DE3650635T2

DE3650635T2 - Monoklonale Antikörper

Info

Publication number: DE3650635T2
Application number: DE3650635T
Authority: DE
Inventors: De Sa Maria-Fatima Grossi; Klaus Scherrer
Original assignee: Pro-Soma
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1985-08-30
Filing date: 1986-08-29
Publication date: 1997-12-04
Anticipated expiration: 2006-08-30
Also published as: CA1294570C; EP0434670B1; ATE73463T1; JPH0822226B2; DK172758B1; JPH0671435B2; KR0138534B1; EP0219368B1; KR870002453A; DK414386A; US5059521A; EP0219368A1; JPS62130699A; IE59258B1; DK414386D0; ATE154395T1; JPH0787967A; DE3650635D1; AU6189486A; ES2001626A6

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur immunchemischen Diagnose und ein diagnostisches Reagenz für die Verwendung in diesem Verfahren.
Prosomen sind Ribonucleoprotein-Komplexe (RNP-Komplexe) oder RNP- Partikel, die vor kurzem mittels biochemischer Verfahren nachgewiesen und mittels Elektronenmikroskop sichtbar gemacht wurden, insbesondere im Zytoplasma von Enten- und Maus-Erythroblasten und in menschlichen Helazellen [definiert von SPOHR et al., Eur. J. Biochem. 17, 296-318,(1970)). Hier kann als Referenz der Bericht von Schmid et al. im EMBO Journal 3(1), 29-34, (1984) genannt werden, der in der vorliegenden Beschreibung als Referenz zitiert wird.
Das Molekulargewicht von Prosomen wird auf ungefähr 600'000 Dalton geschätzt. Prosomen sind ausgesprochen stabile Komplexe. Sie sind sogar resistent gegen Ribonuclease, Protease K, Lösungen aus Cäsiumionen, die höher als 1 M sind, und, in den oben erwähnten Zellen, gegen 1% Lösungen des Detergenz "Sarkosyl" (Natrium-N- Lauroylsarcosinat), das die anderen Bestandteile reprimierter mRNP auflösen kann.
Diese Komplexe, die einen Sedimentationskoeffizienten von ungefähr 19 S aufweisen, enthalten je nach Zelltyp und Spezies 1 bis 12 kleine RNA und ein oder mehrere Elemente aus einer charakteristischen Population von Proteinen, die spezies-spezifische Elemente und allen Spezien gemeinsame Elemente enthält. Das Molekulargewicht dieser Proteine variiert zwichen 19'000 und 50,000, und die Molekülzahl der Proteine pro Prosom liegt ungefähr bei 20.
Die Population der prosomalen Proteine umfasst wenigstens 25 verschiedene Elemente; folglich können mindestens 25 verschiedene Prosomentypen existieren.
Bis jetzt war die physiologische und diagnostische Bedeutung der Prosomen unklar. Jedoch gibt es jetzt Anzeichen dafür, dass Prosomen Einfluss haben auf viele lebenswichtige physiologische Vorgänge, die mit der Differenzierung von Zellen und von ganzen Organismen, mit der Kommunikation zwischen Zellen und mit Autoimmun- Erkrankungen zusammenhängen.
Beispielsweise wurde eine differentielle Verteilung der Prosomen nachgewiesen, die auf eine physiologische Spezifität hinweist, die mit dem funktionellen Zustand der Zelle oder des Organismus während der embryonalen Entwicklung und der Zelldifferenzierung in Wechselbeziehung steht.
Genauer gesagt wurde im Epithel von Embryonen je nach Stadium der Differenzierung ein bestimmter Typ eines prosomalen Antigens im Nukleus, danach im Zytoplasma und schliesslich in den Sektoren des Zytoplasmas gefunden.
Eine weiterer bemerkenswerter Nachweis liegt darin, dass zu bestimmten Zeitpunkten Prosomen vorhanden sind, die möglicherweise ausschliesslich aus an die prosomale RNA gebundenen vielfachen Kopien einer einzelnen Proteinkomponente bestehen. Wir haben ebenfalls festgestellt, dass mit dem Stadium der Erythroblastendifferenzierung nicht nur die quantitative Verteilung der Prosomen variiert, sondern dass sich zudem die verschiedenen prosomalen Proteine in der Verteilung in den nachfolgenden Differenzierungsstadien unterscheiden, obwohl festgestellt wurde, dass die Proteine im Nukleus das gleiche Molekulargewicht wie jene im Zytoplasma haben.
Es kann gezeigt werden, dass Prosomen ein Teil eines Netzwerkes sind, das die Zelle vom Chromosom bis zur Plasmamembran und weiter umspannt. Dies bedingt eine Wechselwirkung zwischen der zelldynamischen Architektur und aufeinanderfolgende Schritte der Genexpressionskaskade und -Kontrolle - der wichtigsten den Prosomen zugeordneten Rolle. Die Bestimmung und insbesondere der differentielle Nachweis von Prosomen und prosomalen Proteinen sollte dann als sehr wichtiges Mittel zur Diagnose von mit der Genkontrolle zusammenhängenden Störungen angesehen werden, wie dies zum Beispiel bei Krebserkrankungen der Fall ist.
Prosomen stellen also eine neue Zellkomponenten-Klasse dar, die durch ihre Struktur und Anwesenheit den physiologischen Zustand einer bestimmten Zelle widerspiegelt.
Damit wurde bewiesen, dass es nötig ist, Mittel zur Identifizierung von Prosomen zur Verfügung zu haben, beispielsweise für:
A) experimentelle Zwecke:
1) Analyse der detaillierten Struktur lebender menschlicher oder tierischer Zellen;
2) Studium der Kontrolle der Genexpression nach der Transkription; und
B) diagnostische Zwecke:
1) Definition einer Störung des prosomalen Immunphänotyps einer bestimmten Zelle im Zusammenhang mit einem pathologischen Zustand oder einem Krankheitserreger;
2) Identifikation von Zellen in Zusammenhang mit deren Differenzierung- und Entwicklungszustand, beispielsweise die Identifizierung der Zellen des embryonalen Typs zwischen ausdifferenzierten Zellen.
Die gegen prosomale Proteine gerichteten Antikörper sind beispielsweise beim Nachweis von mit Prosomen zusammenhängenden Phänomenen hilfreich und können bei gewissen prosomenabhängigen Störungen therapeutisch angewendet werden.
Aus diesem Grund beschäftigt sich die vorliegende Erfindung mit einem Verfahren zum Nachweis eines mit der Zelldifferenzierung zusammenhängenden Phänomens oder einer Störung in einer Probe, das umfasst:
- das Inkubieren der genannten Probe mit monoklonalen Antikörpern, nicht jedoch mit jenen monoklonalen Antikörpern, die von einer bei der Collection Nationale de Microorganismes des Institut Pasteur in Paris unter der Nummer I-588 oder I-589 hinterlegten Zelllinie produziert werden, wobei die genannten monoklonalen Antikörper gegen ein prosomales Protein gerichtet und direkt oder indirekt mit einer Markierung versehen werden, und anschliessend
- Bestimmung der Bindung des genannten markierten monoklonalen Antikörpers an das prosomale Protein mit Hilfe der Aktivität der Markierung.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zum Nachweis eines mit der Zelldifferenzierung zusammenhängenden Phänomens in einer Probe, das umfasst:
- Inkubieren der genannten Probe mit einem ersten Set monoklonaler Antikörper, nicht jedoch mit jenen monoklonalen Antikörpern, die von einer bei der Collection Nationale de Microorganismes des Institut Pasteur in Paris unter der Nummer I-588 oder I-589 hinterlegten Zelllinie produziert werden, wobei die genannten Antikörper gegen ein prosomales Protein gerichtet sind; danach
- Inkubieren der genannten Probe mit markierten gegen die genannten ersten monoklonalen Antikörper gerichteten monoklonalen Antikörpern; und danach
- Bestimmen der Bindung des genannten markierten monoklonalen Antikörpers an die ersten monoklonälen Antikörper mit Hilfe der Aktivität der Markierung.
Ausserdem richtet sich die vorliegende Erfindung auf das Verfahren gemäss der Erfindung, worin die genannten monoklonalen Antikörper gegen ein prosomales Protein gerichtet sind, das ein mittels SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) festgestelltes Molekulargewicht von 27 K Dalton besitzt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls das Verfahren gemäss der Erfindung, worin die genannten monoklonalen Antikörper gegen ein prosomales Protein gerichtet sind, das ein mittels SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) festgestelltes Molekulargewicht von 31 K Dalton besitzt.
Im Verfahren gemäss der Erfindung kann die Probe entweder Gewebematerial (vorzugsweise ist ein Teil davon für eine mikroskopische Untersuchung geeignet) oder ein Flüssigmedium (wie beispielsweise Blut oder eine Fraktion davon, Urin oder Lymphflüssigkeit), das aus dem zu diagnostizierenden Lebewesen stammt, oder in gewissen Fällen das ganze Lebewesen sein (beispielsweise durch Imaging).
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls ein diagnostisches Reagenz, das einen spezifisch gegen ein prosomales Protein gerichteten und an eine Markierung gekuppelten monoklonalen Antikörper umfasst.
Die Markierung, die im Verfahren gemäss der Erfindung verwendet wird, kann eine beliebige, im allgemeinen in Immunassays verwendete Markierung sein. Beispiele sind radioaktive Atome oder Verbindungen, Enzyme, Partikel wie Erythrozyten, Latexpartikel, dispergierte Farb-Solpartikel, Metalle oder Metallverbindungen, Chromophore, Fluorophore etc. Die Markierung kann direkt oder indirekt an die monoklonalen Antikörper gebunden sein. Eine direkte Bindung kann vorzugsweise durch eine kovalente Bindung, gegebenenfalls mittels Verwendung eines Linkermoleküls, erreicht werden. Eine indirekte Bindung zwischen Markierung und monoklonalem Antikörper kann hergestellt werden, indem beispielsweise der monoklonale Antikörper mit einem spezifischen Antigen, einem zweiten Antikörper oder einem Fragment davon, mit Protein A oder einer ähnlichen Verbindung reagieren gelassen wird, oder beispielsweise durch Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, an den Avidin oder Biotin gebunden ist, wonach dieser mit markiertem Biotin beziehungsweise Avidin reagieren gelassen wird.
Wird das Verfahren gemäss der Erfindung bei einer Flüssigprobe angewendet, so kann jeder beliebige Typ eines gewöhnlichen Immunassays verwendet werden. Dazu gehören beispielsweise: Sandwich- Assay, kompetitiver Festphasen-Assay, Agglutinationsassay oder Agglutination-Inhibitionsassay. In einem Sandwich-Assay ist im allgemeinen das nachzuweisende Antigen zwischen einem immobilisierten oder auf einer festen Oberfläche zu immobilisierenden Antikörper auf der einen Seite und einem markierten oder zu markierenden Antikörper auf der anderen Seite eingeschlossen. In einem kompetitiven Festphasen-Assay kann das zu bestimmende Antigen beispielsweise mit einem Festphasen-gebundenen Antikörper und einem markierten Antigen inkubiert werden. In einem Agglutinationsassay wird das nachzuweisende Antigen mit Partikel-gebundenen Antikörpern inkubiert, die nach der Antigen-Bindung aggregieren und einen Niederschlag bilden. Andererseits können beim Agglutination- Inhibitionsassay sowohl Partikel-gebundene Antigene als auch freie Antikörper mit dem nachzuweisenden Antigen inkubiert werden.
In Fällen, in denen im Verfahren gemäss der Erfindung Gewebematerial als Probe verwendet wird, kann dieses Gewebematerial gegebenenfalls fixiert und danach mit den markierten oder zu markierenden monoklonalen Antikörpern inkubiert werden, nachdem das Material gegebenenfalls zuerst durch chemische oder physikalische Mittel fixiert wurde.
Die Markierungen gemäss der Erfindung werden nach der Inkubation je nach Markierungstyp und verwendetem Assay bezüglich ihrer Bindung mittels visueller oder instrumenteller Verfahren beobachtet.
Die spezifisch gegen prosomale Proteine gerichteten monoklonalen Antikörper werden von biologisch reinen Zelllinien immortalisierter Antikörper-produzierender Zellen produziert.
Solche immortalisierten Antikörper-produzierende Zellen können nach jedem der verschiedenen bekannten Verfahren erhalten werden, wobei diese Verfahren die folgenden Schritte durchlaufen: 1. Verwendung geeigneter Zellen wie Lymphozyten, um die Produktion spezifischer Antikörper auszulösen; 2. Immortalisieren der genannten Zellen; und 3. Selektionieren von Klonen aus diesen immortalisierten Zellen, die Antikörper der gewünschten Spezifität und Affinität produzieren. Ein oft verwendetes Verfahren wurde 1975 von Köhler und Millstein [Nature 256,495-497 (1975)] beschrieben und umfasst das Immunisieren von Mäusen mit dem Antigen, gegen das Antikörper erhalten werden sollen, Isolieren der Milzzellen und Fusion dieser Zellen mit Maus-Myelomazellen, um sogenannte Hybridome zu erhalten. Jedoch können auch andere Zellen als Mauszellen immunisiert werden, und Antikörper-produzierende Zellen aus anderen Körperteilen/-organen eignen sich dazu. Ausserdem können diese Antikörper-produzierenden Zellen auch mit anderen Verfahren immortalisiert werden, wie beispielsweise durch Transformation der Zellen mit immortalisierendem transformierendem genetischem Material, wie beispielsweise dem Epstein-Bar-Virus oder oncogen DNA.
Wie oben festgehalten, eignen sich die monoklonalen Antikörper gegen prosomale Proteine gemäss der Erfindung zum Nachweis oder zur Identifikation von Prosomen mittels klassischer Techniken der immunologischen Bestimmung, wie beispielsweise Immunfluoreszenz und immunenzymatische oder radioimmunologische Techniken.
Die Anwendung des Verfahrens gemäss der Erfindung ist sehr wichtig, sowohl im Bereich der experimentellen Forschung der Biologie als auch im Bereich der medizinischen Forschung, insbesondere Krebsforschung, und in der klinischen Medizin bei der Diagnose von Erkrankungen durch differentielles Immunphänotypisieren.
Beispielsweise kann auf dem Gebiet der experimentellen Biologie das Verfahren gemäss der Erfindung zur Charakterisierung von Struktur, Funktion und Synthese von Prosomen in der Rolle als ubiquitäre physiologische Komplexe verwendet werden. Insbesondere die differentielle zytologische Lokalisierung individueller Prosomentypen, gemäss Verfahren der Zellfraktionierung und der Biochemie oder durch Immunfluoreszenz auf intakten Zellen oder Gewebeteilen, kann durch das Verfahren gemäss der Erfindung bedeutend vereinfacht werden.
In der Entwicklungsbiologie, im Falle der An- oder Abwesenheit von Prosomen und der charakteristischen zytologischen Lokalisierung spezifischer Prosomen in Zellen eines spezifischen Typs, sind die prosomalen monoklonalen Antikörper bei der Charakterisierung, Identifizierung und der Suche nach spezifischen Zellen in der embryonalen Entwicklung hilfreich, wodurch die Bildung einer dynamischen Mikroanatomie bezüglich der Entwicklung ermöglicht wird. Sofern die Prosomen bei der differentiellen Kontrolle der Genexpression eine Rolle spielen, kann das Verfahren gemäss der Erfindung zur Analyse der der Zellregulierung unterliegenden Mechanismen verwendet werden.
Auf dem Gebiet der medizinischen Forschung wird das Verfahren gemäss der Erfindung mittels differentieller Immunphänotypierung, je nach Zelltyp eines spezifischen Gewebes und dem Differenzierungstadium der Zellen ganz verschiedene Möglichkeiten für die Verteilung von zu bildenden prosomalen Antigenen zur Verfügung stellen. Die Veränderung dieser Verteilung im Falle von pathologischen Zuständen, die die Regulierung und damit das physiologische Stadium der Zellen beeinflusst, wird mit der Verwendung des Verfahrens gemäss der Erfindung identifiziert werden können.
Für die klinische Diagnose pathologischer Zustände unterschiedlichen Ursprungs wird das Verfahren gemäss der Erfindung ein wesentliches Werkzeug darstellen. Tatsächlich wird dieses Verfahren die Anwesenheit und Verteilung von vom Normalzustand abweichenden Zellen ermöglichen, die in entfernten Gewebeteilen beispielsweise durch Biopsie oder in physiologischen Flüssigkeiten schnell erkannt werden können. Auf diese Weise kann die Diagnose pathologischer Zustände, die sonst eine grosse Erfahrung in Zytologie und Mikroanatomie voraussetzen, mittels differentieller Zytofluorimetrie automatisiert werden.
Im Zusammenhang mit Krebs kann das Verfahren gemäss der Erfindung für den Nachweis von in peripherem Blut vorhandenen Zellen in einem frühen Entwicklungsstadium sehr hilfreich sein. Tatsächlich enthält normales peripheres Blut nur wenige unreife Zellen. Im Gegensatz dazu wird im peripheren Blut von Leukämie-Patienten die Anwesenheit einer betrchtliche Anzahl unreifer Zellen festgestellt.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die unten aufgeführten illustrativen Beispiele detailliert dargestellt.

Beispiel 1

Isolierung prosomaler Proteine

Die Proteine wurden mittels Gelelektrophorese aus den Prosomen extrahiert, wobei die Prosomen zuvor durch Fraktionierung auf einem Saccharosegradienten von anderen Zellkomplexen getrennt worden waren.
Die Herstellung prosomaler Proteine beinhaltet somit:
1) Trennung der Prosomen von anderen Zellkomplexen durch Fraktionierung mittels differentieller Zentrifugation und auf einem Saccharosegradienten, und Gewinnung der Partikel, die einen Sedimentationskoeffizient von ungefähr 19S aufweisen;
2) Extraktion der gesuchten Proteine durch Gelelektrophorese
Die Herstellung von Enten- und Mausprosomen wurde von SCHMID et al. im EMBO Journal 3(1), 29-34, (1984) detailliert beschrieben.
Helazellprosomen wurden gemäss dem nachfolgenden Verfahren erhalten:
1) Postmitochondriale Überstände wurden aus Helazellkulturen nach dem von GANDER et al. (Eur. J. Biochem. 38, 443-452, 1973) beschriebenen Verfahren hergestellt;
2) Präparationen aus Polyribosomen und postribosomalen Partikeln wurden dann nach dem von VINCENT et al. (Eur. J. Biochem., 112, 617-633, 1980) beschriebenen Verfahren hergestellt;
3) die freien zytoplasmatischen Ribonucleoprotein-Komplexe wurden durch Sedimentation der Pellets von postribosomalen Partikeln fraktioniert, die in 15 bis 28% starker (Gewicht/Gewicht) isokinetischen Saccharosegradienten in einer Pufferlösung mit niedrigem Salzgehalt suspendiert worden waren, deren Zusammensetzung die folgende ist: 10 mM Thriethanolamin.HCl (pH 7,4), 50 mM KCl und 5 mM 2-Mercaptoethanol. Solche Fraktionierungen wurden in einem "Beckmann" zonalen Rotor des Typs Ti 14 15 Stunden bei 41'000 U/Min. und 4ºC durchgeführt;
4) die Partikel, die in einem Bereich zwischen 15 und 30 S sedimetierten wurden dann wiedervereint und durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation in einem "Beckmann"-Rotor des Typs Ti 60 18 Stunden bei 48'000 U/Min. und 4ºC konzentriert;
5) das Zentrifugations-Pellet wurde auf einen Saccharosegradienten (5 bis 21 % Gewicht/Gewicht) gegeben, in Anwesenheit von KCl in einer Konzentration von 0,5 M (Rotor SW 41 37'000 U/Min., 17 Stunden, 4ºC), und die Fraktion, die bei ungefähr 19 S sedimentierte, wurde gesammelt.
In allen Fällen werden die prosomalen Proteine aus diesen Fraktionen extrahiert und unter Verwendung bekannter Gelelektrophorese- Techniken identifiziert, wie beispielsweise Elektrophorese auf eindimensionalem Natriumdodecylsulfat (SDS )-Polyacrylamidgel nach LAEMMLI (Nature 227, 680-685, 1970) oder Elektrophorese auf zweidimensionalem Gel wie von O'FARRELL et al. (Cell 12, 1133-1142, 1977) beschrieben. Bei den in diesen elektrophoretischen Verfahren verwendeten molekularen Gewichtsmarkern handelte es sich um folgende Verbindungen: Phosphorylase-b(94 K), Rinderserumalbumin (68 K), Ovalbumin (43 K), Carboanhydrase (31 K), Sojabohnentrypsin- Inhibitor (21 K) und Lactalbuminum (14 K).

Beispiel 2

Monoklonale Antikörder gegen prosomale Proteine

In seiner allgemeinen Ausführung umfasst das Verfahren gemäss der Erfindung zum Erhalten Antikörper-produzierender Hybridomzelllinien gegen Proteine von Prosomen folgende Schritte:
1) Immunisieren von Mäusen mit einer gegebenen Menge des nach Beispiel 1 hergestellten gewünschten Proteins;
2) Entfernen der Milz aus den immunisierten Mäusen und Trennung der Milzzellen;
3) Fusion der dadurch erhaltenen Milzzellen mit Mausmyelomzellen in Anwesenheit eines Fusionspromotors;
4) Züchten der Hybridzellen in einem selektiven Medium, in dem die nicht-fusionierten Myelomzellen nicht wachsen, und in Anwesenheit von geeigneten Nährstoffen;
5) Selektion von Zellen, die die gewünschten Antikörper produzieren, und Klonen dieser Zellen.
Der erste Schritt dieses Verfahrens, insbesondere die Immunisierung der Mäuse, wird ausgeführt, um das Zellgedächtnis zur Antikörpersynthese zu stimulieren.
Das Immunisierungsprotokoll besteht aus subkutanem und intraperitonealem Injizieren einer bestimmten Menge des prosomalen Proteins, dreimal in Abständen von ungefähr 2 bis 3 Wochen, und, 4 Tage vor der Fusion und nach einer Ruheperiode von zwei Monaten, der intravenösen und intraperitonealen Booster-Impfung mit der gleichen Menge des prosomalen Proteins.
Die Menge des bei jeder Injektion verwendeten prosomalen Proteins beträgt ungefähr 20 bis 50 µg pro Maus.
Die auf diese Weise immunisierten Mäuse wurden dann getötet, die Milz entfernt und zur Gewinnung der Milzzellen in beispielsweise von MOORE et al. "Culture of Normal Human Leucocytes" J.A.M.A. 199, 519-524, 1967 definiertem RPMI 1640-Medium behandelt.
Die Fusion der Zellen, die den dritten Schritt des Verfahrens gemäss der Erfindung darstellt, besteht aus dem Mischen der Milzzellen von gegen ein prosomales Protein immunisierten Mäusen mit Maus-Myelomzellen gemäss der Technik von KOHLER und MILSTEIN [Nature 256, 495-597 (1975)] in Anwesenheit des Fusionspromotors Polytehylenglykol. Die Myelomzellen und Milzzellen werden in einem Verhältnis von 1:10 verwendet.
Nach Inkubation unter Schütteln bei 37ºC während einer Minute in Anwesenheit von Polytehylenglykol wurden die Zellen in RPMI 1640- Medium gewaschen und im gleichen Medium resuspendiert und anschliessend auf einem selektiven Medium gezüchtet, das sich für das Wachstum von Hybridzellen eignet.
Da die Myelomzellen nicht über das Enzym Hypoxanthin:Guaninphosphoribosyltransferase verfügen, vermehren sie sich auf einem Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthaltenden Medium nicht. Folglich enthält das für das Wachstum der Hybridomzellen verwendete selektive Medium Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin.
Die Zellen, die gegen das gewünschten prosomale Protein Antikörper produzieren, werden dann selektioniert und geklont.
Die Herstellung substantieller Mengen monoklonaler Antikörper kann erreicht werden, indem entweder die Hybridzellen in vitro gezüchtet werden oder indem diese in Mäuse injiziert werden und deren Ascites-Flüssigkeit, die den gesuchten Antikörper enthält, nach ungefähr 15 Tagen entnommen wird.
Die so erhaltenen monoklonalen Antikörper werden bei -20ºC tiefgekühlt gelagert.

Beispiel 3

Herstellung von Antikörpern gegen die Proteine p 27 K und p 31 K aus Enten-Prosomen

Die Begriffe "Protein p 27 K" und "Protein p 31 K" bezeichnen in diesem Beispiel das prosomale Protein mit einem Molekulargewicht von 27'000 beziehungsweise 31'000.
Die 20 S Enten-Globin-mRNPs, die nach dem von VINCENT et al. (in Eur. J. Biochem. 112, 617-633 (1980)] beschriebenen Verfahren erhalten wurden, wurden durch Behandlung mit 0,5 M KCl in vier hauptsächliche Subkomplexe mit Sedimentations-Koeffizienten von 4S, 13S, 16S und 19S (Prosom) aufgeteilt. Um Antikörper gegen die spezifischen Prosomenproteine zu erhalten, wurden Balb/c-Mäuse in Anwesenheit von Freundschem Adjuvans intraperitoneal und subkutan mit 20 µg Prosomen (oben erhaltene Sedimentationspartikel 19S) gemäss dem in Beispiel 2 beschriebenen Immunisierungsprotokoll geimpft. Eine Woche nach der zweiten Injektion wurde das Mausserum gewonnen und die Anwesenheit von Antikörpern mittels ELISA und Immunelektrotransfer-Techniken festgestellt.
Zwei Monate nach der dritten Injektion wurde eine intravenöse und interperitoneale Booster-Impfung mit der gleichen Prosomenmenge durchgeführt, und vier Tage später wurden die Mäuse getötet, die Milz entfernt und die Milzzellen (10&sup8;) mit Myelomzellen (10&sup7;) von PAI-Mäusen [vom Labor T. STAEHELIN von HOFFMANN-LA-ROCHE, Basel, Schweiz zur Verfügung gestellt) nach dem Verfahren von KOHLER und MILSTEIN unter Verwendung von Polyethylenglykol als Fusionspromotor fusioniert.
Die Zellen, die Antikörper gegen prosomale Proteine produzierten, wurden danach auf einem selektiven Medium selektioniert und mittels des Verfahrens der limitierenden Verdünnung geklont.
Der Nachweis von Antikörper-produzierenden Hybridzellen wurde mittels ELISA-Verfahren und Immunelektrotransfer-Verfahren erreicht.
Für diese beiden Tests wurde der 20S Globin mRNP-Partikel als Antigen verwendet und die positiven Klone, das heisst die Klone, die gegen die prosomalen Proteine p 27 K und p 31 K Anitkörper produzieren, wurden mit diesem Antigen selektioniert.
Die Zelllinien, die gegen die prosornalen Proteine p 27 und p 31 K monoklonale Antikörper produzierten, wurden bei der Collection Nationale de Culture de Microorganismes des Institut Pasteur unter der Nr. I-588 beziehungsweise I-589 hinterlegt.
Die Zelllinie, die anti-p 27 K-Antikörper produziert (intern als IB5 bezeichnet), produziert Antikörper der Klasse IgGl, die einen isoelektrischen pH-Wert von ungefähr pH 5,2 aufweist.
Die Zelllinie, die anti-p 31 K Antikörper produziert (intern als AA4 bezeichnet), produziert ebenfalls Antikörper der Klasse IgGl, weist einen isoelektrischen pH-Wert von ungefähr pH 5,2 auf.
Die beigefügte Figur 1 zeigt:
- das Sedimentationsprofil des 20S Enten-Globin mRNP-Partikels in einem Saccharosegradienten in Anwesenheit von 0,5 M KCl, beobachtet bei 254 nm (Figur 1A),
- eine Fotografie des eindimensionalen SDS-Polyacrylamid-Gels der Proteine in der Fraktion des in A gezeigten Gradienten, wobei die Proteine mit Coomassie-blau angefärbt wurden (Figur 1B). In dieser Figur bezeichnet M Molekulargewichtsmarker, und die Region 3-6 entspricht den prosomalen Entenproteinen,
- eine Fotografie der Proteine eines dem in B gezeigten homologen Gels, nach dem Transfer auf Nitrocellulose-Papier und nachfolgender Reaktion (ELISA) mit den monoklonalen Antikörpern gegen Protein p 27 K (Figur 1C&sub1;) und Protein p 31 K (Figur 1C&sub2;) nach dem im Beispiel 4 beschriebenen Verfahren.

Beispiel 4

Demonstration der universellen Eigenschaften der Proteine 27 K und 31 K unter Verwendung von in Beispiel 3 erhaltenen monoklonalen Antikörpern

Um die Spezifität und Vielseitigkeit der monoklonalen Antikörper gegen prosomale Proteine zu belegen, wurden die prosornalen Proteine aus Enten-, Maus- und Helazellen, die nach der Trennung auf einem Saccharosegradienten in 0,5 M Kaliumchlorid erhalten worden waren, einer eindimensionalen Gelelektrophorese unterzogen und mit Coomassie-blau angefärbt. Die Proteine der homologen Gele wurden mittels Immunelektrophorese gemäss der Technik von TOWBIN et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354) vom Gel auf Nitrocellulose-Papier übertragen. Nach dem Übertragen wurde das Nitrocellulose-Papier über Nacht bei 4ºC in eine 3% Rinderserumalbumin enthaltende PBS-Phosphat-Pufferlösung getaucht, um die unspezifischen Reaktionsprodukte zu entfernen. Das Papier wurde dann mit dem Antikörper gegen prosomale Proteine, der im Beispiel 3 aus Ascites- Flüssigkeit erhalten und in PBS verdünnt worden war (1:600), bei 18ºC über Nacht inkubiert. Das Papier wurde danach viermal mit PBS gewaschen und anschliessend 3 Stunden mit einem Peroxidasemarkierten Antikörper (Ziegen-Antikörper gegen Maus-IgG) inkubiert, der in PBS verdünnt worden war (1:1000) und 10% Ziegenserum enthielt. Nach der Reaktion wurde das Papier erneut mit PBS gewaschen und die Enzymreaktion mit 4-Chlor-1-naphthol 5 bis 10 Minuten sichtbar gemacht.
In diesem Versuch reagierten die im Beispiel 3 erhaltenen Antikörper gegen die prosomalen Enten-Proteine p 27 K und p 31 K positiv mit prosomalen Proteinen der Enten-, Maus- und Helazellen.
Die beigefügte Figur 2 zeigt:
- unter A eine Fotografie des Gels von der Elektrophorese des Proteins von Enten-Erythtozyten (a), Maus-Erythrozyten (b) und Helazellen (c) nach der Anfärbung mit Coomassie-blau, wobei M die Molekulargewichtsmarker bezeichnen;
- unter B eine Fotografie der Proteine in einem homologen Gel nach der Übertragung auf Nitrocellulose-Papier und nach der Reaktion mit dem monoklonalen Antikörper gegen das Protein p 31 K;
- unter C eine Fotografie der genannten Proteine nach der Übertragung auf Nitrocellulose-Papier und nach der Reaktion mit dem monoklonalen Antikörper gegen das Protein p 27 K.

Beispiel 5

Verwendung der monoklonalen Antikörper gegen prosomale Proteine zur Identifizierung von Prosomen

Zyto-Immunfluoreszenz-Studien wurden zur Identifizierung des prosomalen Antigens mit verschiedenen Zelltypen durchgeführt.
In einem ersten Schritt wurde ein Abstrich von Zellen gemacht, die unter Verwendung von 3% Paraformaldehyd in PBS bei Raumtemperatur 15 Minuten fixiert wurden. Nach diesem Fixierungsschritt wurden die Zellen mit 0,1% "Triton x 100" während 5 Minuten durchlässig gemacht und danach mit 1% Kaninchenserum und 0,1% Rinderserumalbumin in PBS vorinkubiert, um unspezifische Reaktionen zu unterdrükken.
Nach vier aufeinanderfolgenden Waschungen mit PBS wurden die Zellen eine Stunde in einer Feuchtkammer mit dem monoklonalen Antikörper gegen das Protein p 27 K oder dem monoklonalen Antikörper gegen das Protein p 31 K inkubiert. Die Zellen wurden danach dreimal während 30 Minuten gewaschen und mit einem zweiten Fluorescein-markierten Antikörper (Kaninchen-Antikörper gegen Maus- IgG/FITC) im Dunkeln 30 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden dann im Lichtmikroskop beobachtet und die die prosomalen Proteine enthaltenden Zellen bestimmt, wobei es sich bei diesen Zellen um die fluoreszierenden Zellen handelt.
Dieser Versuch wurde mit peripheren Blutzellen von Enten und mit Helazellen durchgeführt. Die beigefügten Figuren 3 und 4 zeigen Fotografien der im Mikroskop beobachteten Zellen.
In diesen Figuren zeigt:
- die Fotografie 3A&sub1; periphere Enten-Blutzellen, die mit dem Antikörper gegen das Protein p 27 K reagierten;
- die Fotografie 3A&sub2; periphere Enten-Blutzellen, die mit dem Antikörper gegen das Protein p 31 K reagierten. In diesen beiden Fotografien kann beobachtet werden, dass die ausgewachsenen Zellen über keine Fluoreszenz verfügen, während die jungen Zellen, die mehr oder weniger fluoreszierend sind, in einer Intensität und Verteilung über prosomale Proteine verfügen, die von ihrem Differenzierungsgrad und von der Art des verwendeten monoklonalen Antikörpers abhängen;
Die Figur 4B&sub1; zeigt Helazellen, die mit dem monoklonalen Antikörper gegen das Protein p 27 K inkubiert wurden;
Die Figur 4B&sub2; zeigt Helazellen, die mit dem monoklonalen Antikörper gegen das Protein p 31 K inkubiert wurden. In diesem Fall waren alle Zellen fluoreszierend, und somit enthielten alle prosomale Proteine. Es ist festzustellen, dass die Färbung je nach Art des verwendeten prosomalen Antikörpers verschieden ist.
Dieser Versucht zeigt, dass die monöklonalen Antikörper gemäss der Erfindung zum Studium der Differenzierung lebender menschlicher oder tierischer Zellen verwendet werden kann.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis eines mit der Zelldifferenzierung zusammenhängenden Phänomens oder einer solchen Störung in einer Probe, das umfasst:

- das Inkubieren der genannten Probe mit monoklonalen Antikörpern, nicht jedoch mit jenen monoklonalen Antikörpern, die von einer bei der Collection Nationale de Microorganismes des Institut Pasteur in Paris unter der Nummer I-588 oder I-589 hinterlegten Zelllinie produziert werden, wobei die genannten monoklonalen Antikörper gegen ein prosomales Protein gerichtet sind und direkt oder indirekt mit einer Markierung versehen werden, und anschliessende

- Bestimmung der Bindung des genannten markierten monoklonalen Antikörpers an das prosomale Protein mittels der Aktivität der Markierung.

2. Verfahren zum Nachweis eines mit der Zelldifferenzierung zusammenhängenden Phänomens oder einer solchen Störung in einer Probe, das umfasst:

- Inkubieren der genannten Probe mit einem ersten Set monoklonaler Antikörper, nicht jedoch mit jenen monoklonalen Antikörpern, die von einer bei der Collection Nationale de Microorganismes des Institut Pasteur in Paris unter der Nummer I-588 oder I-589 hinterlegten Zelllinie produziert werden, wobei die genannten Antikörper gegen ein prosomales Protein gerichtet sind; danach

- Inkubieren der genannten Probe mit markierten gegen die genannten ersten monoklonalen Antikörper gerichteten monoklonalen Antikörpern; und danach

- Bestimmen der Bindung des genannten markierten monoklonalen Antikörpers an die ersten monoklonalen Antikörper mittels der Aktivität der Markierung.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die genannten monoklonalen Antikörper gegen ein prosomales Protein gerichtet sind, das ein mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) festgestelltes Molekulargewicht von 27 K Dalton besitzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die genannten monoklonalen Antikörper gegen ein prosomales Protein gerichtet sind, das ein mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) festgestelltes Molekulargewicht von 31 K Dalton besitzt.