früher
gezeigt wurde (Saez-Valero et al., J. Neurochem. 72, 1600-1608,
1999) zeigte AD-CSF eine geringere AChE-Aktivität (16,3+2,0 U/ml, n=6) als
die Kontrollen (28,3+4,9 U/ml, n=6). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM,
ein Unit (U) ist definiert als die Menge an Enzym, welche 1 nmol
Acetylthiocholin pro Minute bei 22 °C hydrolysiert (nicht gezeigt).
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Um
zu untersuchen, ob die Abnahme der AChE-Aktivität in AD-CSF mit der differenziellen
Expression von AChE-R verbunden ist, wurden 8 μg Protein von CSF-Proben einer elektrophoretischen
Trennung unterzogen, gefolgt von einer Immunoblotanalyse und einer
densitometrischen Quantifizierung. Die Blots wurden mit dem Antikörper gegen
das C-terminale Peptid inkubiert, welches für AChE-R einzigartig ist (anti-ARP:
oberes Feld, 8A) oder mit dem Antikörper, welcher
auf die gemeinsame Domäne
aller AChE-Isoformen gerichtet ist (anti-core; unteres Feld).
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Wie
in 8A gezeigt ist, werden mit beiden Antikörpern drei
Proteinbanden zwischen 66 und 46 kD beobachtet. Diese drei Proteinbanden
spiegeln wahrscheinlich unterschiedliche Ausmaße der Glykosylierung des AChE-Proteins
wider. Aber der polyklonale Antikörper, welcher durch das C-terminale
Peptid hervorgerufen wurde, welcher einzigartig ist für die durch
Stress assoziierte "durchgelesene" AChE-Isoform, ergab einen signifikanten
Anstieg (p < 0,05)
in den AD-CSF-Proben im Vergleich mit den Kontrollen (oberes Feld).
Wenn ein polyklonaler Antikörper,
welcher gegen die N-terminale Domäne gerichtet ist, die allen
AChE-Isoformen gemeinsam ist, verwendet wurde (unteres Feld), wurden
andererseits keine signifikanten Unterschiede zwischen den AD- und
Kontrollproben gefunden, obwohl das Signal in der Kontrolle stärker war.
Es wird angemerkt, dass ARP, humane rekombinante AChE-S und AChE-R
als Positivkontrollen oder Negativkontrollen an der rechten Seite
der Füllung
verwendet wurden.
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Die
Ergebnisse wurden durch Quantifizierung der Blots durch eine densitometrische
Analyse bestätigt (8B).
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Immunmarkierung von ARP
bei Alzheimer-Krankheit im Vergleich zu normalen Hirnschnitten
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Das
Muster der AChE-R-Expression in Hirnschnitten von Patienten mit
Alzheimer-Krankheit wurde als nächstes
untersucht, um zu ermitteln, ob eine Expression dieses Proteins
auch im Hirn ein Unterschied war, ähnlich zu den in der CSF gefundenen
Expressionsunterschieden.
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Die 9A bis 9H stellen
die Immunmarkierung mit einem Anti-ARP-Antikörper in verschiedenen in Paraffin
eingebetteten Hirnschnitten dar. Interessanterweise färbten die
Anti-ARP bei Alzheimer-Patienten die meisten Mikroglia, wohingegen
in normalen Hirnschnitten Neuronen und Blutgefäße markiert waren. In der Tat
wurden bei der Markierung von ARP in AD-Hirnschnitten im Vergleich
zu normalen Hirnschnitten beträchtliche
Unterschiede gefunden.
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Als
Folgerung tritt im CSF von AD-Patienten ein selektiver Anstieg des
AChE-R-Proteins
auf. Die stärkere
Produktion von AChE-R bei AD könnte
zur charakteristischen Neuroverschlechterung dieser Form von Demenz
beitragen oder sie verstärken.
Im Hinblick auf die nicht cholinergen, nicht katalytischen Aktivitäten, welche
AChE-R bei der Modulation einer neuronalen Langzeitumororganisation
nach einer Belastung oder anderen cholinergen Verletzungen (Kaufer
et al., Nature 393, 373-377,
1998) zuzuordnen sind, erscheint diese Möglichkeit ziemlich wahrscheinlich.
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