DE69322960T2

DE69322960T2 - Empfängnisverhütender impfstoff

Info

Publication number: DE69322960T2
Application number: DE69322960T
Authority: DE
Inventors: Diana G. West Simsbury Ct 06092 Myles; Paul West Simsbury Ct 06092 Primakoff
Original assignee: University of Connecticut
Current assignee: University of Connecticut
Priority date: 1992-06-12
Filing date: 1993-06-10
Publication date: 1999-08-12
Anticipated expiration: 2013-06-11
Also published as: EP0646015B1; AU4534893A; KR950701821A; EP0646015A1; ATE175357T1; CA2137077A1; WO1993025233A1; DE69322960D1; JPH08503601A

Description

Grundlagen

Es ist bekannt, daß eine Immunisierung von männlichen und weiblichen Tieren mit Extrakten aus vollständigen Spermien eine Unfruchtbarkeit verursacht (Tung, K., et al., J. of Reproductive Immunol., 1: 145-158 (1979) und Menge, A., et al., Biol. of Reproduction, 20: 931-937 (1979)). Ebenfalls sind Männer und Frauen, die spontan Antispermien Antikörper produzieren, unfruchtbar aber sonst gesund (Bronson, R. et al., Fert. and Steril., 42: 171-183 (1984)) Wenn auch die entscheidenden Spermien-Antigene unbekannt sind, haben diese Beobachtungen zu der Hypothese geführt, daß Spermien-Proteine zur Entwicklung eines empfängnisverhütenden Impfstoffs zweckdienlich sein könnten.
Es ist angenommen worden, daß in Säuger-Species Spermien-Proteine eine Rolle bei der Spermien-Adhäsion an die Zona pellucida der Eizelle spielen. Bei der Maus ist gezeigt worden, daß eine Spermien-Oberflächen Galactosyl- Transferase ein Adhäsionsprotein ist, das bei Akrosomintakten Spermien der Bindung an die Zona dient (Shur, B. E., Galactosyl transferase as a recognition molecule during fertilization and development, In: "The Molecular Biology of Fertilization," Herausgeber Schatten, H. und Schatten, G., Academic Press, Seiten 37-71 (1989)). Auf Ratten-Spermien gibt es einen Galactose-Rezeptor, (RTG- r), der mit dem Leber Asialoglycoprotein-Rezeptor verwandt ist und über seine Lektin-Eigenschaften bei der Spermien-Bindung an die Oligosaccharid-Zone dienen könnte (Abdullah, M., und Kierszenbaum, A. L., J. Cell Biol., 108: 367-375 (1989)). Es ist auch berichtet worden, daß ein Eberspermien Plasmamembran-Protein (AP&sub2;), das sich von der zu Galactosyl-Transferase unterscheidet, und ein Kaninchenspermien Protein eine Rolle in der Spermien-Zona Adhäsion spielen (Peterson, R. N. und Hunt, W. P., Gam. Res., 23: 103-118 (1989) und O' Rand, M. G., et al., Dev. Biol., 129: 231-240 (1988)).
Beim Meerschweinchenspermien-Oberflächenprotein PH- 20 ist gezeigt worden, daß es eine erforderliche Funktion bei der Spermien-Adhäsion an die extrazelluläre Hülle (Zona pellucida) der Eizelle, ein notwendiger erster Schritt bei der Befruchtung, besitzt. In männlichen und weiblichen mit PH-20 immunisierten Meerschweinchen wurde eine 100% wirksame Kontrazeption erhalten. Antisera von immunisierten Weibchen besaßen hohe Titer, erkannten spezifisch PH-20 in Spermien-Extrakten und blockierten in vitro die Spermien-Adhäsion an die Zona pellucida der Eizelle. Die empfängnisverhütende Wirkung war langanhaltend und reversibel; immunisierte Weibchen, die in Intervallen von 6-15 Monaten nach der Immunisierung gepaart wurden, gewannen ihre Fertilität schrittweise zurück. Ein zweites Meerschweinchenspermien-Oberflächenprotein, PH-30, zeigte ebenfalls eine empfängnisverhütende Wirkung.
In WO 92/10569 (Internationales Veröffentlichungsdatum 25. Juni 1992) sind die DNS-Sequenzen von Genen offengelegt, die PH-20 Protein vom Meerschwein, von der Maus und vom Menschen codieren. Es wurde festgestellt, daß Teile des isolierten Meerschweinchen PH-20 Gens, die als Sonde verwendet werden, an DNS-Fragmente von genomischen DNS-Verdaus von jeweils mehreren Säugern, die in einer Southern Hybridisierung getestet wurden, hybridisieren.
In WO 93/06859 (internationales Veröffentlichungsdatum 15. April 1993) wurden die Testis assoziierten T- Komplex exprimierten-1 (TCTE-1) cDNSren der Maus und des Menschen jeweils isoliert und in E. coli als Fusionsproteine exprimiert. Humane und murine Gene, die dieses Spermien-Oberflächenprotein codieren, wurden als hochkonserviert erkannt. Wenn die murine cDNS als Sonde in einer Southern Hybridisierung verwendet wurde, wurde festgestellt, daß sie an genomische DNS von Xenopus, Huhn und verschiedenen Säugern hybridisierte. Eine Vorinkubation von Kaninchen anti-(Maus)-TCte-1 IgG mit murinen Spermien verminderte den Anteil an Spermien, der in der Lage ist, an murine Eizellen zu binden.
Andere Spermien-Proteine, die als empfängnisverhütende Immunogene getestet wurden, umfassen die Spermien- Enzyme Hyaluronidase, Akrosin und Lactat-Dehydrogenase C- 4. Eine Immunisierung weiblicher Tiere mit diesen Enzymen besaß entweder keine Wirkung auf die Fertilität oder partielle Wirkungen auf die Fertilität, die nicht hoch genug waren, um diese Proteine als empfängnisverhütendes Agens geeignet erscheinen zu lassen. Die hohe empfängnisverhütende Wirksamkeit von PH-20 beim Meerschweinchen scheint von mehreren seiner spezifischen Eigenschaften, einschließlich seines Vorhandenseins auf der Spermien- Oberfläche, seiner starken Immunogenität und seiner essentiellen Rolle in der Befruchtung abzuhängen.
Die Spermien-Zona Adhäsion ist beim Säuger in den meisten Fällen artspezifisch. Spermien von anderen Säuger-Species sind den Meerschweinchen-Spermien ähnlich, weil sie an die Zona pellucida entweder vor oder nach der Akrosom-Reaktion binden können. Die Identifizierung und Isolierung von Spermien-Oberflächenproteinen, die für die Befruchtung in anderen Species als Meerschweinchen wesentlich sind, könnte zur Entwicklung von Impfstoffen zur wirksamen Immunisierung und Bereitstellung einer langanhaltenden Kontrazeption in diesen Species zweckdienlich sein. Die fehlende biochemische Identifizierung, Isolierung und Klonierung von in Frage kommenden Spermien-Adhäsionsproteinen hat Wissenschaftler bei der Entwicklung wirksamer empfängnisverhütender Impfstoffe für Menschen wie auch für andere Säuger Species behindert.

Zusammenfassung der Erfindung

Der Gegenstand der Erfindung bezieht sich auf Verfahren der Kontrazeption, in denen eines von mehreren PH-30 Spermien-Oberflächenproteinen einem Säuger verabreicht wird. Das Spermien-Oberflächenprotein (oder Teil des Proteins) wird in einer für die Stimulation einer Immunantwort wirksamen Menge verabreicht, wodurch ein Antikörper, der an das Spermien-Oberflächenprotein bindet, in einem Titer produziert wird, der hinreichend ist, die Spermium-Eizelle Fusion zu verhindern oder die Rate der Spermium-Eizelle Fusion wesentlich zu vermindern. Das Protein oder Protein-Fragment kann mittels konventioneller Verfahren gereinigt sein oder mittels rekombinanter DNS-Verfahren hergestellt sein.
Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf empfängnisverhütende Zusammensetzungen zur Verwendung in den hier beschriebenen Verfahren. Diese Zusammensetzungen enthalten ein Spermien-Oberflächenprotein oder einen Teil davon. Bevorzugte Spermien-Oberflächenproteine sind PH-30 Spermien-Oberflächenproteine.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Abb. 1 ist ein Diagramm, das einen Teil einer Restriktionskarte der DNS, die das Meerschweinchen PH-20 Protein codiert, und die relativen Positionen von 5 cDNS- Klonen darstellt.
Abb. 2 ist ein Diagramm, das die Meerschweinchen cDNS-Sequenz, die das PH-20 Protein codiert, und die abgeleitete Aminosäure-Sequenz des Meerschweinchen PH-20 Proteins im Einbuchstaben-Code darstellt.
Abb. 3 ist ein Diagramm, das die murine DNS- Sequenz, die das PH-20 Protein codiert, darstellt. Die in Abb. 3 offengelegte Sequenz ist als SEQ ID Nr. 3 und 4 abgebildet.
Abb. 4 ist ein Diagramm, das die menschliche DNS-Sequenz, die eine Form des menschlichen PH-20 Proteins codiert, und die abgeleitete Aminosäure-Sequenz im Dreibuchstaben-Code dargestellt. Die Offenlegung der Sequenz in Abb. 4 ist als SEQ ID Nr. 5 und 6 abgebildet.
Abb. 5A-B sind Diagramme, die die menschliche DNS-Sequenz, die ein Teil einer zweiten Form des menschlichen PH-20 Proteins codiert, und die abgeleitete Aminosäure-Sequenz im Dreibuchstaben-Code dargestellen. Die Offenlegung der Sequenz in Abb. 5 ist als SEQ ID Nr. 7 und 8 abgebildet.
Abb. 6 ist ein Diagramm, das die vorliegende Erfindung mit der DNS-Sequenz der PH-30 α-Untereinheit des Meerschweinchens darstellt. Die Offenlegung der Sequenz in Abb. 6 ist als SEQ ID Nr. 9 abgebildet.
Abb. 7 ist ein Diagramm, das die vorliegende Erfindung mit der DNS-Sequenz der PH-30 β-Untereinheit des Meerschweinchens darstellt. Die Offenlegung der Sequenz in Abb. 7 ist als SEQ ID Nr. 10 abgebildet.
Abb. 8A-B sind Diagramme, die die vorliegende Erfindung mit einem Vergleich von Aminosäure-Sequenzen des Meerschweinchen PH-30 mit Disintegrin-Sequenzen darstellen. Abb. 8 führt 31 Peptid-Sequenzen vollständig auf. Diese Sequenzen sind in der Sequenzliste als SEQ ID NR. 11 bis SEQ ID NR. 41 fortlaufend abgebildet.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Der Gegenstand der Erfindung bezieht sich auf PH-30 Spermien-Oberflächenproteine, die für die Befruchtung wesentlich sind, oder Teile davon und ihre Verwendung in empfängnisverhütenden Verfahren. Ein Spermien-Oberflächenprotein ist für die Befruchtung wesentlich, falls zum Beispiel ein monoklonaler Antikörper, der gegen das Protein, oder ein polyklonaler Antikörper, der gegen das gereinigte Protein gerichtet ist, wenn er an das Spermium gebunden ist, eine Befruchtung in vitro oder in vivo oder einen beliebigen Schritt der in vitro Befruchtung hemmt. Der Befruchtungsvorgang ist als die Bindung oder Fusion zweier Gameten (Spermium und Eizelle) und anschließende Fusion ihrer Zellkerne, um ein Genom eines neuen Organismus zu bilden, definiert. Das Oberflächenprotein kann in der Plasmamembran des Spermiums und/oder der inneren Akrosommembran lokalisiert sein. Es kann ein Protein oder Glycoprotein sein. Das zur Immunisierung verwendete isolierte Oberflächenprotein kann das gesamte Oberflächenprotein oder einen immunogenen Teil des Proteins, der außerhalb der Zelle ist, umfassen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf PH-30 Proteine und alle Verweise auf PH-20 dienen nur der Information.
Sowohl die PH-20 als auch die PH-30 Gene codieren Proteine, die auf der Oberfläche des Spermiums vorhanden sind und für die Befruchtung wesentlich sind. Es ist festgestellt worden, daß die DNS, die PH-20 in einer Säuger-Species codiert, kreuzreaktiv (d. h. hybridisierbar) mit genomischer DNS aus allen anderen getesteten Säugern ist. Das Auftreten dieser Homologien in anderen Säuger-Species war eine unerwartete Entdeckung, da in den meisten Fällen die Spermien-Zona pellucida Adhäsion beim Säuger artspezifisch ist. Entsprechend hybridisiert Meerschweinchen PH-30 cDNS mit menschlicher genomischer DNS.
Weibliche, mit affinitätsgereinigtem Meerschweinchen PH-20 immunisierte Meerschweinchen waren für mindestens sechs Monate vollständig unfruchtbar und ihre Sera blockierten die Spermien-Bindung an die Zona pellucida der Eizelle in vitro. Eine kleine Anzahl an männlichen, mit Meerschweinchen PH-20 immunisierten Meerschweinchen war für mindestens sieben Monate unfruchtbar (Primakoff, P., et al., Nature 335: 543-546 (1988)).
Die abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen der α- und β- Untereinheiten des Meerschweinchen PH-20 zeigen Ähnlichkeiten zueinander, was auf eine evolutionäre Verwandtschaft hindeutet und zeigt, daß beide Typ-I integrale Membranproteine mit großen N-terminalen extrazellulären Domänen und kurzen cytoplasmatischen Anhängen sind. Die β-Untereinheit enthält eine mutmaßliche Integrin bindende "Disintegrin" Domäne, die zur Bindung eines mutmaßlichen Rezeptors (Integrin oder Integrin- ähnlich) auf der Plasmamembran der Eizelle dienen könnte (Blobel, C. P. et al., Nature 356: 248-252 (1992)).

Herstellung und Reinigung vom Immunogen

Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Spermien-Oberflächenproteinen zur Verwendung als kontrazeptives Immunogen erfolgt mittels der rekombinanten DNS- Technologie. Um das Protein mit Hilfe dieser Technologie herzustellen, ist es notwendig, die DNS, die das Protein oder einen immunogenen Teil davon codiert, zu isolieren und zu klonieren. Fachleute sind mit einer Reihe an Verfahren vertraut, die verwendet werden können, um ein Gen von Interesse zu klonieren. Nur mit dem isolierten Protein von Interesse, kann allerdings der Erfolg einer solchen Anstrengung nicht mit einer angemessenen Sicherheit vorausgesagt werden.
Im folgenden Referenzbeispiel 1 beschreiben die Anmelder die Isolierung und Klonierung von DNS, die das Meerschweinchen PH-20 Gen codiert. Das angewandte Verfahren zur Isolierung von DNS, die den 3'-Teil des PH- 20 Gens codiert, beinhaltet auch das Durchmustern einer cDNS-Expressionsbibliothek mit polyklonalen Sera, die mit dem PH-20 Protein reagieren. Eine anchored PCR wurde verwendet, um den 5'-Teil des Gens zu isolieren.
Referenzbeispiel 2 beschreibt die überraschende Entdeckung, daß ein breites Spektrum an genomischer Säuger-DNS DNS-Sequenzen enthält, die unter den beschriebenen Hybridisierungebedingungen an Meerschweinchen PH-20 Sequenzen hybridisieren. Tatsächlich wurden kreuzreaktive Sequenzen in jeder analysierten Säuger- Probe identifiziert.
Die in Referenzbeispiel 1 und 2 gegebene Information ermöglicht dem Fachmann, das PH-20 Gen aus einer beliebigen Säuger-Species zu isolieren und zu klonieren. Zum Beispiel wird eine cDNS-Bibliothek aus Testis-Zellen oder spermatogenen Zellen, die aus einem Säuger von Interesse (z. B. Felidae, Equidae, Canidae, Bovidae, etc.) isoliert sind, hergestellt. Dies kann ein zeitraubender Prozeß sein, ist aber technisch einfach. Ein Fachmann würde diese Aufgabe mit einer großen Sicherheit erfolgreich ausführen.
Eine derartige cDNS-Bibliothek wird dann mit Hilfe von zum Beispiel markierten Meerschweinchen PH-20 DNS- Sonden durchmustert. Die DNS, die das gesamte oder einen Teil von PH-20 codiert, ist durch die Fähigkeit gekennzeichnet, an eine derartige Sonden-Sequenz unter Hybridisierungsbedingungen, wie beispielsweise den in Referenzbeispiel 2 beschriebenen Bedingungen, zu hybridisieren. Verfahren zur Markierung und Durchmusterung mittels Hybridisierung sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Positive Klone werden analysiert und eine vollständige cDNS wird mittels konventioneller Verfahren konstruiert. In Anbetracht der Erfahrungen der Antragsteller, daß jeder der 7 analysierten Säuger kreuzhybridisierende Sequenzen enthielt, würde ein Fachmann erwarten, daß alle Säuger kreuzhybridisierende Species enthalten. Es ist diese Methodik, die den Anmeldern es ermöglichte, die murinen und humanen PH-20 Gene, wie unten genauer beschrieben, zu isolieren und zu klonieren.
Das geklonte Gen oder Teile davon, das eine immunogene Region des PH-20 Proteins codiert, kann mit Hilfe einer Insertion der codierenden Region in einen Expressionsvektor, um ein Expressionsprodukt zu konstruieren, exprimiert werden. Viele derartige Expressionsvektoren sind dem Fachmann bekannt. Diese Vektoren enthalten einen Promotor für das Gen von Interesse wie auch zusätzliche Transcriptions- und Translationssignale. Expressionsvektoren für sowohl eukaryonte Wirtszellen als auch prokaryonte Wirtzellen sind allgemein verfügbar. Das DNS-Expressionskonstrukt wird verwendet, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren.
Eukaryontische Wirtszellen, insbesondere Säuger- Wirtszellen, werden für die Expression des Spermien-Oberflächenproteins bevorzugt. Es ist festgestellt worden, daß zum Beipiel eukaryontische Proteine häufig Probleme bei der Faltung zeigen, wenn sie in prokaryontischen Zellen exprimiert werden. Zusätzlich erfordert die Herstellung authentischer, biologisch aktiver eukaryonter Proteine aus klonierter DNS häufig eine post-translationale Modifizierung, wie beispielsweise Disulfidbrückenbildung, Glycosylierung, Phosphorylierung oder spezifische proteolytische Spaltprozesse, die in bakte riellen Zellen nicht durchgeführt werden. Dies trifft insbesondere auf Membranproteine zu. Das Spermien-Oberflächenprotein wird mit Hilfe der transcriptionalen und translationalen Komponenten der Wirtszelle hergestellt. Nach einer geeigneten Wachstums- und Expressionszeit wird die Wirtszellkultur lysiert und das Spermien-Oberflächenprotein wird aus dem Lysat gereinigt. Lyse-Puffer enthalten typischerweise nicht-ionisches Detergens, Protease-Hemmer etc.
Aus dem gelösten Zellextrakt kann das Spermien- Oberflächenprotein mit Hilfe von physikalischen und biochemischen Verfahren, wie beispielsweise Ultrazentrifugation, Säulen-Chromatographie, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, Elektrophorese etc. gereinigt und isoliert werden. Alternativ kann das Spermien-Oberflächenprotein mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern isoliert werden (siehe Primakoff et al., Biol. of Reprod. 38: 921-934 (1988)). Derartige Verfahren zur Reinigung von Proteinen sind dem Fachmann bekannt.
Die oben für das PH-20 Gen und Genprodukt grob dargelegten Verfahren sind ebenfalls gemäß der vorliegenden Erfindung auf das PH-30 Gen und Genprodukte anwendbar. Die Isolierung von DNS, die die α- und β- Untereinheiten des PH-30 Spermien-Oberflächenproteins codiert, ist in Beispiel 5 beschrieben. Verfahren, die zu den oben beschriebenen analog sind, können ebenfalls angewandt werden, um Säuger-Proteine, die zu dem Meerschweinchen PH-30 Protein homolog sind, zu isolieren und zu exprimieren. Es kann mit hoher Wahrscheinlichkeit vorausgesagt werden, daß DNS, die das Meerschweinchen PH-30 Spermien- Oberflächenprotein codiert, als Sonde verwendet werden kann, um homologe Sequenzen aus anderen Säugern zu isolieren. Diese Voraussage beruht auf der Tatsache, daß Meerchweinchen DNS verwendet worden ist, um das Vorhandensein eines PH-30 Homologs in genomischer menschlicher DNS zu identifizieren.
Wie oben erwähnt, sind antigene Teile des Spermien- Oberflächenproteins zusätzlich zu dem vollständigen Protein als Immunogen zweckdienlich. Antigene Fragmente können zum Beispiel durch proteolytischen Verdau des vollständigen Proteins und anschließender Isolierung des gewünschten Fragments hergestellt werden. Alternativ kann eine chemische Synthese durchgeführt werden, um das gewünschte Fragment aus monomeren Aminosäure-Resten zu bilden.
Hinsichtlich des PH-30 Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung sind bestimmte antigene Domänen bevorzugte Kandidaten für eine Verwendung in einem empfängnisverhütenden Impfstoff. Wie in dem folgenden Beispielabschnitt genauer diskutiert, enthält die PH-30 β-Untereinheit eine Domäne, die im Vergleich zu einer als Disintegrine bekannten Klasse von Proteinen hochkonserviert ist. Ein Peptid (oder ein Teil davon), das identisch mit oder im wesentlichen identisch mit dieser Domäne ist, wird für die Verwendung in den empfängnis verhütenden Verfahren dieser Erfindung bevorzugt. Im wesentlichen identisch, wie im vorausgehenden Satz verwendet, heißt, daß mindestens 80% der Aminosäure- Sequenz des Peptids identisch mit dem entsprechenden Teil der PH-30 β Disintegrin Domäne ist.
Disintegrine sind zum Beispiel im Schlangengift gefunden worden und sind dafür bekannt, daß sie an eine Klasse von Blutplättchen-Oberflächenproteinen, die als Integrine bekannt sind, binden. Das Binden von Disintegrinen an Integrine hat gezeigt, daß es die Blutgerinnung hemmt. Analog wird von Peptiden, die der PH-30 β Disintegrin Domäne entsprechen, vorausgesagt, daß sie in der Spermazelle-Eizelle Bindung und Fusion aktiv sind.

Empfängnisverhütender Impfstoff

Sobald das Spermien-Oberflächenprotein hergestellt und gereinigt worden ist, kann ein Impfstoff durch Kombination des Spermien-Oberflächenproteins mit einem geeigneten Träger für eine Verabreichung an ein Tier zur Immunisierung hergestellt werden. Ein Impfstoff kann ein oder mehrere Spermien-Oberflächenproteine enthalten. In der vorliegenden Erfindung verwendete Spermien-Oberflächenproteine können mit Adjuvanzien kombiniert sein, die unspezifische Stimulatoren des Immunsystems enthalten. Die richtige Verwendung von Adjuvanzien kann eine starke Antikörperantwort auf fremde Antigene (z. B. Spermien-Oberflächenproteine) induzieren. Die Wirkung von Adjuvanzien ist nicht vollständig verstanden, aber die meisten Adjuvanzien beeinhalten zwei Komponenten. Die eine Komponente ist eine Substanz, die zur Bildung einer Anlagerung, die das Antigen vor Katabolismus schützt, dient. Zwei Verfahren zur Bildung einer Anlagerung verwenden Mineralöle oder Aluminiumhydroxid-Präzipitate. Mit Mineralölen wie beispielsweise Freund Adjuvans wird das Immunogen in einer Wasser-in-Öl Emulsion präpariert. Bei Aluminiumhydroxid wird das Immunogen entweder an vorgeformten Präzipitaten adsorbiert oder wird während der Präzipitation eingeschlossen. Alternative Überbringungssysteme umfassen Liposomen oder synthetische oberflächenaktive Stoffe. Liposomen sind nur wirksam, wenn das Immunogen in die äußere Lipidschicht eingebaut ist; eingeschlossene Moleküle werden vom Immunsystem nicht erkannt.
Die zweite, für ein wirksames Adjuvans benötigte Komponente ist eine Substanz, die das Immunsystem unspezifisch stimuliert. Diese Substanzen stimulieren die die Produktion einer großen Reihe an löslichen Peptidfaktoren, die als Lymphokine bekannt sind. Ihrerseits stimulieren Lymphokine direkt die Aktivität von Antigenprocessierenden Zellen und verursachen eine lokale Entzündungsreaktion an der Injektionsstelle. Eine Lipopolysaccharidverbindung, bekannt als Lipid A, wird gewöhnlich verwendet. Lipid A ist in mehreren synthetischen und natürlichen Formen verfügbar, die viel weniger toxisch sind als Lipopolysaccharide, aber die meisten der gewünschten Adjuvans-Eigenschaften der Lipopolysaccharidmoleküle noch beibehalten. Lipid A Verbindungen werden häufig mit Hilfe von Liposomen befördert. Die beiden Bakterien, die gewöhnlicherweise in Adjuvanzien als unspezifisches Stimulantien verwendet werden, sind Bordatella pertussis und Mycobacterium tuberculosis. Wenn sie als vollständige Bakterien verwendet werden, müssen sie vor der Verwendung mit Hitze abgetötet werden. Die immunmodulatorischen Mediatoren von B. pertussis umfassen eine Lipopolysaccharidverbindung und das Pertussistoxin. Das Pertussistoxin ist gereinigt worden und kommerziell verfügbar. M. tuberculosis wird gewöhnlicherweise in komplettem Freund Adjuvans verwendet. Als die aktivste Komponente von M. tuberculosis ist Muramyldipeptid bestimmt worden, das in mehreren Erscheinungsformen verfügbar ist.

Immunisierungen (Impfung und Auffrischungsimpfungen)

Das zu immunisierende Versuchstier kann ein beliebiges Tier sein, das ein kompetentes Immunsystem besitzt. Beispiele für Versuchssäugetiere umfassen Mensch und Haustiere (z. B. Hunde, Katzen, Kühe, Pferde, etc.), ebenso wie Tiere, die für experimentelle oder andere Zwecke (z. B. Mäuse, Ratten, Kaninchen, etc.) bestimmt sind.
Bei der Bestimmung der richtigen Dosis für die erste Immunisierung sind zwei unterschiedliche Kriterien als wichtig zu betrachten. Erstens die optimale Dosis, um die stärkste Antwort zu erreichen, und zweitens die mini male Dosis, die voraussichtlich die Produktion zweckdienlicher polyklonaler Antikörper induziert. Eine Menge des injizierten Materials wird vor Erreichen der geeigneten Ziel-Immunzelle katabolisiert und abgebaut werden. Die Wirkungsamkeit dieses Prozesses hängt von den Wirtsfaktoren, dem Injektionsweg, der Verwendung von Adjuvanzien und der intrinsichen Natur des injizierten Oberflächenproteins ab. Folglich kann die dem Immunsystem überbrachte wirksame Dosis in einem geringeren Verhältnis zu der eingeführten Dosis stehen und die resultierende notwendige Dosis muß empirisch bestimmt werden. Diese Bestimmungen können von einem Fachmann ohne weiteres durchgeführt werden. Sekundärinjektionen und spätere Auffrischungsimpfungen können in entsprechenden oder geringeren Mengen als die Erstinjektion verabreicht werden.
Der Injektionsweg richtet sich nach drei praktischen Entscheidungen: 1) welches Volumen muß überbracht werden; 2) welche Puffer und weitere Komponenten werden mit dem Immunogen injiziert; und 3) wie schnell soll das Immunogen im Lymph- oder Blutkreislauf freigesetzt werden. Zum Beispiel werden normalerweise bei Kaninchen Injektionen mit großen Volumina an vielen subkutanen Stellen gegeben. Bei Mäusen sind große Volumina nur mit intraperitonealen Injektionen möglich. Wenn die Injektion Adjuvanzien oder partikuläre Stoffe enthält, sollte das Immunogen nicht intravenös gegeben werden. Wenn eine langsame Freisetzung des Impfstoffs gewünscht ist, sollten die Injektionen entweder intramuskulär oder intradermal durchgeführt werden. Für sofortige Freisetzung sind intravenöse Injektionen angebracht.
Erste Antikörperantworten sind häufig sehr schwach, insbesondere für sofort katabolisierte, lösliche Antigene. Deshalb werden Sekundärinjektionen oder Auffrischungsinjektionen nach der ersten Immunisierung benötigt. Ein zeitlicher Abstand ist vor der Wiedereinführung des Proteins in ein Versuchstier erforderlich. Ein Minimum von 2 oder 3 Wochen wird empfohlen, aber es sind auch größere Intervalle möglich. Die Antikörperantworten auf sekundäre und nachfolgende Injektionen ist viel stärker. Höhere Antikörpertiter werden erreicht, aber noch wichtiger, die Natur und Menge der im Serum vorhandenen Antikörper verändert sich. Diese Veränderungen führen zu hochaffinen Antikörper. Die Intervalle zwischen sekundären, tertiären und nachfolgenden Injektionen können ebenfalls variieren, sollten aber üblicherweise vergrößert werden, um den Antikörperspiegel im Blutkreislauf ausreichend zu verringern, um eine schnelle Clearance von neu injiziertem Antigen zu verhindern.
Nachfolgende Auffrischungsinjektionen werden benötigt, um einen verringerten Antikörperspiegel im Blutkreislauf für eine kontinuierliche Kontrazeption zu erhöhen. Die tatsächlichen Intervalle für diese Injektionen unterscheiden sich von Species zu Species. Jedoch können die Intervalle von einem Fachmann durch Kontrolle der Serumspiegel von Spermien-Oberflächenprotein Antikörper festgelegt werden.
In einer anderen Anwendung können den Tieren Alloantisera oder monoklonale Antikörper, die gegen ein Spermien-Oberflächenprotein gerichtet sind, verabreicht werden, um eine Kontrazeption zu erreichen. Das Alloantiserum wird in einem anderen Individuum der gleichen Species produziert, aus dem Serum des Individuums isoliert und in einem geeigneten Träger zur Injektion in dem Empfängertier präpariert. Fachleute sind mit Methoden zur Herstellung und Formulierung monoklonaler Antikörper zur Verabreichung vertraut.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher erläutert.

Beispiele

Referenzbeispiel 1: Isolierung der Meerschweinchen PH-20 codierenden DNS

Herstellung und Durchsuchen der Bibliothek

Eine Population testikulärer Meerschweinchen Zellen, die in einem Percoll-Gradienten bezüglich spermatogenen Zeilen angereichert wurden, wurde zur Isolierung der Gesamt RNS aus spermatogenen Zellen verwendet. Die pelletierten Zellen wurden mit Detergenz in Anwesenheit von Vanadyl-Ribonucleosid-Komplexen (VRS) in 0,5-1,0 ml einer Lösung lysiert, die 10 mM Tris (pH 8,6), 0,5% NP- 40, 0,14 M NaCl, 1,5 mM MgCl&sub2; und 10 mM VRC enthielt. Nach dem Pelletieren zellulärer Bruchstücke wurden zum Überstand 0,5 Volumen von Proteinase K Puffer (2X = 0,2 M Tris (pH 7,5), 25 mM EDTA (pH 8,0), 0,3 M NaCl und 2,0% SDS) und 200 ug/ml Proteinase K hinzugefügt. PolyA+ RNS wurde aus der Gesamt RNS durch Oligo-dT Cellulosechromatographie gereinigt. cDNS wurde unter Verwendung von Standardmethoden synthetisiert. Aufgrund der Größe ausgewählte cDNS (0,5-7kb) wurde an Lambda gtI1 Arme ligiert und in Lambda Hüllproteine unter Verwendung der Sets und Protokolle von Amersham Corporation verpackt.
Die nichtamplifizierte Bibliothek wurde zum Durchsuchen mit 20 000 Plaques/150 mm Schale ausplattiert. Von einem einzigen Nitrozellulose-Filter von jeder Schale erfolgte ein Immunoblot mit Kaninchen anti-PH-20 polyklonalem Antiserum, das gegen affinitätsgereinigtes PH-20 Protein gerichtet war (Primakoff et al., Biol. Reprod. 38: 921-934 (1988)), und in TBST (10 mM Tris (pH 8,0), 0,15 NaCl, 0,05% Tween-20), das 2 mg/ml E. coli Protein enthielt, 1/500 verdünnt wurde. Das E. coli Protein wurde hergestellt, indem eine übernachtkultur von Y1090 Zellen pelletiert, die Zellen in einem minimalen Volumen an TBST resuspendiert und in flüssigem Stickstoff eingefroren wurden. Die aufgetauten Zellen wurden beschallt, und die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung von BCA Reagenz (Pierce Chemical) bestimmt. Sechs positive Plaques wurden mit einem anti-Kaninchen IgG alkaline Phosphatase konjugiertem Sekundärantikörper (Promega Biotec) detektiert. Die Größe des aus Plaquegereinigten positiven Klonen hergestellten Fusionsproteins lag in einem Bereich von 118-157 kD, wie durch die Analyse der E. coli Extrakte, die das Fusionsprotein enthielten auf SDS-PAGE bestimmt wurde. Inserts aus den sechs positiven Klonen wurden in pUC19 subkloniert und zumindest teilweise sequenziert.
Bei zwei der Inserts bestätigte sich, daß sie das PH-20 Protein codieren, da die Sequenzen von zwei tryptischen PH-20 Peptiden in der davon abstammenden Aminosäure Sequenz liegt. Diese beiden Inserts (gpPH-20-1, Nucleotid (nt) 1016-2152 und gpPH-20-2, nt 1010-2125, Abb. 1 und 2) enthielten einen langen (-925 nt) offenen Leserahmen, ein Stopcodon, eine 3' untranslatierte Region und einen PolyA-Schwanz. Somit wurde darauf geschlossen, daß diese zwei Inserts das 3' Ende einer cDNS von PH-20 darstellen. Die anderen vier Antikörperpositiven Lambda-Klone waren nicht mit PH-20 verwandt.
Der 5'-Teil der PH-20 cDNS wurde unter Verwendung von anchored PCR nach dem Protokoll von Frohman et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998-9002 (1988)) kloniert. PolyA+ RNS aus spermatogenen Zellen (2 ug in 10 ul dH&sub2;O) wurde auf 65ºC für 3 min erhitzt und dann durch Hinzugabe von 4 ul 10 · RTC Puffer (1x Puffer ist 50 mM Tris (pH 8,3), 50 mM KCl, 4 mM Dithiothreitol, 10 mM MgCl&sub2;)) und 4 ul 10 mM Stammlösung von jedem dNTP (1 mM Endkonzentration), 2 ul von 80 mM Natriumpyrophosphat (4 mM Endkonzentration), 1 ul (40 Einheiten) RNasin (Promega Biotec), 40 pmol PH-20 spezifische Primer (PH-20-RT), 18 Einheiten AMV Reverse Transcriptase (LifeSciences) und 40 uCi ³²P-dCTP in 40 ul Gesamtvolumen revers transcribiert. Nach einstündiger Inkubation bei 42ºC wurde zusätzlich 1 ul Reverse Transcriptase hinzugefügt und die Inkubation wurde eine zweite Stunde fortgeführt. Der PH-20-RT Primer war ein 17 Nucleotid (nt) Oligomer (nt 1242-1258, Abb. 2), -250 Basen stromabwärts von dem 5' Ende des Inserts gpPH-20-1 (Abb. 1).
Die einzelsträngige cDNS wurde von überschüssigem PH-20-RT durch Säulenchromatographie abgetrennt, PolyA angehängt und auf 1,0 ml verdünnt. Zweitstrangsynthese und PCR-Amplifikation wurden mit einem GeneAmp Set (Perkin Elmer Cetus) in einer 100 ul Reaktion durchgeführt, die 10 ul des Produktes der Reversen Transcription, 20 pmol (dT) 17 Adapter, 50 pmol Adapter und 50 pmol PH-20-AMP Primer enthielt. Der PH-20-AMP Primer war ein 17 nt Oligomer (nt 1202-1218, Abb. 2), der sich stromaufwärts vom PH-20-RT Primer befindet. Das PCR- Produkt wurde von nichteingebauten Primern und freinen Nucleotiden durch Spin-Säulenchromatographie (Säulen von Boehringer-Mannheim) gereinigt. Es wurde anschließend mit HgiA I und Sal I verdaut, aus dem Gel gereinigt und in mit Pst I und Sal I verdautem pBluescript ligiert. Das Haupt PCR-Produkt war 1,2 kb, und eine Southern Blot Analyse bestätigte, daß diese Bande mit dem markierten Insert gpPH-20-1 hybridisierte. Die Haupt PCR Produkte aus drei getrennten Reaktionen wurden kloniert, und ein Insert von jeder der drei Reaktionen wurde sequenziert (gpPH-20-3, nt 1-1175, gpPH-20-4, nt 24-1175 und gpPH-20-5, nt 295- 1175).
Die vollständige cDNS Sequenz und die davon abgeleitete Aminosäure-Sequenz wurde von den fünf cDNS Inserts (Abb. 2), die auf beiden Strängen vollständig sequenziert wurden, gewonnen. Die cDNS Sequenz enthält eine 354 nt 5' untranslatierte Region, einen 1590 nt offenen Leserahmen und eine 208 nt 3' untranslatierte Region. Die abgeleitet Aminosäure-Sequenz enthält all die tryptischen Peptid-Sequenzen, die aus gereinigten PH-20 gewonnen wurden, wodurch bestätigt ist, daß die cDNS authentische PH-20 Klone sind. Hybridisierungsexperimente zeigen an, daß genomische DNS aus Meerschweinchen ein einziges Gen für PH-20 enthielt. Computer gestützte Untersuchungen ergaben keine signifikante Homologie der Meerschweinchen PH-20 Aminosäure-Sequenz mit anderen bekannten Sequenzen.

Referenzbeispiel 2: PH-20 Homologe in anderen Säugerarten

Um festzustellen, ob es ein Homolog des PH-20 Gens in der genomischen DNS von anderen Arten gibt, wurden Arten-übergreifende Southern Blots durchgeführt. Genomische DNS wurde aus Meerschweinchen-, Ratten-, Kaninchen-, Mäuse- und Hamstermilzen durch Detergenz Lyse-Proteinase K Verdau isoliert. Andere DNS-Proben (d. h. Mensch, Affe und Huhn) wurde von anderen Forschern des University of Connecticut Health Center zur Verfügung gestellt. DNS aus Lachssperma und bovinem Thymus wurde von Sigma erworben und 1 mg/ml in TE (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)) rekonstituiert. Die DNS aller Arten (10 ug) wurde mit Restriktionsenzymen geschnitten und auf einem 1%igem Agarosegel aufgetrennt. Der Southern Transfer wurde durch kapillare Übertragung auf eine Nylonmembran durchgeführt. Die Membranen wurden in einer Lösung, die aus 6xSSC, 1x Denhardt's, 250 mg/ml Lachsspermien DNS, 1% SDS und 50 mM NaPO&sub4; (pH 7,4) bestand, 1-2 Stunden bei 65ºC prähybridisiert. Die Membranen wurden über Nacht bei 55ºC in Prähybridisierungspuffer plus 2 · 10&sup4; cpm/ml der Sonde hybridisiert. Die Sonden wurden mit Hilfe des Random Hexamer Verfahrens hergestellt. Der Blot wurde 3 · 5 min in 2xSSC + 0,1% SDS bei Raumtemperatur, 2 · 30 min in 2xSSC + 1,0% SDS bei 50ºC und 2 · 30 min in 1xSSC + 0,1% SDS bei 60ºC gewaschen. Der Blot wurde mit Plastikfolie überspannt, und es wurde ein Film mit einer Verstärkerfolie bei -70ºC exponiert.
Die Blots wurden mit einer Mischung aus markiertem gpPH-20-3 und gpPH-20-2 sondiert. Die Southern Blots zeigten eine schwache Hybridierierungsbande bei -10 kb bei Huhn DNS und starke Hybridisierungsbanden bei Maus, Ratten, Hamster, Kaninchen und humaner DNS. Zusätzlich wurde Hybridisierung mit boviner und Affen DNS beobachtet.

Referenzbeispiel 3: Isolierung der Maus PH-20 codierenden DNS

PolyA+ RNS wurde aus murinen runden Spermatiden isoliert und zum Herstellen einer cDNS Bibliothek in Lambda J unter Verwendung herkömmlicher Verfahren verwendet. Die Bibliothek wurde unter Verwendung einer markierten Meerschweinchen PH-20 cDNS Sonde vollständiger Länge durchsucht. Die Sonde wurde hergestellt, indem zunächst Meerschweinchen PolyA+ RNS isoliert wurde. Ein Oligo-dT Primer wurde an den Poly(A) Bereich hybridisiert und Reverse Transcriptase wurde zum Erzeugen eines ersten cDNS-Stranges verwendet. Zwei Oligonucleotide, wobei ein erstes komplementär zu einem Teil der Meerschweinchen PH- 20 5' untranslatierten Region und ein zweites komplementär zu der 3' untranslatierten Region ist, wurden zu der Reaktionsmischung hinzugefügt, und eine doppelsträngige DNS Sequenz vollständiger Länge, die die gesamte codierende Region enthielt, wurde durch Polymerase-Ketten- Reaktion erzeugt. Das Produkt dieser Reaktion war ein doppelsträngiges DNS Fragment von etwa 1,5-1,6 kb. Das Fragment wurde kloniert, und das klonierte Fragment wurde analysiert, um zu überprüfen, daß es tatsächlich das Meerschweinchen PH-20 Protein codiert. Eine markierte Sonde wurde aus diesem Klon durch herkömmliche Verfahren erzeugt.
Die murine cDNS Bibliothek wurde unter Verwendung der oben beschriebenen Meerschweinchen Sonde durchsucht. Zwei positive Klone wurden identifiziert. Die zwei Klone repräsentieren etwa 1500 Basenpaare DNS. Keiner der Klone enthielt Sequenzen aus dem 5' Bereich der cDNS. Um den 5' Bereich des murinen Gens zu klonieren, wurde anchored PCR unter Verwendung eines zu dem 5' Ende des einen der positiven Klone komplementären Primersets verwendet. Die DNS Sequenz wird in Abb. 3 offengelegt.

Referenzbeispiel 4: Isolierung von humanem PH-20 codierender DNS

Humanes PH-20 codierende DNS wurde isoliert und durch Durchsuchen einer Bibliothek aus humanem Testis in Lambda gtI1 kloniert. Die Bibliothek wurde mit einer Dichte von etwa 3000 Plaques pro 90 mm Schale ausplattiert. Phagenplaques wurden auf Duplikatfilter übertragen und mit einer Mischung aus zwei radioaktiv markierten DNS Sonden, einer Maus PH-20 cDNS und einer Meerschweinchen PH-20 cDNS, durchsucht. Spezifischer war die Meerschweinchen Sonde die oben beschriebene markierte Meerschweinchen PH-20 Sonde in voller Länge, und der murine Klon war einer der zwei murinen Klone, denen Sequenzen am 5' Ende der murinen cDNS fehlten.
Positive Plaques, die mit der Mischung der zwei Sonden hybridisierten, wurden gepickt und gereinigt. Die cDNS Inserts wurden subkloniert, und die DNS Sequenz unter Verwendung von Standardverfahren bestimmt. Es wurden zwei cDNS Klone gewonnen. Jeder der zwei codiert eine unterschiedliche Form des humanen PH-20. Ein humaner Klon wird als H18 bezeichnet (Abb. 4) und ein anderer wird als H16 bezeichnet (Abb. 5).
H18 ist ein Klon vollständiger Länge, der einen offenen Leserahmen aus 510 Aminosäuren und kurze 5' und 3' untranslatierte Regionen enthält. Das in dem offenen Leserahmen von H18 codierte Protein ist zu 59% identisch und zu 74% ähnlich (einschließlich konservativer Substitutionen) zu PH-20 aus Meerschweinchen.
H16 ist ein Klon partieller Länge, der die carboxyterminale Hälfte des humanen PH-20 codiert. Nucleotid 1 in H16 entspricht dem Nucleotid 814 in H18. Die Sequenz von H16 vom Nucleotid 1-781 ist identisch zur Sequenz von H18 von Nucleotid 814-1594; die bei Nucleotid 782 beginnende und bis zum Nucleotid 1675 reichende Sequenz von H16 unterscheidet sich von der von Nucleotid 1595 beginnenden und bis zum Nucleotid 1696 reichenden Sequenz von H18. Hinsichtlich des codierten PH-20 Proteins ist das von H16 codierte Teilprotein zwischen den Aminosäuren 236-496 (Aminosäurenummerierung bezieht sich auf H18 Sequenz) identisch mit dem von H18 codierten Protein. H16 codiert dann die Aminosäuren 497-511 und H18 codiert die Aminosäuren 497-510 und die Sequenzen unterscheiden sich an jedem Rest.

Expression und Reinigung des humanen PH-20

Der Klon vollständiger Länge für PH-20 (H18) wurde in zwei E. coli Expressionsvektoren pMAL-p und pMAL-c (New England Biolabs, Beverly, MA) subkloniert. In beiden Vektoren wird das PH-20 als ein Fusionsprotein hergestellt, wobei der N-terminale Fusionspartner das Maltosebindende (MBP) Protein von E. coli ist. In pMAL-p hat das codierte MBP (das normalerweise ein periplasmatisches Protein ist) seine gewöhnliche Signalsequenz, was zu Folge hat, daß die MBP-PH-20 Fusion an das Periplasma gerichtet ist. Für Fusionsproteine, die erfolgreich in das Periplasma exportiert werden können, hat dieser Ort den Vorteil, daß sich Disulfidbrücken bilden (zwölf Cysteine sind im humanen PH-20 vorhanden), wodurch ein potentiell immunogeneres Protein hervorgebracht wird. In pMAL-c ist die Signalsequenz für MBP nicht vorhanden, und das Fusionsprotein wird im Cytoplasma gefunden und bildet keine Disulfide. Humanes PH-20 wird von sowohl pMAL-p als auch pMAL-c hergestellt. Dennoch ist in pMAL-p tragenden Stämmen die Menge an hergestelltem hPH-20 gering, wohingegen in pMAL-c tragenden Stämmen die Menge an hergestelltem PH-20 hoch ist (das Fusionsprotein ist die Hauptbande in einem E. coli Extrakt auf einem Coomassieblau gefärbten SDS-PAGE Gel). Um das humande Fusionsprotein PH-20 zu reinigen, wird das MBP-PH-20 Fusionsprotein an ein Amyloseharz (an das MBP bindet) gebunden und mit Maltose eluiert.

Beispiel 5: Isolierung der Sperma-Oberflächenprotein PH- 30 codierenden DNS

Dieses Beispiel beschreibt die Isolierung von Sperma-Oberflächenprotein PH-30 codierender DNS. Der Gegenstand dieses Beispiels wurde von Blobel et al. (Nature 356: 248 (1992)) veröffentlicht.
Das ausgereifte PH-30 Protein ist ein dimeres Protein mit einer α und einer β Untereinheit. Das ausgereifte PH-30 Protein wurde wie von Primakoff et al. (J. Cell. Biol. 104: 141-149 (1987)) beschrieben affinitätsgereinigt. Im Anschluß an die Isolierung wurden die Untereinheiten durch SDS-PAGE aufgetrennt und unter Verwendung eines Elutrap von Scheicher und Schuell elektroeluiert. Aminoterminale und interne Peptid- Sequenzen wurden von α und β Untereinheiten von PH-30 bestimmt, da sie auf fertilisationskompetenten (reifen) Spermien (siehe Blobel et al., J. Cell. Biol. 111: 69-78 (1990)) vorkommen.
Um die N-terminale Peptid-Sequenz zu bestimmen, wurde das eluierte Protein reduziert und durch Reverse- Phase-HPLC gereinigt. Für interne Peptid-Sequenzen der α Untereinheit wurde das eluierte, reduzierte Protein mit Trypsin vor der HPLC gespalten. Die Peptide wurden mittels automatisiertem Edman-Abbau unter Verwendung eines Gasphasen-Sequenziergerätes von Applied Biosystems Sequenziert.
Für die α Untereinheit waren die bestimmten Sequenzen YCTGQSGKCPLDTYKQDG (SEQ ID NR 24) und ALFAAIQIPHGDD (SEQ ID NR 30). Diese zwei Peptid-Sequenzen wurden verwendet, um degenerierte Oligonucleotid-Primer für eine nested Polymerase-Ketten-Reaktionen (PCR) mit Meerschweinchen Testis cDNS zu entwerfen. Die Identität der Primer und Kombinationen werden insbesondere in Blobel et al. (Nature 356: 284 (1992)) spezifiziert. Das Produkt der nested PCR, eine Bande von 308 Nucleotiden, wurde subkloniert, sequenziert und gezeigt, daß es die kürzlich bestimmte Peptid-Sequenz codiert. Das nested RACE Protokoll wurde dann zum Vervollständigen der 3' Sequenz des ausgereiften PH-30 α und zum Bestätigen der Peptid- Sequenz des ausgereiften N-Terminus durchgeführt. Amplifizierte DNS Fragmente wurden aus einem Agarosegel ausgeschnitten, mit Geneclean (Bio 101, Inc.) gereinigt und direkt sequenziert. Beide Stränge wurden mit Primern sequenziert, die in einem Abstand von etwa 175 Nucleotiden entfernt waren; die sekundären Reaktionsprodukte aus zwei verschiedenen primären RACE Reaktionen waren identisch. Die abgeleiteten Aminosäure-Sequenzender PCR Produkte umfaßten die kürzlich bestimmten Peptid- Sequenzen. Der Rest der α Sequenz wurde durch ein Protokoll der nested rapid amplification of cDNS ends (RACE) (Frohman und Martin, Techniques 1: 165-170 (1989)) erzeugt. Die abgeleitete Sequenz der PH-30 α Untereinheit ist in Abb. 6 dargestellt. Die Nucleotid-Sequenz der α Untereinheit enthält einen offenen Leserahmen, der 289 Aminosäuren codiert.
Die Sequenz der β Untereinheit wurde auf ähnliche Weise bestimmt. Peptid-Sequenzen wurden wie bei der α Untereinheit beschrieben bestimmt, aber zum Erzeugen der N-terminalen Peptid-Sequenz wurde die β Untereinheit auf eine Immobilon (DUPont Biotechnology Systems, Boston, Massachusetts) Membran transferiert. Um die interne Peptid-Sequenz zu erhalten, wurde das eluierte Protein mit Cyanbromid oder V8 Protease gespalten, elektrophoretisch aufgetrennt und auf Immobilon transferiert. Alternativ wurde eluiertes Protein aufeinanderfolgend mit CNBr und Trypsin verdaut, gefolgt von Reverse-Phase-HPLC. Die durch diese Verfahren bestimmten Peptid-Sequenzen waren SNPV_GNNRVEQGEDCDCGSQEECQDTC (SEQ ID NR 22), AQGP (SEQ ID NR 16), STDECDLPEYCNGSSGACQEDL (SEQ ID NR 16), MGSVD_FEQL_TKNDIT_N (SEQ ID NR 27), A_GASNWK (SEQ ID NR 31), M_IYA_ISG (SEQ ID NR 31), SAL_VR (SEQ ID NR 34), C_PS_VCR (SEQ ID NR 34) und VATV (SEQ ID NR 19). Die Peptide SNPV_GNNRVEQGEDCDCGSQEECQDTC (SEQ ID NR 22) und STDECDLPEYCNGSSGACQEDL (SEQ ID NR 16) wurden zum Entwerfen von vier degenerierten Oligonucleotid-Primern verwendet. Nested PCR unter Verwendung von Kombinationen der degenerierten Primer resultierten in zwei starken Banden von 185 und 206 Basenpaaren. Das 206-Basenpaar Fragment wurde aus einem Polyacrylamidgel geschnitten, in Wasser eluiert, präcipitiert, sequenziert und befunden, daß es die PH-30 β Peptid-Sequenzen codiert. Es wurde mit 32p markiert und zum Sondieren einer Expressionsbank aus Meerschweinchen cDNS spermotogener Zellen (Lathrop et al., J. Cell. Biol. 111: 2939-2941 (1990)) unter Verwendung hochstringenter Hybridisierungs- und waschbedingungen verwendet.
Ein Klon, der gesamtes ausgereiftes PH-30 β plus 4 Aminosäuren der Vorläuferdomäne codierte, wurde aus 500 000 Plaques identifiziert und direkt unter Verwendung von PCR amplifizierten DNS Fragmenten mit Primern, die in einem Abstand von etwa 200 Nucleotiden entfernt lagen, sequenziert. Die Sequenz wurde durch Sequenzieren beider Stränge von ausgereiftem PH-30 β bestätigt, das durch PCR aus dem ersten Strang der Meerschweinchen Testis cDNS amplifiziert wurde. Die abgeleitete cDNS Sequenz der PH- 30 β Untereinheit ist in Abb. 7 dargestellt. Die Nucleotid-Sequenz der β Untereinheit enthält einen offenen Leserahmen, der 353 Aminosäuren codiert.
Die meisten viralen Fusionsproteine enthalten ein "Fusionspeptid", entweder am N-Terminus oder innerhalb des Polypeptides, dessen Sequenz innerhalb, aber nicht zwischen Virusfamilien stark konserviert ist. Fusionspeptide sind (1) immer in einer membranverankerten Untereinheit angeordnet, (2) relativ hydrophob und (3) fähig, in eine "seitige" α Helix geformt zu werden, bei der die Vielzahl der üppigen hydrophoben Reste an einer Seite angeordnet sind. In zumindest einem Fall wird eine helicale Struktur angenommen, wenn das Fusionspeptid mit einer Membranoberfläche interagiert. Die hydrophobe Seite der Helix könnte Virus-Zell-Interaktionen vermitteln, die zur Fusion führen. PH-30 enthält eine Region (Reste 90- 111 in Abb. 8b), die alle drei dieser Kriterien eines internen Fusionsproteins erfüllt. Putative interne virale Fusionsproteine haben Prolinreste bei oder in der Nähe ihrer Centren, ähnlicherweise hat diese Region zwei Proline in der Mitte von seiner vorhergesagten Helix, was vermutlich, wie Proline es auch in anderen membraninteraktiven α-Helices bedingen, einen Knick verursacht. Dieses potentielle Fusionspeptid von PH-30 α überlappt eine andere PH-30 Region (Reste 82-102 in Abb. 8b), die in der Sequenz ähnlich zu einem potentiellen Fusionspeptid des E2 Glycoproteins von Rubellavirus (GADTRCGRLICGLSTTAQYPPTR) (SEQ ID NR 42) ist.
Die meisten viralen Proteine sind für die Bindung an als auch für die Fusion mit Zielmembranen verantwortlich. Die N-terminalen 90 Aminosäuren des aurgereiften PH-30 β enthält eine putative Integrin-bindende "Disintegrin"-Domäne, die im Membran-bindenden Schritt wirken könnte, der der Spermium-Eizellen-Fusion vorangeht. Disintegrine, wie zum Beispiel Bistatin (Shebuski et al., J. Biol. Chem. 264: 21550-21556 (1989)), Barbourin (Scarborough et al. J. Biol. Chem. 266: 9359- 9362 (1991)), Kistrin (Dennis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 4022-4026 (1989)) und Echistatin (Gan et al. J. Biol. Chem. 263: 19832 (1988)) umfassen eine Familie kurzer (49-83 Aminosäuren), löslicher und hochkonservierter Blutplättchen-Agglomerations-Inhibitoren aus Schlangengiften, die durch kompetetive Inhibition des an das Integrin gpIIb/IIIa bindende Fibrinogen wirken. Die Ähnlichkeit von Spermien PH-30 β zu diesen Integrin- Liganden läßt vermuten, daß es an einen Rezeptor, wahrscheinlich einem Integrin, auf der Eizellen-Plasmamembran bindet.
Die meisten Disintegrine enthalten eine Integrin Konsensus-Bindesequenz RGD. Veränderungen in dieser Sequenz verändern entweder die Affinität (Garsky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 4022-4026 (1989)) oder die Spezifität der Bindung (Scarborough et al., J. Biol. Chem. 266: 9359-9362 (1991), Phillips et al., Cell 65: 359- 362 (1991)). Dennoch enthält die Hälfte der bekannten Integrin-Liganden entweder keines dieser Tripeptide oder kann mit Integrinen unter Verwendung von nicht-RGD Sequenzen interagieren. Kernspinresonanz-Analysen offenbarten, daß die RGD Sequenzen von Kistrin und Echistatin an der Spitze eines Loops sind, und dort vermutlich eine Konformation annehmen, die zur hochaffinen Bindung notwendig ist. Falls die Disintegrin- Domäne von PH-30 β eins ähnliche tertiäre Struktur annimmt, würde die Sequenz TDE und zusätzlich (ungeradzahliges) Cystein die Spitze eines solchen Loops besetzen und könnten dann mit einem Integrin auf der Eizellen- Plasmamembran interagieren. Die Disintegrin-Domäne des längeren Schlangengift-Proteins HR1B enthält die Sequenz ESE und ein zusätzliches Cystein in dieser Position.
Zwei indirekte Hinweise unterstützen die Hypothese, daß PH-30 β an ein Integrin der Eizellen-Plasmamembran bindet: Proteolyse von Mäuseeiern verringert deren Fertilisationskompetenz (Calarco Microscope Tech. 17: 401- 411 (1991), Boldt et al., Gamete Res. 23: 91-101 (1989)), und zwei der beteiligten Eizellen-Oberflächen-Polypeptide haben ein Molekulargewicht von 95K und 150K, ähnlich zu den α und β Untereinheiten von Integrin; auch micromolare Konzentrationen der RGD-enthaltenden Peptide inhibieren eine Fusion zwischen humanen oder Hamsterspermien und Hamstereiern ohne eine Zona pellucida. RGD Peptide können mit PH-30 Homologen auf diesen Spermien konkurieren, sogar wenn die Homologen keine RGD Sequenz enthalten, da RGD Peptide um die Bindung von nicht-RGD Integrin- Liganden konkurieren können.

Beispiel 6: Empfängnisverhütende Impfung durch die Verabreichung von PH-30 Protein

Die Identifizierung und die Reinigung des Meerschweinchen Sperma-Oberflächenproteins PH-30 ist von Primakoff et al. (J. Cell. Biol. 104: 141 (1987)) beschrieben worden. Dieses Beispiel beschreibt die Ergebnisse von Experimenten, in denen sowohl männliche als auch weibliche Meerschweinchen mit gereinigtem PH-30 Protein immunisiert wurden und die Wirkung dieser Immunisierung auf die Fertilität.
Weibliche oder männliche Hartley Meerschweinchen (vom etwa 300 Gramm (Weibchen) oder 600-650 Gramm (Männchen) zum Zeitpunkt der ersten Injektion) erhielten zwei Injektionen an PH-30 in den unten angegebenen Mengen. Aus Spermien durch mAk-Affinitätschromatographie gereinigtes PH-30 zeigte unter Verwendung von Silberfärbung des gereinigten Proteins auf SDS Gelen keine nachweisbaren Kontaminationen. Die Reinheit jeder für die Immunisierung von Weibchen oder Männchen verwendeten PH- 30 Präparation wurde durch SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Silberfärbung verifiziert. Das affinitätsgereinigte PH-30 in 0,375 ml Phosphat gepufferter Saline (PBS), die 3mM Octylglucosid (OG) enthielt, wurde mit 0,375 ml kompletten Freund Adjuvans (CFA) emulgiert. Jedes Tier erhielt 0,5 ml der Emulsion subcutan in den Rücken und 0,25 ml intramuskulär in ein Hinterbein. Etwa 1 Monat später wurde die gleiche Menge an PH-30 in PBS und 3mM OG wurde mit inkompletten Freund Adjuvans (IFA) emulgiert und wurde in die selben Stellen in jedes Tier injiziert (es gelten folgende Ausnahmen: Die Männchen 1 und 3 erhielten nur eine Injektion). Kontrollweibchen und -männchen erhielten die gleichen Injektionen im gleichen Zeitplan, die PBS und 3 mM OG und CFA oder IFA, aber kein PH-30 enthielten. Um den injizierten Weibchen zu erlauben, sich zu paaren, wurden sie etwa zwei Monate nach der anfänglichen Injektion zusammen mit Männchen für 3 Wochen gehalten. Jeder Käfig enthielt ein Männchen (575-600 g), ein PH-30 immunisiertes Weibchen und 2-4 Kontrollinjizierte Weibchen. Nach drei Wochen wurden die Weibchen von den Männchen getrennt, trächtige Weibchen warfen Junge und die Nachkommen wurden gezählt. Kontrollinjizierte Weibchen wurden nicht trächtig und waren in Käfigen gewesen, in denen die anderen Kontrollen trächtig wurden, wodurch angezeigt wird, daß alle sich mit den immunisierten Weibchen paarende Männchen fertil waren. Um den injizierten Männchen zu ermöglichen, sich zu paaren, wurde etwa vier Monate nach der anfänglichen Injektion jedes injizierte Männchen mit zwei Weibchen (etwa 600 Gramm) für drei Wochen gehalten. Die Weibchen und Männchen wurden dann getrennt und nach zusätzlichen 5 Wochen wurden die Weibchen getötet, und die Föten wurden gezählt. Die Ergebnisse dieser Experimente werden in den folgenden Tabellen bekanntgegeben. Tabelle 1. immunisierte Weibchen
Tabelle 1 zeigt, daß von den 6 weiblichen Meerschweinchen, die immunisiert wurden, vier fertil waren. Von den Kontroll-injizierten Weibchen waren 34 von 36 fertil. Tabelle 2. Immunisierte Männchen
Tabelle 2 zeigt, daß von den 3 männlichen Meerschweinchen, die immunierten wurden, alle 3 unfruchtbar waren. Von den Kontroll-injizierten Männchen waren 5 von 5 fertil.

Beispiel 7: Verwendung von PH-30 Disintegrin-Peptiden als Inhibitor der Spermien-Fusion an die Eizellen- Plasmamembran

Peptide aus der PH-30 β Disintegrin-Domäne wurden bezüglich der Inhibition der Spermienbindung an die Eizellen-Plasmamembran untersucht. Spezifischer wurden zwei modifizierte PH-30 β Peptide untersucht. Diese zwei Peptide enthalten die Sequenz TDE, die in der selben Position in der Disintegrin-Domäne wie RGD ist, welches das aktive Tripeptid in den meisten Disintegrinen aus Schlangen darstellt. Die zwei untersuchten modifizierten PH-30 Peptide waren STDECDLK (SEQ ID NR 43) und CSTDEC (SEQ ID NR 44). Das erste der zwei Peptide ist ein lineares Peptid und wurde durch die Addition eines Lysinrestes (K) modifiziert, um die Konjugation des Peptides an ein Agarose-Kügelchen zu erleichtern. Das zweite der zwei Peptide ist ein cyclisiertes Peptid und wurde durch die Addition eines Cysteinrestes (C) modifiziert, um eine Ringbildung durch Disulfidbildung zu ermöglichen. Zwei Kontrollpeptide, die eine zufällige Aufeinanderfolge von Aminosäuren darstellen, waren ebenfalls in dem Fusions-Inhibitions-Test eingeschlossen. Die Kontrollpeptide waren GRGDTP (SEQ ID NR 45) und GRGES (SEQ ID NR 46).
Der Fusions-Inhibitions-Test wurde wie folgt durchgeführt. Es wurden Eizellen aus Meerschweinchen- Ovarien gesammelt. Die Eizellen wurden über Nacht in Gewebekulturmedium inkubiert. Die Zona pellucida wurde mit einer Mischung aus Proteasen entfernt. Die Eizellen ohne Zona pellucida wurden in Kulturmedien mit Peptid bei einer spezifischen Konzentration für 30 Minuten inkubiert.
Aus der Epididymis männlicher Meerschweinchen gesammelte Spermien wurden durch Inkubation befähigt und wie von Flemming und Yanagimachi beschrieben (Gamete Res. 4: 253-273 (1981)) mit Akrosom reagiert und wurde zu den Eizellen hinzugegeben und für 15 Minuten inkubiert. Die Eizellen wurden dann in ein Spermien-freies Kulturmedium überführt und zusätzliche 1 Stunde und 45 Minuten inkubiert. Die Eizellen wurden dann fixiert und wie von Primakoff et al. J. Cell. Biol. 104: 141 (1987)) beschrieben, gefärbt. Die Gesamtanzahl der angeschwollenen Spermienköpfe wurde dann gezählt. Angeschwollene Spermienköpfe sind ein Anzeichen, daß Spermium und Eizelle fusioniert haben.
Auf der Basis dieser Beobachtungen werden mehrere Indices berechnet. Der Fertilisations-Index (F. I.) wird durch Dividieren der Gesamtzahl der angeschwollenen Köpfe durch die Gesamtzahl der Eizellen bestimmt. Die Fertilisationsrate (F. R.) ist der Prozentsatz der fertilisierten Eizellen. Der Prozentsatz an Inhibition wird durch Dividieren des Fertilisationsindex des experimentellen Peptides durch den Fertilisationsindex des Kontrollpeptides bestimmt.
Die aus dem Spermien-Eizellen-Fusions-Inhibitions- Test gewonnenen Daten sind unten in Tabellen 3-6 zusammengefaßt. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen deutlich, daß verglichen mit keinem Peptid, die Inkubation der Eizellen ohne Zona pellucida mit den Kontrollpeptiden GRGES und GRGDTP keine signifikante Inhibition der Spermien-Eizellen-Fusion zu Folge hat. Die zwischen dem Test ohne Peptid und dem Test mit Kontrollpeptid beobachteten Fusionsraten waren in Anwesenheit des Kontrollpeptids (Tabelle 3) ähnlich oder höher.
Dennoch wurde, wenn die experimentellen Peptide CSTDEC und STDECDLK hinzugefügt wurden, die Spermien- Eizellen-Fusion starkt gehemmt verglichen mit der, wenn kein Peptid hinzugegeben wurde (Tabelle 4) oder verglichen mit der Zugabe von Kontrollpeptid (Tabelle 5). Wenn der Fertilisationsindex nahe dem biologischen normalen Gehalt von 1 Spermium pro Eizelle ist, hemmt STDECDLK eine Spermium-Eizellen-Fusion um 92% und CSTDEC um 89% (Tabelle 4). Aus diesen Daten kann gefolgert werden, daß die PH-30 β Disintegrin-Domäne ein Epitop darstellt, daß bei der Spermien-Eizellen-Fusion kritisch ist. Es kann vorausgesagt werden, daß Antikörper, die spezifisch an dieses Epitop binden, eine Spermien-Eizellen-Fusion blockieren. TABELLE 3 UNFÄHIGKEIT EINES KONTROLLPEPTIDES (GRGES) EINE SPERMIUM-EIZELLEN-FUSION ZU INHIBIEREN TABELLE 4 VERGLEICH DER TDE PEPTIDE UND DER KONTROLLE OHNE PEPTID IN DEM SPERMIEN-EIZELLEN-FUSIONS-TEST TABELLE 5 VERGLEICH EINES KONTROLLPEPTIDES (GRGES), ZWEIER TDE PEPTIDE UND EINES RGD PEPTIDES IM SPERMIEN-EIZELLEN- FUSIONS-TEST

Entsprechungen

Der Fachmann erkennt viele Entsprechungen oder kann diese mit Hilfe üblicher Experimente zu den spezifischen Anwendungen der hier beschriebenen Erfindung feststellen. Diese Entsprechungen liegen beabsichtigterweise im Rahmen der folgenden Ansprüche.

SEQUENZ-LISTE

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER:
(A) ADRESSAT: University of Connecticut
(B) STRASSE: 213 Whetten Graduate Center
438 Whitney Road Extension
(C) STADT: Storrs
(D) BUNDESSTAAT: CT
(C) STRAT: USA
(F) PLZ: 06269
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Empfängnisverhütende Impfstoffe
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 46
(iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:
(A) ADRESSAT: Hamilton, Brook, Smith & Reynolds, P. C.
(B) STRASSE: Two Militia Drive
(C) STADT: Lexington
(D) BUNDESSTAAT: MA
(E) STAAT: USA
(F) PLZ: 02173
(v) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) MEDIUMTYP: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, Version 1.25
(vi) AKTUELLE ANMELDEDATEN
(A) ANMELDUNGSNUMMER: 07/897, 883
(B) EINREICHUNG: 12. Juni 1992
(C) KLASSE:
(viii) PATENTANWALT:
(A) NAME: Brook, David E.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 22.592
(C) REFERENZ/LISTENNUMMER: UBM90-01AA
(ix) TELEKOMMUNIKATION:
(A) TELEFON: (617) 861-6240
(B) TELEFAX: (617) 861-9540

(1) INFORMATION ZU SEQ ID NR: 1:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 2152 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNS (genomisch)
(xi) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) POSITION: 355..1941

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 1:

CCTTTACTGT GAGGTTGCTT GTACATTGAT TTTCCAGTTC TCTTAAGAAT CTGTGGCTTG 60
ATGTAGCTCA CACGAATCCA GGAGGATTTT TGTTTCTTAA TTTTGATGAC TGCGTACATG 120
ATTAGTAGTA CATCGTAAAG TCTCTTCCAA CAAGTTACAG ATGGTGCAAC ATTCAAAACA 180
TTCCTGAAAT ACAAAACAAG AAGAATATTT TAATGTAACA GAGTTGTTTA CCTCTTTATC 240
CACCAAAGTG ACCTCACTGT ACTACGCTTC TTTTCGGCTC ATATTCTGCA ACAAATATTG 300
GAAAAAACAG TGTATAAGAA GAAAAAGTAT TTTTCACAGC TGTTAGTCTT TCTA ATG 357
TAGGCTCATG GCAACTCAAA AGTACCRAAT TCAATATCAT AAAAATTCTA TAATCAAAAT 2001
CCTTTGAATT TTTAAAGCAA AATACATACT ATTCTATCAA AGACACTGTA AAGCCTGTGG 2061
TACTTGGAAG ATACAGCTTT CTTTTGAGAA GAGTGAAGAT TTGAATAAAA CAAAATTACT 2121
GAAAAAAAAA AAAAAAAAA AAAAAAAAAA A 2152

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 2:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 529 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 2:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 3:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 2125 Basenpaare
(β) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: doppelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNS (genomisch)
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LOKALISIERUNG: 313..1848

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 3:

CTAAGAGTGC TGAAGTAGAT TTAGATTGAC CATGGCTCAC ATGAATTAAG AAGTGTTTTC 60
TTTTGTTATG ATGGAGATGC GAGTGGTAGG CAGGTATTTT AAGTTTCCAG CAAGTTCTGG 120
ATGATTTAAC TTCCTCCAAG ATATTCCTGA AATGTAACAC AGGAAGAAGA ATCTTCAGTG 180
TAAATCAGTC ACCATACATT CATCTCCCTC AATAGCCTCA TGCCACAGTC TTTCTAATCT 240
TTTGCATCTA ATACTAAACA GACCACAGTG TGTAAGAAGG AATAAGTGCC TACTTAGTAA 300
TATTTTTGCA GGCCTCAGTA ATTTGGGATT ATGAATGGGA TTCTATTTTA CCAAAGTAAT 1948
TCAATTTTTA TAATCAAGAT TCTATTTTTG AGTTTCAAAG AGAAATTATA TATTCTTCTA 2008
CCAAAGATTG ATTACAAGCA ACGCTACTTA GGGATTAGTT TTGGTTTAAA GAGAATGAAG 2068
ACTGAATAAA ATAAAATCAC TAGAAAATTA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 2125

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 4:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 512 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 4:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 5:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 1695 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: doppelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNS (genomisch)
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LOKALISIERUNG: 109..1635

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 5:

GGAATTCATT CCATTCCCTT TCATCTGTGC TCATACTTTG CATCAGATAT TCGGTAAACC 60
AAAGTGTGTA GGAAGAAATA AATGTTTTCA TAGTCATTAC TCTTTACA ATG GGA GTG 117
AATGAACAAT ATGTCCATCT TAAAGTGTGC TTCCCCAATT 1695

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 6:

(i) SEQUENZMERKMALE;
(A) LÄNGE: 509 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIßUNG: SEQ ID NR. 6:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 7:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 1674 Hasenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: doppelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNS (genomisch)
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LOKALISIERUNG: 1..825 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 7:
GGTGTCAGCC TCATTTTACC CAGCCCTATT GAAGATGGAC TCACTCTGGT TCCAATGCTT 925
CTGACAGCAG TAGAGATAAC ACAGTATTCA AGCAAGAGAA CAGAGCTCCT GATCACCTGT 985
GTGCGTCCTT TGAGTGGATG GCAGCTCCAT CTCTGCATTA CAGCTAGTTA GAATGATGAG 1045
TGCTTGCTAT GCCTCAAGCA CTGTTTCGAG TGTTTGATGT CTATTATCTC ACTTCATGCT 1105
CACCAGGACC CCATCCGAGC CTTAATTTCA GTTGACAGTA ACTATTGGAT CCCCAGGAAT 1165
ATGTTTGCAT ATTTGGGGAG AAAATACTAT TGGAGGGGAA CAGAAATGCT ACTAAGGGTC 1225
TCACTGTGTC ACCCAGGCTG GAGTCCATCA AAGCTCACTG CACGCTTAAC CTTCTGTGCT 1285
CAAGGGATCC TCCCACTTAA GCCTCCTGAG TAGCTGGAAC TACAGGCATA TCCCACCGAG 1345
CCTGGCTAAT CTTTGATTTT TTTGTACAGA TTCTGTCTCC TTATGTTGCT GAGGCTCGAC 1405
TCAKACTTCT GGTCTCAAGC GATCTTTCCA TCTTAGCTTC CCAAATTGTT GGAATTATGG 1465
RCATGAGCCA GTGTGCTTGG CCTGATTTTT TTTTTTTTTT TAATGAGAAA AACGTTCCTT 1525
AAGAAAAGTT TCATTGTAAG ACGAGGACTT GCTATGTTGC CAGTTTGGTC TTGAACTCGG 1585
TCTCAAGTGA TTCTCGTGCC TTGGGTTCCC AAAGCGTTTG GGCCGGCAGA TGTCAGCCAC 1645
ACCCCGCCTG CCTTATTCTT ATAAACTCA 1674

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 8:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 275 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 8:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 9:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 1104 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: doppelsträngig
(β) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNS (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 9:

TACTGCACTG GTCAATCTGG AAAGTCCCCT CTAGACACAT ACAMCAAGA TGGTACCCCA 60
TGTAATGAGG GATTCTTCTG TGTAAGTAAG GGGGTGCACGG ACCCTGGTAT TCMTGCGCA 120
ACCTATTTTG GGCATGGTGC CAGGTCTGCC CCAGATGCAT GTTACACTAC ATTGAACAGC 180
ATAGGGAATA TATTTGGAAA CTGTGGTCAA TCAGGTAATC CGACCACCTA TGTTGGGTGT 240
TCAGGTGATA GTACAAAGTG TGGGAAACTC ATATGTACAG GTATTTCTTC AATACCTCCA 300
ATCAGAGCTC TATTTGCAGC GATCCAGATC CCTCATGGAG ATGACTGGTG CTGGAGCATT 360
AGTAACTTTG GGGATCCTGC CTCCTCCCCC ACAGAAGGAG CTGTGTCAGC AGGCACGTCT 420
TGCGCTTCAG GCAAAGCGTG TGTAAATGCC CAGTGTTCTA CTTTCACACT TGAGACTGCT 480
AACTGTAGTG CAGCTGAAAT GTGTAATGAG AATGGAATTT GCAACAATTT AGGGCACTGC 540
CACTGTGGAG ATGGTTTTGC TCCCCCCAAC TGCAAAGAAC AAGGAACTGG AGGTAGTATA 600
GATAGTGGTC CCCCTCCCCC TTCTAGTACA CCTACTGCAC CTCCTAAACC AACCCAAACG 660
ACAAAAGCAT CAAGTGAAAA CTTAGCATTA ATTGGCCTGA TAATTTTCGT AATACTATTA 720
CTACTTCTAG TTATTTGTGC TATCTGCCTT GGTATACCTG CTGAAGAAGC TCCTCCACCA 780
CCAGAAGAGG AAGAAGCAGG GGAACTGGAA GAAGAACCAG AACCAGAACC AGAACCGGAG 840
GAGGAGGAAG CAGCAGAGGA GGAAGACTAG AGTGATAACT GGTGGAAGGG CAAAGCCAAA 900
TATATCAAAT TCCTCAAGTG ATTACTAGGA ATGAGAAGCT CAGGGAAGCA AAAGTTCAGT 960
GGGAACTGAC AGCTCTAATG GCTCTAACTA GGACTCTATA CTCTAAAAAG ACACCACTGT 1020
AAGAGGACCT ATTCCTCCAT CTTTCTCATC TAAGTAAATA AATTCTTGTT TACCTAGCAT 1080
ATTAAAAACA AAAAAAAAAA AAAA 1104

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 10:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 1463 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: doppelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNS (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 10:

GAATTCCAGC CCGTCTACAG GTCAAACCCG GTCTGCGGCA ATAACAGGGT GGAACAGGGT 60
GAAGACTGCG ACTGCGGATC GCAGGAGGAA TGCCAAGACA CCTGCTGTGA TGCTGCTACC 120
TGCAGGCTGA AAAGTACTTC ACGATGTGCT CAAGGGCCCT GTTGTIJ%CCA GTGTGAGTTC 180
AAAACTAAAG GAGAGGTATG CCGAGAGTCC ACGGATGAGT GTGATCTCCC TGAGTACTGC 240
AACGGCTCGT CTCGGGCTTG CCAAGAAGAC CTCTATGTTA TTAATGGGCA CAGATGCGCA 300
AATGAAGAGT GGATCTGCAT GAATGGGAGG TGTCTGTCTG GGAAGGCACA ATGCCAAGAA 360
ACATTTGGTA CAGAAATGGA AATCGCTTCA GTAGACTGCT TTGAACAACT TAATACTAAG 420
AATGACATTA CTCGAAACTG TGGTATCCTC AGCCCCGGGA ATTACAAAGC ATGTGGAGCT 480
AGCAATTGGA AGTGTGGAAA ATTAATCTGT TCCTATGATA AGAGCGAAAT CCTGAGAAAC 540
AAGGAAGGCA TGACCATTTA TGCCAACATC AGCGGCCATA TCTGTGTCAG CATAGAATAT 600
CCTCGTGGTC ACGCCAAGAG TGCACTGATG TGGGTAAGAG ATGGCACCGT GTGTGGCCCG 660
AGTGAGGTTT GTAGGCAACA ACAGTGTGTA TCCAGTTCGT ATTTGGGATA TGACTGCACA 720
CCAGCCACTT GCAGTGATCA TGGTGTATGC AATAACAAAA GGCACTGTCA CTGTAATCCC 780
ACCTATGTAC CTCCAAACTG CGAGACCCAA GATTCGACAA AGCCTGGAGG GAGTGTTGAC 840
AGCGGTAATC TACGATATGA ACCAATCCCT GAAACGTATT TCGTTGAAGG TGCTTACCAT 900
ACCAAGTCTA GAAAATGCCC ATTTTTCTTG ATCATTCCTT TTTTCGTTAT TTTCTCCGTA 960
CTGGTTGCTA CAGTGGTAAA AGTCTATTAC CAAAAGRAAA AATGGAAAAC TGAAGATTAT 1020
GCAAATGATG AGAACATTCA AAGCGAGAGT GAACCCAAAA GCTCCAAAGT CTCTTCCAAG 1080
TAGACTGGCT GGCAAGGATT CTATGCTGCC ACAGTGAGTG TCAAATAGTT CAAGTCTTCC 1140
AGAACAAGTA TCTTTAGTGG ATAGAAAAAA GTGGAGAAGA AAAAATATGC ACTACCTTAC 1200
TTCCTGGAAG TCAAACTGAT GTATCGTGGT TCCAGTGCAC CAGAAACTAT AGACATTTCA 1260
TGTACATGTA ACATACATAT ATGTCGTATA TATATGATTC TATAACAGAT AATTTATTTG 1320
TAAGGAAGGC CTAATTATGA GTTTTACATT ACATTTTTCT CATTTTAAAA GTTATTTCAC 1380
ACCGTGTTAG CTAGAAGTCA CTAATTCTGT TAGTAGGCAT GATATAGAAA AACTTATAAT 1440
AAAGGTAATA CCATGGGAAT TCC 1463

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 11:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 40 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 11:

2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 12:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 40 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 12:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 13:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 40 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 13:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 14:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 27 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ZD NR. 14:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 15:

(i) SEQUENZMERKMALE;
(A) LÄNGE: 25 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 15:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 16:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 50 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 16:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 17:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 50 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 17:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 18:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 43 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) Molekültyp: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 18:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 19:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE; 46 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 19:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 20:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 43 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 20:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 21:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 49 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 21:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 22:

(i) SEQUENZMERKMALE
(A) LÄNGE: 40 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 22:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 23:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 40 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 23:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 24:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 19 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 24:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 25:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 50 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 25:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 26:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 50 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 26:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 27:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 49 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 27:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 28:

(i) SEQUENZMERKALE:
(A) LÄNGE: 50 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 28:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 29:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 49 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ü) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 29:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 30:

(i) SEQUENZ MERKMALE:
(A) LÄNGE: 50 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 30:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 31:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 49 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 31:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 32:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 30 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 32:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 33:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 50 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 33:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 34:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 48 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 34:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 35:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 38 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 35:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 36:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 47 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 36:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 37:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 50 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 37:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 38:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 50 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 38:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 39:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 50 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 39:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 40:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 24 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 40:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 41:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 16 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 41:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 42:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 23 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 42:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 43:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 43:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 44:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 44:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 45:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 45:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 46:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 46:

Claims

1. Verwendung eines isolierten, immunogenen Teils vom Sperma-Oberflächenprotein PH-30 in einem Verfahren zur Kontrazeption, das Verabreichen einer wirksamen Menge des Peptids an einen Säuger umfaßt, wobei das Peptid in dem Säuger Antikörper stimuliert, die an das Sperma-Oberflächenprotein PH-30 in vivo binden, wobei dadurch die Sperma-Ei-Fusion verhindert oder die Rate der Sperma-Ei-Fusion wesentlich reduziert wird.

2. Verwendung eines isolierten, immunogenen Teils vom Sperma-Oberflächenprotein PH-30 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verhütung einer Schwangerschaft durch Verabreichung des Peptids an einen Säuger, um die Stimulierung von Antikörpern zu bewirken, die an das Sperma-Oberflächenprotein PH-30 binden.

3. Die Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Peptid zu einer Integrin-bindenden Domäne homolog ist.

4. Eine kontrazeptive Zusammensetzung, die ein im wesentlichen reines Peptid mit einer Aminosäure- Sequenz, die zu der eines immunogenen Epitops vom Sperma-Oberfächenprotein PH-30 homolog ist, in einem pharmazeutisch geeigneten Träger umfaßt.

5. Die kontrazeptive Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin das im wesentlichen reine Protein durch Expression einer DNS hergestellt ist, die ein immunogenes Epitop des Sperma-Oberflächenproteins PH- 30 codiert in einem rekombinanten DNS- Expressionsvektor, und das Peptid zu einer Integrin bindenden Domäne des Sperma-Oberflächenproteins PH-30 homolog sein kann.

6. Eine kontrazeptive Zusammensetzung, die einen Teil von Sperma-Oberflächenprotein PH-30 eines Säugers umfaßt, das für die Stimulierung von Antikörpern, die an das Sperma-Oberflächenprotein PH-30 binden, wirksam ist.

7. Die kontrazeptive Zusammensetzung nach Anspruch 6, worin der Teil in der Aminosäure-Sequenz zu der einer PH-30 Integrin-bindenden Domäne im wesentlichen identisch ist.

8. Verwendung eines gereinigten Sperma-Oberflächenproteins PH-30 bei der Herstellung einer Zusammensetzung, die in einem Säuger Antikörper stimuliert, und diese Antikörper an PH-30 Sperma-Oberflächenproteine binden.

9. Verwendung eines gereinigten Sperma-Oberflächenproteins PH-30 bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung in einem Säuger, um gegen Sperma-Oberflächenprotein PH-30 zu immunisieren.

10. Die kontrazeptive Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6 zur Verwendung als ein Kontrazeptivum in einem männlichen Säuger.

11. Die Verwendung gemäß Anspruch 8 oder Anspruch 9, wobei die Zusammensetzung als ein Kontrazeptivum in einem männlichen Säuger verwendet wird.