DE69634449T2

DE69634449T2 - Verfahren zum identifizieren von geschlechtsspezifischen und speziesspezifischen molekülen, mit verfahren identifizierte moleküle und verwendung der moleküle

Info

Publication number: DE69634449T2
Application number: DE69634449T
Authority: DE
Inventors: R. Stan BLECHER; Rosemarie Irene Howie
Original assignee: University of Guelph
Current assignee: University of Guelph
Priority date: 1995-08-11
Filing date: 1996-08-09
Publication date: 2006-01-05
Anticipated expiration: 2016-08-10
Also published as: US5840504A; AU6652696A; DE69634449D1; WO1997007399A1; JPH11511252A; ATE290695T1; EP0876612A1; EP0876612B1; AU722913B2; CA2183012A1; BR9610235A; MX9801183A; NZ313947A

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abtrennen geschlechtsspezifischer Moleküle von nicht-geschlechtsspezifischen Molekülen und ein Verfahren zur Herstellung einer Präparation die entweder in nicht-geschlechtsspezifischen Weibchenmolekülen oder in nicht-geschlechtsspezifischen Männchenmolekülen angereichert ist.
Hintergrund der Erfindung
Es besteht ein großes Interesse an der Steuerung des Geschlechts der Säugetier-Nachkommen, und es gibt zahlreiche Vorschläge für Verfahren zum Vorauswählen des Geschlechts. Der Anlass zur Steuerung des Geschlechts ergibt sich aus dem Wunsch das Auftreten geschlechtsgekoppelter genetischer Erkrankungen zu begrenzen und wegen einer effizienteren Agrarwirtschaft. Im letzteren Fall erfordert der agrarische Milch- und Rindfleischsektor weibliche bzw. männliche Tiere; es wird dann jeweils das Tier mit dem nicht gewünschten Geschlecht einfach getötet, was ein großer Wertverlust darstellt.
Es werden zur Zeit zwei Ansätze aktiv verfolgt zur Geschlechtsauswahl in Säugetieren: die Geschlechtsdeterminierung (d.h. Herstellung des genetischen Geschlechts) von Präimplantationsembryos und die Trennung von X- und Y-tragenden Spermatozoen. Die Geschlechtsbestimmung von präimplantierten Embryos erfolgt durch (a) Karyotypisierung, (b) durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Amplifikation von Y-Chromosom spezifischen Nukleotidsequenzen oder (c) durch immunologische Verfahren. Nachteilig an den ersten beiden Verfahren ist, dass die Embryos für den Erhalt von Biopsien mikromanipuliert werden müssen und dass sie deshalb invasive Verfahren sind.
Die immunologischen Verfahren basieren auf einem immunologischen Nachweis eines Männchen-eigenen Moleküls. Die Untersuchungen Männchen-eigener Moleküle begannen mit der Entdeckung von Eichwald und Silmser (1955, Transplant Bull 2: 148) an, was nun als das H-Y-Antigen bekannt ist. Diese Autoren fanden, dass im Inzucht-Mausstamm C57BL/6 Hauttransplantate von Männchen auf Weibchen abgestoßen wurden, wohingegen Transplantate von Männchen auf Männchen, von Weibchen auf Männchen und von Weibchen auf Weibchen im gleichen Stamm toleriert wurden. Hauscha (1955, Transplant Bull 2: 154) schlägt vor, dass diese Daten durch ein Antigen erklärt werden können, das von einem Gen auf Y kodiert wird. Dieses System ist als H-Y-Histokompatibilitätslocus des Y-Chromosoms bekannt.
H-Y ist ein Minor-Histokompatibilitätsantigen. Es hat einen eigenen genetischen Locus neben dem Major-Histokompatibilitätskomplex (MHC). Die Minor-Histokompatibilitätsloci befassen sich hauptsächlich mit der zellulären Immunität; die wenigen Produkte, sofern vorhanden, führen zur Bildung von Antikörpern. Dennoch schien die Suche nach einem serologischen Gegenstück zum Transplantations-H-Y-Antigen erfolgreich, als Goldberg et al. (1971, Nature 232: 478) ein serologisches H-Y-Verfahren beschrieb.
Neuere Daten weisen darauf hin, dass das serologisch nachweisbare H-Y-Antigen möglicherweise gleich ist mit dem Histokompatibilitätsantigen. Insbesondere werden die Serum- und das Transplantations-H-Y nachweislich von Genen an verschiedenen Loci kodiert (Simpson et al., 1990, Arch. Androl. 24: 235). Das mit serologischen Verfahren identifizierte Molekül wird nun weithin als serologisch nachweisbares männliches Antigen (SMA) bezeichnet. Es wurde ferner durch Absorption gezeigt, dass Nagetier-Anti-H-Y-Antiseren kreuzreagieren mit weiblichen Vogelgeweben oder -zellen, wenn der weibliche Vogel ein Heterogamet ist (Watchel et al. 1975, Nature 257: 235; Shalev et al., 1978, J. Immunogenetics 5: 203; Muller et al., 1979, Nature 280: 142). Der serologische Faktor kennzeichnet somit das heterogametische und nicht das männliche Geschlecht.
H-Y-Antikörper wurden und werden in Geschlechtsuntersuchungen verwendet. Die frühen Verfahren zur serologischen Untersuchung von H-Y, die in gewissem Maß von subjektiven Assays abhingen, wurden durch die Entwicklung des Enzym-gekoppelten Immunosorbensassays (ELISA) verbessert; Verfahren nach Bradley et al. (1987, Hum. Genet. 76: 352) und Brunner und Wachtel (1988, J. Immunol. Methods 106: 49). Weitere Fortschritte führten zu einem teilweisen Erfolg bei der Geschlechtsbestimmung von Embryos (Epstein, 1980, Tiss. Antigens 15: 63; Anderson, 1987, Theriogenology 27: 81; Wachtel, 1988, Fert. Ster. 50: 355; Avery und Schmidt, 1989, Acta. Vet. Scand. 30: 155). Jüngste immunologische Geschlechtsbestimmungsuntersuchungen scheinen etwa die gleichen Erfolgsraten wie die oben-erwähnende Arbeit zu erreichen. Beispielsweise berichten de Lima et al (1993, Theriogenology 39: 1341) von einem 83%igen Erfolg bei der der Geschlechtsbestimmung von Maus- und Rinderembryonen mit Hilfe von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern. Utsumi et al. (1993, Mol. Reprod. Devel. 34: 25) verwendeten H-Y-Antikörper auf Embryonen unterschiedlicher Arten, die in Kultur gehalten wurden. Die Entwicklung wurde ungefähr zur Hälfte angehalten und die so ange haltenen Rinderembryonen besaßen knapp zu 80% einen XY-Karyotyp, während 80–90% der nicht beeinflussten XX waren. Utsumi und Iritani (1993, Mol. Reprod. Devel. 36: 238) fanden, dass von 35 Rinderblastozysten, die mit H-Y-Antikörper geschlechtsbestimmt wurden, in 31 Fällen (89%) die Diagnose mit der Diagnose übereinstimmte, die durch DNA-Analyse erfolgte.
Coe (1977, Proc. Nat. Acad. Sci. 74: 730) hat ein Weibchen-Protein identifiziert, das hormonabhängig ist und daher unwahrscheinlich in Blastozysten oder Spermium gefunden wird. Brown et al (1991, Nature 349: 38) berichten, dass das erste XX-spezifische Molekül ein mRNA-Molekül ist, das vom „inaktivierten" X transkribiert wird und deshalb nur in somatischen Geweben von Weibchen hergestellt wird.
Es wurde vielen Verfahren zur Abtrennung von X-Chromosom-haltigen Säugetier-Spermium von Y-Chromosom-haltigem Spermium untersucht. Einige Verfahren basieren auf den Eigenschaften des Spermiums, z.B. der Größe, der Kopfform, der Masse, den Oberflächeneigenschaften, den Oberflächenmakromolekülen, dem DNA-Gehalt, der Schwimmgeschwindigkeit und der Beweglichkeit (siehe die Übersicht von Windsor et al., 1993, Reprod. Fert. Dev. 5: 155). Es gibt auch Versuche zur Geschlechtsbestimmung eines Spermiums durch immunologische Verfahren mit Hilfe von H-Y-Antikörpern (z.B. US-Patente 4 448 767 und 4 191 749 von Bryant). Weitere Autoren fanden keinen Beweis, dass H-Y bevorzugt auf Y-tragendem Spermium exprimiert wird (z.B. Hendricksen et al. 1993, Mol. Reprod. Devel. 35: 189). In dem Übersichtsartikel von Windsor et al. (1993, Reprod. Fert. Dev. 5: 155) wird geschlossen, dass sich keine – Unterschiede zwischen den beiden Spermiumklassen immunologisch nachweisen lassen.
Fabricant et al. (US-Patent 4 722 887) beschreiben ein Verfahren zum Abtrennen von X- und Y-Spermium durch Polymerphasentrennung basierend auf einer unterschiedlichen Expression eines Spermium-Zelloberflächen-Sulfoglycolipids.
Spaulding (US-Patent 5 021 244) beschreibt ein Verfahren zum Sortieren von Sperma in X- und Y-Chromosom-angereicherte Präparationen. Spaulding verwendet den DNA-Gehalt und Zellsortierungsverfahren zum Abtrennen der Subpopulationen. Jedoch kann das vorstehende Verfahren zu Veränderungen in der DNA führen und das letztere Verfahren ist nicht sehr genau, da nur etwa ein 3%iger Unterschied im DNA-Gehalt zwischen X- und Y-Spermium besteht. Ferner vermutet Spaulding, dass die Subpopulationen für die jeweiligen Spermiumarten angereichert sind, aber Spaulding überprüft nicht, ob die jeweils isolierten Gruppen von Spermien tatsächlich X- und Y-Spermien sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Das Problem des Standes der Technik wird gelöst durch ein Verfahren zum Abtrennen geschlechtsspezifischer Moleküle von nicht-geschlechtsspezifischen Molekülen, die an Membranen von Tierzellen gebunden sind, umfassend (a) Immunisieren weiblicher Tiere einer ersten Tierspezies mit Zellmembranfraktionen, die aus Zellen oder Geweben von Weibchen einer zweiten Tierspezies gewonnen sind; zur Herstellung von Anti-Weibchen-Antikörpern (b) Behandeln einer Zellmembranfraktion aus adulten, fötalen oder embryonalen Tierzellen oder -geweben männlichen Geschlechts mit ein oder mehreren Weibchen Anti-Weibchen-Antikörpern oder ein oder mehreren Männchen Anti-Männchen-Antikörpern, die dann an nicht-geschlechtspezifische Moleküle in der Zellmembranfraktion binden, so dass man Konjugate zwischen den nicht-geschlechtsspezifischen Molekülen und den Antikörpern erhält; (c) Abtrennen des Materials in der Zellmembranfraktion, das nicht an die Antikörper bindet, wobei man eine Subfraktion gewinnt, die geschlechtsspezifische Moleküle enthält; (d) Isolieren der geschlechtsspezifischen Moleküle in der Subfraktion und (e) wahlfrei Abtrennen der Antikörper von den Konjugaten, wobei man eine zweite Subfraktion gewinnt, die nicht-geschlechtsspezifische Moleküle enthält, und Isolieren der nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle in der zweiten Subfraktion. Eine alternative Lösung ist ein Verfahren zum Abtrennen geschlechtsspezifischer Moleküle von nicht-geschlechtsspezifischen Molekülen, die an Membranen von Tierzellen gebunden sind, umfassend (a) Immunisieren männlicher Tiere einer ersten Tierspezies mit Zellmembranfraktionen, die aus Zellen oder Geweben von Männchen einer zweiten Tierspezies gewonnen sind zur Herstellung von Anti-Männchen-Antikörpern; (b) Behandeln einer Zellmembranfraktion aus adulten, fötalen oder embryonalen Tierzellen oder -geweben weiblichen Geschlechts mit ein oder mehreren Weibchen Anti-Männchen-Antikörpern, die dann an nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle in der Zellmembranfraktion binden, so dass man Konjugate zwischen den nicht-geschlechtsspezifischen Molekülen und den Antikörpern enthält; (c) Abtrennen des Materials in der Zellmembranfraktion, das nicht an die Antikörper bindet, wobei man eine Subfraktion gewinnt, die geschlechtsspezifische Moleküle enthält; (d) Isolieren der geschlechtsspezifischen Moleküle in der Subfraktion; und (e) wahlfrei Abtrennen der Antikörper von den Konjugaten, wobei man eine zweite Subfraktion gewinnt, die nicht-geschlechtsspezifische Moleküle enthält, und Isolieren der nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle in der zweiten Subfraktion. Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den abhängigen Ansprüchen 2 bis 13 beschrieben.
Der Erfinder hat ein Verfahren zur Abtrennung geschlechtsspezifischer Moleküle (SSMs) entwickelt, die an der Oberfläche adulter, fötaler und embryonalen Tierzellen vorhanden sind. Das Verfahren verwendet xenogene Immunisierung zur Gewinnung von Antikörpern gegen nicht-geschlechtsspezifische Antigene. Die Antikörper gegen nicht-geschlechtsspezifische Antigene werden eingesetzt zum Entfernen nicht-geschlechtsspezifischer Komponenten des Antigenmaterials und somit zum Anreichern des Antigenmaterials auf verbliebene geschlechtsspezfische Moleküle. Das geschlechtsspezifische Material wird nach der Aufreinigung zur Gewinnung xenogener-Antikörper gegen das andere Geschlecht verwendet (Weibchen-Anti-Männchen oder Männchen-Anti-Weibchen).
Das xenogene Immunisierungsverfahren führt zu einer stärkeren Antikörperantwort als eine isogene Immunisierung innerhalb der Spezies. Das Ergebnis ist, dass sowohl die Avidität der Antigen-Antikörper-Bindung als auch der Antikörpertiter in den Antiseren besser wird. Spezies-spezifische Antikörper, welche die Erkennung der geschlechtsspezifischen Antikörper in SMA-Antiseren beeinträchigen, werden bislang weithin als unüberwindbares Problem bei xenogenen Immunisierungmethoden angesehen.
Der Erfinder hat sein Verfahren eingesetzt zum Abtrennen sowohl von männlich- als auch weiblichspezifischen Molekülen. Die Abtrennung von weiblichen- und männlichenspezifischen Molekülen erlaubt die Herstellung von erheblichen Mengen Antikörpern hoher Affinität. Diese Antikörper sind nützlich zur Geschlechtsbestimmung von Tierzellen und -geweben und stellen nicht-invasive Verfahren zur Geschlechtsbestimmung bereit, die sowohl hohe Spezifität (wenige Falschpositive) als auch hohe Sensitivität (wenig Falschnegative) besitzen.
Der Erfinder verwendet das Verfahren auch zum Abtrennen nicht-geschlechtsspezifischer Moleküle (auch fortan als spezies-spezifische Moleküle bezeichnet), die beispielsweise als spezies-spezifische allelische Marker verwendet werden können.
Die Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren zur Abtrennung von geschlechtsspezifischen Molekülen und nicht-geschlechtsspezifischen Molekülen, die mit Tierzellen verbunden sind, beispielsweise mit Tierzellmembranen, vorzugsweise Plasmamembranen (Außenmembranen), umfassend a) Behandeln einer Zellmembranfraktion aus adulten, fötalen oder embryonalen Tierzellen, mit ein oder mehreren Substanzen, die an nicht-geschlechtsspezifischen Molekülen in der Zellmembranfraktion zur Bildung von Konjugaten zwischen nicht-geschlechtsspezifischen Molekülen und den Substanzen; b) Abtrennen des Materials in der Zellmembranfraktion, das nicht an die Substanzen bindet, wobei man eine Subfraktion gewinnt, die geschlechtspezifische Moleküle erhält; c) Isolieren der geschlechtsspezifischen Moleküle in der Subfraktion; und d) wahlweise Abtrennen der Substanzen von den Konjugaten, wobei man eine zweite Subfraktion gewinnt, die nicht-geschlechtsspezifische Moleküle enthält, und Isolieren der nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle in der zweiten Subfraktion.
Erfindungsgemäß ist die Substanz ein Antikörper gegen nicht-geschlechtsspezifische Moleküle und in einer bevorzugten Ausführungsform ist die Substanz Weibchen-Anti-Weibchen-Antikörper und/oder Männchen-Anti-Männchen-Anti-Männchen-Antikörper.
Die geschlechtsspezifischen Moleküle und die nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurden, können verwendet werden zur Identifizierung von Nukleinsäuremolekülen mit Sequenzen, die geschlechtsspezifische und nicht-geschlechtsspezifische Moleküle kodieren. Deshalb wird ein gereinigtes und isoliertes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, enthaltend eine Sequenz, die ein geschlechtsspezifisches Molekül kodiert, das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurde. Ferner wird ein gereinigtes und isoliertes Nukleinsäuremolekül, enthaltend eine Sequenz bereitgestellt, die ein nicht-geschlechtsspezifisches Moleküle kodiert, das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurde.
Die Nukleinsäuremoleküle, die geschlechtsspezifische und nicht-geschlechtsspezifische Moleküle kodieren oder Fragmente davon, können in einen geeigneten Expressionsvektor eingeführt werden, d.h. einen Vektor, der die erforderlichen Elemente für die Transkription und Translation der eingefügten Proteinkodierungssequenz enthält. Es können so rekombinate DNA-Moleküle zur Transformation einer Wirtszelle hergestellt werden, die ein Nukleinsäuremolekül enthalten, das ein Molekül kodiert, welches mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurde, sowei ein oder mehrere Transkriptions- und Translationselemente, die funktionell mit dem Nukleinsäuremolekül verbunden sind.
Das rekombinante Molekül kann zur Herstellung transformierter Wirtszellen verwendet werden, die das Molekül oder Teile davon exprimieren.
Die vorliegende Beschreibung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines geschlechtsspezifischen Moleküls bereit, eines nicht-geschlechtspezifischen Moleküls oder Isoformen oder Teile davon und zwar unter Verwendung der gereinigten und isolierten Nukleinsäuremoleküle, die mit den hier beschriebenen Verfahren identifiziert wurden.
Ein geschlechtsspezifisches Molekül ist ferner beschrieben, das als (a) männchenspezifisch charakterisiert ist; (b) das verbunden ist mit der Plasmamembran von Zellen aus fötalen und adulten Geweben des Rinds, insbesondere aus Hoden, Milz und Nieren; und (c) das ein Molekulargewicht von etwa 60 KD besitzt.
Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten geschlechtsspezifischen und nicht-geschlechtsspezifischen Molekülen oder Isoformen oder Teile davon, werden mit anderen Molekülen konjugiert wie Proteine, Polypeptide, oder sie können glykolysiert sein.
Die Beschreibung erlaubt ferner die Herstellung von Nukleotidsonden, die für Nukleinsäuremoleküle eindeutig sein, welche geschlechtsspezifische und nicht-geschlechtsspezifische Moleküle kodieren. Diese wurde mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert und auch die zu den geschlechtsspezifischen und nicht-geschlechtsspezifischen Molekülen zugehörigen Isoformen oder Fragmente. Somit lehrt die Beschreibung eine Sonde, umfassend eine Nukleotidsequenz, die für ein geschlechtsspezifisches Molekül oder ein nicht-geschlechtsspezifisches Molekül kodiert, das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurde. Die Sonde kann markiert sein, beispielsweise mit einer nachweisbaren Substanz, und sie kann verwendet werden zur Auswahl einer Nukleotidsequenz, die für ein geschlechtsspezifisches Molekül, ein nicht-geschlechtsspezifisches Molekül oder ein Fragmente hiervor kodiert, und zwar aus einem Gemisch von Nukleotidsequenzen.
Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Moleküle, welche aus Geweben isoliert wurden oder die rekombinant hergestellt werden können, eignen sich zur Herstellung von Antikörpern. Es werden ferner Antikörper vorgeschlagen, die spezifisch sind für ein Epitop eines geschlechtsspezifischen Moleküls oder eines nicht-geschlechtsspezifischen Moleküls oder einer Isoform oder eines Fragments hiervon, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurden. Die Antikörper können mit einer Nachweisbarsubstanz markiert werden und sie können verwendet werden zum Nachweis geschlechtsspezifischer oder nicht-geschlechtsspezifischer Moleküle in Proben aus Geweben, Zellen und Embryonen.
Die mit dem hierin beschriebenen Verfahren identifizierten geschlechtsspezifischen Antigene bzw. die Antikörper gegen ein Epitop dieser geschlechtsspezifischen Moleküle können verwendet werden zur Erhöhung der Wahrscheinlichkeit, dass die Nachkommen das gewünschte Geschlecht besitzen oder dass sie ein bzw. kein Gen besitzen für eine Anlage, die mit dem Geschlechtschromosom verbunden ist.
Die Antikörper gegen ein Epitop des mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten geschlechtsspezifischen Moleküls eignen sich zur Differenzierung zwischen Männchen und Weibchen. Diese beruht auf dem Nachweis des Vorhandenseins des geschlechtsspezifischen Moleküls, das mit einer Zellmembran, vorzugsweise der Plasmamembran, verbunden ist. Deshalb lehrt die Beschreibung ein Verfahren zur Differenzierung zwischen Männchen und Weibchen, umfassend das Zugänglichmachen eines Embryos oder eines Wachstumsmediums des Embryos ein oder mehreren Antikörpern, sie spezifisch sind für ein Epitop eines mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten geschlechtsspezifischen Moleküls unter Bedingungen, dass sich ein Konjugat zwischen dem Antikörper und dem geschlechtsspezifischen Molekül bilde'n kann, und den Nachweis der Konjugate. Der Nachweis eines Konjugates mit Antikörper gegen ein Männchen-spezifisches Molekül liefert ein Männchen und der Nachweis eines Konjugates mit Antikörper gegen ein Weibchen-spezifisches Molekül liefert ein Weibchen.
Es wurde gefunden, dass die Spermien die geschlechtsspezifischen Moleküle tragen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurden. Deshalb lehrt die Beschreibung ein Verfahren zur Abtrennung Weibchen- und Männchen-ergebender Spermien aus natürlichem Samen. Es umfasst das Behandeln von natürlichen Spermien mit ein oder mehreren Antikörpern gegen ein mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziertes geschlechtsspezifisches Molekül, so dass Konjugate zwischen männlich- oder weiblich-bestimmenden Spermien und den Antikörpern gebildet werden, und Isolieren der Konjugate und der Spermien, die nicht an Antikörper gebunden sind.
Weiterhin lehrt die Beschreibung das Immunisieren von Weibchen gegen X-Spermium, Y-Spermium oder beide durch Verabreichen einer immunogenen Menge eines geschlechtsspezifischen Moleküls, das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurde. Dies erhöht somit die Wahrscheinlichkeit von Nachkommen eines bestimmten Geschlechts. Dies kann auch zum Sinken der Fruchtbarkeit führen. Die Antikörper gegen ein Epitop eines erfindungsgemäßen geschlechtsspezifischen Moleküls und das Komplementsystem können ferner verwendet werden zum Abtöten männlicher und/oder weiblicher Embryos in vitro oder in vivo. Insbesondere können Antikörper gegen ein Epitop eines geschlechtsspezifischen Moleküls und Komplement im Uterus eines schwangeren Tieres eingebracht werden, so dass männliche und/oder weibliche Embryonen abgetötet werden.
Antikörper gegen ein Epitop eines mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten geschlechtsspezifischen Moleküls können ferner konjugiert werden mit einem Cytotoxin, das Spermien inaktiviert.
Die die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten geschlechtsspezifischen Moleküle können ferner verwendet werden zum Nachweis von spezifischen Antikörpern für die geschlechtsspezifischen Moleküle in einer Probe.
Die nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle, die mit dem hierin beschriebenen Verfahren identifiziert wurden, und die Antikörper gegen ein Epitop dieser nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle, können als spezies-spezifische Allelmarker verwendet werden. Beispielsweise können die Moleküle zum Nachweis der Kontamination einer Gewebekultur mit einer nicht-identifizierten Zelle verwendet werden und sie können eingesetzt werden in Somazellen-Untersuchungen zur Identifizierung von menschlichen- und/oder Mauschromosomen.
Die Beschreibung betrifft ferner Kits, die sich eignen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, umfassend Antikörper gegen Epitope von mit dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierten geschlechtsspezifischen oder nicht-geschlechtsspezifischen Molekülen sowie geeignete Träger zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden eingehenden Beschreibung.
Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung wird nun mit Bezug auf die Zeichnungen beschrieben. Es zeigt:
1 ein SDS-PAGE-Gel mit aufgereinigten fötalen Männchen(Spur 3)- und Weibchen(Spur 5)-Proteinen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
I. Verfahren zum Identifizieren von Spezies und geschlechtsspezifischen Molekülen
Wie oben erwähnt, betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Abtrennen geschlechtsspezifischer Moleküle von nicht-geschlechtsspezifischen Molekülen, die an Tierzellen gebunden sind, vorzugsweise an Membranen, besonders bevorzugt an Plasmamembranen. Der Fachmann erkennt, dass weitere Moleküle mit dem erfindungsgemäßen Verfahren abgetrennt werden können. Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten insbesondere geschlechtsspezifischen und nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle, enthalten Glyco-, Lipo- und Phosphoproteine, Polypeptide und Peptide und Komplexe dieser Moleküle.
Das hier beschriebene Verfahren, kann bei jedem Tier verwendet werden, das eine ausreichende evolutionäre Konservierung von geschlechtsspezifischen Allelen aufweist und kann entsprechend eine große Vielzahl von Tieren verwenden. Es können beispielsweise verwendet werden, Säugetiere, Vogel-Spezies, Reptilien und Fische, vorzugsweise gewerblich bedeutende Säugetier-Spezies, einschließlich Rinder, Hunde, Katzen, Pferde, Schweine und Schafe. Es ist ferner auf Menschen anwendbar.
Das Verfahren umfasst: Erstens das Herstellen einer Gewebeprobe aus adulten, fötalen oder embryonalen Tierzellen oder -geweben. Proben können ferner von Parthenogenoten (parthenogenotes) hergestellt sein. Die Gewebeprobe wird vorzugsweise aus einer Zellmembran erhalten, beispielsweise der Plasmamembran (Außenmembran), der inneren Membran, der Mitochondrienmembran und der Membran des endoplasmatischen Retikulums, insbesondere der Plasmamembran. Gewebeproben können erhalten werden mit Hilfe von dem Fachmanns bekannten Verfahren. Beispielsweise kann die Plasmamembranfraktion, folgend erhalten werden. Organe, wie Milz, Nieren, Hoden und Eierstöcke können herausgeschnitten werden aus Rinder-fötalem oder adultem Gewebe. Die Organe werden in einem Homogenisierungspuffer, der Proteaseinhibitoren und Solubilisierungsmittel, wie Detergenzien enthält, eingebracht und in sehr kleine Stücke mit einer feinen Schere geschnitten. Die DNAse kann hinzugefügt werden und das Gewebe kann homogenisiert werden, beispielsweise mit einem Polytron^TM-Homogenisator. Das Homogenat kann sanft aufgetragen werden auf eine Saccharoselösung und bei 900 × g bei 4°C über 60 Minuten ultrazentrifugiert werden. Das Plasmamembranmaterial kann als eine Zwischenbande erhalten, durch weitere Ultrazentrifugation gewaschen und anschließend eingefroren, und bis zur Verwendung gelagert werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden die geschlechtsspezifischen Moleküle, die an die Spermienmembran gebunden sind, vorzugsweise aus der Plasmamembran des Spermiums isoliert. Eine Zellmembranfraktion kann erhalten werden aus den Spermium-Präparationen durch Herstellen der X und Y angereicherten Spermiumfraktionen. Die angereicherten Fraktionen können hergestellt werden auf der Basis der Eigenschaften des X- und Y-Spermiums, z.B. der Größe, der Kopfform, des Gewichts, der Oberflächeneigenschaften, der Oberflächenmakromoleküle, des DNA-Gehalts, der Schwimmgeschwindigkeit und der Beweglichkeit (siehe Übersichtsartikel von Windsor et al., 1993, vorstehend). In einer Ausführungsform wird eine Durchflusscytometrie der Spermiumpräparationen durchgeführt, welche darauf beruht, dass das X-Spermium mehr DNA als das Y-Spermium enthält und das X-Spermium eine leicht stärkere Fluoreszenz nach der Behandlung mit einem bindenden Fluoreszenzfarbstoff (Hoechst 33342) zeigt, als das Y-Spermium. In einer weiteren Ausführungsform werden die Spermiumpräparationen mit Anti-Männchen oder -Weibchen-Embryo oder fötalen Antikörpern behandelt.
Membranvesikel können isoliert werden aus angereicherten X- und Y-Fraktionen mit Hilfe einer Hohlraumbildung (cavitation) (beispielsweise, Gillis et al., Prep. Biochem., 8, Seiten 363–378, 1978). Zellmembranvesikel bestehend im Wesentlichen aus der Kopf-Zellmembran und etwas Schwanz-Zellmembran aus Spermium-Köpfen, Schwänzen und weitere Partikel, können dann erhalten werden durch pelletbildende Zentrifugation, vorzugsweise zweimalige Zentrifugation bei 2500 × g über etwa 30 Minuten. Der Überstand, der Zellmembranbestandteile enthält, kann dann zentrifugiert werden (z.B. 100.000 × g), unter Erhalt des Materials, das in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete wird. Das Material kann resuspendiert und in Trisacetat (10 mM, pH 5,5) gewaschen werden, zur Entfernung des gesamten Fluoreszenzfarbstoffes.
Die, wie vorstehend beschrieben erhaltende Membranfraktion wird mit einer oder mehreren Substanzen behandelt, die an nicht-geschlechtsspezifische Moleküle in der Fraktion binden, zur Bildung von Konjugaten zwischen den nicht-geschlechtsspezifischen Molekülen und den Substanzen. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Substanz ein Antikörper gegen nicht-geschlechtsspezifische Moleküle. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Substanz ein Weibchen-Anti-Weibchen-Antikörper und/oder Männchen-Anti-Männchen-Antikörper, die durch xenogene Immunisierung hergestellt wurde. Beispielsweise werden männliche und weibliche Tiere einer ersten Spezies (bezeichnet als SP1) immunisiert mit männlichen und weiblichen Zellmembranfraktionen, die isoliert sind aus einer zweiten Tierspezies (bezeichnet als SP2), zur Herstellung von Männchen-SP1-Anti-Weibchen-SP2-Antikörpern, Männchen-SP1-Anti-Männchen-SP2-Antikörpern, Weibchen-SP1-Anti-Männchen-SP2-Antikörpern und Weibchen-SP1-Anti-Weibchen-SP2-Antikörpern. Die ersten und zweiten Tierspezies sind ausgewählt, dass eine ausreichende evolutionäre Konservierung der geschlechtsspezifischen Allele besteht, d.h. dass ein SP1-Tier nicht in nennenswertem Umfang Antikörper gegen geschlechtsspezifische Moleküle eines SP2-Tiers des gleichen Geschlechts herstellt.
Die ersten und zweiten Tierspezies können ausgewählt werden aus Kaninchen, Schafen, Ratten, Mäusen, Pferden, Kühen und Ziegen oder Nicht-Säugetierspezies, wie verschiedene Geflügelarten. In einer Ausführungsform der Erfindung werden männliche und weibliche Kaninchen mit männlichen und weiblichen Rinderplasmamembranfraktionen, zur Herstellung von männlichen Kaninchen-Anti-Weibchen-Rinder-Antikörpern, männlichen Kaninchen-Anti-Männchen-Rinder-Antikörpern, weiblichen Kaninchen-Anti-Männchen-Rinder-Antikörpern und weiblichen Kaninchen-Anti-Weibchen-Rinder-Antikörpern, immunisiert.
Die Weibchen-Anti-Weibchen-Antikörper und Männchen-Anti-Männchen-Antikörper Präparationen, die durch xenogene Immunisierung, wie hier beschrieben hergestellt wurden, können ferner behandelt werden, um sicher zu stellen, dass die Präparationen keine Antikörper gegen weibchen-geschlechtsspezifische Moleküle bzw. männchen-geschlechtsspezifische Moleküle enthalten. Beispielsweise kann eine Männchen-Kaninchen-Anti-Männchen-Rinder-Antikörper Präparation mit einer männlichen Rinderplasmamembranfraktion reagieren, unter Erhalt von Konjugaten, die Antikörper in der Präparation und die Antigene in der Fraktion enthalten. Die Antigene, die dann an die Männchen-Kaninchen-Anti-Männchen-Rinder-Antikörper gebunden sind, können isoliert werden und zur Immunisierung eines weiblichen Kaninchens verwendet werden. Die Weibchen-Kaninchen-Anti-Männchen-Rinder-Antikörper können dann mit einer weiblichen Rinderplasmamembranfraktion behandelt werden. Anti-Männchen-Rinder geschlechtsspezifische Moleküle binden nicht an Antigene in der weiblichen Rinderplasmamembranfraktion, während die Anti-Männchen-Rinder nicht-geschlechtsspezifischen Molekülen an die nicht-geschlechtsspezifischen Antigene in der Fraktion binden. Eine hochgereinigte Präparation von männlichen Rinder nicht-geschlechtsspezifischen Molekülen kann dann isoliert und zur Immunisierung von Kaninchen usw. verwendet werden, so dass eine Antikörper-Präparation erhalten wird, die hochspezifisch ist für Rinder nicht-geschlechtsspezifischen Molekülen. In ähnlicher Weise kann hochgereinigte Präparation von weiblichen Rinder nicht-geschlechtsspezifischen Molekülen isoliert und zur Immunisierung von Kaninchen usw. verwendet werden, so dass eine Antikörper-Präparation erhalten wird, die hochspezifisch ist für Rinder nicht-geschlechtsspezifische Moleküle.
Die Substanz, die an die nicht-geschlechtspezifischen Moleküle in der Plasmamembranfraktion bindet, oder Teile davon, kann unlöslich sein, zum erleichterten Abtrennen der Subfraktion, die Konjugate der Substanzen und der nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle enthält von der Subfraktion, die die geschlechtsspezifischen Moleküle enthält. Beispielsweise kann die Substanz an einen geeigneten Träger gebunden sein. Beispiele von geeigneten Trägern sind Agarose, Cellulose, Dextran, Sephadex, Sepharose, Carboxymethyl-Cellulosepolystyrol, Filterpapier, Ionentauscherharz, Plastikfilm, Plastikröhre, Glaskügelchen, Polyamin-methylvinylether-maleinsäure-Copolymer, Aminosäure-Copolymer, Ethylen-Maleinsäure-Copolymer, Nylon, Seide usw. Der Träger kann in der Form beispielsweise einer Röhre, einer Testplatte, eines Kügelchen, einer Scheibe, einer Kugel usw., sein.
Die unlösliche Substanz kann hergestellt werden durch Umsetzen des Materials mit einem geeigneten unlöslichen Träger mit Hilfe bekannter chemischer oder physikalischer Verfahren, beispielsweise Cyanbromid-Kopplung.
Die Konjugate der Substanzen und der nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle werden isoliert aus der Subfraktion enthaltend die geschlechtsspezifischen Moleküle durch herkömmliche Isolierungstechniken, beispielsweise Aussalzen, Chromatographie, Elektrophorese, Gelfiltration, Fraktionierung, Absorption, Polyacrylamidgelelektrophorese, Agglutination oder Kombinationen davon. Wenn die Substanz unlöslich ist, können die Konjugate mit Hilfe herkömmlicher Verfahren eluiert werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden die geschlechtsspezifischen Moleküle durch Molekulargröße und/oder pI mit Hilfe bekannter Verfahren isoliert. Elektrophorese nach einem Standardverfahren, wie von Sambrook, J. et al (Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbour Laboratory Press, Abschnitte 6.3–6.9, 1989) beschrieben, kann verwendet werden zur Abtrennung der geschlechtsspezifischen Moleküle. Träger wie Gelblätter oder Gelröhren, beispielsweise Polyacrylamid, Agarose oder weitere Polymere werden allgemein als Trägermedium verwendet. Vorzugsweise werden zweidimensionale Gele verwendet, die die Proteine auf der Basis zweier Eigenschaften, z.B. Molekulargröße und pI trennen. Insbesondere SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (IPG-SDS/PAGE) oder immobilisiertes pH-Gradientengel-SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (IPG-SDS/PAGE) werden zur Abtrennung der geschlechtsspezifischen Moleküle verwendet. Die geschlechtsspezifischen Moleküle können aus den Gelen mit Hilfe herkömmlicher Verfahren eluiert werden, wie beschrieben von Lee et al. (1987, Analyt. Biochem. 166: 308).
II. Charakterisierung von Molekülen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurden
Der Erfinder hat männliche und weibliche geschlechtsspezifische Moleküle mit Hilfe der hier beschriebenen Verfahren identifiziert. Wenn das männliche Gewebe durch das erfindungsgemäße Verfahren aufgereinigt wird, wie in 1 veranschaulicht, werden spezifische Proteinmoleküle gefunden, die im weiblichen Material nicht vorliegen, und wenn weibliches Material verwendet wird, werden unterschiedliche spezifische Moleküle gefunden, die nicht in Männchen vorliegen. Beispielsweise wurde ein geschlechtsspezifisches Protein in dem männlichen Material identifiziert, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es an die Plasmamembran von männlichen Zellen aus Rinderfötalem- und adultem Gewebe, insbesondere den Hoden, der Milz und den Nieren, gebunden ist. Das Molekül hat ein Molekulargewicht in der SDS-PAGE von etwa 60 KD.
Die isolierten und aufgereinigten geschlechtsspezifischen und nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle können verwendet werden zum Isolieren von Nukleinsäure-Molekülen mit Sequenzen, die ein geschlechtsspezifisches oder nicht-geschlechtsspezifisches Molekül kodieren. Beispielsweise kann die Teilaminosäuresequenz für ein geschlechtsspezifisches Molekül oder nicht-geschlechtsspezifisches Molekül bestimmt werden. Eine DNA-Sonde kann synthetisiert werden, die auf der Aminosäuresequenz basiert und die Sonde kann verwendet werden zum Absuchen einer DNA-Bank der mRNA aus einer Zelle, die das geschlechtsspezifische oder nicht-geschlechtspezifische Molekül herstellt oder einer genomischen DNA-Bank. Klone, die cDNA oder genomische DNA enthalten, die mit den Sonden hybridisieren, können isoliert werden. Die cDNA oder die genomischen DNA Sequenzen, die Moleküle kodieren, können identifiziert werden beispielsweise durch Sequenzieren oder durch Exprimieren der cDNA in einem eukaryontischen Expressionssystem und identifizieren Klone, die das Protein herstellen, das an den Antikörper bindet, der spezifisch ist für die geschlechtsspezifischen oder nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle. Die Teilaminosäuresequenz können ferner verwendet werden zum Herstellen von Primern, die in der PCR-Reaktion zur Amplifizierung des Gens verwendet werden, das die geschlechtsspezifischen oder die nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle kodiert. Die PCR isolierte Gene können sequenziert und in Expressionsvektoren zur Klonierung eingefügt werden.
Fragmente der Nukleinsäuremoleküle werden ferner angegeben. In einer Ausführungsform enthalten die Fragmente mindestens 15 Basen und sind zur Hybridisierung unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit der Nukleinsäuresequenz geeignet, die das geschlechtsspezifische oder nicht-geschlechtsspezifische Molekül kodiert, wie hier beschrieben.
Es wird ferner erkannt, dass eine doppelsträngige Nukleinsäuresequenz, die ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder ein Fragment davon umfasst, die über eine Wasserstoffbrückenbindung mit einer komplementären Nukleinsäurebasensequenz gebunden ist und eine durch Transkription dieser Nukleinsäuresequenz hergestellte RNA angegeben ist.
Weiterhin wird erkannt, dass die Beschreibung Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen umfasst, die eine beträchtliche Sequenzidentität aufweisen. Der Ausdruck „Sequenzen mit beträchtlicher Sequenzidentität" bedeutet, das jene Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen, die leichte oder unbedeutende Sequenzvariationen aufweisen, d.h. die Sequenzen wirken im Wesentlichen in der gleichen Weise zur Herstellung von im Wesentlichen gleichen Polypeptiden, wie die natürlich vorkommenden Sequenzen. Die Variationen können den örtlichen Mutationen, Polymorphismen oder strukturellen Änderungen zugeordnet werden.
Stringente Hybridisierungsbedingungen sind stringent genug, um eine Spezifität bereitzustellen, die die Anzahl der Fehlpaarungen reduzieren und dennoch ausreichend flexibel sind die Ausbildung stabiler Hybride bei annehmbarer Geschwindigkeit zu ermöglichen. Die Bedingungen sind dem Fachmann, beispielsweise aus Sambrook et al, (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) bekannt.
Die Beschreibung stellt ferner Aminosäuresequenzen für die erfindungsgemäßen geschlechtsspezifischen und nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle und Sequenzen bereit, die eine beträchtliche Identität mit den Aminosäuresequenzen aufweisen. Die Beschreibung schlägt Peptide vor, die einzigartig zu den geschlechtsspezifischen und nicht-geschlechtsspezifischen Molekülen der Erfindung sind. Vorzugsweise haben die Peptide mindestens 10 bis 20 Aminosäuren.
Die Nukleinsäuresequenzen, die in den Nukleinsäuremolekülen enthalten sind, oder ein Fragment davon, können in Bezug auf ihre normale Anordnung für die Transkription, zur Herstellung von Antisense-Nukleinsäuremolekülen, invertiert sein. Die Antisense-Nukleinsäuremoleküle können hergestellt werden mit Hilfe chemischer Synthese und enzymatischer Ligationsreaktionen und mit Hilfe der im Stand der Technik bekannten Verfahren. Die Antisense-Nukleinsäuremoleküle oder ein vorzugsweise mindestens 15 Basen enthaltendes Fragment der Antisensesequenz, können chemisch verwendet werden mit Hilfe natürlich auftretender Nukleotide oder unterschiedlich modifizierter Nukleotide, die ausgestaltet sind zur Erhöhung der biologischen Stabilität der Moleküle oder zur Erhöhung der physikalischen Stabilität der Duplex, die mit der mRNA oder dem Gen ausgebildet ist, z.B. Phosphorthioat-Derivate und Acridin-substituierte Nukeleotide. Die Antisensesequenzen können biologisch hergestellt werden mit Hilfe eines in Zellen eingeführten Expressionsvektors in Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder abgeschwächten Virus. In diesen Vektoren werden Antisensesequenzen unter der Kontrolle einer hoch effizienten regulatorischen Region hergestellt, deren Aktivität durch den Zell-Typ bestimmt werden kann, in den der Vektor eingeführt ist.
III. Herstellung von Molekülen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurden
Nukleinsäuremoleküle kodierend die geschlechtsspezifischen und die nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurden oder Fragmente davon, können isoliert und sequenziert werden mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens oder sie können durch chemische Synthese und enzymatische Ligationsreaktionen mit Hilfe bekannter Verfahren hergestellt werden.
Die geschlechtsspezifischen und die nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle der Erfindung oder Isoformen oder Teile davon, können hergestellt werden mit Hilfe rekombinanter DNA-Verfahren. Somit können Nukleinsäuremoleküle mit einer Sequenz, die für ein geschlechtsspezifisches Molekül, ein nicht-geschlechtsspezifisches Molekül oder Fragmente davon kodiert, kann in einer bekannten Art in einen geeigneten Expressionsvektor eingebracht werden, der die gute Expression der Moleküle oder Isoformen oder Teile davon sicherstellt. Mögliche Expressionsvektoren enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf Cosmide, Plasmide oder modifizierte Viren, vorausgesetzt der Vektor ist mit den verwendeten Wirtszellen kompatibel.
Die Beschreibung lehrt ein rekombinantes Molekül an, das ein Nukleinsäuremolekül enthält, welches ein geschlechtsspezifisches Molekül oder ein nicht-geschlechtsspezifisches Molekül kodiert, das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurde oder Fragmente davon und die erforderlichen Elemente für die Transkription und Translation der eingefügten Sequenz enthält. Geeignete Transkriptions- und Translationselemente können abgeleitet werden aus zahlreichen Quellen, einschließlich Bakterien-, Pilze-, virale-, Säugetier- oder Insektengene. Die Wahl der geeigneten Transkriptions- und Translationselemente ist von der verwendeten Wirtzelle abhängig und kann durchgeführt werden von einem Durchschnittsfachmann. Beispiele dieser Elemente sind: ein transkriptionaler Promotor und Enhancer oder eine RNA-Polymerase-Bindungssequenz, eine ribosomale Bindungssequenz einschließlich eines Translations-Initiationssignals. Zusätzlich können, abhängig von der verwendeteten Wirtszelle und des verwendeten Vektors, weitere genetische Elemente, wie ein Replikationsursprung, zusätzliche DNA-Restriktionsschnittstellen, Enhancer und Sequenzen, die die Induzierbarkeit der Transkription verleihen, in dem Expressionsvektor eingeführt werden. Es wird ferner erkannt, dass die erforderlichen Transkriptions- und Translationselemente bereitgestellt werden können durch das natürliche Gen und/oder seine flankierenden Regionen.
Die rekombinanten Moleküle können ferner ein Reportergen enthalten, das die Selektion von Wirtzellen erleichtert, die mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten Molekül transformiert oder transfiziert werden. Beispiele von Reportergenen sind Gene, die Proteine kodieren, wie β-Galactosidase, Chloramphenicol-Acetyltransferase und Leuchtkäfer-Luciferase. Die Transkription des Reportergens wird durch Veränderungen in der Konzentration des Reporterproteins beobachtet, wie β-Galactosidase, Chloramphenicol-Acetyltransferase oder Leuchtkäfer-Luciferase. Dieses ermöglicht es, die Expression rekombinanter Moleküle darzustellen und zu untersuchen.
Rekombinante Moleküle können in die Wirtzellen durch Transformation, Transfektion, Infektion, Elektroporation usw. eingeführt werden. Methoden zur Transformierung, Transfektion usw. von Wirtszellen zur Expression fremder DNA sind im Stand der Technik bekannt (siehe, z.B., Itakura et al., US-Patent 4 704 362; Hinnen et al., PNAS USA 75: 1929–1933, 1978; Murray et al., US-Patent Nr. 4 801 542; Upshall et al., US-Patent 4 935 349; Hagen et al., US-Patent 4 784 950; Axel et al., US-Patent 4 399 216; Goeddel et al., US-Patent 4 766 075; und Sambrook et al. Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Geeignete Wirtszellen schließen eine größe Anzahl an prokaryontischen und eukaryontischen Wirtzellen, einschließlich Bakterien-, Säugetier-, Hefe- oder weitere Pilz-, Viren-, Pflanzen- oder Insektenzellen, ein.
Die geschlechtsspezifischen Moleküle, die nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle oder Isoformen oder Teile davon, können ferner durch chemische Synthese hergestellt werden mit Hilfe bekannter Techniken in der Proteinchemie, wie Festphasensynthese (Merrifield, 1964, J. Am. Chem. Assoc. 85: 2149–2154) oder Synthese in homogener Lösung (Houbenweyl, 1987, Methods of Organic Chemistry, Herausgeber E. Wansch, Band 15 I und II, Thieme, Stuttgart).
Die geschlechtsspezifischen Moleküle oder die nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle der Erfindung oder Isoformen oder Teile davon, können konjugiert werden mit weiteren Molekülen, wie Proteinen oder Polypeptiden. Fusionsproteine können hergestellt werden durch Fusionierung mit Hilfe rekombinanter Techniken, einer Region der geschlechtsspezifischen oder der nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle oder Teilen davon und eines ausgewählten Proteins oder Markerproteins mit einer gewünschten biologischen Funktion. Beispiele von Proteinen, die verwendet werden können zur Herstellung von Fusionsproteinen, umfassen Zytotoxine und immunogene Proteine. Sie können ferner an weitere spezifische Moleküle, einschließlich Antikörper zur Steuerung der Lokalisation der Moleküle an spezielle Zielstellen, konjugiert werden. Zusätzlich können die Gene, die die Moleküle kodieren, in Expressionsvektoren eingefügt werden unter der Kontrolle von ortspezifischen Promotoren, so dass spezifische Orte angesteuert werden. Genkonstrukte können ferner hergestellt werden, die kodierende Sequenzen für die geschlechtsspezifischen Moleküle und Sequenzen für besonders immunogene Moleküle enthalten, zur Verbesserung der Antigenizität der Moleküle (Tao und Levy, 1993, Nature Band 363: 755–758).
Der Erfinder lehrt ferner ein Verfahren zum Screening von Epitopen der geschlechtsspezifischen Moleküle, die von Mayorhistokompatibilitätskomplex II-Molekülen präsentiert werden. Dies kann erreicht werden durch Isolieren der Plasmamembran-Präparationen von Makrophagen- oder Monozytenzellen, die mit einem geschlechtsspezifischen Molekül gepulst werden, und Isolieren der Epitope mit Hilfe der Antikörper, die spezifisch für die geschlechtsspezifischen Moleküle sind, die durch die hier beschriebenen Verfahren erhalten wurden.
IV. Anwendungen, der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Moleküle
Die Nukleinsäuremoleküle, die die geschlechtsspezifisichen Moleküle und die nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle kodieren, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurden, oder Fragmente davon, erlauben dem Fachmann Nukleotidsonden zur Verwendung beim Nachweis von Nukleotidsequenzen von biologischen Materialien herzustellen. Eine Nukleotidsonde kann markiert sein mit einer nachweisbaren Substanz, wie eine radioaktive Markierung, die ein geeignetes Signal und eine ausreichende Halbwertszeit bereitstellt, wie ³²P, ³H ¹⁴C oder ähnliche. Weitere nachweisbare Substanzen, die verwendet werden können, schließen Antigene ein, die von einem spezifisch markierten Antikörper, Fluoreszenzverbindungen, Enzyme, wie lac Z, die Antikörper-spezifisch für ein markiertes Antigen und Chemilumineszenz sind, erkannt werden. Eine geeignete Markierung kann ausgewählt werden unter Berücksichtigung der Hybridisierungsrate und der Bindung der Sonde an die nachzuweisende Nukleotidsequenz und der für die Hybridisierung verfügbaren Nucleotidmenge. Markierte Sonden können an Nukleinsäuren auf festen Trägern hybridisiert werden, wie Nitrozellulosefilter oder Nylonmembranen, wie allgemein in Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2. Auflage) beschrieben. Die Nukleotidsonden können verwendet werden zum Nachweis von Genen, die die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten geschlechtsspezifischen oder nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle kodieren.
Die geschlechtsspezifischen oder die nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurden, oder Isoformen und Teilen davon, können verwendet werden zur Herstellung von Antikörpern. Antikörper mit Spezifität für die Moleküle können ferner erzeugt werden gegen Proteine, die durch Exprimieren von Nukleinsäuremolekülen hergestellt wurden, die die Moleküle in einer Wirtszelle kodieren, wie oben beschrieben.
Innerhalb des Kontexts der vorliegenden Erfindung umfassen Antikörper monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, Antikörperfragmente (z.B. Fab und F(ab')₂ und rekombinant hergestellte Bindungspartner.
Polyklonale Antikörper können leicht durch einen Durchschnittfachmann hergestellt werden, von einer Vielzahl warmblütiger Tiere, wie Pferde, Kühe, verschiedene Geflügelarten, Kaninchen, Ziegen, Schafe, Kaninchen, Mäuse oder Ratten. In Kürze wird ein geschlechtsspezifisches Molekül oder ein nicht-geschlechtsspezifisches Molekül zur Immunisierung des Tieres, durch intraperitoneale, intramuskuläre, intraokulare, intrasplenische (intrasplenic) Implantation verwendet, z.B. mit Hilfe von Nitrozellulose als Träger oder subkutane Injektionen in Verbindung mit einem Adjuvans, wie Freundsches vollständiges oder unvollständiges Adjuvans oder nach Konjugation oder chemischer Modifikation zur Erhöhung der Antigenizität. Nach mehreren Booster-Immunisierungen werden Serumproben gesammelt und auf Reaktivität mit dem geschlechtsspezifischen Molekül untersucht. Besonders bevorzugte polyklonale Antiseren werden in einem dieser Assays ein Signal ergeben, das mindestens dreimal größer ist als der Hintergrund. Sobald der Titer des Tieres ein Plateau erreicht hat in Bezug auf seine Reaktivität des geschlechtsspezifischen Moleküls, können große Mengen an Antiseren leicht erhalten werden, entweder durch wöchentliche Blutungen oder durch Ausbluten des Tieres.
Monoklonale Antikörper können ferner leicht erzeugt werden mit Hilfe herkömmlicher Techniken (siehe Kohler und Milstein, Nature 256, 495–497, 1975; siehe ferner Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn und Bechtol (Herausgeber), 1980 und Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Herausgeber), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988).
In Kürze wird in einer Ausführungsform ein Tier, wie eine Ratte oder Maus mit einem geschlechtsspezifischen oder einem nicht-geschlechtsspezifischen Molekül injiziert. Das Molekül kann gemischt werden mit einem Adjuvans, wie Freundsches vollständigem oder unvollständigem Adjuvans zur Erhöhung der resultierenden Immunantwort. Zwischen ein und drei Wochen nach der ersten Immunisierung des Tiers, kann das Tier nochmals immunisiert werden mit einer weiteren Booster-Immunisierung und auf Reaktivität gegen das Molekül getestet werden. Sobald das Tier ein Plateau in der Reaktivität der Proteine erreicht hat, wird es geopfert und Organe werden geerntet, die eine große Anzahl von B-Zellen enthalten, wie Milz- und Lymphknoten.
Zellen, die von dem immunisierten Tier erhalten werden, können immortalisiert werden durch Transfektion mit einem Virus, wie das Epstein-Barr-Virus (EBV) (siehe Glasky und Reading, Hybridoma 8(4): 377–389, 1989). Alternativ werden die geernteten Milz- und/oder Lymphknoten-Zellsuspensionen mit einer geeigneten Myelom-Zelle fusioniert, zur Herstellung eines „Hybridoms", das monoklonale Antikörper sezerniert. Geeignete Myelom-Linien schließen beispielsweise NS-1 (ATCC Nr. TIB 18) und P3X63 – Ag 8.653 (ATCC Nr. CRL 1580) ein.
Nach der Fusion können die Zellen in Kulturplatten eingebracht werden, die ein geeignetes Medium enthalten, wie RPMI 1640 oder DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium) (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas), ebenso wie zusätzliche Inhaltsstoffe, wie Fötales Rinderserum (FBS, z.B. von Hyclone, Logan, Utah oder JRH Biosciences). Zusätzlich sollte das Medium ein Reagenz enthalten, das selektiv das Wachstum der fusionierten Milz und Myelom-Zellen, wie HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) erlaubt. Nach etwa 7 Tagen können die erhaltenen fusionierten Zellen oder Hybridoma zur Bestimmung des Vorhandenseins der Antikörper abgesucht werden, die gegen das geschlechtsspezifische oder das nicht-geschlechtsspezifische Molekül reaktiv sind. Eine große Anzahl von Assays kann benutzt werden zur Bestimmung des Vorhandenseins von Antikörpern, die gegen ein nicht-geschlechtsspezifisches oder ein geschlechtsspezifisches Molekül reaktiv sind, einschließlich beispielsweise Gegenstrom-Immunelektrophorese, Radioimmunassay, Radioimmunpräzipitationen, Enzym-gekoppelter-Immunabsorptions-Assay (ELISA), Dot-Blot Assay, Inhibititions- oder Kompetitionsassays und Sandwich-Assays (siehe US-Patente 4 376 110 und 4 186 530; siehe ferner Antikörper: A Laboratory Manual, Harlow und Lane (Herausgeber), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Nach mehreren klonalen Verdünnungen und nochmaligen Assays kann ein Hybridom isoliert werden, das Antikörper herstellt, die reaktiv sind gegen ein nicht-geschlechtsspezifisches oder ein geschlechtsspezifisches Molekül.
Weitere Techniken können ferner verwendet werden zur Herstellung monoklonaler Antikörper (siehe William D. Huse et al., „Generation of a Large Combinational Library of the Immunoglobin Repertoire in Phage Lambda", Science 246: 1275–1281, December 1989; siehe ferner L. Sastry et al., „Cloning of the Immunological Repertoire in Escherichia coli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies: Construction of a Heavy Chain Variable Region-Specific cDNA Library", Proc Natl. Acad. Sci USA 86: 5728–5732, August 1989; siehe ferner Michelle Alting-Mees et al., „Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology 3: 1–9, January 1990; diese Literaturstellen beschreiben ein handelsübliches System, erhältlich von Stratacyte, La Jolla, Kalifornien, das die Herstellung von Antikörpern durch rekombinante Techniken ermöglicht).
In ähnlicher Weise können Bindungspartner ferner mit rekombinanten DNA-Techniken hergestellt werden, zum Einbau der variablen Region eines Gens und der konstanten Region eines weiteren Gens, z.B. eine nicht-menschliche Tier variable Region und eine menschliche konstante Region Innerhalb einer Ausführungsform werden Gene, die die variable Region von einem Hybridom kodieren, das einen interessierenden monokonalen Antikörper herstellt, amplifiziert mit Hilfe von Nukleotidprimern für die variable Region. Diese Primer können synthetisiert werden von einem Durchschnittsfachmann oder können von kommerziell verfügbaren Quellen gekauft werden. Primer für Maus und Mensch variable Regionen sind von Stratacyte (La Jolla, Kalifornien) erhältlich. Diese Primer können verwendet werden zur Amplifizierung der schweren oder leichten Kette variablen Regionen, die dann in Vektoren eingesetzt werden können, wie ImmunoZAP^TM H bzw. ImmunoZAP^TM L (Stratacyte). Diese Vektoren können dann eingeführt werden zur Expression in E. coli. Mit Hilfe dieser Techniken können große Mengen von Einzelketten-Protein enthaltend eine Fusion der V_H und V_L Domänen, hergestellt werden (siehe Bird et al., Science 242: 423–426, 1988). Zusätzlich können solche Techniken verwendet werden, zur Veränderung eines „Maus" Antikörpers zu einem „Mensch" Antikörper ohne Änderung der Bindungsspezifität der Antikörper.
Sobald geeignete Antikörper oder Bindungspartner erhalten wurden, können sie durch mehrere Techniken isoliert oder gereinigt werden, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind (siehe Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Herausgeber), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Geeignete Techniken schließen Peptid- oder Proteinaffinitätssäulen ein, HPLC oder RP-HPLC, Reinigung an Protein A oder Protein G Säulen oder irgendeine Kombination dieser Techniken.
Die Spezifität der Antikörper oder Bindungspartner für geschlechtsspezifische oder nicht-geschlechtsspezifische Moleküle kann bestätigt werden durch Umsetzen mit gereinigten Antigenpräparationen. Beispielsweise kann die Spezifität von Antikörpern für weibliche geschlechtsspezifische Antigene bestätigt werden, durch Umsetzen der Antikörper mit einer Gewebeprobe von einer Parthenogenote (parthenogenote), die von männlichen geschlechtsspezifischen Antigenen frei ist.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden Antikörper gegen männlich- oder weiblich-geschlechtsspezifischen Moleküle assoziiert mit Rinderzellmembranen erzeugt durch Injektion der gereinigten Rinder geschlechtsspezifischen Moleküle in ein geeignetes Empfängertier einer anderen Spezies, vorzugsweise Kaninchen, Schafe und Ziegen. Insbesondere ist die andere Spezies Schaf oder Ziege, da sie eine erhöhte Produktivität (erhöhte Menge von Serum) bereitstellt und Anti-Männchen und Anti-Weibchen-Antikörper erzeugt in einer abweichenden Spezies und werden zu sekundären Antikörpern führen, die nicht kreuzreagieren. Antikörper wurden gegen die Moleküle, wie in 1 gezeigt, erzeugt. Jede Bande in dem eindimensionalen Gelelektrophoretogramm, wie in 1 gezeigt, stellt wahrscheinlich mehr als ein Protein dar, wie durch zweidimensionale Elektrophorese gezeigt. Die Antikörper, die durch jede Bande erzeugt werden, sind daher oligospezifisch; das heißt sie haben eine Reaktivität für ein kleine Anzahl (z.B. drei oder vier) verschiedener Antigene. Durch Verwendung der zweidimensionalen Elektrophorese werden vorzugsweise einzelne Moleküle isoliert und monospezifische Antikörper hergestellt. Insbesondere werden mit Hilfe des zweidimensionalen Western Blotting die am stärksten antigenen, geschlechtspezifischen und effizienteren Bindungsmoleküle identifiziert.
Die polyklonalen oder monoklonalen Antikörper für geschlechtsspezifische Moleküle können verwendet werden zum Nachweis der geschlechtsspezifischen Moleküle oder Isoformen oder Teilen davon, in Embryonen, verschiedenen Zellen und Geweben (z.B. Spermiumzellen, Milz, Niere, Eierstock und Hoden, Extrakte und Zellen) und biologisches Material (z.B. Körperflüssigkeiten, wie Blut, Urin und Blastozysten-Flüssigkeit und amniotische Flüssigkeiten). Die Antikörper können ferner verwendet werden zum Quantifizieren der Menge eines geschlechtsspezifischen Moleküls oder einer Isoform oder eines Teils davon, in einer Probe zur Ermittlung ihrer Funktion, bestimmten zellulären Ereignissen oder pathologischen Zuständen. Insbesondere können die polyklonalen und monoklonalen Antikörper der Erfindung in immunhistochemischen Analysen verwendet werden, beispielsweise im zellulären und sub-subzellulären Bereich zum Nachweis eines geschlechtsspezifischen Moleküls der Erfindung, zur dessen Lokalisierung zu speziellen Zellen, Geweben, Embryonen und Organismen und spezifischen subzellulären Orten und zur Quantifizierung des Expressionsspiegels.
Die polyklonalen und monoklonalen Antikörper gegen nicht-geschlechtsspezifische Moleküle kann verwendet werden zum Nachweis und/oder Quantifizieren von nicht-geschlechtsspezifischen Molekülen in Zellen, Geweben und biologischen Materialien. Die Antikörper können ferner verwendet werden zum Nachweis der Zellen, aus einer bestimmten Spezies, in Gewebekultur und Hybridomstudien.
Direkte Verfahren können eingesetzt werden, in denen der Antikörper mit einer nachweisbaren Substanz, wie oben beschrieben, markiert ist. Indirekte Verfahren können ferner eingesetzt werden, in denen die primäre Antigen-Antikörperreaktion durch die Einführung eines zweiten Antikörpers amplifiziert wird, mit Spezifität für den Antikörper, der mit dem geschlechtsspezifischen oder dem nicht-geschlechtsspezifischen Antikörper, reagiert. Beispielsweise, wenn der Antikörper mit Spezifität gegen das geschlechtsspezifische Molekül der Erfindung ein Kaninchen IgG Antikörper ist, kann der zweite Antikörper ein Ziege-Anti-Kaninchen Immunglobulin G sein, der mit einer nachweisbaren Substanz, wie hierin beschrieben, markiert ist.
Allgemein kann ein Antikörper der Erfindung markiert werden mit einer nachweisbaren Substanz und die geschlechtsspezifischen und nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle der Erfindung können auf der Basis der Anwesenheit der nachweisbaren Substanz nachgewiesen werden. Beispiele der nachweisbaren Substanzen schließen verschiedene Enzyme, fluoreszierende Materialien, lumineszierende Materialien, Biotin, magnetische Partikel, Mikro- und Makropartikel und radioaktives Material, ein. Beispiele von geeigneten Enzymen schließen Meerrettichperoxidase, Alkalische Phosphatase, β-Galaktosidase oder Acetylcholinesterase, ein; Beispiele von geeigneten fluoreszierenden Materialien schließen Umbelliferon, Fluoreszein, Fluoreszeinisothiocyanat, Rhodamin, Dichlortriazinylaminfluoreszein, Dansylchlorid oder Phycoerythrin ein; ein Beispiel eines lumineszierenden Materials schließt Luminol ein; und Beispiele geeigneter radioaktiver Materialien schließen radioaktives Jod I¹²⁵, I¹³¹ oder Tritium ein. Antikörper können ferner an elektronendiche Substanzen gekoppelt werden, wie Ferritin oder kolloidales Gold, die leicht durch Elektronenmikroskopie dargestellt werden können.
Radioaktiv markierte Materialien können durch Radiomarkierung mit I¹²⁵ durch das Cloramin-T Verfahren hergestellt werden (Greenwood et al, Biochem. J. 89: 114, 1963), das Laktoperoxidase Verfahren (Marchalonis et al, Biochem. J. 124: 921, 1971), das Bolton-Hunter Verfahren (Bolton und Hunter, Biochem. J. 133: 529, 1973 und Bolton Review 18, Amersham International Limited, Buckinghamshire, England, 1977), das Jod Verfahren (Fraker und Speck, Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 849, 1978), das Jodkügelchen Verfahren (Markwell Anal. Biochem. 125: 427, 1982) oder mit Tritium durch reduktive Methylierung (Tack et al., J. Biol. Chem. 255: 8842, 1980).
Bekannte Kupplungsverfahren (beipielsweise Wilson und Nakane, in „Immunofluorescence and Related Staining Techniques", W. Knapp et al, Herausgeber, Seite 215, Elsevier/North-Holland, Amsterdam & New York, 1978; P. Tijssen und E. Kurstak, Anal. Biochem. 136: 451, 1984) können verwendet werden zur Herstellung enzymmarkierter Materialien. Fluoreszenz-markierte Materialien können hergestellt werden durch Umsetzen des Materials mit Umbelliferon, Fluoreszein, Fluoreszeinisothyocyant, Dichlortriazinylaminfluoreszein, Dansylchlorid, Derivat von Rhodamin, wie Tetramethylrhodaminisothiocyanat oder Phycoerythrin.
Wenn der markierte Antikörper verwendet wird, können die geschlechtsspezifischen und die nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle durch Messung der markierten Antikörper-Antigen Konjugate nachgewiesen werden. Das geeignete Verfahren zur Messung der markierten Konjugate ist von der verwendeten nachweisbaren Substanz abhängig. Beispielsweise, wenn das Markierungsagens ein Enzym ist, kann das geschlechtsspezifische Molekül unter Verwendung eines geeigneten Enzymsubstrats für kolorimetrische, lumineszente oder fluoreszierende Systeme nachgewiesen werden. Wenn das Markierungsagens ein fluoreszierendes Material ist, kann die Anwesenheit eines geschlechtsspezifischen Moleküls durch Fluoreszenzintensität bestimmt werden. Wenn das Markierungsagens radioaktives Material ist, kann das geschlechtsspezifische Molekül der Erfindung durch Radioautographie lokalisiert werden. Die Ergebnisse der Radioautographie können durch Bestimmung der Dichte der Partikel in dem Radioautographen durch verschiedene optische Verfahren oder durch Auszählen der Körner, quantifiziert werden.
Der Antikörper gegen ein geschlechtsspezifisches oder ein nicht-geschlechtsspezifisches Molekül kann durch Bindung an einen geeigneten Träger unlöslich gemacht werden. Beispiele für geeignete Träger sind hier beschrieben. Der unlöslich gemachte Antikörper kann hergestellt werden durch Umsetzen des Materials mit einem geeigneten unlöslichen Träger unter Verwendung bekannter chemischer oder physikalischer Verfahren, beispielsweise Cyanbromidkopplung.
Die Antikörper und die mit einer nachweisbaren Substanz markierten Antikörper, wie oben beschrieben, können verwendet werden zum Nachweis der Anwesenheit der geschlechtsspezifischen und der nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle in herkömmlichen Assays, wie ELISA, Radioimmunassays, Inhibition- oder Kompetitionsassays, Sandwichassays, Dot-Blot Assays, Radioimmunpräzipitation oder histochemische Tests.
Beispielsweise können die Antikörper verwendet werden zum Nachweis eines geschlechtsspezifischen Moleküls in einer Zelle, Gewebe oder biologischen Materials in einem Inhibitionsassay, in dem Extrakte des zu untersuchenden Materials an eine Platte beschichtet werden, wird der Antikörper mit ansteigenden Mengen von Antigen in einer Testlösung umgesetzt und das Vorhandensein der Antikörper in der Testlösung wird quantifiziert in Bezug auf die Menge der auftretenden Inhibition, wenn der vorbehandelte Antikörper mit den beschichteten Antigenen umgesetzt wird. In einem weiteren Sandwichverfahren oder Fangassay, wird gereinigter Antikörper gegen ein geschlechtsspezifisches Molekül auf eine Platte gebunden, verschiedene Mengen einer mutmaßlichen Quelle von Antigenen werden eingeführt, die Platte wird gewaschen und die Menge des gebundenen Antigens durch die Verwendung von biotin-konjugiertem Antikörper und Avidin-biotinyliertem Peroxidaseindikator bestimmt.
Die Antikörper und Nukleinsäuresonden, die geeignet sind zum Nachweis geschlechtsspezifischer und nicht-geschlechtsspezifischer Moleküle können in herkömmliche Kits gepackt werden, die die erforderlichen Materialien bereitstellen, die in geeignete Behälter gepackt sind. Beispielsweise können solche Kits eine Serie von Antikörpern gegen geschlechtsspezifische oder nicht-geschlechtsspezifische Moleküle einschließen. Die Kits können ferner geeignete Träger enthalten, die geeignet sind zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung.
Die Antikörper, Nukleinsäuresonden und Kits der vorliegenden Erfindung haben viele brauchbare Verwendungsmöglichkeiten. Geschlechtsspezifische Moleküle (d.h. männchenspezifische Moleküle in Männchen und weibchenspezifische Moleküle in Weibchen), die mit dem hier beschrieben Verfahren identifiziert wurden, sind an der Außenoberfläche der Plasmamembran von vielen Zellen vorhanden, einschließlich der Zellen an der Außenoberfläche der Rinderembryos. Durch Inkontaktbringen der Embryos mit spezifischen Antikörpern für diese geschlechtsspezifischen Moleküle, ist es möglich das Geschlecht der Embryos zu identifizieren, beispielsweise mit Hilfe nachweisbarer Substanzen, die an die Antikörper gebunden werden. Auf diese Weise ausgewählte Embryos können gewonnen werden, indem der Antikörper abgewaschen werden kann, fortgesetzte in vitro Kultur mit nachfolgendem Transfer in Kühe kann durchgeführt werden und erfolgreiche Trächtigkeit kann resultieren.
Somit lehrt der Erfinder ein Verfahren zur Unterscheidung zwischen Männchen und Weibchen, umfassend das Inkontaktbringen eines Embryos oder Wachstumsmediums eines Embryos mit einem oder mehreren Antikörpern, spezifisch für ein Epitop eines geschlechtsspezifischen Moleküls, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurden, unter Bedingungen, so dass sich ein Konjugat zwischen den Antikörpern und dem geschlechtsspezifischen Molekül ausbildet und Nachweisen der Konjugate. Der Nachweis eines Konjugates mit einem Antikörper gegen ein männchenspezifisches Molekül bestimmt ein Männchen und der Nachweis eine Konjugates mit einem Antikörper gegen ein weibchenspezifisches Molekül bestimmt ein Weibchen. Anti-Männchen- und Anti-Weibchen-Antikörper können getrennt, in Kombination oder nachfolgend zur Unterscheidung zwischen Männchen und Weibchen verwendet werden. Die direkten und indirekten Verfahren, wie oben diskutiert, die als herkömmliche Assays, wie ELISA, Radioimmunassays oder histochemische Tests ausgestaltet sind, können verwendet werden zur Geschlechtsbestimmung von Embryonen.
Embryonen, deren Geschlecht mit den hier beschriebenen Verfahren bestimmt werden, können erhalten werden aus Säugetierspezies, einschließlich Rinder, Hunde, Katzen, Pferde, Schweine, Ziegen und Schafe und Nicht-Säugetieren, einschließlich Vogelspezies, Fische und Reptilien. In einigen dieser Tiere sind die Weibchen heterogametisch (wohingegen in Säugern die Männchen heterogametisch sind) und daher können einige Säugetiermännchen geschlechtsspezifische Moleküle homolog sein zu den weibchen-geschlechtsspezifischen Molekülen von einigen dieser Nicht-Säugetier Spezies und umgekehrt.
Die Embryos können in vitro oder in vivo befruchtete Embryos oder Parthenogenoten (parthenogenotes) sein.
Embryos können mit Hilfe herkömmlicher Techniken gewonnen werden. Zum Beispiel können Embryos von superovulierten Schafen, Ziegen und Rindern gewonnen werden. Schafe, Ziegen und Rinder können mit FSH-P in absteigenden, unterteilten Dosen in 12 Stundenabständen für etwa 3 Tage gespritzt werden, gefolgt von der Injektion eines Prostaglandinanalogs (d.h. Ono-1052, Ono Pharma. Co. Ltd., Japan). Embryos können durch Laparaskopie von Ziegen und Schafen gesammelt werden. Rinderweibchenembryos können nicht-chirurgisch, durch Spülen der Gebährmutter von superovolierten Spendern, etwa 6 bis 7 Tage nach Östrus und künstlicher Befruchtung gesammelt werden. Die Embryos können kultiviert werden bei 37°C in 5% CO₂:95% Luft über etwa sechs Stunden in 10% bCS zugesetzten BMOC-3 Medium (Brinster, RL, 1972: Cultivation of the mammalian embryo. In: G. Rothblat, VJ Cristfalo (Herausgeber); „Nutrition and Metabolism of Cells in Culture", Band 2. New York: Academic Press, Seiten 252–286).
Ein Antikörper, der spezifisch ist für ein Epitop des geschlechtsspezifischen Moleküls, das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurde, kann mit Hilfe des hier beschriebenen Verfahrens hergestellt werden. Die Bedingungen, die verwendet werden können, so dass sich zwischen dem Antikörper und dem geschlechtsspezifischen Molekül ein Konjugat bildet, sind allgemein im Stand der Technik bekannt. Die Menge des Antikörpers, die zur Bildung des Konjugates verwendet wird, kann ausgewählt werden basierend auf dem Antikörpertyp und den Eigenschaften des geschlechtsspezifischen Moleküls. Die Konjugate können durch herkömmliche Isolierungstechniken getrennt werden, beispielsweise Aussalzen, Chromatographie, Elektrophorese, Gelfiltration, Fraktionierung, Absorption, Polyacrylamidgelelektrophorese, Agglutination oder Kombinationen davon.
Die folgenden drei Techniken oder Kombinationen davon werden vorzugsweise zur Abtrennung der Embryos verwendet:

a) Ein Doppelantikörperverfahren. Die Embryos können in Kontakt gebracht werden mit Antikörpern gegen ein oder mehrere geschlechtsspezifische Moleküle, gefolgt durch fluoreszeinmarkierten Anti-Gammaglobulin zweiten Antikörper. Aufeinanderfolgende Verwendung von Anti-Männchen-Antikörper, gefolgt durch ihre entsprechenden Antikörper kann verwendet werden. Dieses Verfahren gestattet die manuelle Abtrennung der markierten von nicht-markierten Embryos.
b) Die Embryos können basierend auf ihrer Morphologie abgetrennt werden, wenn sie mit einem Antikörper gegen ein geschlechtsspezifisches Molekül inkubiert werden, nach dem Verfahren von Utsami et al., (1993, Mol. Reprod. Devel. 36: 238). Die Antikörper können reversibel das Wachstum von männlichen, jedoch nicht weiblichen Embryos verzögern, bei Verwendung eines Anti-Männchen-Antikörpers oder umgekehrt, bei Verwendung eines Anti-Weibchen-Antikörpers. Diese Antikörper können verwendet werden mit oder ohne Additive, z.B. mit Komplement zur irreversiblen Unterdrückung oder zum Töten der Embryos eines Geschlechts, wobei im Wesentlichen reine Kulturen des anderen Geschlechts verbleiben. Dieses Verfahren erlaubt ferner die manuelle Abtrennung.
c) Magnetische Kügelchenmarkierung. In diesem Verfahren werden Embryos in Kontakt gebracht mit im Handel verfügbaren, mikroskopisch kleinen magnetischen Kügelchen, die beschichtet sind mit geeigneten Antikörpern (z.B. Olsacker et al., 1993, Anim. Genet. 24: 311), in diesem Fall, entweder mit männchenspezifischen oder weibchenspezifischen Antikörpern. Magnetische Kügelchen beschichtet mit im Handel erhältlichem Ziege-Anti-Kanichen-Immunglobulin kann zu Embryos hinzugefügt werden, die zuvor mit männchenspezifischen oder weibchenspezifischen Antikörpern in Kontakt gebracht wurden. Alternativ können die Kügelchen beschichtet sein, beispielsweise mit Anti-Kaninchen-Immunglobulin und dann mit männchenspezifischen Antikörpern und direkt in eine Suspension der Embryos in eine geeignete Glasschale eingebracht werden. Da die geschlechtsspezifischen Proteine auf der epithelialen Zelloberfläche vorhanden sind, werden männliche Embryos an den männchenspezifischen Antikörpern auf den Kügelchen binden, wohingegen weibliche Embryos nicht binden. Die Kügelchen und angehefteten Embryos werden dann an die Seite der Schale mit Hilfe eines Magneten gezogen. Im Handel erhältliche brauchbare Kombinationen des zweiten Antikörpers und Avidin-Biotin verstärkte magnetische Kügelchen können ferner verwendet werden.

Das Geschlecht der abgetrennten Embryos kann mit Hilfe bekannter Verfahren, wie chromosomale Analyse und/oder durch DNA Verfahren bestätigt werden.
Spermienzellmembranproteine enthalten Moleküle, die mit männchenspezifischen oder weibchenspezifischen Antikörpern mit Hilfe des Verfahrens der Erfindung hergestellt werden. Die Anti-Männchen und Anti-Weibchen-Antikörper reagierten mit unterschiedlich großen Proteinen. Die Proteine, die mit dem männchenspezifischen Antikörper reagierten, schließen ein Protein ein, das die gleiche Größe (etwa 60 Kilodalton), wie das Hauptmolekül, das in gereinigten männlichen fötalen und embryonalen Proteinpräparationen (1) identifiziert wurde. Der weibliche Antikörper reagiert in ähnlicher Weise mit einem Molekül einer Größe, das in weiblichem Gewebe gefunden wird. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die unterschiedlichen Moleküle, männchenspezifisch und weibchenspezifisch, vorzugsweise in den zwei Klassen von Spermien Y bzw. X eingeordnet sind.
Deshalb lehrt der Erfinder ferner ein Verfahren zur Abtrennung Männchen und Weibchen bestimmenden Spermien, von natürlichen Spermien, welches umfasst das Inkubieren von natürlichen Spermien mit einem oder mehreren Antikörpern gegen ein geschlechtsspezifisches Molekül, das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurde unter Ausbildung von Konjugaten zwischen Männchen oder Weibchen bestimmenden Spermien und den Antikörpern und Isolieren der Konjugate und Spermien, die nicht an die Konjugate gebunden haben. Die in dem Verfahren verwendeten Antikörper können die Antikörper gegen die geschlechtsspezifischen Moleküle, identifiziert in adulten, fötalen und embryonalen Zellen und Geweben sein oder sie können Antikörper gegen männchen und weibchenspezifische Moleküle, isoliert aus Spermienzellplasamembran-Präparationen, sein.
Die Antikörper gegen X- oder Y spezifische Antigene können an X- bzw. Y-Spermien binden und inaktivieren und sie können verhindern, dass sie eine Eizelle befruchten. Die Spermiumzellen, die nicht durch die Antikörper gebunden sind, können lebensfähig und aktiv bleiben zur Befruchtung der Eier. Somit stellt die Erfindung ein Verfahren bereit zur Herstellung einer Samenprobe angereichert an aktiven X- oder Y-Spermien und somit fähig zur Erhöhung der Wahrscheinlichkeit, dass Nachkommen ein gewünschtes Geschlecht aufweisen oder ein Gen für Geschlechtschromosom-gekoppelte Eigenschaften tragen werden oder nicht.
Das Magnetkügelchenverfahren (z.B., wie beschrieben von Olsaker et al., 1993, vorstehend) kann verwendet werden zum Abtrennen mutmaßlicher X- von Y-Spermien. Die Kügelchen beschichtet beispielsweise mit männchenspezifischen Antikörpern können eingebracht werden in eine Suspension der Spermienzellen, in einer geeigneten Glasschale. Da die geschlechtsspezifischen Proteine in den Spermienzellplasmamembranen vorhanden sind, binden die Y-Spermienzellen an den männchenenspezifischen Antikörper an den Kügelchen, wohingegen die X-Spermien nicht binden. Die Kügelchen werden dann an die Seite der Schale mit Hilfe eines Magneten gezogen. Spermiumzellen der zwei Klassen werden gewonnen, die sich an die Kügelchen (Y) anlagern und solche, die sich nicht anlagern (X).
Das folgende Verfahren kann ferner verwendet werden zur Abtrennung der männlichen und weiblichen bestimmenden Spermatozoen. Eine natürliche Spermium-Präparation kann mit einem ersten Antikörper in Kontakt gebracht werden, der männchenspezifische Moleküle bindet. Das in Kontakt gebrachte Spermium kann zusammen mit einem Konjugat eines zweiten Antikörpers suspendiert werden, der ausschließlich an den ersten Antikörper und an ein immunabsorbierendes Substrat in einem proteinfreien Verdünnungsmittel bindet, unter Bildung einer Konjugat/Spermium-Präparation, wodurch die männlichen Spermien an das Substrat gebunden werden. Die männlichen Spermien können dann vom Substrat durch spezifische Bindung des Substrats wiedergewonnen werden.
Die Verfahren zur Abtrennung männlicher und weiblicher Spermien, wie hier beschrieben, verringert die Schädigung der Spermien durch mechanische Handhabung, so dass die Spermien eine erhöhte Lebensfähigkeit besitzen. Die Verfahren sind ferner nicht-invasiv; sie erfordern keine chemische Bindung an zelluläre interne Strukturen; sie umfassen minimale Manipulation; sie sind kostengünstig; es gibt minimale Erfordernisse für die Ausrüstung oder Instrumente; und sie werden leicht durch den Fachmann ausgeführt.
Die Antikörper gegen geschlechtsspezifische Moleküle, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurden, können ferner verwendet werden zum Steuern des Geschlechtes der Nachkommen in vivo. Beispielsweise können Weibchen gegen X-Spermien, Y-Spermien oder beide, mit Hilfe von Impfstoffen, enthaltend die geschlechtsspezifischen Antigene, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurden, immunisiert werden, so dass sich die Wahrscheinlichkeit eines bestimmten Geschlechts erhöht oder die gesamte Fruchtbarkeit abnimmt. Das Geschlecht der Nachkommen eines Tieres (vorzugsweise Säugetier) kann gesteuert werden zur Erzeugung von mehr Weibchen oder Männchen, durch Einbringen von Antikörpern gegen männchenspezifische Moleküle bzw. weibchenspezifische Moleküle und Komplement in die Gebärmutter eines schwangeren Tieres zum Töten männlicher oder weiblicher Embryonen.
Antikörper gegen ein Epitop eines geschlechtsspezifischen Moleküls, das mit den erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurde, kann ferner mit einem Cytotoxin konjugiert werden, das Spermien inaktiviert. Somit kann das Cytotoxin spezifisch gegen Spermien gerichtet sein. Diese Präparationen können daher als Verhütungsmittel brauchbar sein. Antikörper gegen männchen- und weibchenspezifische Moleküle, die mit den hier beschriebenen Verfahren identifiziert wurden, können ferner als Verhütungsmittel durch in Kontakt bringen von Spermien, sowohl mit Anti-Weibchen- als auch mit Anti-Männchen-Antikörper gepulst sein. Anti-Sense-Sequenzen gegen männchen und weibchenspezifische Moleküle können ferner als Verhütungsmittel brauchbar sein.
Die geschlechtsspezifischen Moleküle, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurden, können ferner verwendet werden zum Nachweis der Anwesenheit von Antikörpern spezifisch gegen die geschlechtsspezifischen Moleküle in einer Probe.
Die spezifischen Antikörper, spezifisch für die geschlechtsspezifischen Moleküle, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurden, sind ferner im medizinischen Bereich zur Verhinderung von tödlichen geschlechts-gekoppelten genetischen Erkrankungen im Mensch bedeutend. Beispielsweise können die weibchenspezifischen Antikörper verwendet werden zur Herstellung einer Samenprobe, die in aktive X- oder Y-Spermien angereichert sind und somit wird die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass Nachkommen ein Gen für eine Geschlechtschromosom-gekoppelte Eigenschaft tragen oder nicht tragen werden.
Nicht-geschlechtsspezifische Moleküle, die mit den hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurden, und Antikörper gegen ein Epitop dieser nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle, können als spezies-spezifische, allelische Marker verwendet werden. Beispielsweise können die Moleküle und Antikörper zum Nachweis der Kontamination der Gewebekultur mit einer nicht-identifizierten Zelle verwendet werden und sie können in somatischen Zellstudien verwendet werden zur Identifizierung von Mensch- und/oder Mauschromosomen.
Die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Verfahren zur Isolierung geschlechtsspezifischer Moleküle
Herstellung von Antikörpern
Antikörper wurden in diese New Zealand White Kaninchen erzeugt, die durch teilweise Inzucht erhalten wurde. Nach der Entnahme von Präimmun-(Negativkontrolle)Serumproben wurden 4 Kanichen (2 Männchen und 2 Weibchen) für jede Serie von Antikörpern mit Männchen oder Weibchen-Rindermaterial immunisiert, zur Herstellung der folgenden 4 Typen von Antiserum (siehe Tabelle 1, nachstehend): Weibchen-Kaninchen-Anti-Männchen-Rind (bezeichnet als α), Weibchen-Kaninchen-Anti-Weibchen-Rind (β), Männchen-Kaninchen-Anti-Männchen-Rind (γ) und Männchen-Kaninchen-Anti-Männchen-Rind (δ). Die Antiseren wurden durch Blutungen der Kaninchen gesammelt. Nach der Charakterisierung durch ELISA wurden die Antiseren durch Dialyse äquilibriert.
TABELLE 1: BEZEICHNUNG DER ANTISERUM-TYPEN
Herstellung von Antigen
Adultes und fötales Rinder-Material wurde von einem Schlachthof erhalten. Embryo-Material wurde von in vitro befruchteten (IVF) Embryos oder in vivo ausgespülten Embryos hergestellt.
Plasmamembran-Präparationen wurden von Männchen und Weibchen adulter oder fötaler Leber, Milz, Niere und Geschlechtsdrüsenmaterial oder Gesamtblastozysten hergestellt. In frühem fötalen Material, in dem das Geschlecht durch äußere Untersuchung nicht offensichtlich ist, und in Embryonenmaterial wurde das Geschlecht durch cytogenetische Analyse diagnostiziert, mit Hilfe von Techniken entwickelt von King et al, (1979, Vet Sci. Commun, 3: 51) oder mit Hilfe einer Y-Chromom-spezifischen DNA-Sonde (Wildeman, Universitiy of Guelph, Guelph, Kanada, 1995).
Plasmamembran-Präparationen wurden solubilisiert und durch Dialyse für ein Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) System äquilibriert. Säulen wurden für die Affinitätschromatographie hergestellt mit Hilfe von Ultra-Affinitäts-Silica-Träger-Säulen (Beckman) und als Liganden, präimmunes männliches und weibliches Kaninchenserum und IgG Fraktionen von Antiseren β (Weibchen-Anti-Weibchen) und δ (Männchen-Anti-Männchen). Die solubilisierten und äquilibrierten rohen Antigen-Präparationen wurden aufeinanderfolgend durch die Präimmun-säule, und β und/oder δ Säulen geschickt. Das Totvolumen enthielt die geschlechtsspezifischen Antigenkomponenten. Das ligandengebundene Material umfasst nicht-geschlechtsspezfische Komponenten, die eluiert werden können. Geschlechtsspezifische und nicht-geschlechtsspezifische Fraktionen wurden durch Tris-gepufferte Saline durch Dialyse reäquilibriert und dann wieder konzentriert. Die eluierten und wiederhergestellten nicht-geschlechtsspezifischen Fraktionen können verwendet werden zur Immunisierung von Tieren, z.B. Kaninche, zur Herstellung verbesserter Antiseren gegen nicht-geschlechtsspezifische Komponenten von natürlichem Antigen. Diese Antiseren bezeichnet mit ββ und δδ, sind dahingehend verbessert, dass sie keine Antikörper gegen geschlechtsspezifische Moleküle enthalten, jedoch Antikörper gegen nicht-geschlechtsspezifische Moleküle enthalten. Im Gegensatz dazu, obwohl β und δ Typ Seren vor allem nicht-geschlechtsspezifische Antikörper enthalten, könnten sie einige geschlechtsspezifische Antikörper in dem Umfang enthalten, dass das geschlechtsspezifische Antigen, obwohl evolutionär hochkonserviert, sich dennoch leicht zwischen den Spezies unterscheiden kann.
Geschlechtsspezifische Antigen-Präparationen wurden durch eine Gelfiltrationssäule (Sephadex G-200) passiert. Die Peakfraktion wurde erneut durch die β und δ Säulen geschickt und dann rekonzentriert. In einigen Experimenten wurde ferner die Probe durch eine DEAE-Anionenaustausch-Säule geschickt, die dann eluiert wurde. Das Eluat wurde konzentriert und durch ELISA, SDS-PAGE und Western Blotting untersucht. α und δ Antiseren wurden ferner durch Umsetzung mit weiblichem bzw. männlichem Antigen gereinigt.
BEISPIEL 2
Nach der Affinitätschromatographie und Gelfiltrationsverfahren von adultem oder fötalem Material, wie beschrieben in Beispiel 1, wurden mutmaßliche geschlechtsspezifische Männchen und weibchenspezifische Moleküle erhalten, d.h. Moleküle von spezifischer Größe, wie in der 1D Elektrophorese beobachtet, die ausschließlich in den aufgereinigten männlichen Proben vorhanden sind und andere, die ausschließlich in den weiblichen Proben sind (1, links). Es wird auf das ~60 KD männchenspezifische Molekül in 1 hingewiesen.
Antikörper gegen teilweise gereinigte männliche und weibliche Proben wurden erzeugt. Mit Hilfe gereinigter Antikörper erzeugt gegen adultes Material, können fötale Antigene identifiziert und verwendet werden zur Erzeugung von anti-fötalen-Antikörper, mit denen embryonale Antigene isoliert wurden. Die anti-adulten Antikörper regierten stärker mit dem adulten Material als mit fötalem Material. Entsprechende Unterschiede traten beim Stadium des Föten zur Blastozyste auf. Somit kann das Erzeugen von Antikörper gegen embryonale Proteine eine Antigen-Antikörper Reaktion mit größerer Spezifität als die bisher erreichte bereitstellen. Vorläufige Hinweise aus Western Blott-Versuchen legen ferner nahe, dass die Anti-Männchen-Antikörper und Anti-Weibchen-Antikörper, die Anwesenheit ihrer entsprechenden Antigene in extrahierten Spermaproteinen nachweisen.
Die geschlechtsspezifischen Moleküle werden in den SDS-PAGE Gelen reproduzierbar identifiziert und werden aus Gelen für weitere Studien durch zweidimensionale Elektrophorese und Western Blot extrahiert, zur Feststellung, ob die Einzelbande, die in der 1D Elektrophorese beobachtet wird ein oder mehrere geschlechtsspezifische Moleküle enthält. Einzelne geschlechtsspezifische Moleküle werden verwendet zur Erzeugung monospezifischer Antikörper und zur Aminosäuresequenzierung zum Ableiten einer Nucleotidsequenz für PCR Experimente.
BEISPIEL 3
Die hier beschriebene Technik der Geschlechtsbestimmung von Embryos verwendet Antikörper, die gerichtet sein können gegen spezifische Moleküle im Embryo, im Wesentlichen in der gleichen Art, wie Antikörper gegen infektiöse Bakterien den Körper verteidigen, durch „Abzielen" auf Bakterienmoleküle. Antikörper, die männchenspezifische Moleküle in männlichen Embryos identifizieren, und weitere Antikörper, die weibliche Moleküle in weiblichen Embryos erkennen, sind entwickelt worden. X- und Y-tragende Spermiumzellen können weibchen- bzw. männchenspezifische Moleküle enthalten und sie können mit diesen Antikörpern reagieren. Western-Blot-Techniken erlauben die Untersuchung, zum Bestimmen, ob eine Präparation von Spermiumprotein-Molekülen irgendwelche Moleküle enthält, die mit männchenspezifischen oder weibchenspezifischen Antikörpern reagieren, die in Übereinstimmung mit der Erfindung. Spermiumplasmamembran wird isoliert aus frisch gesammeltem Stierejakulat hergestellt wurden. Mit Hilfe der Stickstoffkavitation (nitrogen cavitation), mit nachfolgender Hochdruckeinwirkung und explosiver Dekompression, zur Entfernung der Membranen. Nach Homogensierung und Solubilisierung wird das Material elektrophoretrisch aufgetrennt und mit Standardmethoden auf Nitrozellulose übertragen. Western Blotting wird mit Antikörpern des α- und γ-Typs ausgeführt.
In vorläufigen Experimenten mit männlichen, fötalen und Embryonenprotein-Präparationen Hilfe nur teilweise gereinigter Präparationen zeigen die Ergebnisse, dass es Spermiumproteine gibt, die mit beiden Typen von Antikörpern reagieren. Ferner reagieren die männchen- und weibchenspezifischen Antikörper mit unterschiedlich großen Proteinen. Weiterhin schließen die Proteine, die mit dem männchenspezifischen Antikörper reagieren, ein Protein ein, das die gleiche Größe (ungefähr 60 Kilodalten), wie das in gereinigten männlichen, fötalen und Embryonenprotein-Präparationen identifizierte Hauptmolekül hat (siehe 1 und Beispiel 2). Der weibliche Antikörper reagiert in ähnlicher Weise mit einem Molekül einer Größe, die im weiblichen Gewebe gefunden wird. Diese anfänglichen Ergebnisse legen nahe, dass die unterschiedlichen Moleküle, männchenspezifische und weibchenspezifische, in zwei Klassen von Y bzw. X-Spermium, vorzugsweise angeordnet sein können.
Zur Bestätigung, dass der Antikörper gegen männliche Moleküle an die Y-tragenden Spermien und der weibliche Antikörper an das X-Spermium bindet, wird ein etabliertes DNA-Geschlechtsbestimmungsverfahren (Dr. Alan Wildeman, Universitiy of Guelph, 1995) modifiziert zur Verwendung mit Spermiumzellen. Ein Verfahren ist entwickelt worden zur Verteilung von Spermiumzellen auf einem Träger in einer für die in situ Hybridisierung geeigneten Weise mit Hilfe einer Y-Chromosom-spezifischen Sonde, von Immunozytochemie mit Hilfe von Antikörpern gegen die geschlechtsspezifischen Moleküle, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurden.
BEISPIEL 4
In vorläufigen Experimenten wurde gefunden, dass Anti-Männchenspezifische-Antikörper die Entwicklung von männlichen Embryos hemmen und dass Anti-Weibchen-Antikörper die Entwicklung von weiblichen Embryos hemmen. Es erscheint, dass wenn Anti-Männchen-Antikörper 80% Diagnose erreichen, dann sollte das Anti-Weibchen-Serum fähig sein, 80% des verbleibenden Teils im Geschlecht zu bestimmen, was eine Gesamterfolgsrate von etwa 96% ergibt.
BEISPIEL 5
Die Antikörper, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, werden verwendet zur Entwicklung eines Verfahrens zur Abtrennung der zwei Klassen von Spermienzellen. Ein etabliertes Verfahren zum Abtrennen von Zellen durch Verwendung von Antikörpern, wird wie nachstehend verwendet. Im Handel erhältliche, mikroskopisch kleine Magnetkügelchen werden mit den geeigneten Antikörpern beschichtet (Olsaker et al., 1993, Anim. Genet. 24: 311), in diesem Fall, entweder männchenspezifische, weibchenspezifische oder nicht-geschlechtsspezifische Antikörper (oder mit sekundärem Antikörper, z.B. Ziege-Anti-Kaninchen IgG). Die Kügelchen beispielsweise mit einem männchenspezifischen Antikörper beschichtet, werden in eine Suspension der Spermienzellen in eine geeignete Glasschale eingebracht. Da die geschlechtsspezifischen Proteine auf der Zelloberfläche vorhanden sind, werden dann die Y-Spermienzellen an den männchenspezifischen Antikörper auf den Kügelchen binden, wohingegen die X-Spermien nicht binden werden. Die Kügelchen werden dann, mit Hilfe eines Magneten an die Seite der Schale gezogen. Spermienzellen der zwei Klassen werden gewonnen als Gene, die an die Kügelchen (Y) anlagern und jene die sich nicht anlagern (X).
Spermienproteine, die aus den äußeren Zellmembranen der Spermienzellen durch ein Standardverfahren extrahiert werden, werden zur Isolierung der männchen- und weibchenspezifischen Moleküle gereinigt, nach dem Verfahren, wie in Beispiel 1 beschrieben. Wie in Beispiel 1 ausgeführt, basiert das Verfahren auf der Verwendung von Antikörpern, die die nicht-geschlechtsspezifischen Proteine entfernen und damit die geschlechtsspezifischen Proteine intakt belassen. Antikörper gegen diese aufgereinigten Spermienproteine werden dann hergestellt; es wird angenommen, dass solche Antikörper spezifischer wirken beim Nachweis der unterschiedlichen Spermienzellen, als solche Antikörper, die von fötalen (oder embryonalen) geschlechtsspezifischen Molekülen erzeugt werden.
Die gleichgeschlechtlichen Seren, beta (β) und delta (δ) werden verwendet zur Entfernung der nicht-geschlechtsspezifischen Proteine. Diese Seren können dieses erreichen auf Grund der Art, in der sie hergestellt werden. Wenn Rindergewebe in ein Kaninchen eingespritzt wird, produziert das Kaninchen Antikörper gegen viele der Moleküle in dem Rindergewebe, weil das Kaninchenimmunsystem „fühlt", dass diese Moleküle fremd für das Kaninchen sind. Allerdings sind die Moleküle, die die Geschlechtsentwicklung kontrollieren, in allen Säugetieren ziemlich ähnlich, so dass ein Weibchen-Kaninchenimmunsystem nicht Rinder-weibliche Geschlechtsmoleküle als fremd behandelt und nicht effizient Antikörper herstellen wird gegen diese Proteine. Daher wird das Serum in einem weiblichen Kaninchen durch Einspritzen von weiblichem Rindermaterial Antikörper enthalten gegen sämtliche Rinder-Moleküle, die nicht-geschlechtsspezifisch sind, aber wenige, wenn überhaupt, Antikörper gegen geschlechtsspezifische Proteine. Wenn das Serum dann in Kontakt gebracht wird mit frisch hergestelltem weiblichem Gewebe, werden die nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle in diesem Gewebe an die Antikörper binden und belassen die geschlechtsspezifischen Moleküle ungebunden. Mit Hilfe des Verfahrens der Affinitätschromatographie können die gebundenen Moleküle entfernt werden und belassen die weibchen-geschlechtsspezifischen Proteine für die weitere Reinigung, für das Verfahren der Gelfiltration. In ähnlicher Weise werden bei Verwendung von Antikörpern, erzeugt durch männliches Gewebe in einem männlichen Tier aufgereinigte männchenspezifische Antigene erhalten.
Die gereinigten männchen- und weibchenspezifische Proteine erhalten aus Spermienprotein, werden zur Erzeugung neuer spezifischer Antikörper verwendet. Es wird erwartet, dass diese wirksam sind in dem Spermien-Abtrennungsverfahren.
Spermienzellen abgetrennt durch das Verfahren der magnetischen Mikrokügelchen, wie oben beschrieben, werden untersucht auf Wirksamkeit bei der Abtrennung. Zuerst wird dieses durchgeführt werden durch die in situ Hybridisierungs-Technik (DNA-Sonde). Wenn eine gute Abtrennung erreicht wird, wie durch dieses Mittel beurteilt, wird eine in vitro Befruchtung durchgeführt. Schließlich wird künstliche Befruchtung, als ein Feldversuch der Wirksamkeit des Verfahrens, durchgeführt.
BEISPIEL 6
Identifizierung der Epitope, die durch MHC Klasse II Moleküle präsentiert werden
Makrophagen oder Monocytenzellen werden aus Kaninchen geerntet und eine Kurzzeitzellkultur wird eingerichtet. Nach Konfluenz der Zellen wird die Kultur mit männlichem oder weiblichem Antigen gepulst. Nach der Prozessierung und Präparation der immundominanten Epitope, werden die Zellen geerntet und die Plasmamembran-Präparationen werden hergestellt. Da die Verbindung zwischen präsentierendem Antigen und den Antigen-präsentierenden Zellmembran MHC Molekülen sehr stabil ist (Jensen, PE, J. Immunol. 143: 420, 1989) können die präsentierten immundominanten Epitope auf diesem Weg erhalten werden. Nach dem SDS-PAGE und dem Western Blotting, werden α- oder γ-Antiseren verwendet zur Identifizierung der geschlechtstypischen Moleküle, die parallel aus Gelen extrahiert und eluiert werden.
BEISPIEL 7
Antiseren des γ (Gamma) Typs (d.h. Antiseren gegen weibliche Rinder-Antigen-Moleküle, erzeugt in männlichen Kaninchen) wurden verwendet in Verbindung mit im Handel erhältlichem Komplement, zum selektiven Töten der weiblichen Embryonen und unter Erhalt einer reinen Kultur der Männchen. In einigen Experimenten wurde ferner das Enzym Pronase verwendet, zur Untersuchung, ob das Enzym die Passage des Antikörpers und/oder Komplements durch die Zona pellucida ermöglicht, eine Deckmembran, die den Embryo in den untersuchten Stadien umgibt. Es erschien, dass Pronase keine Wirkung hatte und daher wurden die Ergebnisse der Experimente mit und ohne Pronase zusammengefasst. Ferner wurden Kontrollexperimente durchgeführt.
In den zusammengefassten Daten der Experimente, wurden männliche Embryos erhalten, in denen das Geschlecht durch Chromosomen-Analyse bestimmt war, waren 120 von 129 der aufeinanderfolgend untersuchten Embryos Männchen. Dies ergibt eine korrekte Prognoserate von etwa 93%. Der Binomialsatz stellt ein standardstatistisches Verfahren zur Bestimmung der Wahrscheinlichkeit bereit, ein solches Ergebnis allein durch Zufall zu erhalten.
Die Daten zeigen, wie das Verfahren der Erfindung es ermöglicht, die geschlechtsspezifischen Moleküle zu isolieren, spezifische Antikörper gegen diese Moleküle herzustellen und diese Antikörper zur Selektion von Embryos nach Geschlecht zu verwenden.
BEISPIEL 8
Antiseren des γ (Gamma) Typs wurden zur Auswahl von Y-tragenden Spermienzellen verwendet. Spermien wurden in serumfreien in vitro Kulturmedium suspendiert und mit dem Antikörper in Kontakt gebracht. Nach der Behandlung wurde der Samen durch ein Glaswollefilter filtriert und die Spermien in dem Filtrat wurden verwendet zur Durchführung von in vitro Befruchtung. Nach Kultur wurde das Geschlecht des erzeugten Embryos durch cytogenetische Analyse bestimmt. Diese Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Die erfolgreichen Ergebnisse mit Spermien wurden mit Hilfe von drei unterschiedlichen γ-Antikörpern erhalten. Die Erfolgsrate ist 93%. Wenn man das abweichende Experiment (#4) ausschließt, so ist sie 97%.

Claims

Verfahren zum Abtrennen geschlechtsspezifischer Moleküle von nicht-geschlechtsspezifischen Molekülen, die an Membranen von Tierzellen gebunden sind, umfassend (a) Bereitstellen von Anti-Weibchen-Antikörpern, hergestellt durch Immunisieren weiblicher Tiere einer ersten Tierspezies mit Zellmembranfraktionen, die aus Zellen oder Geweben von Weibchen einer zweiten Tierspezies gewonnen sind; (b) Behandeln einer Zellmembranfraktion aus adulten, fötalen oder embryonalen Tierzellen oder -geweben männlichen Geschlechts mit ein oder mehreren Anti-Weibchen-Antikörpern, die dann an nicht-geschlechtspezifische Moleküle in der Zellmembranfraktion binden, so dass man Konjugate zwischen den nicht-geschlechtsspezifischen Molekülen und den Antikörpern erhält; (c) Abtrennen des Materials in der Zellmembranfraktion, das nicht an die Antikörper bindet, wobei man eine Subfraktion gewinnt, die geschlechtsspezifische Moleküle enthält; (d) Isolieren der geschlechtsspezifischen Moleküle in der Subfraktion und (e) wahlfrei Abtrennen der Antikörper von den Konjugaten, wobei man eine zweite Subfraktion gewinnt, die nicht-geschlechtsspezifische Moleküle enthält, und Isolieren der nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle in der zweiten Subfraktion.
Verfahren zum Abtrennen geschlechtsspezifischer Moleküle von nicht-geschlechtsspezifischen Molekülen, die an Membranen von Tierzellen gebunden sind, umfassend (a) Bereitstellen von Anti-Männchen-Antikörpern, hergestellt durch Immunisieren männlicher Tiere einer ersten Tierspezies mit Zellmembranfraktionen, die aus Zellen oder Geweben von Männchen einer zweiten Tierspezies gewonnen sind; (b) Behandeln einer Zellmembranfraktion aus adulten, fötalen oder embryonalen Tierzellen oder -geweben weiblichen Geschlechts mit ein oder mehreren Anti-Männchen-Antikörpern, die dann an nicht-geschlechtspezifischen Moleküle in der Zellmembranfraktion binden, so dass man Konjugate zwischen den nicht-geschlechtsspezifischen Molekülen und den Antikörpern erhält; (c) Abtrennen des Materials in der Zellmembranfraktion, das nicht an die Antikörper bindet, wobei man eine Subfraktion gewinnt, die geschlechtsspezifische Molekülen enthält; (d) Isolieren der geschlechtsspezifischen Moleküle in der Subfraktion; und (e) wahlfrei Abtrennen der Antikörper von den Konjugaten, wobei man eine zweite Subfraktion gewinnt, die nicht-geschlechtsspezifische Moleküle enthält, und Isolieren der nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle in der zweiten Subfraktion.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zellmembranfraktion aus Zellmembranen von Rinderzellen gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Zellmembranfraktion eine Membranfraktion ist der Plasmamembran, der inneren Membran, der Mitochondrienmembran oder der Membran des endoplasmatischen Retikulums.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zellmembranfraktion eine aus Spermium gewonnene Plasmamembranfraktion ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die erste und die zweite Tierspezies so gewählt sind, dass die erste Tierspezies im Wesentlichen keine Antikörper gegen geschlechtsspezifische Moleküle der zweiten Tierspezies bildet.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die erste und die zweite Tierspezies ausgewählt werden aus der Gruppe Schafe, Ratten, Mäuse, Pferde, Kühe, Ziegen und Geflügel.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die erste Tierspezies Kanninchen und die zweite Tierspezies Rind ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Antikörper insolubilisiert ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, das zudem das Herstellen von Antikörpern mit einer Spezifität gegen ein Epitop des geschlechtsspezifischen Moleküls umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Präparation, die in nicht-geschlechtsspezifischen Weibchenmoleküle angereichert ist, umfassend (a) Bereitstellen von Anti-Weibchen-Antikörpern, hergestellt durch Immunisieren von weiblichen Tieren einer ersten Tierspezies mit Zellmembranfraktionen, die aus Zellen oder Geweben von Weibchen einer zweiten Tierspezies gewonnen sind; (b) Umsetzen der Anti-Weibchen-Antikörper mit einer Zellmembranfraktion, die aus einem weiblichen Tier einer zweiten Tierspezies gewonnen wird, so dass man Antikörper-Antigen-Konjugate erhält; (c) Abtrennen der Antigene von den Konjugaten und Immunisieren eines männlichen Tiers der ersten Tierspezies mit den abgetrennten Antigenen, so dass man Anti-Weibchen(zweite Tierspezies)-Antikörper im Männchen der ersten Tierspezies erhält; (d) Isolieren der Anti-Weibchen(zweite Tierspezies)-Antikörper des Männchens der ersten Tierspezies; (e) Umsetzen der isolierten Antikörper mit einer Zellmembranfraktion, die von einem Männchen der zweiten Tierspezies gewonnen wird, so dass man Konjugate erhält zwischen den isolierten Antikörpern und nicht-geschlechtsspezifischen Weibchenmolekülen in der Zellmembranfraktion; und (f) Abtrennen der nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle von den Konjugaten.
Verfahren zur Herstellung einer Präparation, die in nicht-geschlechtsspezifischen Männchenmolekülen angereichert ist, umfassend (a) Bereitstellen von Anti-Männchen-Antikörpern, hergestellt durch Immunisieren von männlichen Tieren einer ersten Tierspezies mit Zellmembranfraktionen, die aus Zellen oder Geweben von Männchen einer zweiten Tierspezies gewonnen sind; (b) Umsetzen der Anti-Männchen-Antikörper mit einer Zellmembranfraktion, die aus einem männlichen Tier einer zweiten Tierspezies gewonnen wird, so dass man Antikörper-Antigen-Konjugate erhält; (c) Abtrennen der Antigene von den Konjugaten und Immunisieren eines weiblichen Tiers der ersten Tierspezies mit den abgetrennten Antigenen, so dass man Anti-Männchen(zweite Tierspezies)-Antikörper im Weibchen der ersten Tierspezies erhält; (d) Isolieren der Anti-Männchen(zweite Tierspezies)-Antikörper des Weibchens der ersten Tierspezies; (e) Umsetzen der isolierten Antikörper mit einer Zellmembranfraktion, die von einem Weibchen der zweiten Tierspezies gewonnen wird, so dass man Konjugate erhält zwischen den isolierten Antikörpern und nicht-geschlechtsspezifischen Männchenmolekülen der zweiten Tierspezies in der Zellmembranfraktion; und (f) Abtrennen der nicht-geschlechtsspezifischen Moleküle von den Konjugaten.
Verwendung nicht-geschlechtsspezifischer Moleküle, die gemäß dem Verfahren nach Anspruch 11 oder 12 identifiziert werden können, zum Nachweis von Verunreinigungen von Gewebekulturen mit einer nicht identifizierten Zelle, oder in somatischen Zellstudien, zum Identifizieren von Mensch- und/oder Mauschromosomen.