DE3218269A1

DE3218269A1 - Verfahren zur herstellung von monoklonalen antikoerpern gegen prostaglandine und die verwendung der antikoerper zur bestimmung der prostaglandine

Info

Publication number: DE3218269A1
Application number: DE19823218269
Authority: DE
Inventors: Kay Prof. Dr. 8521 Marloffstein Brune; Wolf Dieter Dipl.-Chem. Dr. 5600 Wuppertal Busse; Rudi Dipl.-Biol. Dr. 5650 Solingen Grützmann; Mithat Dipl.-Chem. Dr. Mardin
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1982-05-14
Filing date: 1982-05-14
Publication date: 1983-11-17

Description

Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern
gegen Prostaglandine und die Verwendung der Antikörper zur Bestimmung der Prostaglandine Die vorliegende Erfindung betrifft neue monoklonale Antikörper gegen Prostaglandine, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Diagnostika zur Bestimmung von Prostaglandinen, bevorzugt von 6-Keto-Prostaglandin-F1 (6-Keto-PGF1 ) oder Prostaglandin-F2 (PGF2 & ) mittels immobilisierter, monoklonaler Antikörper.
Für die Entwicklung radioimmunologischer Tests zur quantitativen Bestimmung von Prostaglandinen (PGs) sind Antikörper (Ak) entsprechender Spezifität die Voraussetzung.
In konventionellen Radioimmunoassays werden Antiseren (AS) verwendet, die immer ein Gemisch von AK enthalten, welche mehr oder weniger stark mit einer Reihe strukturverwandter PGs kreuzreagieren. Weiterhin unterscheiden sich Seren, die gegen dasselbe PG induziert wurden, hinsichtlich Avidität, Spezifität und Titer. Dies erschwert die Gewinnung von Antiseren gleicher Qualität, die Voraussetzung für die Standardisierung von Radioimmunoassays sind.
Zur Vermeidung dieser Probleme bestand eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, monoklonale Antikörper, im folgendem mAK genannt, mit Spezifität für Prostglandine mittels spezieller Hybridzellinien herzustellen.
Monoklonale Antikörper werden von Hybridzellen produziert, die clonalen Ursprungs sind. Das bedeutet, daß die Hybridzellen nur von einer einzigen Ursprungszelle abstammen. Die Klonierung eines Antikörper sezernierenden Lymphozyten erfolgt durch Hybridisierung einer Tumorzelle mit einem Antikörper-produzierenden Lymphozyten entsprechender Spezifität. Dadurch entstehen eine Hybridzelle, welche sowohl die Eigenschaften der Tumorzelle als auch die Eigenschaften des Lymphozyten besitzt. Die Eigenschaft der Tumorzelle besagt, auch in vitro permanent zu wachsen und die des Lymphozyten, den speziellen Antikörper dieses Lymphozyten permanent herzustellen und freizusetzen. Die Isolierung eines einzelnen Antikörper sezernierenden Lymphozyten und die Vermehrung derselben führt zu einem Zellklon. Da alle Lymphozyten eines solchen Zellklons Antikörper mit identischer Aminosäuresequenz - und daher mit identischer Spezifität - herstellen, werden diese auch "monoklonale Antikörper" genannt.
Gegenüber herkömmlichen Verfahren der Herstellung von Antiseren gegen Prostaglandine, z.B. durch Immunisierung von Spendertieren, besitzen die mAK-produzierenden Zelllinien den Vorteil, daß in Zellkultur und der Ascites- flüssigkeit Tumor tragender Mäuse große Mengen de sprechenden Antikörpers mit stets gleicher Spezifität hergestellt werden können.
Die so hergestellten mAK gegen Prostaglandine sind deshalb für analytische und diagnostische Verfahren unter Verwendung von bekannten Immunoassay-Verfahren besonders geeignet, da sie reproduzierbare und vergleichbare Bestimmungen mit unterschiedlichen Chargen ermöglichen und erheblich billiger in der Produktion sind.
Die Verwendung von Monoklonalen anti-Prostaglandin-AK in bekannten Radioimmunoassays, insbesondere die Verwendung in immobilisierter, an Plastikoberflächen gebundener Form für diagnostische Verfahren ist neu.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen Prostaglandine mittels klonierter Hybridzellen. Die Hybridzellen werden erfindungsgemäß hergestellt durch: A. Kovalente Kopplung der speziellen Prostaglandine, vorzugsweise 6-Keto-PG F1 4 oder PG F2 g , an ein Immunogen in wäßriger Lösung, B: wiederholtes Einbringen des Konjugates in ein Versuchstier, vorzugsweise eine Maus, besonders bevorzugt in eine BALB/c-Maus, C. anschließende Isolierung von Lymphozyten aus dem Versuchstier, bei der Maus vorzugsweise aus der Milz, Mischen von diesen mit Tumorzellen, in physiologischem Medium, D. Abtrennung des physiologischen Mediums und Fusionierung der Zellen, vorzugsweise mit Polyethylenglykol (PEG), mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 10 000, besonders bevorzugt 1500 bis 4000, E. Aufnahme des Fusionsgemisches in einem selektiven Kulturmedium und Aufbringen auf Kulturplatten in einer Konzentration bis zu 106 Zellen pro Vertiefung der Kulturplatte, F. Testen der überstände in den Vertiefungen, die Zellwachstum zeigen, nach bekannten Methoden auf Vorhandensein der gewünschten Antikörper G. Separierung der Zellen aus den Kulturen, welche wie im Test festgestellt die gewünschten Antikörper produzieren; Vermehrung von individuellen Zellen, d.h. Herstellung der Zellklone, und Entnahme der mAK aus den die Zellklone enthaltenden Gefäßen.
Als Immunogen wird vorzugsweise Protein, besonders bevorzugt Rinderserum-Albumin eingesetzt.
Als Tumor zellen werden solche der Thymidin-Kinase negativen Linie X 63, vorzugsweise P3 X 63-Ag 8 und P3-NF1/1-Ag4-1, besonders bevorzugt P3 X 63-Ag 8.653 eingesetzt.
Als selektives Kulturmedium wird vorzugsweise eins eingesetzt, welches als Zusätze Aminopterin und Hypoxanthin und Thymidin enthält.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten mAX als Diagnostika. Vorzugsweise werden die mAK als Diagnostika für spezielle Prostaglandine, besonders bevorzugt 6-Keto-PGF1iv und PG F2y verwendet.
Unter Diagnostika wird erfindungsgemäß verstanden der Nachweis und die Bestimmung (qualitativ und quantitativ) der Prostaglandine mit den entsprechenden mAK in den zu untersuchenden Probelösungen, insbesondere in Körperflüssigkeiten.
Unter kovalenter Kopplung im Sinne der vorliegenden Erfindung wird das Mischen bestimmter Prostaglandine, bevorzugt von PGF2jvoder 6-Keto-PGFl , mit einem immunogenen Trägermolekül, bevorzugt Rinderserumalbumin#, in wäßrigem Medium mit anschließender Verknüpfung dieser Moleküle nach bekannten Verfahren, vorzugsweise mit wasserlöslichem Carbodiimid, verstanden (K.T. Kirton, Radio-immunoassay of Prostaglandins, Ch-21, S 657).
Unter physiologischem Medium im Sinne der vorliegenden Erfindung werden besonders gepufferte Medien, besonders bevorzugt phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösungen (8g NaCl, 0,2 g KCl, 2.0 g Na2HPO4, 0,4 g KH2PO4 in 1 Liter destilliertem Wasser gelöst, pH 7,2 - 7,3), im folgendem PBS genannt, verstanden.
Unter selektivem Kulturmedium im Sinne der vorliegenden Erfindung werden Medien für die Zellkultur verstanden, in dessen nur Hybridzellen wachsen können, die aus der Fusion von Tumorzelle(n) und Lymphozyt(en) hervorgeganaen sind.
Insbesondere werden hierunter nach -der Methode von Littlefield (Littlefield, J.W. Science 145, 709 (1964)) hergestellte selektive Kulturmedien verstanden.
1. Herstellung der Anti-Prostaglandin-Antikörper-produzierenden Hybridzellinien Zur Zellfusionierung werden verwendet: 1. in vitro und in vivo wachsende Thymidin-Kinase negative murine Myelomzellen P 3 X 63-Ag 8 (Köhler, G. und Milstein, C.- Nature 256, 495, 1975) oder bevorzugt P 3- X 63-Ag 8.653 (Kearney, J.F., Radbruch, A., Liesegang, B., und Rajewsky, K.J., Immunol. 123, 1548 51979) oder andere geeignete Tumor zell in ien.
2. Lymophozyten, die nach Induktion einer Immunantwort in vitro (Selected Methods in Cell. Immunol., W.H.
Freeman and Co., 1980, Ed. B.B. Mishell and S.M.
Shiggi, pp. 28-68) oder in vivo, insbesondere Mäusen oder Ratten (Garbey, I.S., Cremer, N.E., und Sussdorf, D.H., eds., ch. 21-1, 26 und 30, in "Methods in Immunology", Benjamin/Cumming, London, Amsterdam, Ontario, Sydney, Tokyo (1977) gewonnen wurden.
Zur Induktion der Immunantwort werden Prostaglandine, die an immunogene Träger, insbesondere Makromoleküle, wie z.B.
Rinderserumalbumin oder andere Proteine, durch bekannte Vernetzungsverfahren (K.T. Kirton, Radioimmunoassay of Prostalandins, Ch. 21, p. 657) gekuppelt werden, eingesetzt.
Die Zellen werden nach bekannten Verfahren, insbesondere mit Polyethylenglykol (Hämmerling, G.J., Eur. J. Immunol. 7, 743 (1977), oder Sendai-Viren (Köhler, G., und Milstein, C. Nature, 256, 495 (1975)) fusioniert und die entstehenden Hybridzellen nach der Methode von Littlefield (Littlefield, J.W. Science 145, 709 (1964)) selektioniert.
Hybridzellen werden nach bekannten Verfahren, insbesondere durch begrenzte Verdünnung (Oi, V.T. und Herzenberg, L.A., in "Selected Methods in Cellular Immology", Mishell, B.B. und Shiigi, S.M., eds., pp. 366-368 (1980)) kloniert und in geeigneten Kulturmedien in Zellkultur kultiviert und expandiert. Ascitestumore werden durch intraperitoneale Injektion einer Zellsuspension in das PetrioneunyGon Tieren, insbesondere von Mäusen und Ratten (Conero, M., Polter M.J., J. Exp.
Med. 144, 1554 (1976)) induziert. Vor dem Einbringen der Hybridzellen wird den Tieren ein öl (a.a.O.) i.p. appliziert.
Die Antikörper befinden sich in den Zellkulturüberständen oder in der Ascites-Flüssigkeit Tumor-tragender Mäuse.
Aus diesen Flüssigkeiten werden die Antikörper isoliert.
2. Isolierung und Reinigung der monoklonalen Antikörper Die Zellüberstände oder die Ascitesflüssigkeit von Antikörper-sezernierenden Hybridomzellinien können durch bekannte Verfahren (Onone, K., Yagi, J., Grossberg A.L. und D. Pressman, Immunochem. 2. 401 (1965), insbesondere durch Ionenaustauscher - oder Affinitätschromatographie (March, S.C., Parik, 1. und Cuatrecasas, P., Anal. Biochem. 60, 149 (1974)) gereinigt werden.
3. Immunologische Bestimmung von Prostaglandinen unter Verwendung der monoklonalen Anti-Prostaglandin-Antikörper Die Bestimmung von Prostaglandinen erfolgt nach bekannten Verfahren: 1. Radioimmunoassay in Lösung: Zunächst werden Antikörper und radioaktives Prostaglandin, insbesondere 3H-6-Keto-PFG1α und 3H-PFG2α, in Lösung miteinander inkubiert. Im Falle eines Inhibitionstests wird zusätzlich ein Inhibitor, d.h. eine Lösung, die Prostaglandine in unterschiedlichen Konzentrationen enthält, mit Antiserum und Antigen inkubiert. Im zweiten Schritt der Reaktion wird dann das Prostaglandin, welches nicht an Antikörper gebunden ist, mit Aktivkohle oder einem den Antikörper bindenden Antiserum ausgefällt. Das Präzipitat wird abzentrifugiert und die Menge an radioaktivem Prostaglandin bestimmt, welche an Antikörper gebunden ist. Im Falle eines Inhibitionstests ist die Menge an Radioaktivität im Uberstand ein Maß für die Konzentration von kaltem Prostaglandin in der Probelösung (5. Sönksen, 1974 und Peskar, 1979).
2. Immunoabsorbenttest: Die monoklonalen Antikörper werden an geeigneten Matrixoberflächen, insbesondere Plastikmaterial adsorbiert, indem sie in gereinigter Form direkt durch elektrostatische, chemische, oder andere Wechselwirkungen an der Matrix zum Haften gebracht werden. In nicht gereinigter Form als Ascitesüberstand bzw. Zellüberstand oder nach der Reinigung werden sie indirekt an geeignete Matrixoberflächen, insbesondere Plastikoberflächen durch Bindung an gegen sie gerichtete Antikörper einer anderen Spezies, die an der Matrix fixiert sind, gebunden.
Diese mit mAK versehenen Matrices werden als Immunadsorbent bezeichnet und eignen sich für an sich bekannte radioimmunologische und verwandte Bestimmungsverfahren für Prostaglandine nach den in der Referenz (Monoclonal Antibodies and Development in Immunoassay", eds. A. Albertini und R. Ekins, Elsevier, Norble-Holland, 1981, pp. 3-23 und 101-193) dargestellten Methoden.
Für die Durchführung der Doppelantikörperbestimmung im Immunosorbenttest werden gegen die monoklonalen Anti-Prostaglandin-Antikörper gerichtete Antikörper einer anderen Spezies mit Hilfe von bekannten affinitätschromatographischen Verfahren (March, S.C., Parikh, E. und E.P. Guatrethsas, Anal. Biochem. 60, 149 (1974)) eingesetzt.
Beispiel 1 Herstellung der Hybrid-Zellinie anti-6-K-PGF1a-7/21 Kopplung von 6-Keto-PGF1 OL an Rinderserumalbumin 7,5 mg Rinderserumalbumin (BSA) in 4,4 ml H20 wurden unter ständigem Rühren mit 4 mg Carbodiimid (CDI, N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid) versetzt. Zu dieser Lösung wurden tropfenweise 4 mg 6-Keto-PFG1α in 400 Ll H20 bzw. Ethanol gegeben und unter Rühren über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wurde dieser Reaktionsansatz nochmals tropfenweise mit 4 mg BSA/0,3 ml H2O versetzt und für weitere 7 Stunden inkubiert. Danach wurde das Reaktionsgemisch gegen Phosphat gepufferte 0,9 % Kochsalzlösung pH 7,2 - 7,3 dialysiert und bei -20°C aufbewahrt.
Immunisierung Für die Induktion einer Immunantwort gegen die genannten Prostaglandine wurden weibliche BALB/c-Mäse verwendet.
Für die Erstimmunisierung wurde 6-Keto-PFG1α-BSA-Konjugat in Freund's komplettem Adjuvans (CFA) und für Folgeimmunisierungen in inkomplettem Freund's Adjuvans (IFA) emulgiert (Carvey, J.S. Cremer, N.E. und Sussdorf, D.H., eds., ch. 21-1,184 in "Methods in Immunology", Benjamin/Cummings Publishing Company, London, Amsterdam, Don Mills, Ontaria, Sydney, Tokyo (1977)). Die Erstimmunisierung erfolgte durch subkutane Applikation von 100 ag Antigen pro Tier in 0,2 ml CFA. Nach 7 Tagen erfolgte die Zweitimmunisierung durch subkutane Gabe von 30 ßg Antigen/200 l in IFA und nach weiteren 7 Tagen eine intravenöse Injektion von 30 ßg Antigen in Q,2 ml Phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,2 - 7,3.
3 Tage nach der letzten Immunisierung wurden von den Tieren Milzzellen isoliert und mit Zellen der P 3 X 63-Ag 8.653-Linie fusioniert (Kearney, J.F. Radbruch, A.
Liesegang, B. und Rajewsky, K.J. Immunol., 123, 1548 (1979)).
Fusion Die Fusion wurde mit Polyethylenglykol, Molekulargewicht 4000 (PEG 4000;) durchgeführt (Hämmerling, G.H., Eur. J.
Immunol., 7, 743 (1977). Hybridzellen wurden nach der Methode von Littlefield (a.a.o.) in HAT-Medium (s.u.) selektioniert; zur Umgewöhnung selektionierter Hybridzellen von HAT-Medium auf normales Medium wurden die Zellen zunächst nochmals mit HT-Medium (s.u.) und dann mit geeignetem Normalmedium gefüttert.
Zur Herstellung der PEG 4000-Lösung wurden 20 g PEG 4000 für 20 Minuten autoklaviert und anschließend bei 60°C in 28 ml PBS gelöst.
Das HAT-Medium wurde aus Kulturmedium durch Zugabe folgender Substanzen hergestellt: 13,6 mg/l Hypoxantin 3,88 mg/l Thymidin und 0,191 mg/l Aminopterin.
Milzzellen aus BALB/c-Mäusen, die mehrmals mit Ag immunisiert worden waren (so.), wurden am Tag 3 nach der letzten Antigengabe mit Zellen der P3X63-Ag8.653-Linie 8 fusioniert. Hierzu wurde ein Gemisch von 1 x 108 Milzzellen und 2 x 107 Myelomzellen herunterzentrifugiert und der Überstand vollständig abgehoben. Die sedimentierten Zellen wurden in einer PEG 4000-Lösung (s.o.) resuspendiert und 1 Minute unter leichtem Schütteln in diesem Medium inkubiert. Danach wurde über einen Zeitraum von etwa 5 Minuten der Fusionsansatz durch tropfenweise Zugabe von 10 ml PBS verdünnt, das auf 37"C vorgewärmt war. Das Fusionsgemisch wurde für 5 Minuten bei 200 g herunterzentrifugiert, die Zellen in HAT-Medium (s.o.) resuspendiert und in einer Konzentration von 2 x 10 Zellen/1,5 ml/Vertiefung auf sterile Plastikplatten verteilt.
Subklonieren der Hybridzellen Die Hybridzellen wurden durch "begrenzende Verdünnung (limiting dilution) kloniert, indem 300, 100 und 30 Zellen in jeweils 20 ml Kulturmedium zusammen mit Milzzellen einer BALB/c-Maus in 96 Löchern einer Kulturplatte verteilt wurden. Wenn in weniger als 20 % der Löcher einer Kulturplatte Zellwachstum auftrat, war aufgrund der Poissonverteilung davon ausgegangen worden, daß jede Zellkolonie von einer Zelle abstammt und daher ein Klon ist. Zellen solcher Subklone wurden für die weitere Verwendung expandiert und eingefroren.
Im direkten Bindungstext (s.u.) wurde untersucht, ob Uberstände klonierter Hybridzellen, die 2-3 Wochen nach der Fusion sichtbar waren, Antikörper der gewünschten Spezifität enthielten.
Hybridzellinie anti-6-K-PFG1α -7/21 Überraschenderweise sezernierte eine, auf die oben beschriebene Weise, hergestellte Zellinie, die in gängigen Zellkulturmedien (z.B. RPMI 1640-Medium, Moore G.E., J. Am. Med. ASSOC. 199, 519 (1967)) gut wächst, in diese Medien auch in Gegenwart von fötalem Kälberserum (5-25 %) anti-6-Keto-PGF1 y -Antikörper in Mengen von 1-100 ag pro 10 Zellen/24 Stunden je nach Kultivierungsbedingungen.
Wachstum der Zellinie anti-6-K-PFG1α -7/21 in vivo Die aus einer Zellfusion hervorgegangene Sybridlinie wuchs in histokompatiblen Mäusen in der Peritoneal- flüssigkeit <Ascitesflüssigkeit) in Suspension. Für die Induktion von Ascitesflüssigkeit wurde Mäusen 3 Tage bis 10 Wochen vor der intraperitonealen (i.p.) Injektion von 105 - 106 Tumorzellen eine i.p. Injektion von 0,5 ml einer geeigneten blimmersion verabreicht (Canero, M.
und Potter, M., J. Exp. Medi., 144, (1976)). In Folge des Tumorwachstums bildet sich im Peritoneum Ascitesflüssigkeit, was äußerlich am Anschwellen des Bauches erkennbar ist. Aus einer Maus konnten durch mehrmaliges Ernten bis zu 20 ml Ascitesflüssigkeit gewonnen werden, dessen zelluläre Bestandteile durch Zentrifugation für 10 min. bei 400 g isoliert wurden; der Ascitesüberstand Antikörper-se zernierender Hybridzellen enthielt neben anderen Serumproteinen zwischen 2 und 30 mg/ml monoklonalen Antikörper.
Reinigung von monoklonalen anti-6-Keto-PGF 1.3C/-Antikörpern durch Ammoniumsulfatfällung und Ionenaustauscherchromatograph ie Um die monoklonalen anti-6-Keto-PGF1 &-Antikörper in einem neuen Immoassay an der Oberfläche von Plastik einsetzen zu können, wurden sie folgendermaßen gereinigt: Ascitesflüssigkeit der IgG-sezernierender Myelomzellinie anti-6-K-PFG1α -7/21 wurde mit dem 0,9-fachen Volumen einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung tropfenweise unter ständigem Rühren versetzt und der entstandene Niederschlag für 10 Minuten bei 10.000 g herunterzentrifu- giert. Das Sediment wurde im gleichen Ausgangsvolumen PBS (s.o.) gelöst und die Präzipitation mit (NH4)2SO4 noch einmal wiederholt. Anschließend wurde der Niederschlag im halben Ausgangsvolumen des Puffers aufgenommen und für die anschließende Ionenaustau scherchromatograph ie an Diethylzellulose gegen 0,01 M Phosphatpuffer, pH 8,0, dialysiert. Mit Diethylzellulose die mit dem gleichen 0,01 M Phosphatpuffer äquilibriert war, wurde in einer Plastikspritze eine Säule gegossen und pro 2 ml Ionenaustauscher 1 ml der durch Ammoniumsulfatfällung vorgereinigten Präparation aufgetragen. Anschließend wurde nicht gebundenes Protein weggewaschen und die gebundenen Antikörper mit einem phosphatgepufferten Gradienten (0,01-0,1 M, pH 8,0) eluiert, wobei das Gesamtvolumen des Elutionspuffers das 5-10-fache des Säulenvolumens betrug. Die optische Dichte (O.D.) des Eluats bei 280 nm war ein Maß für die Proteinkonzentration (Onone, K., Yagi, Y., Grossberg, A.L. und D. Pressman, Immunochemistry, 2, 401 (1965)).
Der monoklonale Antikörper wurde nach seiner Reinigung durch Ultrafiltration mit geeigneten Membranen oder Kollodiumhülsen eingeengt.
Der Reinheitsgehalt der Immunglobuline nach den jeweiligen Reinigungsschritten und die ungefähre Konzentration der AK im Ausgangsascites wurde durch die analytische Mikrozonenelektrophorese auf Zelluloseacetatmembranen bestimmt.
Charakterisierung der monoklonalen Antikörper der Hybridzelline anti-6-K-PFG1α -7/21 Mit Hilfe von spezifischen Reagentien wurde mAK anti-6-Keto-PGF1-7/21 nach der Methode von Kearney et al, (Kerarney, J.E., Radbruch, A., Liesegang, B. und K.
Rajewsky, J. Immunol. 123, 1548 (1979)) als IgG-Typ identifiziert, und zwar mit Kappa-leichten Ketten und schweren Ketten der Klasse IgG1.
Die Spezifität von mAK anti-6-K-PFG1α α ist in Beispiel 6 gezeigt.
Zur Charakterisierung von überstand bzw. Ascitesflüssigkeit von mAK anti-6-K-PFG1α -7/21 werden nachfolgend exemplarisch die Daten einer Titerbestimmung von Ascitesflüssigkeit gezeigt.
Titerbestimmung von Ascitesflüssigkeit des mAK anti-6-Keto-PFG1α 7/21 im direkten Bindungstest in Lösung 3H-markiertes 6-Keto-PFG1α (3 x 10 cpm) wurde mit Ascitesflüssigkeit des monoklonalen AK anti-6-keto-PGF1& 7/21 gemischt und über Nacht inkubiert. Anschließend wurde das nicht an AK gebundene radiaktive 6-Keto-PGF1 mit Aktivkohle präzipitiert und die an Antikörper gebundene Radioaktivität im überstand gemessen (Tabelle 1).
Tabelle 1 Verdünnung der Ascitesflüssigkeit % Bindung (+ 3 %) 1:100 63 1:500 55 1:2500 46 1:12500 37 1:62500 22 1:312500 16 Beispiel 2 Herstellung der Hybridzellinien anti-PFG2/Sc/2 Kopplung von PGF2 αan Rinderserumalbumin 7,5 mg Rinderserumalbumin (BSA) in 4,4 ml H2O wurden unter ständigem Rühren mit 4 mg Carbodiimid (CDI, N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid) versetzt. Zu dieser Lösung wurden tropfenweise 4 mg PGF2 > in 400 Al H20 bzw. Ethanol gegeben und unter Rühren über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wurde dieser Reaktionsansatz nochmals tropfenweise mit 4 mg BSA/0,3 ml H2O versetzt und für weitere 7 Stunden inkubiert. Danach wurde das Reaktionsgemisch gegen Phosphat gepufferte 0,9 % Kochsalzlösung bei pH 7,2 - 7,3 dialysiert und bei -200C aufbewahrt.
Immunisierung Für die Induktion einer Immunantwort gegen die genannten Prostaglandine wurden weibliche BALB/c-Mäuse verwendet.
Für die Erst immunisierung wurde PGF2 XrBSA-Konjugat in Freund's komplettem Adjuvans (CFA) und für Folgeimmunisierungen in inkomplettem Freund's Adjuvans (IFA) emulgiert (carvey, J.S. Cremer, N.E. und Sussdorf, D.H., eds., ch. 21-1, 184, in "Methods in Immunology", Benjamin/Cummings Publishing Company, London, Amsterdam, Don Mills, Ontaria, Sydney, Tokyo (1977)). Die Erstimmunisierung erfolgte durch subkutane Applikation von 100 ßg Antigen pro Tier in 0,2 ml CFA. Nach 7 Tagen erfolgte die Zweitimmunisierung durch subkutane Gabe von 30 iig Antigen/200 ßl in IFA und nach weiteren 7 Tagen eine intravenöse Injektion von 30 Ag Antigen in 0,2 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,2 -7,3.
3 Tage nach der letzten Immunisierung wurden von den Tieren Milzzellen isoliert und mit Zellen der P3X63-Ag 8.653-Linie fusioniert (Kearney, J.F. Radbruch, A.
Liesegang, B. und Rajewsky, K.J. Immunol., 123, 1548 (1979).
Fusion Die Fusion wurde mit Polyethylenglykol, Molekulargewicht 4000 (PEG 4000;) durchgeführt (Hämmerling, G.H., Eur. J.
Immunol., 7, 743 (1977). Hybridzellen wurden nach der Methode von Littlefield (a.a.o.) in HAT-Medium (s.u.) selektioniert; zur Umgewöhnung selektionierter Hybridzellen von HAT-Medium auf normales Medium wurden die Zellen zunächst nochmals mit HT-Medium (s.u.? und dann mit geeignetem Normalmedium gefüttert.
Zur Herstellung der PEG 4000-Lösung wurden 20 g PEG 40Q0 für 20 Minuten autoklaviert und anschließend bei 60°C in 28 ml PBS gelöst.
Das HAT-Medium wurde aus Kulturmedium durch Zugabe folgender Substanzen hergestellt: 13,6 mg/l Hypoxantin 3,88 mg/l Thymidin und 0,191 mg/l Aminopterin.
Milzzellen aus BALB/c-Mäusen, die mehrmals mit Ag immunisiert worden waren (s.o.), wurden am Tag 3 nach der letzten Antigengabe mit Zellen der P3X63-Ag8.653-Linie 8 fusioniert. Hierzu wurde ein Gemisch von 1 x 10 Milzzellen und 2 x 107 Myelomzellen herunterzentrifugiert und der Überstand vollständig abgehoben. Die sedimentierten Zellen wurden in einer PEG 4000-Lösung (s.o.) resuspendiert und 1 Minute unter leichtem Schütteln in diesem Medium inkubiert. Danach wurde über einen Zeitraum von etwa 5 Minuten der Fusionsansatz durch tropfenweise Zugabe von 10 ml PBS verdünnt, das auf 370C vorgewärmt war. Das Fusionsgemisch wurde für 5 Minuten bei 200 g herunterzentrifugiert, die Zellen in HAT-Medium (s.o.) resuspendiert und in einer Konzentration von 2 x 10 Zellen/1,5 ml/Vertiefung auf sterile Plastikplatten verteilt.
Subklonieren der Hybridzellen Die Hybridzellen wurden durch "begrenzende Verdünnung (limiting dilution) kloniert, indem 300, 100 und 30 Zellen in jeweils 20 ml Kulturmedium zusammen mit 1 o 6 Milzzellen einer BALB/c-Maus in 96 Löchern einer Kulturplatte verteilt wurden. Wenn in weniger als 20 % der Löcher einer Kulturplatte -Zellwachstum auftrat, war aufgrund der Poissonverteilung davon ausgegangen worden, daß jede Zellkolonie ein Klon ist. Zellen solcher Subklone wurden für die weitere Verwendung expandiert und eingefroren.
Im direkten Bindungstext (s.u.) wurde untersucht, ob überstände klonierter Hybridzellen, die 2-3 Wochen nach der Fusion sichtbar waren, Antikörper der gewünschten Spezifität enthielten.
Hybridzellinie anti-PGF2 Sc/2 Uberraschenderweise sezernierte eine, auf die oben beschriebene Weise, hergestellte Zellinie, die in gängigen Zellkulturmedien (z.B. RPMI 1640-Medium, Moore G.E., J. Am. Med. ASSOC. 199, 519 (1967) gut wächst, in diese Medien auch in Gegenwart von fötalem Kälber- serum (5-25 %) anti-PGF2 »-Antikörper in Mengen von 1-100 g pro 10 Zellen/24 Stunden je nach Kultivierungsbedingungen.
Wachstum von der Zellinie anti-PGF2 -Sc/2 in vivo Die aus einer Zellfusion hervorgegangene Hybridlinie wuchs in histokompatiblen Mäusen in der Peritonealflüssigkeit (Ascitesflüssigkeit) in Suspension. Für die Induktion von Ascitesflüssigkeit wurde Mäusen 3 Tage bis 10 Wochen vor der intraperitonealen (i.p.B Injektion von 105 106 Tumorzellen eine i.p. Injektion von 0,5 ml einer geeigneten blimmersion verabreicht (Canero, M. und Potter, M., J. Exp. Medi., 144, (1976)).
In Folge des Tumorwachstums bildet sich im Peritoneum Ascitesflüssigkeit, was äußerlich am Anschwellen des Bauches erkennbar ist. Aus einer Maus konnten durch mehrmaliges Ernten bis zu 20 ml Ascitesflüssigkeit gewonnen werden, dessen zelluläre Bestandteile durch Zentrifugation für 10 min. bei 400 g isoliert wurden; der Ascitesüberstand Antikörper-sezernierender Hybrid-Zelllinien enthielt neben anderen Serumproteinen zwischen 2 und 30 mg/ml monoklonalen Antikörper.
Renigung von monoklonalen anti-PGF2 t-Sc/2-Antikörper durch Ammoniumsulfatfällung und Ionenaustauscherchromatographie Um die monoklonalen anti-PFG2α-Antikörper in einem neuen Immunoassy an der Oberfläche von Plastik einsetzen zu können, wurden sie folgendermaßen gereinigt: Ascitesflüssigkeit der IgG-sezernierender Myelomzellinie anti-PFG2>,-SC/2 wurde mit dem 0,9-fachen Volumen einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung tropfenweise unter ständigem Rühren versetzt und der entstandene Niederschlag fUr 10 Minuten bei 10.000 g herunterzentrifugiert. Das Sediment wurde im gleichen Ausgangsvolumen PBS gelöst und die Präzipitation mit (NH4)2SO4 noch einmal wiederholt. Anschließend wurde der Niederschlag im halben Ausgangsvolumen des Puffers aufgenommen und für die anschließende Ionenaustauscherchromatographie an Diethylzellulose gegen 0,01 M Phosphatpuffer, pH 8,0, dialysiert. Mit Diethylzellulose die mit dem gleichen 0,01 M Phosphatpuffer äquilibriert war, wurde in einer Plastikspritze eine Säule gegossen und pro 2 ml Ionenaustauscher 1 ml der durch Ammoniumsulfatfällung vorgereinigten Präparation aufgetragen. Anschließend wurde nicht gebundenes Protein weggewaschen und die gebundenen Antikörper mit einem phosphatgepufferten Gradienten (0,01-0,1 M, pH 8,0) eluiert, wobei das Gesamtvolumen des Elutionspuffers das 5-10-fache des Säulenvolumens betrug. Die optische Dichte (O.D.) des Eluats bei 280 nm war ein Maß für die proteinkonzentration (Onone, K., Yagi, Y., Grossberg, A.L.
und D. Pressman, Immunochemistry, 2, 401 (1965)).
Der monoklonale Antikörper wurde nach seiner Reinigung durch Ultrafiltration mit geeigneten Membranen oder Kollodiumhülsen eingeengt.
Der Reinheitsgehalt der Immunglobuline nach den jeweiligen Reinigungsschritten und die ungefähre Konzentration der AK im Ausgangsascites wurde durch die analytische Mikrozonenelektrophorese auf Zelluloseacetatmembranen bestimmt.
Charakterisierung der monoklonalen Antikörper der Hybridzellinie anti-PFG2α-Sc/2 Mit Hilfe von spezifischen Reagentien wurde der mAK anti-PFG2α-Sc/2 nach der im Beispiel 1 beschriebenen Methode als IgG-Typ identifiziert und zwar mit kappaleichten Ketten und schweren Ketten der Klasse IgG1.
Zur Charakterisierung des Überstandes der Ascitesflüssigkeit wurde eine Titerbestimmung durchgeführt.
Titerbestimmung von Ascitesflüssigkeit des mAK anti-PGF im direkten Bindungstest in Lösung 3H-markiertes PFG2α (3 x 104 cpm) wurde mit Ascitesflüssigkeit des monoklonalen AK anti-PGF2 gemischt und über Nacht inkubiert. Anschließend wurde das nicht an Antikörper gebundene radioaktive PFG2α mit Aktivkohle präzipitiert und die an Antikörper gebundene Radioaktivität im Uberstand gemessen (Tabelle 2).
Tabelle 2 Verdünnung der Ascitesflüssigkeit % Bindung (+ 3 %) 1:10 64,7 1:100 60,2 1:1000 44,5 1:10000 30,7 1:100000 8,9 Beispiel 3 Radioimmunosorbenttest (direkter Bindungstest) Der Radioimmunosorbenttest wurde an Platten aus Polyvinylchlorid durchgeführt, in die 96 Vertiefungen mit je ca. 300 ßl Volumen gestanzt waren. Inkubiert man die Oberfläche mit der Antikörperlösung, , dann haftet der Antikörper durch elektrostatische Wechselwirkung an dem Plastikmaterial.
Zunächst werden die Antikörper eines Zellüberstandes der Zellinie anti-6-K-PFG1α-7/21 an die Plastikoberfläche adsorbiert, indem die Plastikvertiefungen mit jeweils 100 1 Antikörperlösung (2-6 Al/ml Puffer) für 4-36 Stunden inkubiert werden. Nach Auswaschen nicht absorbierter Antikörper wird das Immunosorbent direkt mit dem radioaktiv markierten Prostaglandin inkubiert (Tabelle 3).
Tabelle 3 Radioimmunosorbenttest mit direkt gebundenem mAK (Zellkulturüberstand) anti-6-Keto-PGF1 -7/21 und radioaktivem 6-Keto-PGF1 Verdünnung von Kulturüberstand % der eingesetzten cpm gebunden (+ 3 %) 1:5 22,0 z Blindprobe 0,0 % Beispiel 4 Radioimmunosorbenttest mit mAK-anti-PFG2α i Sc/2 und Kaninchenanti-Maus-Ig Zur Verwendung eines Doppelantikörperverfahrens wurden die Antikörper (anti-PFG2α) indirekt an die Plastikoberfläche gebunden, indem die Plastikoberfläche zunächst mit affinitätschromatographisch gereinigtem Kaninchen anti-Maus-Ig inkubiert wird (4 µg/ml PBS, davon 100 \Ll pro Vertiefung, Inkubationsdauer 3-36 Stunden).
Die Kaninchenantikörper werden dazu affinitätschromatographisch mit Hilfe von kovalent an die Polysaccarid- matrix gebundenes Maus-Immunuglobulin absorbiert und nicht gebundenes Protein ausgewaschen. Die absorbierten AK werden mit Glycin/HCl Puffer eluiert, dessen pH zwischen 2,8 und 3,2 lag (0,1 M Glycin, 0,1 M NaCl; der pH wurde mit 0,1 m HCl eingestellt).
Die mit Kan inchenantikörperlösungen inkubierten Plastikoberflächen werden 4 mal gewaschen und für 2-36 Stunden mit 100 µl einer geeigneten Verdünnung von Ascitesflüssigkeit oder Kulturüberstand der Hybridlinie inkubiert. Anschließend werden die Vertiefungen gewaschen und 4 bis 24 Stunden mit 100 µl von radiaktivem 3H-Prostaglandin (3 x 104 cpm pro Vertiefung) inkubiert.
Beim Bindungsinhibitionstest erfolgt die Inkubation mit einem Gemisch aus radioaktivem Prostaglandin und unmarkiertem Inhibitor, Gesamtvolumen ebenfalls 100 tell.
Danach werden die Vertiefungen gewaschen, aus der Plastikplatte ausgeschnitten und die an das Immunosorbent absorbierte Radiaktivität bestimmt (Tabelle 4).
Tabelle 4 Radioimmunosorbenttest mit insolubilisiertem mAK anti-PGF2 -Sc/2 und radioaktivem PGF2d, Verdünnung von Kulturüberstand % der eingesetzten cpm gebunden (+ 3 %) 1:270 23,0 % Blindprobe 0,0 % Beispiel 5 Bestimmung der Kreuzreaktion des monoklonalen anti-PGF2t Sc/2 Antikörpers mit verschiedenen Prostaglandinen Mit vorstehend beschriebenen Bestimmungsverfahren wurde die Kreuzreaktion der mAK, welche von der Zellinie PFG2α-Sc/2 in den Zellüberstand sezerniert werden, mit verschiedenen Prostaglandinen gemessen (Ergebnisse siehe Tabelle 5).
In der Tabelle ist aufgeführt, wieviel ng vom jeweiligen Prostaglandin dem Testansatz zugegeben werden müssen, um die Bindung von 3H-PFG2α an mAK anti-PFG2α-Sc/2 um 50 % zu inhibieren.
Nach der Formel: ng homologer Inhibitor bei 50 % Bindung x 100 ng kreuzreag. Inhibitor bei 50 % Bindung ergibt sich der Prozentsatz der Kreuzreaktion.
Tabelle 5 Prostaglandin 50 % Inhibition % Kreuzreaktion 4 s 4 ng F1 165 ng 2,42 % 195 ng 2,05 % 15-Keto-F2α >1000 ng <1 % 15-Keto-13,14 di-F2α >1000 ng <1 % 15(R)-Methyl-F2α >1000 ng <1 % 15(R)-Methyl-F2α>1000 ng <1 % D1 >1000 ng <1 % TXB1 >1000 ng TXB2 >1000 ng <1 % Wie das Beispiel zeigt, besitzt mAK anti-PFG2α-Sc/2 iiberraschend große Spezifität für PGF2* und reagiert nur sehr schwach mit strukturverwendeten Prostaglandinen.
Beispiel 6 Analog zu Beispiel 5 wurde die Xreuzreaktion des mAK, der von der Zellinie anti-6-K-PFG1α -7/21 in den Zellüberstand sezerniert wird, mit verschiedenen Prostaglandinen gemessen (Tabelle 6).
Tabelle 6 Prostaglandin 50 % Inhibition % Kreuzreaktion 6-Keto-F1α 4,4 ng -F 240 ng 1,83 % E2 240 ng 1,83 % E1 321 ng 1,37 % F2 660 ng 0,67 % 6,5-di-Keto-F1α >1000 ng <1 % 6,5-di-Keto-13,14 dhF1α >1000 ng <1 % TXB1 >1000 ng *1 % TXB2 >1000 ng <1 % D1 >1000 ng <1 % mAK-anti-6-Keto-PFG1α -7/21 besitzt große Spezifität für 6-Keto-PFG1 und reagiert überraschenderweise nur äußerst geringfügig mit strukturverwandeten Prostaglandinen.

Claims

Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen Prostaglandine mittels klonierter Hybridzellen, die hergestellt werden durch: A. Kovalente Kopplung der speziellen Prostaglandine an ein Immunogen in wäßriger Lösung, B. wiederholtes Einbringen des Konjugates in ein Versuchstier, C. anschließende Isolierung von Lymphozyten aus dem Versuchstier, Mischen dieser mit Tumorzellen in physiologischem Medium, D. Abtrennung des physiologischen Mediums und Fusionierung der Zellen mit Polyethylenglykol, E. Aufnahme des Fusionsgemisches in einem selektiven Kulturmedium und Aufbringen auf Kulturplatten in einer Konzentration bis zu 10 Zellen pro Vertiefung der Kulturplatte, F. Testen der überstände in den Vertiefungen, die Zellwachstum zeigen, nach bekannten Methoden auf Vorhandensein der gewünschten Antikörper, G. Separierung der Zellen aus den Kulturen, welche auf Grund des Tests die gewünschten Antikörper produzieren, voneinander; Vermehrung individueller Zellen, d.h. Herstellung der Zellklone und Entnahme der mAK aus den die Zellklone enthaltenden Gefäßen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als spezielle Prostaglandine 6-Keto-PGF1 oder PGF2; eingesetzt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Konjugat in eine Maus, vorzugsweise eine BALB/c-Maus eingebracht wird.
4. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Tumorzellen variante Zellinien der TK negativen P3 X63-Linie verwendet werden.
5. Verfahren nach einen oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Tumorzellen solche der Linie P3X63-Ag8, P3 NF1/1-Ag4-1 oder vorzugsweise P3X63-Ag8.653 verwendet werden.
6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß zur Fusionierung der Zellen PEG mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 10 000, vorzugsweise zwischen 1500 und 4000 eingesetzt wird.
7. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Immungen ein Protein, besonders bevorzugt Rinderserum-Albumin, eingesetzt wird.
8. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als selektives Kulturmedium ein solches eingesetzt wird, in denen nur Hybridzellen wachsen können, die aus der gemäß Anspruch 1 Fusionierung von Tumorzelle(n) und Lymphozyt (en) hervorgegangen sind.
9. Verwendung der gemäß einen oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche hergestellten mAK als Diagnostika.
10. Verwendung der mAK zur Diagnose von 6-Keto-PGF1 und PGF,.