DE60036132T2

DE60036132T2 - Quantitative immunoenzymatische messmethode

Info

Publication number: DE60036132T2
Application number: DE60036132T
Authority: DE
Inventors: Ana Lucia Mexico ALONSO GARCIA; Jaime Mexico MAS OLIVA
Original assignee: Universidad Nacional Autonoma de Mexico
Current assignee: Universidad Nacional Autonoma de Mexico
Priority date: 1999-12-13
Filing date: 2000-12-13
Publication date: 2008-08-21
Anticipated expiration: 2020-12-14
Also published as: AU2234801A; US7749721B2; US20030186342A1; EP1242446B1; DE60036132D1; ATE370971T1; ES2292493T3; CA2394670A1; EP1242446A1; WO2002032935A1

Description

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung: Diese Erfindung betrifft Labortests, gestaltet zur Identifizierung und Quantifizierung des Cholesterinestertransferproteins (CETP) sowohl in biologischen als auch in synthetischen Proben für die klinische Verwendung, mit dem Ziel das Atherogeneserisiko zu evaluieren und zur Verwendung in der Forschung, die CETP betrifft. Insbesondere wird ein polyklonaler Antikörper zur diagnostischen Verwendung bereitgestellt.
Hintergrund: In den 1970igern wurde eine eindeutige Korrelation zwischen den Spiegeln und Arten von Lipoproteinen und Herzerkrankung etabliert. Es ist beobachtet worden, dass hohe Spiegel von Lipoproteinen niedriger Dichte (LDL) eine Erhöhung der Herzerkrankungsinzidenz verursachen können, und dass eine Verzögerung bei der Entfernung dieser Partikel die Zeit, die sie im Plasma verbleiben, erhöht, sie strukturellen Modifikationen aussetzt und ihre Wechselwirkung mit den Arterienwänden erhöht. Außerdem verringern Veränderungen in Apo B die Fähigkeit dieser Partikel an ihre Rezeptoren zu binden und sie werden deshalb im Wesentlichen durch Makrophagenrezeptoren erkannt. Die Unfähigkeit der Makrophagen die Internalisierung von modifiziertem LDL zu regulieren, verursacht eine Akkumulation von Cholesterinestern und die Bildung von Schaumzellen, ein Phänomen, das die Entwicklung von Atherogenese begünstigt.
Atherosklerose ist ein Phänomen, das in der Kindheit und Aldoleszenz beginnt und während des ganzen Lebens fortschreitet. Ihre Folgen, wie zum Beispiel Arterienverschluss, und ihre wohlbekannten klinischen Erscheinungsformen (akuter Myokardinfarkt, Schlaganfälle, Gangrän der unteren Gliedmaßen, usw.) beginnen viele Jahre bevor sie anhand der Veränderung der Gefäßwände nachgewiesen werden. Einige Patienten, die Serumlipidspiegel zeigen, die höher sind als normal, zeigen unter vielem anderen auch eine größere Inzidenz für diese Art von Beschwerden, wie es bei Diabetikern, Nierenkranken oder bei Menschen mit kongenitaler Hyperlipidämie der Fall ist. Um die Möglichkeit nachzuweisen, dass diese Patienten Atherosklerose und ihre klinischen Erscheinungsformen entwickeln, werden die so genannten „koronaren Risikofaktoren" evaluiert. Diese Faktoren zeigen den Belastungsgrad des Einzelnen für Umstände an, die ein größeres Risiko bestimmen können, Beschwerden, die diese Möglichkeit betreffen, aufzuzeigen; das heißt, sie werden verwendet, um das Atherogeneserisiko zu bestimmen. Koronare Risikofaktoren sind wie folgt:

• Hohes Gesamtcholesterin und Lipoproteine niedriger Dichte
• Hoher Blutdruck
• Rauchen
• Diagnose einer ischämischen Kardiopathie
• Hypo-Alpha-Lipoproteinämie (Niedrige Spiegel von Lipoproteinen hoher Dichte oder HDL)
• Diabetes
• Obesitas
• Familienanamnese einer prämaturen Herzerkrankung
• Männliches Geschlecht
• Proteinurie
• Hypertriglyceridämie

Um zu ermitteln, ob der Patient Risikofaktoren einer Koronarerkrankung ausgesetzt ist, werden gezielte Befragungen, Untersuchung, Bestimmung des Lipidprofils, Elektrokardiogramm und Röntgenaufnahme des Thorax durchgeführt. Wenn eine periphere vaskuläre Insuffizienz vermutet wird, werden eine Doppler-Ultraschall-Untersuchung und eine Arteriographie eingeschlossen.
Alle in dieser Evaluierung betrachteten Elemente werden beim Nachweis und der Nachbetreuung von Patienten verwendet, die innerhalb der so genannten „Risikogruppen" sind, welche Personen einschließen, die auf Grund unterschiedlicher Pathologien einen koronaren Risikofaktor und einige alle koronaren Risikofaktoren zeigen. Es gibt jedoch eine große Anzahl von Personen, die Atherogenese-gefährdet sind, die nicht nachgewiesen worden sind, da sie die zugehörigen klinischen Erscheinungsformen noch nicht aufzeigen und deshalb nicht innerhalb der Risikogruppen eingestuft worden sind. Da es keine Frühdiagnose dieser Personen gibt, werden viele wertvolle Jahre der Prävention verloren und wenn die klinischen Erscheinungsformen sich zeigen, ist der Schaden meistens irreversibel.
Außerdem sind Studien inkonsistent, die, beruhend auf der Konzentration von Lipoproteinen im Plasma von Probanden, die in einige der Risikogruppen eingeschlossen werden, Faktoren des Atherogeneserisikos festlegen. Denn es gibt Patienten, die in die Risikogruppen eingeschlossen werden, welche die typische klinische Beschreibung, die ein Atherogeneserisiko anzeigt, wie zum Beispiel schmerzlose Entwicklung nur mit einem Gefühl von Erschöpfung und Luftmangel, nicht zeigen, und einige andere gehen unbemerkt vorüber, weil sie mit verschiedenen Pathologien verwechselt werden. Infolgedessen ist es nötig, die Untersuchung des Patienten bei der Suche nach atypischen Erscheinungsformen auszuweiten.
Es gibt auch Fälle, bei denen selbst wenn Personen Risikofaktoren ausgesetzt sind, sie keine Atherosklerose entwickeln. Nicht alle Faktoren, die festgelegt werden, um das Atherogeneserisiko zu bestimmen, sind zuverlässig. Einige der am meisten diskutieren Faktoren sind im Lipidprofil eingeschlossen, wie zum Beispiel die hohen Spiegel von Gesamtcholesterin und LDL und die niedrigen Spiegel von HDL im Blut, die verwendet werden, um den atherogenen Index zu berechnen. Bei diesem Index handelt es sich um einen beliebigen Parameter, der sich experimentell als unzuverlässig beim Evaluieren des Atherogeneseriskos erwiesen hat: zum Beispiel wurden bei Tests mit Kaninchen, die für lange Zeit Ernährungsweisen mit hohem Cholesterin unterworfen wurden, hohe Spiegel an Gesamtcholesterin, freies Cholesterin, verestertes Cholesterin und mit LDL assoziiertes Cholesterin, niedrige Spiegel von mit HDL assoziiertem Cholesterin, Hypertriglyceridämie, ein hoher Prozentsatz Esterbildung und ein hoher atherogener Index erhalten; sie zeigten jedoch keine Atherogenese.
Schließlich weist das derzeit verwendete Verfahren zum Evaluieren des Atherogeneserisikos schwerwiegende Beschränkungen auf; erstens ist die Größe und Art der Population, die voraussichtlich evaluiert wird, auf Grund des Zeit- und Geldaufwands, der beim Durchführen der Diagnosetests unterstellt wird, beschränkt und dieses macht den frühen Nachweis von Atherogenese-gefährdeten Personen, die nicht in Risikogruppen platziert werden, schwierig, deshalb ist eine Prävention ihrer Komplikationen ungenügend. Zweitens, selbst wenn die derzeit verwendeten Diagnoseparameter eine gewisse Sicherheit erlauben, handelt es sich bei den meisten von ihnen um qualitative Parameter und einige der quantitativen Parameter, die wichtigsten, stehen zur Diskussion, und es ist deshalb nur möglich von einem „starken klinischen Verdacht eines Atherogeneseriskos" zu sprechen, da die Ergebnisse nicht vollkommen zuverlässig sind. Drittens ist nicht viel über die Lipidhomöostase bei Menschen und bei Säugetieren im Allgemeinen bekannt und es ist nicht möglich gewesen, eine deutliche Beziehung zwischen vielen der Parameter, die als Faktoren des Atherogeneserisikos in Betracht kommen, und ihren klinischen Erscheinungsformen zu etablieren, folglich kann die Bestimmung des Risikos, ohne ein echtes Verständnis der Faktoren, die bei Atherogenese und ihren klinischen Erscheinungsformen eingreifen, nicht auf soliden Grundlagen liegen.
Es gibt andere Faktoren, die beim Etablieren des Atherogenserisikos auf eine zuverlässigere Weise nützlich sein können, wie zum Beispiel die Bestimmung der Spiegel des Cholesterinestertransferproteins (CETP) im Plasma. Mit diesem Protein hat man sich viel befasst und es handelt um einen der am besten bekannten Faktoren, der in Lipidhomöostase eingreift. CETP weist eine wichtige Rolle im Lipoprotein-Metabolismus und bei der Entwicklung koronarer Herzerkrankung auf, da es dazu tendiert hohe Spiegel von LDL und VLDL zu erzeugen, die mit dem Fortschreiten der Atherosklerose assoziiert werden (Marotti-KR, Castle-CK, Boyle-TP, Lin-AH, Murray-RW und Melchior-GW, 1993, Nature 364 (6432): 73–5). Bei CETP handelt es sich um ein multifunktionelles Protein, das den Austausch von Cholesterinestern zwischen HDL und LDL und den Austausch von Cholesterinestern und Triacylglycerin zwischen HDL und VLDL fördert; seine Wirkung auf den Katabolismus von HDL weist einen Einfluss auf seinen Cholesterinestergehalt sowie auf seine Zusammensetzung, Größe und kugelförmige Struktur auf (Rye-KA, Hime-NJ & Barter-PJ, 1995, J. Biol. Chem. 270 (1): 189–196) (Bruce-C, Chouinerd-RA y Tall-AR, 1998, Annu. Rev. Nutr. 18: 297–330).
CETP nimmt auch an der Rückgewinnung von während der Lipolyse der Lipoproteine in peripheren Geweben abgelagertem Cholesterin teil (Jiang-XC, Moulin-P, Quinet-E, Goldberg-IJ, Yacoub-LK, Agellon-LB, Compton-D, Schnitzer-Polokoff-R und Tall-AR, 1991, J. Biol. Chem. 266 (7): 4631–9) (Nagashima-M, McLean-J und Lawn-R, 1988, J. Lipid Res. 29: 1643–1649) (Tall-A, 1995, Annu. Rev. Biochem. 64: 235–257). Dieser Transport, den wir „Cholesterin-Rücktansport" nennen, überträgt auf CETP das Kennzeichen eines anti-atherogenen Proteins, daher seine Wichtigkeit bei Anfälligkeit oder Resistenz gegen Atherosklerose (Kondo-I, Berg-K, Drayna-D, Lawn-R, 1989, Clin. Genet. 35 (1): 49–56) (Bruce-C, Chouinerd-RA y Tall-AR, 1998, Annu. Rev. Nutr. 18: 297–330). In Übereinstimmung mit dem Vorstehenden, handelt es sich bei dem Faktor, der seine anti-atherogene Fähigkeit bestimmt, nicht um den HDL-Spiegel im Plasma, sondern um die Größenverteilung seiner Population, die eine starke Korrelation mit CETP-Spiegeln aufweist (Brown-ML, Inazu-A, Hesler-CB, Agellon-LB, Mann-C, Whitlock-ME, Marcel-YL, Milne-RW, Koizumi-J, Mabuchi-H, 1989, Nature 342 (6248): 448–51). Bei experimenteller Arbeit ist beobachtet worden, dass Säugetierarten, denen CETP fehlt, auf eine natürliche Weise gegen die Entwicklung koronarer Herzerkrankung resistent sind.
Im Gegensatz dazu kann bei transgenen Individuen dieser gleichen Arten, die CETP exprimieren, eine Abnahme der Größe und der HDL-Spiegel beobachtet werden. Als eine Folge erhöht die CETP-Expression die Anfälligkeit an einer durch die Ernährungsweise induzierten koronaren Herzerkrankung zu leiden (Rye-KA, Hime-NJ & Barter-PJ, 1995, J. Biol. Chem. 270 (1): 189–196). Ebenso ist beobachtet worden, dass Menschen mit einem genetischen Defizit für CETP, HDL-Spiegel zeigen, die viel höher sind als die Spiegel normaler Probanden (Hypo-Alpha-Lipoproteinämie). Diese Personen scheinen eine niedrigere Inzidenz für Herzerkrankung aufzuweisen (Inazu-A, Quinet-EM, Wang-S, Browun-ML, Stevenson-S, Barr-ML, Moulin-P und Tall-AR, 1992, Biochemestry 31 (8): 2352–8). Transgene Mäuse mit Hypertriglyceridämie, die CETP exprimieren, sind jedoch vor Atherogenese geschützt (Homanics-GE, de Silva-HV, Osada-J, Zhang-SH, Wong-H, Borensztajin-J und Maeda-N, 1995, J. Biol. Chem. 269: 16376–16382).
In Übereinstimmung mit dem Vorstehenden wird das atherogene oder anti-atherogene Kennzeichen von CETP in Korrelation mit dem HDL-Spiegel etabliert und kann als atherogenes Mittel durch Erhöhen der Lipoproteine mit niedriger Dichte, Entfernen der HDL-Cholesterinester, um sie in LDL und VLDL aufzunehmen, wirken. Das anti-atherogene Kennzeichen von CETP beruht auf seiner Fähigkeit den Transfer von Cholesterin in den peripheren Geweben zu beschleunigen, um es in HDL aufzunehmen, das heißt, der atherogenen Wirkung durch den „Reversen Transport von Cholesterin" entgegenzuwirken. Wir können deshalb sagen, dass nach dem Evaluieren der CETP-Spiegel in Korrelation mit der Verteilung der Größen und des Cholesteringehalts der HDLs, seine atherogene oder anti-atherogene Fähigkeit zusammen mit dem Atherogeneserisiko bei allen Arten von Dyslipidämien etabliert werden kann. Beruhend auf dem Ergebnis dieses Tests kann etabliert werden, ob es nötig ist mit der Evaluierung der restlichen Risikofaktoren fortzufahren oder nicht. Die Nachbetreuung kann auch von Patienten gemacht werden, die diagnostiziert worden sind, wobei die Wirksamkeit der Präventionsprogramme oder gegebenenfalls die Wirksamkeit von Ernährungsweisen und/oder -behandlungen evaluiert wird.
Auch wenn es Bezugnahmen auf andere Systeme zur Quantifizierung von CETP im Plasma gibt, sind aktuell, angesichts der Art der benötigten Ausrüstung, nur Verfahren etabliert worden, deren technische Komplikationen ihre Verwendung begrenzen. So der Fall des amerikanischen Patents US05770355 , eingetragen durch Brocia, Robert W. im April 1998, mit dem Titel: „Heart disease test kit and method of determining heart disease risk factor and efficacy of treatment for heart diseases". Dieses Patent benötigt die Synthese eines künstlichen Partikels und die Verwendung von Cholesterin, das mit einem Fluoreszenzmolekül verbunden ist, was seine Verwendung auf Laboratorien beschränkt, welche die erforderliche Ausrüstung aufweisen, um Fluoreszenz zu messen. K. Saito et al.: „Epitop mapping for the anti-rabbit cholesteryl ester transfer Protein monoclonal antibody that selectively inhibits triglycerid transfer" Journal of Lipid Research, Bd. 40, August 1999, Seite 2013–2021, offenbart, dass die carboxylterminalen Abschnitte von CETP (E465–S473) aus Mensch und K485–S493 aus Kaninchen, wobei beide durch mindestens einen (unspezifischen) Rest außerhalb entweder des amino- oder des carboxylterminalen Endes verlängert wurden, sowohl für den Triglycerid- als auch den Cholesteryltransfer verantwortlich sind.
WO96/39168 offenbart ein Verfahren zum Erhöhen des HDL-Cholesterins in einem Säugetier durch das Stimulieren einer Immunreaktion, welches die Funktionen von CETP inhibiert. CETP-Peptide wurden an Träger, wie zum Beispiel KLH oder Ovalbumin gekoppelt, um die Immunogenität zu erhöhen. Unter den verwendeten Epitopen wird das mit H486–S496 bezeichnete Epitop von CETP, gekoppelt an KLH, (siehe Anspruch 5 und Beispiel 2 auf Seite 9, zweiter Absatz) erwähnt.
Das dieser vorliegenden Erfindung zu Grunde liegende Ziel ist es, Mittel bereitzustellen, um CETP-Spiegel in biologischen und synthetischen Proben auf eine einfache, schnelle Weise nachzuweisen und zu quantifizieren, welches es möglich machen wird den Nachweis, die Diagnose und die Nachbetreuung von Atherogenese-gefährdeten Personen mit oder ohne klinische Erscheinungsformen, die diese Pathologie betreffen, und die in Risikogruppen eingeschlossen oder nicht eingeschlossen werden können, zu verbessern. Dieses wird durch die Aufnahme dieses Systems in Protokolle und Ausrüstung, die routinemäßig in den Menschen betreffenden und tierärztlichen klinischen Laboratorien verwendet werden, getan werden.
Beschreibung der Abbildungen
1. Tests nach Art des Westernblots unter Verwendung des polyklonalen Antikörpers Anti-CETP H486–S496 gegen menschliches Plasma (Spur A) und Plasma aus Kaninchen (Spur B). Der polyklonale Antikörper Anti-CETP H486–S496 erkennt CETP von ~67 kDa. In Tests mit an Lipiden verarmte Rohextrakten und perfundierten Geweben wurde exakt dasselbe Ergebnis erhalten. Um die Möglichkeit von falsch Positiven auszuschalten, bei denen der Antikörper Albumin im Plasma erkennt, wurden Kontrollen gegen BSA (Spur C) in all den Tests eingeschlossen. Das Ergebnis dieser Kontrollen ist negativ, deshalb erkennt der polyklonale Antikörper spezifisch CETP.
2. Diese Abbildung zeigt eine Kurve, deren Standardkurvenwerte unter Verwendung des synthetischen Peptids H486–S496 erhalten wurden, und das Ergebnis der Quantifizierung von CETP in 25 Proben von menschlichem Plasma. Gemäß diesen Ergebnissen werden CETP-Spiegel in der Probengruppe zwischen 2 bis 3 μg/ml festgestellt, welches das Äquivalent von 28–31 pM/ml ist. Diese Ergebnisse wurden mit diesem CETP-Quantifizierungssystem erhalten.
Beschreibung der Sequenzen
ID-1 Sequenz. Sequenz der Sense-Oligonukleotide, die mit dem Antisense-Oligonukleotid mit der ID-2 Sequenz bei PCR-Amplifikationen kompatibel ist. Sie stimmt mit der Sequenz der Basen 1391 bis 1414 in Exon 15 der mRNA von CETP überein. Sie ist 24 nt lang, der Gehalt an G-C beträgt 45,8%, die Annealingtemperatur 55,9°C.
ID-2 Sequenz. Sequenz des Antisense-Oligonukleotids, die mit dem Sense-Oligonukleotid mit der ID-Sequenz bei PCR Amplifikationen kompatibel ist. Sie ist zu der Sequenz der Basen 1852 bis 1828 in Exon 16 der mRNA von CETP komplementär. Sie ist 25 nt lang, der Gehalt an G-C beträgt 48,0%, die Annealingtemperatur 55,3°C.
ID-3 Sequenz. Nukleotidsequenz des CETP Fragments, das aus dem Klon pMosBlue/CETP3' gewonnen und in pGex-2T subkloniert wurde, welche den Klon pGex 2T/CETP3' erzeugt. Beim Subklonieren des CETP Fragments werden drei Nukleotide des Vektors pMos (unterstrichen) auf eine Weise überführt, dass der Klon pGex-2T/CETP3' diese Nukleotide zwischen der GST kodierenden Region und der einen, die CETP kodiert, einschließt.
ID-4 Sequenz. Aminosäuresequenz, die mit dem CETP-Abschnitt im rekombinanten Protein GST/CETPCOH, kodiert durch den Klon pGex2T-CETP3', übereinstimmt. Diese Sequenz stimmt mit den letzten 33 Resten seines Carboxylterminus, von I464 bis S495, überein, unter denen die Reste F481, L488, F491 und L495 eingeschlossen sind, die für das Aufrechterhalten der Cholesterinestertransferaktivität wichtig sind (Tall-A, 1995, Annu. Rev. Biochem. 64: 235–257). Dieses Epitop weist einen hohen Gehalt an alpha-Helixstruktur auf und schließt das ganze Cholesterinesterbindungsmotiv ein (von G473 bis S496) (Matsunaga-A, Araki-K, Moriyama-K, Handa-K, Arakawa-F, Nishi-K, Sasaki-J und Arakawa-K, 1993, Biochim. Biophys. Acta. 1166 (1): 131–4) (Wang-S, Wang-X, Deng-L, Rassart-E, Milne-RW, Tall-AR, 1993, J. Biol. Chem. 268 (3): 1955–9). Das Molekulargewicht (M. W.), der isoelektrische Punkt (I. P.) und die Ladung bei pH 7 wurden mit der Hilfe des DNAstar Programms (Lasergene) erhalten.
ID-5 Sequenz. Sequenz des synthetischen CETP-Peptids H486–S496, gestaltet für die Herstellung des polyklonalen IgY-Antikörpers Anti-CETP H486–S496. Dieses Peptid weist einen Cysteinrest am Aminoende auf, der verwendet wird, um es mit dem Transportprotein zu verbinden. Die Sekundärstruktur wurde von Tall-A (1995), Annu. Rev. Biochem. 64: 235–257 beschrieben und von uns mit den Algorithmen von Chou-Fasman und Garnier-Robson bestätigt. Das Peptid schließt drei der vier Reste ein, die für das Konservieren der Bindungsfähigkeit an neutrale Lipide von besonderer Wichtigkeit sind, bei diesen handelt es sich um F481, L488, F491 und L495, welche in schwarzen Buchstaben gezeigt werden. Das Molekulargewicht (M. W.), der isoelektrische Punkt (I. P.) und die Ladung bei pH 7 wurden mit der Hilfe des DNAstar Programms (Lasergene) erhalten; der pH-Wert, bei dem sich das Peptid in Wasser löst, wurde experimentell erhalten.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung stellt einen Antikörper zur diagnostischen Verwendung nach Anspruch 1, den Kit nach Anspruch 12, das Verfahren nach Anspruch 3 und 11 und die Verwendung nach Anspruch 8 bereit. Diese Ausführungsformen reflektieren ein System CETP nachzuweisen und zu quantifizieren. Die Verwendung dieses Systems macht es möglich, Patienten mit Dyslipidämien, deren Wirkungen Veränderungen im Spiegel von im Plasma zirkulierendem CETP betreffen, zu identifizieren, zu evaluieren und ihnen eine Nachbetreuung zu geben, mit dem Ziel ihr Risiko zu evaluieren, Atherosklerose zu entwickeln. Dieses System ist für die Verwendung in der klinischen Praxis und/oder Forschung, die CETP betrifft, gestaltet. Es können Proben verschiedenen Ursprungs, sowohl biologische als auch synthetische, verwendet werden, vorzugsweise Plasma oder Serum, Extrakte aus Zellen oder aus Geweben, Kulturmedien und gereinigte oder halbgereinigte Antigene.
Das fusionierte Protein GST/CETPCOH
GST/CETPCOH weist ein Gewicht von annähernd 67 kDa auf, 3,7 kDa stimmen mit dem Carboxylterminus von CETP überein, der Rest stimmt mit der Glutathion-S Transferase überein. GST/CETPCOH ist für die Verwendung sowohl in ELISA- als auch Western-Blot-Tests gestaltet, als Standard, der die Identifizierung und Quantifizierung von CETP durch die Verwendung von spezifisch gegen seinen Carboxylterminus gerichtete Antikörper erlaubt.
Die Sequenz des Abschnitts, der in dem fusionierten Protein GST/CETPCOH mit CETP übereinstimmt, wird als ID-4 Sequenz vorgelegt. Diese deckt die letzten 33 Reste des Carboxylterminus von CETP von I464 bis S495 ab und weist einen hohen Gehalt an alpha Helixstruktur auf und schließt das vollständige Cholesterinesterbindungsmotiv (von G473 bis S496) ein. Bei der Gestaltung des Standards für die ELISA- und Western-Blot-Tests wurde der Carboxylterminus von CETP gewählt, weil er die Reste F481, L488, F491 und L495 einschließt und es experimentell demonstriert worden ist, dass diese Reste von besonderer Wichtigkeit für das Aufrechterhalten der Cholesterinestertransferaktivität sind (Wang-S, Kussie-P, Deng-L und Tall-A, 1995, J. Biol. Chem. 270 (2): 612–618) (Jiang-X, Bruce-C, Cocke-T Wang-S, Boguski-M und Tall-A, Biocem. 34: 7258–7263) (Matsunaga-A, Araki-K, Moriyama-K, Handa-K, Arakawa-F, Nishi-K, Sasaki-J und Arakawa-K, 1993, Biochim. Biophys. Acta. 1166 (1): 131–4) (Wang-S, Wang-X, Deng-L, Rassart-E, Milne-RW, Tall-AR, 1993, J. Biol. Chem. 268 (3): 1955–9). Auf diese Weise wird die Quantifizierung von CETP nur den CETP-Carboxylterminus als Standard aufweisen, der die Stellen einschließt, die für das Aufrechterhalten der Bindungsfähigkeit an Cholesterinester notwendig sind.
Einer weiterer der Vorteile diesen Standard zu verwenden ist, dass er nicht die Reinigung von CETP aus natürlichen Quellen braucht. Die Reinigung des rekombinanten Proteins ist einfacher und schneller als die Reinigung von CETP aus Plasma; aus Bakterienkulturen kann eine größere Menge rekombinantes Protein erhalten werden als CETP aus Plasma; die Reinheit rekombinanter Präparationen ist größer als die von Reinigungen von Plasma, und eine größere Reinheit reduziert das Risiko falsch positiver und fehlerhafter Quantifizierungen. Die Erzeugung von rekombinanten Proteinen kann unter kontrollierten Bedingungen durchgeführt werden, im Gegensatz zu jenen, die in biologischen Proben auftreten, die von einer großen Anzahl von Variablen abhängen und die meisten von diesen können nicht kontrolliert werden. Letztendlich schließt das rekombinante Protein nur das Carboxylende ein und deshalb vermeidet man nicht nur eine Kreuzreaktion gegen andere Proteine sondern auch gegen andere Epitope von CETP.
Gestaltung des synthetischen Peptids CETP H486–S496 und Erhalten des polyklonalen Antikörpers Anti-CETP H486-S496.
Das Nachweis- und Quantifizierungsystem für CETP erfordert die Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch gegen die Bindungsstelle für neutrale Lipide gerichtet ist, um zu garantieren, dass nur das CETP, das dieses Epitop konserviert, nachgewiesen werden wird und das deshalb die Fähigkeit konserviert, an neutrale Lipide, einschließlich Cholesterinester, zu binden. Wir müssen hier hinzufügen, dass bis jetzt zahlreiche Mutationen und alternative Editionen von Cholesterinestern berichtet worden sind, von denen die meisten nicht translatiert oder in Proteine translatiert werden, die nicht ins Plasma sezerniert werden. Nur eine dieser CETP Variationen, dezimiert um Exon neun (CETPΔ9), wird schlecht in das extrazelluläre Medium sezerniert (Quinet-E, Yang-TP, Marinos-C und Tall-A 1993, J. Biol. Chem 268 (23): 16891–16894).
Obwohl diese Version von CETPΔ9 beim Lipidtransfer inaktiv ist, konserviert sie das Bindungsepitop für neutrales Lipid und ist deshalb potentiell durch den Antikörper Anti-CETP H486–S496 nachweisbar; es ist jedoch bekannt, dass es schlecht in das extrazelluläre Medium sezerniert wird und es gibt keine Berichte seiner Anwesenheit im Plasma, folglich wird seine Wirkung auf die Quantifizierung von CETP unter Verwendung dieses Systems minimal oder null sein.
Bei der diesem Dokument vorausgehenden Forschung, fanden wir jedoch eine andere Version von CETP ohne das Cholesterinesterbindungsmotiv (CETPΔ16) und deshalb ohne eine Bindungsfähigkeit für neutrales Lipid. Diese Version von CETPΔ16 kann in großen Mengen im Plasma gefunden werden und konnte durch Antikörper nachgewiesen werden, die gegen jedwedes Epitop der Ursprungsversion von CETP gerichtet sind, mit Ausnahme der Antikörper, die gegen das Cholesterinesterbindungsmotiv gerichtet sind.
Angesichts des Vorstehenden, sollte der für dieses System erzeugte Antikörper nicht die Quantifizierung der CETPΔ16-Varietät erkennen, es sollte darüber hinaus das Erzeugen von Antikörpern gegen jedwedes andere im Plasma von Säugetieren vorliegende Protein und gegen jedwedes andere Epitop von CETP vermeiden; es ist auch eine sichere Maßnahme, die falsch positive oder fehlerhafte Quantifizierungen vermeidet. Aus diesem Grund wurde vollständiges, gereinigtes CETP jedweder Säugetierspezies als ein Antigen verworfen und stattdessen wurde ein synthetisches Peptid als Antigen gestaltet. Ein synthetisches Peptid kann in einem hohen Reinheitsgrad erhalten werden und es erlaubt, abhängig von seiner Gestaltung, die Erzeugung von Antikörpern gegen ein spezifisches Epitop.
Um dieses Peptid zu gestalten, wurde das RT-PCR-Produkt sequenziert, das mit einem Paar von Oligonukleotiden mit ID-1 und ID-2 Sequenzen amplifiziert worden war. Diese Sequenz wurde in eine Aminosäuresequenz translatiert und mit Hilfe des DNAstar Programms (Lasergene) analysiert, aus der die Vorhersage des Hydrophobizitätsindex des Kyte-Doolittle Typs und die Sekundärstruktur mit den Algorithmen von Chou-Fasman und Garnier-Robson erhalten wurden.
Beruhend auf dieser Information und auf den Kennzeichen, die für dieses CETP-Quantifizierungsystem benötigt werden, gestalteten wir das synthetische Peptid, unter Berücksichtigung der folgenden Gesichtspunkte:
Es muss innerhalb des Bindungsmotivs für neutrales Lipid eingeschlossen sein. Das heißt, unter den letzten 26 Resten des Carboxylterminus von CETP (Wang-S, Deng-L, Milne-RS und Tall-AR, 1992, J. Biol. Chem. 267 (25): 17487–17490). Auf diese Weise kann der Antikörper nur die CETP-Version erkennen, die dieses Epitop einschließt.
Es muss die größtmögliche Anzahl an Resten einschließen, von denen berichtet wurde, dass sie zur Aufrechterhaltung der Lipidbindungsfähigkeit wichtig sind. Die für die Chloesterinestertransferaktivität wichtigen Reste F481, L488, F491 und L495 sind unter den 26 Aminosäuren des Lipidbindungsmotivs eingeschlossen (Tall-A, 1995, Annu. Rev. Biochem. 64: 235–257). Damit konzentrierten wir das Erkennen des Antikörpers nicht nur gegen das Bindungsmotiv für neutrales Lipid, sondern auch gegen die Reste, die am wichtigsten für das Aufrechterhalten dieser Fähigkeit sind.
Seine Sequenz weist keine Homologie mit anderen Epitopen von CETP oder anderen in Säugetieren oder Hühnern exprimierten Proteinen auf. Obwohl Antikörper unter Verwendung jedweden Tiermodells, das CETP nicht exprimiert, erhalten werden können, um den für dieses System adäquaten Antikörper zu erhalten, werden Hühner bevorzugt und auf diese Weise wird eine starke Immunreaktion auf Grund der phylogenetischen Verschiedenheit gesichert. Aus diesem Grund darf die Peptidgestaltung keine Homologie mit in Hühnern exprimierten Proteinen gestatten. Auf der anderen Seite muss der Antikörper CETP einzig und allein in einem Eptitop erkennen, deshalb sollte das synthetische Peptid keine Homologie mit anderen Proteinen oder einem anderen Epitop von CETP aufweisen.
Seine Größe muss die kleinstmögliche Anzahl von Erkennungsbereichen durch das Immunsystem gestatten. Ein Peptid, das diese Bedingung erfüllt, gestattet die Erzeugung polyklonaler Antikörper, die spezifische Epitope mit der gleichen oder größerer Genauigkeit als ein monoklonaler Antikörper erkennen.
Es muss einen Cysteinrest in seinem Aminoende aufweisen, um seine Bindung auf das Transportprotein auszurichten. Ein Cysteinrest am Aminoende des Peptids ermöglicht es, seine Bindung auf ein Transportprotein auszurichten, so dass alle Erkennungsbereiche für das Immunsystem freigelegt sind.
Es muss in einer Region sein, deren Immunreaktion nachgewiesen worden ist. In früheren Arbeiten wurde demonstriert, dass das Carboxylende von menschlichem CETP eine Immunreaktion erzeugt, wobei ein monoklonaler Antikörper gegen dieses Motiv erhalten wird (Swenso-T, Hesler-CB, Browun-ML, Quinet-E, Trotta-PP, Haslanger-MF, Gaeta-FC, Marcel-yl, Miline-RW und Tall-AR, 1989, J. Biol. Chem. 264: 14318–14326). Die Erkennungsbereiche dieses Antikörpers sind jedoch nicht innerhalb der 26 Aminosäuren, die dieses Epitop umfasst, bestimmt worden. Auf Grund des Vorstehenden konnten wir die Möglichkeit nicht verwerfen, dass in diesem Epitop nicht antigene Bereiche existieren und dass eins von diesen mit der synthetischen Peptidsequenz, die wir gestalteten, überschneidet, und deshalb wurde unsere Gestaltung experimentell geprüft.
In Übereinstimmung mit dem Vorstehenden gestalteten wir das synthetische Peptid CETP H486–S496, dessen Sequenz als ID-5 Sequenz gezeigt wird, und das die folgenden Kennzeichen aufweist: Die Peptidsequenz ist innerhalb des Cholesterinbindungsmotivs zu finden und stimmt mit der Sequenz der Reste H486 bis S496 von CETP aus Kaninchen überein; das heißt, den letzten elf Resten des Proteins, und es ist deshalb unfähig, die CETPΔ16-Version zu erkennen. Seine Sequenz schließt drei der vier Reste ein, die von besonderer Wichtigkeit bei der Aufrechterhaltung des Lipid-bindenden Zusammenschlusses sind: L488, F491 und L495. Die synthetische Peptidsequenz weist keine Homologie mit anderen Epitopen von CETP oder mit anderen Säugetier- oder Hühnerproteinen auf, dagegen legt es eine hohe Homologie mit dem Carboxylterminus von CETP mehrerer Arten vor: 100% mit dem aus Kaninchen, Mensch und Affe und 90% mit dem aus Hamster. Da das Peptid nur aus elf Resten gebildet wird, legt es dem Immunsystem nur einen Erkennungsbereich vor. Ein Cysteinrest wurde der ursprünglichen CETP-Sequenz hinzugefügt, um die Bindung auf das Transportprotein hin auszurichten. Die antigene Fähigkeit des synthetischen Peptids CETP H486–S496 wurde durch Erhalten des polyklonalen Antikörpers Anti-CETP H486–S496 demonstriert.
Um den polyklonalen Antikörper Anti-CETP H486–S496 zu erhalten, wurde das Peptid CETP H486–S496 mit dem KLH-Transportprotein verbunden. KLH wurde an Stelle von Rinderserumalbumin verwendet, um die Erzeugung von Antikörpern zu vermeiden, die das im Plasma vorliegende Albumin erkennen würden, was zu falsch positiven und fehlerhaften Quantifizierungen bei den Testergebnissen führen würde. Antikörper werden in Tiermodellen erhalten, vorzugsweise in weißen LEGHORN Hühnern, die einmal in der Woche unter Verwendung eines 63 Tage-Standardprotokolls subkutan inokuliert werden. Der Antikörpertiter im Plasma wird unter Verwendung der ELISA-Technik bestimmt. Die IgYs in den Eiern werden isoliert. In dem Fall, dass andere Tiermodelle verwendet werden, werden die IgGs im Plasma isoliert. Obwohl diese Antikörper von mehreren Modelltieren erhalten werden können, die CETP nicht exprimieren, werden die Titer in Hühnern viel höher sein.
Es sollte hervorgehoben werden, dass auf Grund der Gestaltung des als Antigen verwendeten synthetischen Peptids, der für dieses System erzeugte polyklonale Antikörper ausschließlich die Reste H486 bis S496 innerhalb des Cholesterinesterbindungsmotivs erkennt. Dieses Epitop schließt drei der vier Reste ein, die von besonderer Wichtigkeit beim Aufrechterhalten der Lipidbindungsfähigkeit sind: L488, F491 und L495. Außerdem weist es nur einen Erkennungsbereich auf und weist deshalb eine größere Genauigkeit als der vorstehend erwähnte monoklonale Antikörper auf. Gemäß der Gestaltung des Antigens und der experimentellen Tests des Antikörpers, erkennt es die Version CETPΔ16, andere Säugetier- oder Hühnerproteine oder andere Eptitope von CETP nicht, trotzdem kann es das CETP anderer Arten erkennen, da die für die Gestaltung des Antigens gewählte Region in mehreren Säugetierarten hoch konserviert ist.
Kreuzreaktionstests wurden unter Verwendung von ELISA- und Westernblot- Techniken gegen das freie und das verbundene synthetische Peptid, das rekombinante Protein GST/CETPCOH und Rinderserumalbumin durchgeführt; damit wurde die Spezifität des Antikörpers für sein Antigen bestimmt. Dieser Antikörper könnte, ebenso wie bei der Verwendung im ELISA oder im Westernblot, in Zukunft in Therapieprotokollen bei Patienten mit Dyslipidämie, die mit CETP-Spiegeln im Plasma assoziiert ist, ebenso wie bei Reinigungssystemen für CETP und andere Proteine mit homologen Sequenzen zu dem Carboxylterminus bei diesem einen verwendet werden.
System zum Nachweis und zur Quantifizierung von CETP
Ziel dieses Systems ist es CETP in der größtmöglichen Anzahl an Proben auf eine einfache, schnelle Weise nachzuweisen und zu quantifizieren. Um das so zu tun wird das klassische ELISA (Enzym-gekoppelter Immunadsorptionsassay) Verfahren verwendet. Als Standards werden das rekombinante Protein GST/CETPCOH und/oder das synthetische Peptid CETP H486–S496 verwendet. Das Kontrollantigen sowie die zu quantifizierenden Proben, vorzugsweise Plasma oder Serum, werden mit der ELISA-Platte verbunden, wobei den Routineverfahren von klinischen Laboratorien gefolgt wird.
Wenn Plasma- oder Serumproben verwendet werden, ist vorzugsweise eine Probe von 20–5 pl erforderlich, welche keine Vorbehandlung erfordert. Bei der Nachweisuntergrenze dieses Systems handelt es sich um 0,018 pM (1 pg) CETP, bei der Obergrenze handelt es sich um 360 pM (20 μg). Bei der für menschliches Plasma und Plasma aus Kaninchen vorgeschlagenen Standardkurve handelt es sich um:
(pM/100 μl)
0,250
0,166
0,125
0,100
0,083
0,071
0,062
0,055
Eine Anfangsverdünnung des Plasmas und des Serums von 1:15000, 100 μl pro Vertiefung wird empfohlen. Sollte der CETP-Spiegel die Kurvengrenzen übersteigen, muss diese Verdünnung angepasst werden.
Der polyklonale Antikörper Anti-CETP H486–S496, wie nach Anspruch 1, wird als primärer Antikörper verwendet, um ausschließlich das für die Bindung neutraler Lipide an CETP verantwortliche Motiv, sowohl in Standards als auch in Proben, nachzuweisen. Abhängig vom Ursprung des primären Antikörpers, Huhn oder Säugetier, wird der sekundäre Antikörper, vorzugsweise kommerzielles mit einer Peroxidase verbundenes Anti-IgY bzw. Anti-IgG, gewählt. Um den primären Antikörper im ELISA zu verwenden, ist die bevorzugte Verdünnung 1:5000. Der sekundäre Antikörper muss vorzugsweise kommerziell sein, vorzugsweise mit einer Peroxidase verbunden, die Verdünnung des sekundären Antikörpers muss die sein, welche durch seinen Hersteller vorgeschlagen wird.
Die höchste Anzahl an Proben, die in jedem Behälter im Duplikat bearbeitet werden kann, ist 39, bei einem Protokoll, das die Standardkurve und eine Negativkontrolle einschließt. Experimentell haben wir falsch Positive über die Verwendung einer Kombination von Negativkontrollen verworfen, die Negativkontrolle muss aber im Duplikat eingeschlossen werden, um den experimentellen Fehler des Systemnutzers zu berücksichtigen.
Da CETP in Säugetieren hoch konserviert ist, ist das System fähig, CETP im Plasma von Arten, die CETP auf eine natürliche Weise exprimieren, oder von mit diesem Gen transgenen Spezies, zu erkennen, welche Homologie mit den letzten 11 Resten des Carboxylendes bereitstellen. Aus diesem Grund wird dieses System bei der Menschen betreffenden und tierärztlichen klinischen Arbeit verwendet.
Kit für die Quantifizierung des Cholesterintransferproteins in biologischen Proben
Das vorstehend beschriebene System ist die Grundlage für die Gestaltung eines Diagnosekits, nutzbar bei der Bestimmung der CETP-Spiegel in einer großen Probenanzahl, der schnell und einfach zu verwenden ist, und der bis heute nicht existiert. Dieser erfindungsgemäße Kit wird in Anspruch 12 definiert und wird für die klinische Verwendung gestaltet, vorzugsweise unter Verwendung von Plasma- oder Serumproben von Arten, die CETP auf eine natürliche Weise exprimieren, oder von mit diesem Gen transgenen Arten. Sie müssen die Homologie in den letzten 11 Aminosäuren des Carboxylendes konservieren.
Dieser Kit kann leicht für Proben unterschiedlichen Ursprungs angepasst werden, sowohl biologische als auch synthetische, sowohl für das Menschen betreffende oder tierärztliche klinische Labor und für verschiedene Forschungsverwendungen.
Der Kit besteht aus: LÖSUNGEN

– PBS 10X

– 50 mM Bindepuffer, pH 9,6 (35 mM Na₂CO₃ + 15 mM NaCO₃ + 20 μg/ml NaN₃)

– Phosphat-Citrat Puffer 0,05 M Natriumphosphat/Citronensäure, pH-Wert 5
ANTIGENE

Rekombinantes Protein GST/CETPCOH
synthetisches Peptid CETP H486–S496

ANTIKÖRPER

– 1. Antikörper IgY oder IgG Anti-CETP H486–S496
VERFAHREN

1 Das Kontrollantigen (GST/CETPCOH und/oder CETP H486–S496) sowie die Standardkurve werden in 100 μl Bindepuffer verdünnt.
2 Man verbindet Antigene und Proben in der ELISA-Platte, welche 2 Std. lang bei 37°C inkubiert wird.
3 Man entfernt die Antigene und blockiert 1 Std. lang bei 37°C mit 200 μl Ovoalbumin, 0,5 mg/ml in einem Carbonatpuffer. Am Ende der Inkubation wäscht man viermal mit 0,1% PBS-Tween (PBST).
4 Man inkubiert 1 Std. lang bei 37°C mit 100 μl Anti-CETP H486–S496, in einer Verdünnung von 1:5000 in PBST. Am Ende der Inkubation wäscht man viermal mit PBST.
5 Man inkubiert mit 100 μl mit einer Peroxidase verbundenem sekundären Antikörper, Anti-IgY bzw. Anti-IgG, in der durch den Hersteller empfohlenen Verdünnung in PBST. Man inkubiert 1 Std. lang bei 37°C. Am Ende der Inkubation wäscht man viermal mit PBST und zweimal mit H₂O.
6 Man entwickelt mit 100 μl Substrat für die Peroxidase, vorzugsweise OPD, bei den durch den Hersteller empfohlenen Bedingungen.
7 Man inkubiert 20 min lang in der Dunkelheit, stoppt die Reaktion mit 50 μl H₂SO₄, 1,5 M, um bei 490 nm abzulesen.
– Das ganze Verfahren wird mit der zugedeckten ELISA-Platte durchgeführt, wobei Temperaturgradienten vermieden werden.

Indem die CETP-Quantifizierung in die Parameter für das Diagnostizieren eines Atherogeneserisko eingeschlossen werden, wird die Sicherheit der Diagnose signifikant erhöht, da es ein quantitativer Parameter ist, der fähig gewesen ist, eine eindeutige Beziehung mit vielen der als Atherogeneserisko in Betracht kommenden Parameter und ihren klinischen Erscheinungsformen zu etablieren. Aus diesem Grund gestalteten wir den vorstehend beschriebenen Kit, um die Implementierung dieses Systems in Kliniken zu erleichtern. Die Leichtigkeit diesen Kit zu verwenden, gestattet seine routinemäßige Verwendung in der klinischen Praxis, welches es möglich macht, Personen zu identifizieren, die keine klinischen Erscheinungsformen von Atherogenese aufweisen und nicht in die Risikogruppen fallen. Das Vorhergehende erleichtert den Nachweis von gefährdeten Personen mit nicht diagnostizierter Atherogenese oder mit atypischen Syndromen. Es erleichtert auch die Diagnose und die Nachbetreuung von Patienten und die Evaluierung der Wirksamkeit der Behandlungen, die ihnen gegeben werden.
BEMERKUNGEN
Die bei der Entwicklung dieses Quantifizierungskits für CETP erzeugten Hilfsmittel können unterschiedliche Verwendungen aufweisen. Die Oligonukleotide mit den ID-1 und ID-2 Sequenzen wurden zur Verwendung bei PCR-Amplifikationen gestaltet, sie können jedoch auch als molekulare Sonden gegen DNA- und PCR-Produkte, die ihre Sequenzen enthalten, verwendet werden. Das Oligonukleotid mit der ID-2 Sequenz kann auch als eine Sonde gegen den Messenger von CETP verwendet werden, das Oligonukleotid der Sequenz ID-1 allerdings nicht. Beide können Hilfsmittel bei zukünftigen Arbeiten sein, sowohl in der Forschung als auch bei der Behandlung von Patienten mit Dyslipidämie, welche die Expression von CETP betrifft.
Die Klone pMosBlue/CETP3' und pGex2T/CETP3' können auch verwendet werden, um spezifische Sonden gegen DNA, mRNA und PCR-Produkte von CETP zu erhalten. Der Klon pMosBlue/CETP3' kann verwendet werden, um das cDNA-Fragment von CETP in andere Vektoren für unterschiedliche Zwecke zu subklonieren, vom Erhalten von Sonden und anderen rekombinanten Proteinen bis hin zu Versuchsprotokollen für die Behandlung von Patienten mit Dyslipidämie, welche die Expression von CETP betrifft. Der Klon pGex2T/CETP3' kann auch zum Subklonieren und zum Erhalten des rekombinanten Proteins GST/CETPCOH mit Hilfe eines einfachen, billigen Verfahrens in großen Mengen und in löslicher Form verwendet werden.
Das rekombinante Protein GST/CETPCOH wird zur Verwendung als Standard sowohl in ELISA- als auch Westernblot Tests in der klinischen Praxis gestaltet, was die Identifizierung und Quantifizierung von CETP durch die Verwendung von Antikörpern, die spezifisch gegen den Carboxylterminus gerichtet sind, ermöglicht. Bei den Tests nach Art des Westernblots ist es ein positiver Standard und/oder Kontrolle, die einfach zu handhaben ist, was mit Proteinen oder Proteinen mit geringem Gewicht nicht möglich wäre. Das Erhalten dieses fusionierten und rekombinanten Proteins stellt einen Standard für die Identifizierung und Quantifizierung von CETP bereit, der zuverlässiger ist als jene, die aus natürlichen Quellen gereinigt werden. Dieses rekombinante Protein weist auch Anwendungen im Forschungsbereich auf, unter vielem anderen zum Beispiel bei Strukturstudien mit hoch auflösenden Systemen, wie zum Beispiel Röntgenstrahl-Kristallographie; bei Aktivitätsstudien, da es das Epitop enthält, das die Fähigkeit an Lipide zu binden verleiht; in der Affinitätschromatographie zur Reinigung von Antikörpern oder anderen Moleküle, die dem Carboxylterminus von CETP ähnlich sind; bei der Herstellung von Antikörpern gegen den Carboxylterminus von CETP ohne die Notwendigkeit an Transportproteine zu binden.
Das synthetische Peptid CETP H486–S496 ist nicht nur zur Herstellung von Antikörpern und als ein Standard im ELISA-Protokoll nützlich, sondern es kann auch ein wichtiges Hilfsmittel in Struktur- und Aktivitätsstudien sein.
Die Verwendung des Nachweis- und Quantifizierungsystems von CETP macht es Patienten mit Dyslipidämien, deren Wirkungen Veränderungen im Spiegel von im Plasma zirkulierendem CETP betreffen, zu identifizieren, zu evaluieren und ihnen eine Nachbetreuung zu geben, mit dem Ziel ihr Risiko zu evaluieren, Atherosklerose zu entwickeln. Dieses System wird die Bearbeitung einer großen Anzahl von Proben auf eine schnelle, einfache Weise erleichtern, was die routinemäßige Verwendung dieses Tests in Menschen betreffenden und tierärztlichen klinischen Laboratorien ermöglicht und auf diese Weise wird die Größe der Population, die evaluiert werden kann, ausgedehnt. Obwohl man vorzugsweise Plasma- oder Serumproben verwendet, kann es auch zur Verwendung mit Zell- oder Gewebeextrakten, Kulturmedien, gereinigten oder halbgereinigten Antigenen usw. angepasst werden, welches seinen Verwendungsbereich in der Forschung enorm erhöht.
Die Verwendung des Kits kann auf die Forschung ausgedehnt werden auf Fakten und Phänomene hin, die mit Lipidhomeostase verbunden sind, sowie auf die Untersuchung der physikalischen, chemischen und biologischen Kennzeichen von CETP und Molekülen, die mit ihm in Verbindung gebracht werden, unter Verwendung von biologischen oder nicht biologischen Versuchsmodellen, vorzugsweise Extrakte von Geweben, Organen oder Zellen in Kultur, Kulturmedien, rekombinanten Proteinen und synthetischen Peptiden.
VERWENDUNGSBEISPIELE
1. – Oligonukleotid-Gestaltung:
Aus der Leber des als Modell genommenen weißen New Zealand Kaninchens (Oryctolagus cuniculus) wurde Gesamt-RNA unter Verwendung des von Sumikawa-K; Parker-I und Miledi-R (1989, Methods in Neurosciences 1: 30–45) beschriebenen Verfahrens erhalten, das poly(A⁺) RNA-Fragment wurde unter Verwendung einer Chromatographie in dem oligo(dT)-Cellulose Verfahren isoliert. cDNA wurde unter Verwendung des kommerziellen Systems für RT-PCR (Perkin Elmer) unter Verwendung von mRNA aus der Leber synthetisiert. Für das RT-PCR Protokoll wurde ein Satz von Oligonukleotiden mit Hilfe des Mac-Vektorprogramms gestaltet. Die Oligonukleotid-Gestaltung berücksichtigt die spezifische Amplifikation des 3'-Endes der cDNA von CETP, die angesichts der Kennzeichen der cDNA-Sequenzkennzeichen von CETP besonders schwierig ist, wobei das was am meisten bestimmend ist, sein hoher Gehalt an G-C ist (über 65%). Als ein Ergebnis des Vorstehenden wurden die folgenden Parameter bei der Gestaltung der in dem PCR-Protokoll verwendeten Oligonukleotide etabliert:

SEQUENZ: cDNA von CETP aus Kaninchen, veröffentlicht durch Nagashima-M, McLean-J und Lawn-R 1988 (J. Lipid. Res. 29: 1643–1649).
ANALYSIERTE SEQUENZ: von Nukleotid 1 bis Nukleotid 1870.
GRÖSSE DER OLIGONUKLEOTIDE: von 18 bis 30 Basen.
ANNEALINGTEMPERATUR: 55–80°C.
GEHALT AN G-C: 45–55%.
PRODUKTGRÖßE: 400–1000 Bp.
HÖCHSTE KOHÄRENZ IN AUFEINANDER FOLGENDEN BASEN:
Oligonukleotid im Vergleich zu Oligonukleotid (jedwedes) = 4.
Oligonukleotid im Vergleich zu Oligonukleotid (nur G-C) = 2.
3'-Ende im Vergleich zu 3'-Ende = 2.

ES WURDEN KEINE RESTRIKTIONSSCHNITTSTELLEN ANGEPASST ODER HINZUGEFÜGT.
Diese Gestaltung erlaubt nur eine Variante der Sense-Oligonukleotide nahe dem 3'-Ende und eine der Antisense-Oligonukeotide, die damit kompatibel ist. Die Sequenzen in diesem Satz von Oligonukleotiden werden als ID-1 Sequenz (Sense-Oligonukleotid) und ID-2 Sequenz (Antisense-Oligonukleotid) gezeigt. Dieser Satz von Oligonukleotiden erzeugt ein Produkt von 462 Bp, von den Basen 1391 bis 1852, das sich vom 3'-Ende von Exon 15 bis zur nicht kodierenden Region von Exon 16 der mRNA von CETP erstreckt. Die Temperatur für ein optimales Alignment beträgt 59,9°C, der Prozentsatz von G-C 60,4% und die Annealingtemperatur 83,2°C.
2. – Klonierung des C-terminalen Endes von CETP
Das mit diesem Satz von Oligonukleotiden erzeugte PCR-Produkt wurde in den Vektor pMosBlueT (Amersham) kloniert. Diese Strategie machte es möglich, die Restriktionsschnittstellen für BamHI und SmaI in das PCR-Produkt zu integrieren, um ihre Subklonierung in den Expressionsvektor pGex-2T (Pharmacia LKB Biotec), in der korrekten Orientierung und im korrekten Leserahmen für die Expression des fusionierten Proteins zu gestatten. Auf diese Weise wurden zwei rekombinante Plasmide erzeugt, die mit dem 3'-Ende der cDNA von CETP kloniert wurden, die Klon pMosBlue/CETP3' und Klon pGex-2T/CETP3' genannt werden.
Der Klon pGex-2T/CETP3' wurde in den Bakterienstamm Escherichia coli DH5α transformiert, um an Glutathion-S Transferase (GST) fusionierte rekombinante Proteine zu erhalten. Der transformierte Stamm wird 8 Std. lang bei 37°C in 500 ml Super Luria Kulturmedium mit 50 μg/ml zugegebenem Ampicillin kultiviert. Die Induktion der Kultur wird 3 Stunden lang mit 0,4 mM IPTG ausgeführt. Nach der Inkubation werden die Bakterien mechanisch lysiert und das fusionierte Protein GST/CETPCOH wird in einer Glutathion-Agarosesäule (SIGMA) unter Verwendung eines bekannten Protokolls (Smith-DB und Corcoran-LM, 1995, Expression and Purification of Glutathion-S Transferase Fusion Proteins. In: Short Protocols in Molecular Biology [Ausbel-MF, Brent-R, KingstonRE, Moore-DDR, Seidman-JG und Strhl-K], WILEY, 3. Ausg. S. 16.18–16.31) gewonnen.
3. – Erhalten von Antikörpern der IgY-Art von Anti-CETP
Die mit KLH verbundenen Peptide wurden für die Herstellung von Antikörpern, vorzugsweise in Hühnern, unter Verwendung eines 63 Tage-Standardprotokolls, wobei sie einmal in der Woche subkutan inokuliert wurden, verwendet. Die Inokula bestanden bei der ersten Verabreichung aus 200 μg BSA/200 μl PBS + 200 μl vollständigem Freundschem Adjuvans (Sigma Inmuno Chemicals) und bei anschließenden Verabreichungen aus 200 μg BSA/150 μl PBS + 150 μl unvollständigem Freundschem Adjuvans (Sigma Inmuno Chemicals). Der Antikörpertiter im Plasma wurde durch die ELISA-Technik bestimmt. Die IgYs wurden aus Eiern isoliert, die über 2 Wochen hinweg gesammelt worden waren. Sowohl die Bindung als auch die Herstellung von Antikörpern und die Titration der ersten Plasmaprobe unter Verwendung von ELISA wurde mit ADI (Alpha Diagnostic International) durchgeführt.
4. – Westernblot-Assay für den Nachweis von CETP
Die Bedingungen zur Verwendung des polyklonalen Antikörpers Anti-CETP H486–S496 wurden in Tests nach Art des Westernblots gegen menschliches Plasma und Plasma von Kaninchen und Rohextrakte und verarmte Lipidextrakte aus perfundierten Geweben standardisiert. Der primäre Antikörper wurde in 1:5000 Verdünnungen und der sekundäre IgG-Antikörper Anti-Chicken (H + L), konjugiert mit Peroxidase (PIRCE), wurde mit 1:10.000 verwendet. Sowohl die Blockierungen als auch die Inkubationen wurden 1 Std. lang bei 37°C mit einer Suspension aus 2,5% fettarmem Trockenmilchpulver in 0,1% TBS-Tween durchgeführt. Die Visualisierung zur quantitativen oder qualitativen Bestimmung von CETP wurde mit Supersignal Substrat (PIRCE) in X-OMAT Autoradiographieplatten (Kodak) durchgeführt. BSA wurde als Negativkontrolle in diesen Tests verwendet. Um die Möglichkeit zu verwerten, dass der Antikörper auf unspezifische Weise Albumin erkennt, dessen Molekulargewicht nahe an dem von CETP (~67 KDa) liegt, wurden Negativkontrollen mit BSA eingeschlossen. In allen Testläufen erkennt der Antikörper Anti-CETP H486–S496 spezifisch CETP. Die Ergebnisse dieser Tests können in 1 gesehen werden.
5. – ELISA-Assay zum Nachweis von CETP
Die Bedingungen zur Verwendung des polyklonalen Antikörpers Anti-CETP H486–S496 in ELISA-Tests gegen menschliches Plasma und Plasma von Kaninchen wurden standardisiert. Der primäre Antikörper wurde in Verdünnungen von 1:2000 und der sekundäre IgG Anti-Chicken Antikörper (H + L), konjugiert mit Peroxidase (PIRCE), wurde mit 1:2000 verwendet Sowohl die Blockierungen als auch die Inkubationen wurden 1 Std. lang bei Raumtemperaur mit 0,1% TBS-Tween durchgeführt. Die Visualisierung wurde mit OPD (o-Phenylendiamin-dihydrochlorid, SIGMA) durchgeführt. Die O.D.-Ablesungen wurden bei 450 nm durchgeführt. BSA wurde als Negativkontrolle in diesen Tests verwendet. Um die Möglichkeit zu verwerfen, dass der Antikörper auf unspezifische Weise Albumin erkennt, wurden Negativkontrollen mit BSA eingeschlossen. Einige Ergebnisse, die mit diesem Quantifizierungsystem von CETP erhalten wurden, werden in 2 gezeigt.
LISTE DER SEQUENZEN
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polyklonaler Antikörper zur diagnostischen Verwendung, dadurch gekennzeichnet, dass er die Region erkennt, welche die Aminosäuren H486–S496 von CETP umfasst, aber das Peptid CETPΔ16, nämlich CETP ohne Cholesterinesterbindungsmotiv, nicht erkennt, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper nach dem Verbinden des Peptids, bestehend aus Cys His Leu Leu Val Asp Phe Leu Gln Ser Leu Ser von CETP (wobei es sich bei H486–S496 um SEQ ID No: 5 handelt), mit dem KLH-Transportprotein hergestellt wird.
Polyklonaler Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Antikörper der IgY-Art handelt.
Immunoenzymatisches Verfahren zum Nachweisen und Quantifizieren des Cholesterinestertransferproteins in biologischen und synthetischen Proben, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben mit dem polyklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 oder 2 in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem polyklonalen Antikörper um die IgY-Art handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der polyklonale Antikörper nach einem der Ansprüche 1 oder 2 als primärer Antikörper verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein mit Peroxidase verbundener sekundärer Antikörper verwendet wird, um die Reaktion offensichtlich zu machen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusionsprotein, bestehend aus dem GST-Protein, das an den Aminoterminus von CETP aus Kaninchen, bestehend aus den Resten 1464–S496 (Ile Asn Pro Glu Ile Ile Thr Leu Asp Gly Cys Leu Leu Leu Gln Met Asp Phe Gly Phe Pro Lys His Leu Leu Val Asp Phe Leu Gln Ser Leu Ser) fusioniert ist, und/oder das synthetische Peptid His Leu Leu Val Asp Phe Leu Gln Ser Leu Ser als Standard verwendet werden.
Verwendung des mit dem KLH-Transportprotein verbundenen synthetischen Peptids Cys His Leu Leu Val Asp Phe Leu Gln Ser Leu Ser zur Erzeugung polyklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 oder 2.
Verwendung nach Anspruch 8, wenn der polyklonale Antikörper durch das Inokulieren von Modelltieren, vorzugsweise dem Huhn, erhalten wird.
Verwendung des polyklonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 oder 2 in Immunoassays, vorzugsweise im ELISA oder Westernblot.
In vitro Verfahren zum Diagnostizieren des Atherogeneserisikos oder von Dyslipidämie, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt des Nachweisens und Quantifizierens des Cholesterinestertransferproteins in biologischen und synthetischen Proben zum Diagnostizieren des Atherogeneserisikos oder von Dyslipidämie durch in Kontakt bringen der Proben mit dem polyklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 oder 2 durchgeführt wird.
Kit zum Diagnostizieren des Atherogeneserisikos, beruhend auf der Quantifizierung der CETP-Spiegel im Plasma, dadurch gekennzeichnet, dass er a) das rekombinante Protein, bestehend aus dem GST-Protein, das an den Aminoterminus von CETP aus Kaninchen, bestehend aus den Resten I464–S496 (Ile Asn Pro Glu Ile Ile Thr Leu Asp Gly Cys Leu Leu Leu Gln Met Asp Phe Gly Phe Pro Lys His Leu Leu Val Asp Phe Leu Gln Ser Leu Ser), fusioniert ist, und/oder das synthetische Peptid His Leu Leu Val Asp Phe Leu Gln Ser Leu Ser und b) den polyklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 oder 2 als primären Antikörper enthält.
Kit nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass er einen sekundären Antikörper umfasst, der mit einem Enzym, vorzugsweise Peroxidase, verbunden ist, um die Reaktion offensichtlich zu machen.
Kit nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass er beim Nachweis und der Quantifizierung von CETP in biologischen und synthetischen Proben verwendet wird.
Kit nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass er zur Verwendung in Menschen betreffender und tierärztlicher klinischer Praxis gestaltet wird.
Kit nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass er beim Nachweis, der Evaluierung und Nachbetreuung von Patienten mit Dyslipidämie und/oder Atherogeneserisiko verwendet wird.