JPH0787967A - モノクローン抗体を生産する細胞系 - Google Patents
モノクローン抗体を生産する細胞系Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】プロソマル蛋白に対するモノクローン抗体を生
産する細胞系を提供する。 【構成】パリのパスツール研究所微生物寄託機関に寄託
番号Ｉ−５８８又はＩ−５８９として寄託された細胞
系。 【構成】この細胞系が生産する抗体は免疫化学診断法に
有用である。
産する細胞系を提供する。 【構成】パリのパスツール研究所微生物寄託機関に寄託
番号Ｉ−５８８又はＩ−５８９として寄託された細胞
系。 【構成】この細胞系が生産する抗体は免疫化学診断法に
有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明はプロソマル蛋白［pros
omal proteins］に対するモノクローン抗体を生産する
細胞系に関する。
omal proteins］に対するモノクローン抗体を生産する
細胞系に関する。
【０００２】
【従来の技術】プロソム［prosomes］は、リボ核蛋白
［ＲＮＰ］複合体［complexes ］又はＲＮＰ粒子であ
り、特にダック及びマウスの赤芽球及びヒト ヘラ［He
la] 細胞において、近年生化学的方法により示され、電
子顕微鏡によって可視化されている［SPOHR et al によ
って定義された、Eur. J. Biochem. 17, 296-318,(197
0)]。この目的で参考までに文献を引用しておく[Schmid
et al, EMBO Journal 3 (1),29-34, (1984)] 。
［ＲＮＰ］複合体［complexes ］又はＲＮＰ粒子であ
り、特にダック及びマウスの赤芽球及びヒト ヘラ［He
la] 細胞において、近年生化学的方法により示され、電
子顕微鏡によって可視化されている［SPOHR et al によ
って定義された、Eur. J. Biochem. 17, 296-318,(197
0)]。この目的で参考までに文献を引用しておく[Schmid
et al, EMBO Journal 3 (1),29-34, (1984)] 。
【０００３】プロソムの分子量は約600,000 ドルトンと
評価されている。プロソムは極めて安定した複合体であ
る。実際、これは、リボニュークレアーゼ、プロテアー
ゼＫ、１Ｍを超えるセリウム イオン、及び［上記の細
胞中における］抑制ｍＲＮＰｓの他の構成分を溶解する
ことが示されている界面活性剤“Sarkosyl”［ナトリウ
ムＮ−ラウロイルサルコシネイト］の１％強度溶液に対
して抵抗性がある。
評価されている。プロソムは極めて安定した複合体であ
る。実際、これは、リボニュークレアーゼ、プロテアー
ゼＫ、１Ｍを超えるセリウム イオン、及び［上記の細
胞中における］抑制ｍＲＮＰｓの他の構成分を溶解する
ことが示されている界面活性剤“Sarkosyl”［ナトリウ
ムＮ−ラウロイルサルコシネイト］の１％強度溶液に対
して抵抗性がある。
【０００４】これらの複合体は、約19s の沈降[sedimen
tation] 係数を有し、細胞の型及び種によって、１−１
２の小ＲＮＡ及び種に特定の員子と全ての種に共通の員
子との両者を含む蛋白の特性集団の１又はそれ以上の員
子[member]を含む。これらの員子蛋白の分子量は19,000
及び50,000の間で変わり、プロソムあたりの蛋白の分子
数は２０のオーダーである。
tation] 係数を有し、細胞の型及び種によって、１−１
２の小ＲＮＡ及び種に特定の員子と全ての種に共通の員
子との両者を含む蛋白の特性集団の１又はそれ以上の員
子[member]を含む。これらの員子蛋白の分子量は19,000
及び50,000の間で変わり、プロソムあたりの蛋白の分子
数は２０のオーダーである。
【０００５】プロソマル蛋白の集団[population]は少な
くとも25の識別員子を包含し、従って約25の異なる型の
プロソムが存在し得る。
くとも25の識別員子を包含し、従って約25の異なる型の
プロソムが存在し得る。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】現在まで、プロソムの
生理学的と及び診断的意義は明らかではなかった。然し
ながら、本発明者等は、プロソムが細胞の分化及び全生
体についてさえも細胞間の連絡及び自己免疫疾患に関連
する多くの重要な生理学間過程に関与することがあるこ
との徴候を有している。例えば、発明者等は、細胞、及
び胚の発達及び細胞分化の間の生物の官能状態と関連す
る生理学的特異性を示すプロソムの分化分布[different
ial distribution] を見出だした。
生理学的と及び診断的意義は明らかではなかった。然し
ながら、本発明者等は、プロソムが細胞の分化及び全生
体についてさえも細胞間の連絡及び自己免疫疾患に関連
する多くの重要な生理学間過程に関与することがあるこ
との徴候を有している。例えば、発明者等は、細胞、及
び胚の発達及び細胞分化の間の生物の官能状態と関連す
る生理学的特異性を示すプロソムの分化分布[different
ial distribution] を見出だした。
【０００７】特に、胚の上皮細胞において、一定の型の
プロソマル抗原が、分化の異なる段階に従って、核内
に、次いで細胞質内に、かつ次いで細胞質のセクター内
に証明されることができる。
プロソマル抗原が、分化の異なる段階に従って、核内
に、次いで細胞質内に、かつ次いで細胞質のセクター内
に証明されることができる。
【０００８】他の著しい発見には、一定の場合に多分プ
ロソマルＲＮＡに結合した単一蛋白成分の多重コピーの
みからなるプロソムが存在することがある。更に、プロ
ソムの定量分布が赤芽球の分化の段階に応じて変るばか
りでなく、更に各種のプロソマル蛋白がその後の分化段
階を通じてその分布が異なることが発見されたが、核内
の蛋白は細胞質内のものと同一の分子量を有することが
発見された。
ロソマルＲＮＡに結合した単一蛋白成分の多重コピーの
みからなるプロソムが存在することがある。更に、プロ
ソムの定量分布が赤芽球の分化の段階に応じて変るばか
りでなく、更に各種のプロソマル蛋白がその後の分化段
階を通じてその分布が異なることが発見されたが、核内
の蛋白は細胞質内のものと同一の分子量を有することが
発見された。
【０００９】プロソムは、細胞が染色体からプラスマ膜
へ及びそれを超えて広がるネットワークの部分を構成す
ることを示すことができる。このことは細胞動的構造と
形質発現及び制御のカスケイドの一連の段階［プロソム
に与えられる主な役割］との間の関係を示唆するもので
ある。プロソム及びプロソマル蛋白の決定及び特に分化
検出は、例えば癌の場合におけるように、遺伝子制御の
障害に関連する異常の診断の有力な手段と考えられる。
へ及びそれを超えて広がるネットワークの部分を構成す
ることを示すことができる。このことは細胞動的構造と
形質発現及び制御のカスケイドの一連の段階［プロソム
に与えられる主な役割］との間の関係を示唆するもので
ある。プロソム及びプロソマル蛋白の決定及び特に分化
検出は、例えば癌の場合におけるように、遺伝子制御の
障害に関連する異常の診断の有力な手段と考えられる。
【００１０】従って、プロソムは、その構造及び存在に
より、所定の細胞の生理学的状態を反映する細胞成分の
新しいクラスを代表する。
より、所定の細胞の生理学的状態を反映する細胞成分の
新しいクラスを代表する。
【００１１】このように、プロソムを同定する手段を利
用できることは必要であることが分った。これは例えば
次のような目的のためである。 Ａ） 実験目的で： 1) 生存するヒト及び動物の細胞の詳細な構造の分析、 2) 転写後の形質発現の制御の研究、及び Ｂ） 診断目的で： １） 病的状態又は病原体との関連で所定の細胞のプロ
ソマル免疫表現型の障害の定義、 ２） 分化及び発展の状態に関連する細胞の同定、例え
ば成人細胞の間の胚型の細胞の同定。
用できることは必要であることが分った。これは例えば
次のような目的のためである。 Ａ） 実験目的で： 1) 生存するヒト及び動物の細胞の詳細な構造の分析、 2) 転写後の形質発現の制御の研究、及び Ｂ） 診断目的で： １） 病的状態又は病原体との関連で所定の細胞のプロ
ソマル免疫表現型の障害の定義、 ２） 分化及び発展の状態に関連する細胞の同定、例え
ば成人細胞の間の胚型の細胞の同定。
【００１２】
【発明の構成】この発明は、従って、例えばプロソム関
連現象の検出に有用であり、一定のプロソム関連障害に
治療的に適用できるプロソマル蛋白に対して指向したモ
ノクローン抗体に関する。
連現象の検出に有用であり、一定のプロソム関連障害に
治療的に適用できるプロソマル蛋白に対して指向したモ
ノクローン抗体に関する。
【００１３】この発明は、従って、プロソム関連現象の
検出法、及び特に試料中のプロソム関連障害を診断する
方法であって、該試料を少なくとも１種のプロソマル蛋
白に対して特に指向したモノクローン抗体と共に培養す
ることを包含し、モノクローン抗体が直接的又は間接的
に標識を付与され、次いで該標識とプロソマル蛋白及び
／又は該モノクローン抗体との結合が測定される方法に
も関する。
検出法、及び特に試料中のプロソム関連障害を診断する
方法であって、該試料を少なくとも１種のプロソマル蛋
白に対して特に指向したモノクローン抗体と共に培養す
ることを包含し、モノクローン抗体が直接的又は間接的
に標識を付与され、次いで該標識とプロソマル蛋白及び
／又は該モノクローン抗体との結合が測定される方法に
も関する。
【００１４】従って、この発明は、標識にカップルした
プロソマル蛋白に対して特に指向したモノクローン抗体
を包含する診断剤にも関する。
プロソマル蛋白に対して特に指向したモノクローン抗体
を包含する診断剤にも関する。
【００１５】この発明の方法において、試料は、組織物
質［好ましくは顕微鏡検査に適したその切片］又は診断
すべき生体に由来する液体媒体［血液又はその分画、尿
又はリンパ液］、又はある場合には完全生体自体［例え
ばin imaging] であることができる。
質［好ましくは顕微鏡検査に適したその切片］又は診断
すべき生体に由来する液体媒体［血液又はその分画、尿
又はリンパ液］、又はある場合には完全生体自体［例え
ばin imaging] であることができる。
【００１６】この発明の方法に用いる標識は、免疫測定
において一般に用いられる任意の標識であることができ
る。その例には、放射性原子又は化合物、酵素、赤芽球
のような粒子、ラテックス粒子、染料の分散ゾル粒子、
金属又は金属化合物、染色体、発螢光団等がある。標識
は直接的又は間接的にモノクローン抗体に結合すること
ができる。直接結合は好ましくは共有結合によって、場
合により連結分子を用いて形成することができる。標識
とモノクローン抗体との間の間接的結合は、例えばモノ
クローン抗体と標識特定抗原、又は第２の抗体又はその
フラグメント又は蛋白Ａ又は類似化合物と、例えばアビ
ジン又はビオチンと結合するモノクローン抗体を用い、
これと標識ビオチン又はアビジンとをそれぞれ反応させ
ることによって、形成することができる。
において一般に用いられる任意の標識であることができ
る。その例には、放射性原子又は化合物、酵素、赤芽球
のような粒子、ラテックス粒子、染料の分散ゾル粒子、
金属又は金属化合物、染色体、発螢光団等がある。標識
は直接的又は間接的にモノクローン抗体に結合すること
ができる。直接結合は好ましくは共有結合によって、場
合により連結分子を用いて形成することができる。標識
とモノクローン抗体との間の間接的結合は、例えばモノ
クローン抗体と標識特定抗原、又は第２の抗体又はその
フラグメント又は蛋白Ａ又は類似化合物と、例えばアビ
ジン又はビオチンと結合するモノクローン抗体を用い、
これと標識ビオチン又はアビジンとをそれぞれ反応させ
ることによって、形成することができる。
【００１７】液体試料に適用されるこの発明の方法によ
れば、任意の型の通常の免疫測定が適用できる。その二
三をあげると、サンドイッチ測定、固相競合測定、凝集
測定、又は凝集抑制測定である。サンドイッチ測定にお
いては、一般に検出される抗原は、一方では固定化した
又は固体表面に固定化される抗体と、他方では標識され
又は標識されるべき抗体との間にサンドイッチされる。
固相競合においては、測定される抗原は例えば固相結合
抗体及び標識抗原と共に培養される。凝集測定において
は、測定する抗原は粒子結合抗体と共に培養し、これは
凝集し抗原結合で沈澱を形成する。他方、凝集抑制測定
では粒子結合抗原と共に遊離の抗体が測定する抗原と培
養され得る。
れば、任意の型の通常の免疫測定が適用できる。その二
三をあげると、サンドイッチ測定、固相競合測定、凝集
測定、又は凝集抑制測定である。サンドイッチ測定にお
いては、一般に検出される抗原は、一方では固定化した
又は固体表面に固定化される抗体と、他方では標識され
又は標識されるべき抗体との間にサンドイッチされる。
固相競合においては、測定される抗原は例えば固相結合
抗体及び標識抗原と共に培養される。凝集測定において
は、測定する抗原は粒子結合抗体と共に培養し、これは
凝集し抗原結合で沈澱を形成する。他方、凝集抑制測定
では粒子結合抗原と共に遊離の抗体が測定する抗原と培
養され得る。
【００１８】この発明による方法で組織物質が試料とし
て用いられる場合には、この組織物質は場合により先ず
固定されることができ、次いで場合により物質を先ず化
学的又は物理的手段で固定した後に標識されているか又
は標識されるべきモノクローン抗体と共に培養され得
る。
て用いられる場合には、この組織物質は場合により先ず
固定されることができ、次いで場合により物質を先ず化
学的又は物理的手段で固定した後に標識されているか又
は標識されるべきモノクローン抗体と共に培養され得
る。
【００１９】この発明に用いる標識は培養後に標識の型
あるいは用いる方法の型に応じて可視的又は器具法によ
ってその結合について観察される。
あるいは用いる方法の型に応じて可視的又は器具法によ
ってその結合について観察される。
【００２０】プロソマル蛋白に対して特に指向したモノ
クローン抗体は、不滅化した[immortalized]抗体生産細
胞の生物学的純粋の細胞系によって生産される。
クローン抗体は、不滅化した[immortalized]抗体生産細
胞の生物学的純粋の細胞系によって生産される。
【００２１】この不滅化した抗体生産細胞は、当業界で
既知の各種の方法の任意のものによって得ることがで
き、一般には次の工程を経る。1.リンパ球のような特定
の細胞の生産に適した細胞の誘導；2.該細胞の不滅化；
3.所望の特性及び親和性を有するこれらの不滅化細胞か
らのクローンの選択。しばしば用いられる方法には、コ
ーラ等が1975年に最初に記載したもので[Koehler and M
illstein,Nature 256 ,495-497 (1975)]、求められてい
る抗体に対する抗原でマウスを免疫化し、ヒ細胞を単離
し、これとマウス ミエローマ細胞と融合しいわゆるハ
イブリドーマを得る。然しながら、マウスとは異なる動
物も同様に免疫化することができ、他の体部分からの抗
体生産細胞も同様に適している。更にこれらの抗体生産
細胞はエプテインーバー[Eptein-Bar]ビールス又はオン
コジェン[oncogenic] ＤＮＡのような不滅化形質転換遺
伝物質による細胞の形質転換のような他の方法によって
不滅化することができる。
既知の各種の方法の任意のものによって得ることがで
き、一般には次の工程を経る。1.リンパ球のような特定
の細胞の生産に適した細胞の誘導；2.該細胞の不滅化；
3.所望の特性及び親和性を有するこれらの不滅化細胞か
らのクローンの選択。しばしば用いられる方法には、コ
ーラ等が1975年に最初に記載したもので[Koehler and M
illstein,Nature 256 ,495-497 (1975)]、求められてい
る抗体に対する抗原でマウスを免疫化し、ヒ細胞を単離
し、これとマウス ミエローマ細胞と融合しいわゆるハ
イブリドーマを得る。然しながら、マウスとは異なる動
物も同様に免疫化することができ、他の体部分からの抗
体生産細胞も同様に適している。更にこれらの抗体生産
細胞はエプテインーバー[Eptein-Bar]ビールス又はオン
コジェン[oncogenic] ＤＮＡのような不滅化形質転換遺
伝物質による細胞の形質転換のような他の方法によって
不滅化することができる。
【００２２】上述したように、この発明によるプロソマ
ル蛋白に対するモノクローン抗体は、免疫螢光検査、及
び免疫酵素又は放射免疫技術のような免疫測定の従来の
技術によってプロソムの検出又は同定に適している。
ル蛋白に対するモノクローン抗体は、免疫螢光検査、及
び免疫酵素又は放射免疫技術のような免疫測定の従来の
技術によってプロソムの検出又は同定に適している。
【００２３】この発明による方法の適用は、生物学の実
験研究の分野及び医学研究の分野において、特に癌研
究、及び較差免疫表現型による疾病の診断のための臨床
医学において極めて重要である。
験研究の分野及び医学研究の分野において、特に癌研
究、及び較差免疫表現型による疾病の診断のための臨床
医学において極めて重要である。
【００２４】例えば、生物学の実験研究の分野におい
て、この発明による方法は汎存生理学複合体の役割にお
いてプロソムの構造の特性化、機能及び合成に用いるこ
とができる。特に、プロソムの個別の型の較差細胞学的
局在は、細胞分画及び生化学の方法により、又は完全細
胞又は組織切片の免疫螢光検査によって、この発明によ
る方法を用いて非常に容易となる。
て、この発明による方法は汎存生理学複合体の役割にお
いてプロソムの構造の特性化、機能及び合成に用いるこ
とができる。特に、プロソムの個別の型の較差細胞学的
局在は、細胞分画及び生化学の方法により、又は完全細
胞又は組織切片の免疫螢光検査によって、この発明によ
る方法を用いて非常に容易となる。
【００２５】発達生物学において、プロソムの存在又は
不在及び特定の型の細胞における特定のプロソムの特徴
的細胞学的局在を与えることによって、プロソマルモノ
クローン抗体は胚の発達における特定細胞の特性化、同
定及び追跡に有用であり、従来そうであったように、発
達に関して確立される動的組織学を可能にする。プロソ
ムが遺伝子表出の較差制御に関与する限り、この発明に
よる方法は細胞制御の基礎となる機構を解明するのみに
用いることができる。
不在及び特定の型の細胞における特定のプロソムの特徴
的細胞学的局在を与えることによって、プロソマルモノ
クローン抗体は胚の発達における特定細胞の特性化、同
定及び追跡に有用であり、従来そうであったように、発
達に関して確立される動的組織学を可能にする。プロソ
ムが遺伝子表出の較差制御に関与する限り、この発明に
よる方法は細胞制御の基礎となる機構を解明するのみに
用いることができる。
【００２６】医学研究の分野において、この発明による
方法は、較差免疫表現型により、特定組織の細胞の型及
び細胞の分化の段階に応じ確立されるプロソマル抗原の
分布の実際の地図を可能にする。細胞の制御に影響する
病理学的条件の場合におけるこの分布の変更、従って生
理学的状態は、この発明の方法を用いて同定することが
できる。
方法は、較差免疫表現型により、特定組織の細胞の型及
び細胞の分化の段階に応じ確立されるプロソマル抗原の
分布の実際の地図を可能にする。細胞の制御に影響する
病理学的条件の場合におけるこの分布の変更、従って生
理学的状態は、この発明の方法を用いて同定することが
できる。
【００２７】異なる起源の病理学的条件の臨床診断にあ
ったて、この発明による方法は必須の手段を提供する。
実際、この方法は、健常からそれて、例えばバイオプシ
ーによって除かれた組織の切片及び生理液体中に迅速に
認識すべき細胞の存在及び分布を可能にする。この方法
で、現在は細胞学及び組織学の高度の経験を必要とする
病理学的条件の診断が較差フルオロメトリーによって自
動化され得る。
ったて、この発明による方法は必須の手段を提供する。
実際、この方法は、健常からそれて、例えばバイオプシ
ーによって除かれた組織の切片及び生理液体中に迅速に
認識すべき細胞の存在及び分布を可能にする。この方法
で、現在は細胞学及び組織学の高度の経験を必要とする
病理学的条件の診断が較差フルオロメトリーによって自
動化され得る。
【００２８】癌に関しては、この発明による方法は発達
の初期の段階において末梢血液中の細胞の存在を検出す
るのに極めて有用である。実際、健常末梢血液は未熟細
胞を極めて少数しか含有しない。対照的に、白血病患者
の末梢血液にはかなりの数の未熟細胞が存在することが
認められている。
の初期の段階において末梢血液中の細胞の存在を検出す
るのに極めて有用である。実際、健常末梢血液は未熟細
胞を極めて少数しか含有しない。対照的に、白血病患者
の末梢血液にはかなりの数の未熟細胞が存在することが
認められている。
【００２９】
【実施例】この発明は、次にあげる例によって詳細に説
明する。 例 １プロソマル蛋白の単離 蛋白は電気泳動によってプロソムから抽出する。プロソ
ムは予めショ糖勾配[gradient]に基づき分割法によって
他の細胞複合体から分離したものである。
明する。 例 １プロソマル蛋白の単離 蛋白は電気泳動によってプロソムから抽出する。プロソ
ムは予めショ糖勾配[gradient]に基づき分割法によって
他の細胞複合体から分離したものである。
【００３０】プロソマル蛋白の生産は次の工程からな
る。 1) 遠心分離により及びショ糖勾配に基づく分割法によ
って他の細胞複合体からのプロソムの分離、及び約198
の沈降係数を有する粒子の回収。 2) ゲル電気泳動による求める蛋白の抽出。
る。 1) 遠心分離により及びショ糖勾配に基づく分割法によ
って他の細胞複合体からのプロソムの分離、及び約198
の沈降係数を有する粒子の回収。 2) ゲル電気泳動による求める蛋白の抽出。
【００３１】ダック及びマウスのプロソムの生産は文献
に詳細に記載されている［SCHMID et al, EMBO Journal
3 (1),29-34,(1984)] 。
に詳細に記載されている［SCHMID et al, EMBO Journal
3 (1),29-34,(1984)] 。
【００３２】ヘラ細胞プロソムは次の手順に従って得ら
れた。 1) ポスト−ミトコンドリア上澄みをヘラ細胞の培養か
ら文献［GANDER et al.Eur. J. Biochem. 38, 443-452,
1973] に記載の方法で調製した。 2) ポリリポゾーム及びポスト−リポゾーム粒子の調製
は文献［VINCENT et al.Eur. J. Biochem. 112, 617-63
3, 1980] に記載の方法で調製した。 3) 遊離の細胞質リボ核蛋白複合体は低塩含量のバッフ
ァ中15-28 ％強度（重量／重量）イソカイネチック シ
ョ糖勾配に再懸濁したポスト−リポゾーム粒子のペレッ
トの沈降によって分画した。この組成は次の通りであ
る：10 mM トリエタノールアミン．ＨＣｌ（ｐＨ7.4
）、 50 mM ＫＣｌ及び５mM 2-メルカプトエタノ
ール。この分画はＴｉ14型のベックマン ゾーナル ロ
ータ中で 15h、41,000rpm 及び4 ℃で行った。 4) 15-30Ｓの範囲内で沈降した粒子は次いで再び合
せ、ベックマン型Ｔｉ60ロータ中で 18h、48,000rpm 及
び4 ℃で高速遠心分離によって濃縮した。 5) 遠心分離ペレットをショ糖勾配[ 5-21％重量／重
量］にＫＣｌの存在下で、0.5M［ロータSW41 37,000 rp
m. 17h、 4℃］の濃度で入れ、約19Ｓで沈降した分画を
回収した。
れた。 1) ポスト−ミトコンドリア上澄みをヘラ細胞の培養か
ら文献［GANDER et al.Eur. J. Biochem. 38, 443-452,
1973] に記載の方法で調製した。 2) ポリリポゾーム及びポスト−リポゾーム粒子の調製
は文献［VINCENT et al.Eur. J. Biochem. 112, 617-63
3, 1980] に記載の方法で調製した。 3) 遊離の細胞質リボ核蛋白複合体は低塩含量のバッフ
ァ中15-28 ％強度（重量／重量）イソカイネチック シ
ョ糖勾配に再懸濁したポスト−リポゾーム粒子のペレッ
トの沈降によって分画した。この組成は次の通りであ
る：10 mM トリエタノールアミン．ＨＣｌ（ｐＨ7.4
）、 50 mM ＫＣｌ及び５mM 2-メルカプトエタノ
ール。この分画はＴｉ14型のベックマン ゾーナル ロ
ータ中で 15h、41,000rpm 及び4 ℃で行った。 4) 15-30Ｓの範囲内で沈降した粒子は次いで再び合
せ、ベックマン型Ｔｉ60ロータ中で 18h、48,000rpm 及
び4 ℃で高速遠心分離によって濃縮した。 5) 遠心分離ペレットをショ糖勾配[ 5-21％重量／重
量］にＫＣｌの存在下で、0.5M［ロータSW41 37,000 rp
m. 17h、 4℃］の濃度で入れ、約19Ｓで沈降した分画を
回収した。
【００３３】全ての場合において、プロソマル蛋白はこ
れらの分画から抽出し、ゲル電気泳動の既知の方法を用
いて同定した、例えば、レムリ［LAEMMLI, Nature 227,
680-685, 1970] による一次元ナトリウム ドデシル
サルフェイト［ＳＤＳ］−ポリアクリルアミドゲル上の
電気泳動、又はオファレル[O'FARRELL et al. Cell.12,
1133-1142, 1977] の記載した二次元ゲル上の電気泳動
である。これらの電気泳動法に用いた分子量マーカーは
次の化合物である：フォスフォリラゼ-b［94Ｋ］、ボビ
ン血清アルブミン［64Ｋ］、オバルブミン［43Ｋ］、カ
ルボニック アンヒドラーゼ［31Ｋ］、大豆トリプシン
インヒビター［21Ｋ］及びラクトアルブミン［14
Ｋ］。 例 ２プロソマル蛋白に対するモノクローン抗体 一般的にいって、この発明によるプロソムの蛋白に対す
る抗体を生産するハイブリドマ細胞系を得る方法は次の
工程を包含する。 1) 例１によって調製した所望の蛋白の所定量でのマウ
スの免疫。 2) 免疫マウスのヒ臓の除去及びヒ臓細胞の分離。 3) こうして得たヒ臓細胞のマウスミエローマ細胞との
融合促進剤の存在下における融合。 4) 未融合ミエローマ細胞が成長しない選択性媒体中
で、かつ適当な栄養成分の存在下での得られたハイブリ
ッド細胞の培養。 5) 所望の抗体を生産する細胞の選択及びこれらの細胞
のクローニング。
れらの分画から抽出し、ゲル電気泳動の既知の方法を用
いて同定した、例えば、レムリ［LAEMMLI, Nature 227,
680-685, 1970] による一次元ナトリウム ドデシル
サルフェイト［ＳＤＳ］−ポリアクリルアミドゲル上の
電気泳動、又はオファレル[O'FARRELL et al. Cell.12,
1133-1142, 1977] の記載した二次元ゲル上の電気泳動
である。これらの電気泳動法に用いた分子量マーカーは
次の化合物である：フォスフォリラゼ-b［94Ｋ］、ボビ
ン血清アルブミン［64Ｋ］、オバルブミン［43Ｋ］、カ
ルボニック アンヒドラーゼ［31Ｋ］、大豆トリプシン
インヒビター［21Ｋ］及びラクトアルブミン［14
Ｋ］。 例 ２プロソマル蛋白に対するモノクローン抗体 一般的にいって、この発明によるプロソムの蛋白に対す
る抗体を生産するハイブリドマ細胞系を得る方法は次の
工程を包含する。 1) 例１によって調製した所望の蛋白の所定量でのマウ
スの免疫。 2) 免疫マウスのヒ臓の除去及びヒ臓細胞の分離。 3) こうして得たヒ臓細胞のマウスミエローマ細胞との
融合促進剤の存在下における融合。 4) 未融合ミエローマ細胞が成長しない選択性媒体中
で、かつ適当な栄養成分の存在下での得られたハイブリ
ッド細胞の培養。 5) 所望の抗体を生産する細胞の選択及びこれらの細胞
のクローニング。
【００３４】この方法の第一工程、即ちマウスの免疫は
抗体合成の細胞の記憶を刺激するように行なう。
抗体合成の細胞の記憶を刺激するように行なう。
【００３５】免疫プロトコルは、皮下又は腹腔内に、約
2-3 週間の間隔で連続３回、所定量のプロソム蛋白を、
融合の前４日及び２月の休養期間後、注射して、同量の
プロソム蛋白で皮下又は腹腔内に投与を与えることから
成る。
2-3 週間の間隔で連続３回、所定量のプロソム蛋白を、
融合の前４日及び２月の休養期間後、注射して、同量の
プロソム蛋白で皮下又は腹腔内に投与を与えることから
成る。
【００３６】各注射に用いるプロソム蛋白の量はマウス
あたり約20-50 μｇである。
あたり約20-50 μｇである。
【００３７】この方法で免疫したマウスは次いで殺し、
そのヒ臓を除き、文献［例えば、MOORE et al.“Cultur
e of Normal Human Leucocytes”J.A.M.A.199, 519-52
4, 1967] に定められたようにＲＰＭＩ1940媒体中でヒ
臓細胞回収処理をする。
そのヒ臓を除き、文献［例えば、MOORE et al.“Cultur
e of Normal Human Leucocytes”J.A.M.A.199, 519-52
4, 1967] に定められたようにＲＰＭＩ1940媒体中でヒ
臓細胞回収処理をする。
【００３８】細胞融合は、この発明の第３工程となるも
ので、プロソム蛋白に対し免疫のマウスのヒ臓細胞とマ
ウス ミエソーマとを、融合促進剤ポリエチレン グリ
コールの存在下で、コーラ、ミルスタインの技術［KOHL
ER and MILSTEIN, Nature 256, 495-497 (1975)]に従っ
て混合することからなる。ミエローマ細胞はヒ臓細胞に
対して1:10の割合で使用する。
ので、プロソム蛋白に対し免疫のマウスのヒ臓細胞とマ
ウス ミエソーマとを、融合促進剤ポリエチレン グリ
コールの存在下で、コーラ、ミルスタインの技術［KOHL
ER and MILSTEIN, Nature 256, 495-497 (1975)]に従っ
て混合することからなる。ミエローマ細胞はヒ臓細胞に
対して1:10の割合で使用する。
【００３９】ポリエチレン グリコールの存在下、１分
間37℃で攪拌しながら培養後、細胞はＲＰＭＩ1640媒体
中で洗浄し、同一媒体中に再懸濁し、次いでハイブリッ
ド細胞の成長に適した選択的媒体で培養する。
間37℃で攪拌しながら培養後、細胞はＲＰＭＩ1640媒体
中で洗浄し、同一媒体中に再懸濁し、次いでハイブリッ
ド細胞の成長に適した選択的媒体で培養する。
【００４０】ミエローマ細胞は、酵素ヒポキサンチン：
グアニン フォスフォリボシルトランスフェラーゼが欠
けているので、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチ
ミジンを含む媒体を再現しない。従って、ハイブリドー
マ細胞の成長のための選択的媒体はヒポキサンチン、ア
ミノプテリンおよびチミジンを含む。
グアニン フォスフォリボシルトランスフェラーゼが欠
けているので、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチ
ミジンを含む媒体を再現しない。従って、ハイブリドー
マ細胞の成長のための選択的媒体はヒポキサンチン、ア
ミノプテリンおよびチミジンを含む。
【００４１】所望のプロソーム蛋白に対する抗体を生産
する細胞は次いで選択されクーロンされる。実質的量の
モノクローン抗体の生産は、この方法で選択されたハイ
ブリッド細胞の管中培養によるか、又はマウスに注射
し、約15日後に求める抗体を含む酸性液体を収穫するこ
とによって行なうことができる。
する細胞は次いで選択されクーロンされる。実質的量の
モノクローン抗体の生産は、この方法で選択されたハイ
ブリッド細胞の管中培養によるか、又はマウスに注射
し、約15日後に求める抗体を含む酸性液体を収穫するこ
とによって行なうことができる。
【００４２】こうして得られたモノクローン抗体は-20
℃で冷凍して貯蔵する。 例 ３ダック プロソムの蛋白ｐ27Ｋ及びｐ31Ｋに対する抗体
の調製 ビンセントの記載する方法［VINCENT et al. Eur. J. B
iochem. 112, 617-633, (1980)] によって得られたダッ
ク20ＳグロビンｍＲＮＰｓを、0.5M ＫＣｌの処理で沈
降係数４Ｓ、13Ｓ、16Ｓ及び19Ｓ（プロソム）の４の主
要サブ複合体に解離される。特定のプロソム蛋白に対す
る抗体を得るため、Balb c マウスに上記例２に定めた
免疫プロトコルに従いフロインド［Freund] 助剤の存在
下20μｇのプロソム［上で得られた19Ｓ沈降の粒子］を
腹腔内及び皮下に注射した。第２の注射の１週間後、マ
ウス血清をサンプリングし、抗体の存在をＥＬＩＳＡ及
び免疫電気泳動技術により検出した。
℃で冷凍して貯蔵する。 例 ３ダック プロソムの蛋白ｐ27Ｋ及びｐ31Ｋに対する抗体
の調製 ビンセントの記載する方法［VINCENT et al. Eur. J. B
iochem. 112, 617-633, (1980)] によって得られたダッ
ク20ＳグロビンｍＲＮＰｓを、0.5M ＫＣｌの処理で沈
降係数４Ｓ、13Ｓ、16Ｓ及び19Ｓ（プロソム）の４の主
要サブ複合体に解離される。特定のプロソム蛋白に対す
る抗体を得るため、Balb c マウスに上記例２に定めた
免疫プロトコルに従いフロインド［Freund] 助剤の存在
下20μｇのプロソム［上で得られた19Ｓ沈降の粒子］を
腹腔内及び皮下に注射した。第２の注射の１週間後、マ
ウス血清をサンプリングし、抗体の存在をＥＬＩＳＡ及
び免疫電気泳動技術により検出した。
【００４３】第３の注射の２月後、同量のプロソムの投
与を静脈内及び腹腔内に行ない、４日後マウスを殺し、
そのヒ臓を除き、ヒ臓細胞［106 ］を融合促進剤として
ポリエチレン グリコールを用い、コーラ、ミルスタイ
ンの方法に従い［スイスのバーゼルの HOFFMANN-LA-ROC
HEの T.STAEHELIN研究所から提供された］ＰＡＩマウス
のミエローマ細胞［107 ］と融合させた。
与を静脈内及び腹腔内に行ない、４日後マウスを殺し、
そのヒ臓を除き、ヒ臓細胞［106 ］を融合促進剤として
ポリエチレン グリコールを用い、コーラ、ミルスタイ
ンの方法に従い［スイスのバーゼルの HOFFMANN-LA-ROC
HEの T.STAEHELIN研究所から提供された］ＰＡＩマウス
のミエローマ細胞［107 ］と融合させた。
【００４４】プロソム蛋白に対する抗体を生産する細胞
は次いで選択的媒体で選択され、制限希釈法によってク
ローンした。
は次いで選択的媒体で選択され、制限希釈法によってク
ローンした。
【００４５】抗体を生産するハイブリッド細胞の検出は
ＥＬＩＳＡ法及び免疫電気移転法によって行なった。
ＥＬＩＳＡ法及び免疫電気移転法によって行なった。
【００４６】この２の試験で、20ＳグロビンｍＲＮＰ粒
子を抗原として用い、ポジチブ クローン、即ちプロソ
ム蛋白ｐ27Ｋ及びｐ31Ｋに対する抗体を生産するクロー
ンをこの抗原で選択した。
子を抗原として用い、ポジチブ クローン、即ちプロソ
ム蛋白ｐ27Ｋ及びｐ31Ｋに対する抗体を生産するクロー
ンをこの抗原で選択した。
【００４７】ｐ27Ｋ及びｐ31Ｋプロソム蛋白に対するモ
ノクローン抗体を生産する細胞系を、パスツール研究所
の国立微生物寄託機関［Collection National de Cultu
re de Microorganisms of the Pasteur Institute]に、
それぞれ寄託番号Ｉ−５８８及び寄託番号Ｉ−５８９と
してブダペスト条約に基づく国際寄託をした。
ノクローン抗体を生産する細胞系を、パスツール研究所
の国立微生物寄託機関［Collection National de Cultu
re de Microorganisms of the Pasteur Institute]に、
それぞれ寄託番号Ｉ−５８８及び寄託番号Ｉ−５８９と
してブダペスト条約に基づく国際寄託をした。
【００４８】抗-p27Ｋ抗体を生産する細胞系［内部記号
ＩＢ５と指称する］は、約5.9 の等電ｐＨを有するクラ
スＩｇＧｌの抗体を生産する。
ＩＢ５と指称する］は、約5.9 の等電ｐＨを有するクラ
スＩｇＧｌの抗体を生産する。
【００４９】抗-p31Ｋ抗体を生産する細胞系［内部記号
ＡＡ４と指称する］は、約5.2 の等電ｐＨを有するクラ
スＩｇＧｌの抗体をも生産する。
ＡＡ４と指称する］は、約5.2 の等電ｐＨを有するクラ
スＩｇＧｌの抗体をも生産する。
【００５０】添附の図１は次のものを示す。
【００５１】254nm で観察した0.5mＫＣｌ存在下ショ糖
勾配中のダック20ＳグロビンｍＲＮＰ粒子の沈降プロフ
ィール［図１Ａ］。
勾配中のダック20ＳグロビンｍＲＮＰ粒子の沈降プロフ
ィール［図１Ａ］。
【００５２】蛋白をクウマシイ［Coomasie] ブルーで染
色し、Ａに示す勾配の分画の蛋白の一次元ＳＤＳポリア
クリルアミド ゲルの写真。この図でＭは分子量マーカ
ーを示し、ゾーン3-6 はダック プロソム蛋白に対応す
る。
色し、Ａに示す勾配の分画の蛋白の一次元ＳＤＳポリア
クリルアミド ゲルの写真。この図でＭは分子量マーカ
ーを示し、ゾーン3-6 はダック プロソム蛋白に対応す
る。
【００５３】次の例４と同一の方法によってニトロセル
ロース紙に移し、蛋白ｐ27Ｋ［図１Ｃ1 ］及び蛋白ｐ31
Ｋ［図１Ｃ2 ］に対するモノクローン抗体で後続反応[E
LISA] をしたＢで示したゲルと同種ゲル中の蛋白の写
真。 例 ４例３で得られたモノクローン蛋白を用いる蛋白27Ｋ及び
31Ｋの全般的性質の説明 この例における蛋白27Ｋ及び31Ｋの語はそれぞれ分子量
27000 及び31000 を有するプロソマル蛋白を指すもので
ある。
ロース紙に移し、蛋白ｐ27Ｋ［図１Ｃ1 ］及び蛋白ｐ31
Ｋ［図１Ｃ2 ］に対するモノクローン抗体で後続反応[E
LISA] をしたＢで示したゲルと同種ゲル中の蛋白の写
真。 例 ４例３で得られたモノクローン蛋白を用いる蛋白27Ｋ及び
31Ｋの全般的性質の説明 この例における蛋白27Ｋ及び31Ｋの語はそれぞれ分子量
27000 及び31000 を有するプロソマル蛋白を指すもので
ある。
【００５４】プロソマル蛋白に対するモノクローン抗体
の特異性及び全般性を示すため、0.5 Ｍ塩化カリウム中
でショ糖勾配で解離後得られたダック、マウス及びヘラ
細胞プロソム蛋白を一次元ゲル電気泳動に付しクウマシ
イ ブルーで染色した。同種ゲルの蛋白を、トウビンの
技術によって［TOWBIN et al. Proc. Natl. Acad.Sci.
USA 76, 4350-4354] ゲルからニトロセルロース紙に移
した。移した後、ニトロセルロース紙を４℃で３％のボ
ビン血清アルブミンを含有するＰＢＳフォスフェイト
バッファ中に一夜浸漬し非−特定反応生成物を除いた、
次いで、この紙を腹水液体に由来する例３で得られたプ
ロソム蛋白に対する抗体と18℃で一夜培養しＰＢＳに希
釈した［1:600]。次いで、この紙を４回ＰＢＳで洗浄し
た後、３時間ＰＢＳで希釈し［1:1000] 、10％ゴート血
清を含むパーオキシダーゼ標識抗体［マウスＩｇＧに対
するゴート抗体］で培養した。反応後、この紙を再びＰ
ＢＳで洗浄し5-10分間4-クロロ-1- ナフトールで酵素反
応が可視化した。
の特異性及び全般性を示すため、0.5 Ｍ塩化カリウム中
でショ糖勾配で解離後得られたダック、マウス及びヘラ
細胞プロソム蛋白を一次元ゲル電気泳動に付しクウマシ
イ ブルーで染色した。同種ゲルの蛋白を、トウビンの
技術によって［TOWBIN et al. Proc. Natl. Acad.Sci.
USA 76, 4350-4354] ゲルからニトロセルロース紙に移
した。移した後、ニトロセルロース紙を４℃で３％のボ
ビン血清アルブミンを含有するＰＢＳフォスフェイト
バッファ中に一夜浸漬し非−特定反応生成物を除いた、
次いで、この紙を腹水液体に由来する例３で得られたプ
ロソム蛋白に対する抗体と18℃で一夜培養しＰＢＳに希
釈した［1:600]。次いで、この紙を４回ＰＢＳで洗浄し
た後、３時間ＰＢＳで希釈し［1:1000] 、10％ゴート血
清を含むパーオキシダーゼ標識抗体［マウスＩｇＧに対
するゴート抗体］で培養した。反応後、この紙を再びＰ
ＢＳで洗浄し5-10分間4-クロロ-1- ナフトールで酵素反
応が可視化した。
【００５５】この実験で、ダック プロソム蛋白ｐ27Ｋ
及びｐ31Ｋに対する例３で得た抗体は、ダック、マウス
及びヘラ細胞プロソム蛋白にポジチブに反応した。
及びｐ31Ｋに対する例３で得た抗体は、ダック、マウス
及びヘラ細胞プロソム蛋白にポジチブに反応した。
【００５６】添附の図２は次のものを示す。
【００５７】Ａでは、クウマシイ ブルー染色後のダッ
ク赤血球（ａ）、マウス赤血球（ｂ）及びヘラ細胞
（ｃ）の蛋白の電気泳動からのゲルの写真で、Ｍは分子
量マーカーを示す。
ク赤血球（ａ）、マウス赤血球（ｂ）及びヘラ細胞
（ｃ）の蛋白の電気泳動からのゲルの写真で、Ｍは分子
量マーカーを示す。
【００５８】Ｂでは、ニトロセルロース紙に移し蛋白ｐ
31Ｋに対するモノクローン抗体との反応後の同種ゲルに
おける蛋白の写真。
31Ｋに対するモノクローン抗体との反応後の同種ゲルに
おける蛋白の写真。
【００５９】Ｃでは、ニトロセルロース紙に移し蛋白ｐ
27Ｋに対するモノクローン抗体との反応後の該蛋白の写
真。 例 ５プロソムの同定のためのプロソマル蛋白に対するモノク
ローン抗体の利用 シト免疫螢光研究をプロソマル抗原の同定のため各種の
型の細胞で行なった。
27Ｋに対するモノクローン抗体との反応後の該蛋白の写
真。 例 ５プロソムの同定のためのプロソマル蛋白に対するモノク
ローン抗体の利用 シト免疫螢光研究をプロソマル抗原の同定のため各種の
型の細胞で行なった。
【００６０】第１段階では、室温で15分間ＰＢＳ中３％
パラフォルムアルデヒドを用いて固定した細胞からスミ
アをつくった。この固定段階後、細胞を５分間 0.1％
「トリトン×100]で浸透させ、次いでＰＢＳ中１％ラビ
ット血清及び 0.1％ボビン血清アルブミンで予培養して
非特定反応を抑制した。
パラフォルムアルデヒドを用いて固定した細胞からスミ
アをつくった。この固定段階後、細胞を５分間 0.1％
「トリトン×100]で浸透させ、次いでＰＢＳ中１％ラビ
ット血清及び 0.1％ボビン血清アルブミンで予培養して
非特定反応を抑制した。
【００６１】ＰＢＳで４回連続洗浄後、細胞を１時間湿
潤室内で蛋白ｐ27Ｋに対するモノクローン抗体又は蛋白
ｐ31Ｋに対するモノクローン抗体で培養した。細胞は次
いで３回30分間洗浄し、第２螢光標識抗体［マウスIgG/
FITCに対するラビット抗体］で30分間暗所で培養した。
細胞は次いで光顕微鏡で観察し、細胞は測定したプロソ
マル蛋白を含有し、これらの細胞は螢光細胞であった。
潤室内で蛋白ｐ27Ｋに対するモノクローン抗体又は蛋白
ｐ31Ｋに対するモノクローン抗体で培養した。細胞は次
いで３回30分間洗浄し、第２螢光標識抗体［マウスIgG/
FITCに対するラビット抗体］で30分間暗所で培養した。
細胞は次いで光顕微鏡で観察し、細胞は測定したプロソ
マル蛋白を含有し、これらの細胞は螢光細胞であった。
【００６２】この実験はダック末梢血液細胞及びヘラ細
胞について行なった。図３及び図４は顕微鏡で観察した
細胞の写真である。
胞について行なった。図３及び図４は顕微鏡で観察した
細胞の写真である。
【００６３】これらの図において；写真３Ａ1 は、蛋白
ｐ27Ｋに対する抗体と反応したダック末梢血液細胞のも
のである。写真３Ａ2 は、蛋白ｐ31Ｋに対する抗体と反
応したダック末梢血液細胞のものである。これらの２写
真において成体細胞は実質的に螢光を欠いているが、和
解細胞は多いか少ないかはあるが螢光であり、分化の程
度及び使用したモノクローン抗体の型に応じた強度及び
分布のプロソマル蛋白の存在を示す。
ｐ27Ｋに対する抗体と反応したダック末梢血液細胞のも
のである。写真３Ａ2 は、蛋白ｐ31Ｋに対する抗体と反
応したダック末梢血液細胞のものである。これらの２写
真において成体細胞は実質的に螢光を欠いているが、和
解細胞は多いか少ないかはあるが螢光であり、分化の程
度及び使用したモノクローン抗体の型に応じた強度及び
分布のプロソマル蛋白の存在を示す。
【００６４】図４Ｂ1 は、蛋白ｐ27Ｋに対するモノクロ
ーン抗体で培養したヘラ細胞を示し、図４Ｂ2 は、蛋白
ｐ31Ｋに対するモノクローン抗体で培養したヘラ細胞を
示す。この場合、細胞はすべて螢光であり、従ってすべ
てプロソマル蛋白を含む。染色は使用したプロソマル抗
体の型に応じて異なることを注意すべきである。
ーン抗体で培養したヘラ細胞を示し、図４Ｂ2 は、蛋白
ｐ31Ｋに対するモノクローン抗体で培養したヘラ細胞を
示す。この場合、細胞はすべて螢光であり、従ってすべ
てプロソマル蛋白を含む。染色は使用したプロソマル抗
体の型に応じて異なることを注意すべきである。
【００６５】この実験は、この発明によるモノクローン
抗体が生存ヒト及び動物細胞の分化［differentiation]
の研究に用いられるを示すものである。
抗体が生存ヒト及び動物細胞の分化［differentiation]
の研究に用いられるを示すものである。
【図１】各種の蛋白の状態を示す写真。
【図２】各ゲルにおける蛋白の状態を示す写真。
【図３】各状態の細胞の顕微鏡写真。
【図４】各状態のヘラ細胞の顕微鏡写真。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ // Ｃ０７Ｋ 16/44 8318−4Ｈ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (2)
- 【請求項１】 パリのパスツール研究所微生物寄託機
関に寄託番号Ｉ−５８８として寄託された細胞系。 - 【請求項２】 パリのパスツール研究所微生物寄託機
関に寄託番号Ｉ−５８９として寄託された細胞系。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8512946A FR2586814A1 (fr) | 1985-08-30 | 1985-08-30 | Anticorps monoclonaux anti-proteines p 27 k et p 31 k de prosomes et leur application a titre de reactifs de diagnostic et/ou d'identification de cellules |
| FR8512946 | 1985-08-30 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61201923A Division JPH0671435B2 (ja) | 1985-08-30 | 1986-08-29 | モノクロ−ン抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0787967A true JPH0787967A (ja) | 1995-04-04 |
| JPH0822226B2 JPH0822226B2 (ja) | 1996-03-06 |
Family
ID=9322505
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61201923A Expired - Lifetime JPH0671435B2 (ja) | 1985-08-30 | 1986-08-29 | モノクロ−ン抗体 |
| JP6066670A Expired - Lifetime JPH0822226B2 (ja) | 1985-08-30 | 1994-03-10 | モノクローン抗体を生産する細胞系 |
Family Applications Before (1)
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