JPH05503712A - 診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 明細書 診断方法 技術分野 本発明はＨＴＶ感染の診断に有用な診断方法に関する。

背景技術 後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ″）はヒト免疫不全ウィルス（“ＨＴＶ“）に より引き起こされると考えられている疾患である。ＨＩＶの主な標的は２つの異 なる細胞、１４９２８球及びマクロファージである。一度感染すると１４９２８ 球数は一般的に減少し始める。１４９２８球と異なりマクロファージはＨＩＶ感 染により死滅しないが実際上のウィルスの保有宿主としての役割を果たすことに なる。Ｇａ１ｌｏ＆Ｍｏｎｔａｇｎｅｉｒ’ＡＩＤｓ　ｉｎ　１９８８’、５ｃ ｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ、ｐ、２５　（Ｏｃｔ、１９８８）。

Ｈｌ”ｖ’感染を受けたヒトの早期診断は、一般にヒトがＨＩＶに対する抗体を 育するか否かを測定する診断テストの使用を伴う。患者が疾患のできるだけ早い 時期から最適な医療上のケアを受けること及び感染の更なる広がりをチェックす ることを可能にするため、ＨｒＶ感染において早期診断は特に重要である。

Ｒｅｄｆｉｅｌｄ＆Ｂｕｒｋｅ”ＨＩＶ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：Ｔｈｅ　Ｃ１１ ｎｉｃａｌ　Ｐｉｃｔｕｒｅ”、５ｃｉｅｎｔ欧州特許出願２１９．３６８Ａ　 （米国特許出願Ｓｅｔ、Ｎｏ。

０７／２９８，７９１の対応出願）は、“プロシーム（ｐｒ。

ｓｏｍｅ）”の構成部分を成す蛋白質に対して誘導されたいくつかのモノクロー ナル抗体について開示している。プロシームは、Ｓｃｈｍｉｄ　ｅｔ　ａｔの“ プロシーム：抑制されたメツセンジャーリボ核蛋白質と結合し、特異的５ｃＲＮ Ａ及び特徴的な蛋白質を含む形態学上独特な偏在するリボ核蛋白質粒子”Ｔｈｅ 　ＥＭＢＯ，Ｊｏｕｒｎａｌ、３　（１）、２９−３４（１９８４）に記載され ている細胞内粒子である。

プロシームは“プロテアシーム（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）″またはｍａｐ”　（ ｍｕｌｔｉｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｐｒｏｔｅａｓｅ）と様々な名称で呼ばれてき た。欧州特許出願０３４５７５０Ａ２は“多官能性プロテアーゼ及びそれに対す る抗体について開示している。この出願で記述されている多官能性プロテアーゼ はプロシームであり得る。

１９９０年代の初期から、プロシーム蛋白質に対するマウスモノクローナル抗体 はＢｅｌｇｉｕｍ、Ｔｕｒｎｈｏｕｔの０ｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ　ｎｖ より市販されている。市販されているモノクローナル抗体はプロシーム蛋白質ｐ ２３Ｋ。

ｐ２５に、ｐ２７に、ｐ２９Ｋ　（ｐ２８に、ｐ３３Ｋ）、ｐ３０／３３　Ｋ、 及びｐ３１Ｋに対するモノクローナル抗体、並びに抗ｐ２１Ｋ　（’プロシーム 類似粒子”）である。これらの抗９０）中に詳しく記載されている。

欧州特許出願２１９．３６８Ａ１は、プロシームが細胞や生物の分化、細胞間の コミユニケージタン、自己免疫病に関する多くの生理学的なプロセスと関連し得 ることについても開示している。またプロシームに対するモノクローナル抗体は 例えば癌の診断に有用であり得ることが開示されている。

Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｎｅｗｓで開示されたプロシーム蛋白質に 対するモノクローナル抗体の利用性には、プロシームの分子生物学、正常および 異常な細胞及び組織におけるプロシームの特異型の分布、メツセンジャーリポ核 蛋′白質及び他のリボ核蛋白質の研究が挙げられている。

これらの抗プロシーム蛋白質モノクローナル抗体がエイズまたはＨＩＶ感染等の 感染性の疾患の診断に何らかの有用性を示す可能性についてはどこにも記述また は示唆されていない。

本発明の開示 ＨＩＶに感染したヒトがそのウィルスに感染していないヒトの細胞と異なる表面 抗原を持つ細胞（例えばＴ４及び１８９２８球並びにＢ４細胞）を有することが 発見された。驚くべきことに、特定の細胞上のこれらの表面抗原の存在は、ある 種のラベルされた抗プロシーム蛋白質モノクローナル抗体（例えば、プロシーム 蛋白質ｐ２３に、ｐ２５に、ｐ２７に、ｐ２９Ｋ（ｐ　２８に、　ｐ　３　：３ Ｋ）　、　ｐ　３０／、３３に、及びｐ３１Ｋに対するモノクローナル抗体、並 びにプロシーム類似粒子であるｐ２１Ｋに対するモノクローナル抗体）により検 出することができる。

従って、本発明はＨＩｖ感染の診断において由来を問わずこれらの抗プロシーム 蛋白質及び抗プロシーム類似粒子モノクローナル抗体を使用するＨＩＶ感染の診 断方法を包含する。本方法は、Ｔ４細聴が死滅に至る前であってもＨＩＭにより 感染を受けているかどうかを測定するために使用することができ、従ってこの方 法はＨＩＶ感染の診断のための早期診断用手段として使用可能である。

本方法は一般に；被検者よりＨＩＶに感染され得る細胞を含有する体液（例えば 血液）を入手し：該液中に存在する特定の該細胞を分離、単離、又は何等かの方 法で同定し；先に同定または単離した細胞を１種以上の前述のモノクローナル抗 体を含有する免疫化学試薬と接触させ；血液中に存在する該細胞と、該細胞と反 応するモノクローナル抗体との間で形成される免疫複合体の存在と相対量を検出 する。こうして得られた結果はＨＩｖに感染していないヒトから得られた正常値 と比較することができる。

抗プロシーム蛋白質ｐ２７Ｋ及びｐ３３Ｋに対するモノクローナル抗体はある種 のポリペプチド、又はそれらのフラグメント若しくは誘導体を用いて得ることが できる。これらのポリペプチドは一般に、配列番号＝１又は配列番号＝３で示さ れるポリペプチドの一次構造コンフォメーションの全て又は一部を有しており、 外因性のＤＮＡ源の原核生物又は真核生物における発現により産することができ る。

本発明は従って、配列番号＝１又は配列番号＝３で表わされるポリペプチドの一 次構造の少なくとも一部を有するペプチド産物が原核生物又は真核生物宿主細胞 において確実に発現するように使用するＤＮＡ配列をも含む。一般にこのような りＮＡ配列は、配列番号：１又は配列番号＝３で表わされるＤＮＡ配列又はこれ らの相補鎖；緊縮条件下で該ＤＮＡ配列の蛋白質コード領域とハイブリダイズす るＤＮＡ配列又はそのフラグメント；及び遺伝コードの縮重がなければ前記ＤＮ Ａ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列より成る群から選択される。

本発明は従って、前記のようなりＮＡ配列によりトランスフオーム又はトランス フェクトされた原核生物又は真核生物宿主細胞、及びそのようなりＮＡ配列を含 む生物学上の機能を有する環状プラスミドまたはその他のＤＮＡベクターを包含 する。

また本発明は、例えば細胞の表現型決定に利用される細胞の表面に存在する表面 抗原を分析するためのプロシーム蛋白質に対する抗体の使用を含む。本発明のこ の面として、図１〜８に示したプロフィールを用いて未知の白血球細胞を同定す る。

図面の簡単な説明 図１はＨＩＶ非感染（対照）及びＨＩＶ感染の両方の被検者について、ラベルし た種々の抗プロシーム蛋白質モノクローナル抗体と反応する血液中の１４９２８ 球のパーセンテージを表わすグラフである。

図２はＨＩＶ非感染（対照）及びＨＩｖ感染の両方の被検者について、ラベルし た種々の抗プロシーム蛋白質モノクローナル抗体と反応する被検血液１ｍｍ３あ たりのＴ４リンパ球の数を表わすグラフである。

図３はＨＴＶ非感染（対照）及びＨｒＶ感染の両方の被検者について、ラベルし た種々の抗プロシーム蛋白質モノクローナル抗体と反応する血液中のナチュラル キラー細胞（Ｎ　Ｋ　）のパーセンテージを表わすグラフである。

図４はＨＩＶ非感染（対照）及びＨＩＶ感染の両方の被検者について、ラベルし た種々の抗プロシーム蛋白質モノクローナル抗体と反応する被検血液１ｍｍ３あ たりのナチュラルキラー細胞の数を表わすグラフである。

図５はＨＴＶ非感染（対照）及びＨｒＶ感染の両方の被検者について、ラベルし た種々の抗プロシーム蛋白質モノクローナル抗体と反応する血液中のＴ３細胞の パーセンテージを表わすグラフである。

図６はＨＴＶ非感染（対照）及びＨＩＶ感染の両方の被検者について、ラベルし た種々の抗プロシーム蛋白質モノクローナル抗体と反応する被検血液１ｍｍ３あ たりのＴ３細胞の数を表わすグラフである。

図７はＨＩＶ非感染（対照）及びＨｒ　ｖ＠染の両方の被検者について、ラベル した種々の抗プロシーム蛋白質モノクローナル抗体と反応する血液中のＴ８細胞 のパーセンテージを表わすグラフである。

図８はＨＩＶ非感染（対照）及びＨＩＶ惑染の両方の被検者について、ラベルし た種々の抗プロシーム蛋白質モノクローナル抗体と反応する血液中のＢ４細胞の パーセンテージを表わすグラフである。

図９は本発明の蛋白質をコードしているｃＤＮＡ及び該蛋白質のアミノ酸配列を 表わしている（ヒトｐ２７にプロシーム蛋白質）。

図１０は本発明の他の蛋白質をコードしているｃＤＮＡ及び該蛋白質のアミノ酸 配列を表わしている（ヒト２３３にプロシーム蛋白質）。

本発明の最も好ましい態様 ■、ポリペプチド ポリペプチド又はペプチドは隣接するアミノ酸のα−アミノ基と一カルボキシル 基の間のペプチド結合により互いに連結している直鎖状の一連のアミノ酸である 。本発明で使用する抗体を産生ずるために使用する好ましいポリペプチドは配列 番号　１及び配列番号：３で表わされる。

この蛋白質又はポリペプチドは、血液中の細胞内に、血液中に単独で、及び細胞 膜の表面上に見られる全プロシームに由来する。

本発明によるペプチドまたはそのフラグメントの調製は、組換えＤＮＡ法又は既 知のペプチド合成のための有機化学の手法の一つによる。

有機化学の手法は所望の活性（例えば、抗体を得るために用いられる能力）を有 する小さめのペプチドフラグメントの合成に特に有用である。フラグメントの配 列が解ると、通常の技術を有するペプチド化学者にとって合成はむしろ容易に理 解できるものである。ペプチド合成のための有機化学の手法は、Ｍｅｒｒｉｆｉ ｅｌｄにより開示されている、均質相中で又は固体相の助けを伴ってのいずれか における縮合反応による必要゛□なアミノ酸のカップリングを含む。Ｍｅｒｒｉ ｆｉｅｌｄ、Ｊ導入及びＷａｎｇ、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓａｃ、、９５．１３ ２８（１９７４）を膠照のこと。

他の固体支持体及び他の方法は固相合成法として知られている。（Ｂａ　ｒａｎ ｙ＆Ｍｅ　ｒ　ｒ　ｉ　ｆ　ｉ　ｅ　ｌ　ｄのＴｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ａｎ ａｌｙｓｉｓ、５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｂｉ。

１ｏｇｙ、Ｖｏｌ、２．Ｅ、Ｇｒｏｓｓ　ａｎｄ　Ｊ、Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、 ｅｄｓ、、（Ａｃａｄ、Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ。

、１９８０）、Ｋｎｅｉｂ−Ｃｏｒｄｏｎｉｅｒ　ａｎｄ　Ｍ組換えＤＮＡ法は 、宿主としての適当な微生物の中で１以上の当該ペプチドをコードするポリヌク レオチド配列を伴う組換えポリヌクレオチドを発現させみことにより所望のペプ チド又はそのフラグメントを調製することを含む。一般にこの方法は、クローニ ング−媒体（例えば、プラスミド、ファージＤＮＡ″、又は宿主細胞中で複製す ることができる他のＤＮＡ配列）に、図１又は２に表わしたようなりＮＡ配列を 導入し；該クローニング媒体を遥切な原核生物又は真核生物宿主細胞に導入し、 このように形質転換された宿主細胞を培養することから成る。典型的な宿主細胞 には、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｊ）、シュードモナス属細菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ ｓ）、及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｔｓ）などの細菌を含む。

真核生物である酵母の種々の株及び動物細胞系統もまた大変有用である。

一旦ベブチドが形成されると、本発明に有用なフラグメントもまた決定され得る 。適切な免疫化学上活性を有するペプチドフラグメントは、“ｐｅｐ−ｓｃａｎ ”法に基づいた、Ｇｅｙｓｅｎ　ｅｔ　ａｌの特許出願Ｗ０　８６１０６４８７ ；Ｇｅｙｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、（８ １）３９９８−４００２．（１９８４）；及びＧｅｙｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈ、。

（１０２）２５９−２７４　（１９８７）に記載されている方法に従って発見さ れ得る。この方法においては、該当する完全なペプチドの部分配列と対応する一 連の重複ペプチドが合成され、関連する抗体に対するそれらの反応性を調査する 。

当然ながらフラグメント又はペプチドは配列番号：１及び配列番号：３で正確に 表わされる必要はない。免疫化学上の活性が著しく損なわれない限りペプチド中 の１以上のアミノ酸が他のアミノ酸又はアミノ酸の類似物又は誘導体により置換 され得ることは自明である。

更にペプチドの官能性誘導体もまた使用され得る。官能性誘導体は、ペプチドの 酸付加塩（塩酸、臭化水素酸、フマル酸、リン酸、アスコルビン酸、酒石酸、ク エン酸、乳酸、マレイン酸、パルミチン酸、及びその他の公知の酸）；ペプチド のアミド、特にＣ末端アミド：エステル、特にＣ末端エステル；及びＮ−アシル 誘導体、特にＮ末端アシル誘導体で特にＮアセチル誘導体を包含する。本発明に おいて全ての官能性誘導体は“ポリペプチド°１ｍペプチド”、及び“ペプチド フラグメント”とみなす。

同様に、配列番号＝１及び配列番号＝３の核酸配列も置換され得る。遺伝コード の縮重により、結果として他のコドンになるが先と同じアミノ酸をコードしてい るコドンになるような、あるコドン内の塩基の置換が可能である。例えば、アミ ノ酸であるグルタミン酸のコドンはＧＡＧとＧＡＡの両方である゛。従って、配 列番号＝１又は配列番号：３で示されるアミノ酸配列のポリペプチド又はその抗 原性フラグメントの発現には、図に示された核酸配列と異なるコドン構成を有す る核酸配列が用いられ得ることは明らかである。

また本発明の範囲には、緊縮条件下で配列番号　１又は配列番号・３で示される 核酸配列とハイブリダイズする核酸配列を含む。これらのハイブリダイズし得る 核酸配列は、配列番号＝１又は配列番号＝３で示される核酸配列又はそのフラグ メントと実質的な相同性を示すが、ヌクレオチドの置換、変異、挿入、欠失、逆 位、等を包含する可能性があり、プロシーム蛋白質またはプロシーム類似粒子由 来の蛋白質と機能的に等しい蛋白質またはポリペプチドをコードする。結果とし て生じた機能的に等しい蛋白質、ポリペプチド又はフラグメントは、配列番号： １、配列番号：３で示される蛋白質又はそのフラグメントと同一ではないが、対 応する抗原特性を有する。

＋＋、抗体 検査する叡者の細胞（すなわち患者のＢ４細胞、Ｔ４細胞、Ｔ８細胞、ナチュラ ルキラー細胞、Ｔ３リンパ球、又はこれらの細胞の混合物）の単離又は同定には 抗体を使用するのが好ましい。これらの抗体はモノクローナル抗体又は単一特異 性ポリクローナル抗体（例えば、親和精製されている）が好ましく、又、ポリク ローナル抗体及び抗体フラグメントもまた使用され得る。種々の細胞に対するモ ノクローナル抗体はＱｒｔｈ。

Ｄｉａｇｎｏｓ　ｔ　ｒ　Ｃｓ又はＦｒａｎｃｅＳＰａｒｉｓのＣ。

ｕｌｔｒｏｎｉｃｓなどの会社から市販されており、又調製し得る。例えば、ナ チュラルキラー細胞に対する抗体はＷＯ８９０３３９６に記載されている（米国 Ｓｅｔ、Ｎｏ、１０９゜７３０　１９８７年１０月１６日出願より優先権主張） 。

本発明による診断キット及び診断方法に用いるプロシーム蛋白質に対する抗体は 、種々のプロシーム蛋白質に対するモノクローナル抗体が好ましい。ポリクロー ナル抗体及び修飾ポリクローナル抗体もまた使用され得る。

蛋白質に対して産生されるモノクローナル抗体は不死化抗体産生細胞の生物学上 純粋な細胞系統から生産され得る。不死化抗体産生細胞は当該技術上周知の種々 の方法のいずれかにより得ることができ、一般的に次の工程を含む＝１）特異抗 体を生産するのに適切なリンパ球などの細胞を誘発する（例えば、配列番号：１ 又は配列番号：３のポリペプチド等の免疫原を゛注入する）、２）これらの細胞 を不死化し、３）これらの細胞の中から所望の特異性及び親和性の抗体を生産す るクローンを選択する。例えば、その一つはＫｏｈ　１　ｅ　ｒ及びＭ　ｉ　Ｉ 　Ｉ　ｓ　ｔ　ｅ　ｉ＝　ｎ、Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ、２５６，４９５−４９７ 　（１９７５）の方法である。この方法は、特定のペプチド（例えば配列番号： １又は配列番号＝３のポリペプチド）によりマウスを免疫化し、膵臓細胞を単離 し、これらにマウスミエローマ細胞を融合しハイブリドーマを得ることから成る 。当然マウス以外の動物も同じく用いることができる。

全ての特異的に同定された抗体は（例えば次に挙げた蛋白質に対する該抗体：ｐ ２１に、ｐ２３に、ｐ２５に、ｐ２７Ｋ。

ｐ２９Ｋ　（ｐ２８に、ｐ３３Ｋ）、ｐ３０／３３に、　及びｐ３ＩＫ）は、Ｏ ｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ　ｎｖより市販されている。ｐ２７Ｋ及びｐ３１ Ｋに対するモノクローナル抗体を産生ずる細胞系統は、Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　 Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅｓ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎ ｉｓｍｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐａ５ｔｅｕｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅに１−５８８ 及びＴ−５８９の番号で寄託されている。

この抗体は、ＥＰ２１９，３６８Ａ１　（米国特許出願Ｓｅ’ｒ。

Ｎｏ、０７／２９８，７９１と対応）に記載と同一の方法で製造し得る。

被検者がＨＩＶに感染しているか否かを決定するために被検者のＴ４細胞の研究 に使用するには抗ｐ２７に抗体（ｐ　＝　０゜０１）及び抗ｐ３０−３３に抗体 （ｐ＝０．００１）が好ましい（図１及び２）。しかし抗ｐ２９に抗体（ｐ＝０ ．０１）及び抗ｐ２３に抗体（ｐ　＝　０．　０　ＯＬ）も使用し得る（図１） 。

次に示す抗プロシーム蛋白質のいずれかに対するモノクローナル抗体は、被検者 がＨＩＶに感染しているか否かを決定するために被検者のナチュラルキラー細胞 の研究に使用され得る：ｐ２５に、ｐ２９Ｋ　（ｐ２８に、ｐ３３Ｋ）、ｐ３０ ／３３Ｋ。

及びｐ３１Ｋ又は類似ｐ２１Ｋ（図３及び４）。

次に示す抗プロシーム蛋白質のいずれかに対するモノクローナル抗体は、被検者 がＨＩＶに感染しているか否かを決定するために被検者の１３９７８球の研究に 使用され得る：ｐ２３Ｋ。

ｐ２５に、ｐ２９Ｋ　（ｐ２８に、ｐ３３Ｋ）、ｐ３０／３３Ｋ。

及びｐ３１Ｋ又は類似のｐ２１Ｋ（図５及び６）。このなかでｐ２１に、ｐ２３ に、ｐ２９に、ｐ３０−３３に、及びｐ３１Ｋに対する抗体がより好ましい。

また、いずれかの抗プロシーム蛋白質（ｐ２３に、り２５Ｋ。

ｐ２７に、ｐ２９Ｋ　（ｐ２８に、ｐ３３Ｋ）、ｐ３０／３３Ｋ。

及びｐ　３１　Ｋ’）に対するモノクローナル抗体又は類似の抗ｐ２ＩＫ（“プ ロシーム類似粒子゛由来）に対するモノクローナル抗体は、被検者がＨｒＶに感 染しているか否かを決定するために被検者のＴ８細胞の研究に使用され、抗ｐ２ ７に抗体及び抗り３０−３３に抗体が好ましい（図７）。

被検者がＨｒＶに感染しているか否かを決定するための被検者のＢ４細胞の研究 における使用には抗ｐ２３に抗体が好ましい（図８）。

Ｉｌ＋診断方法 本発明による好ましい診断方法においては、種々の細胞（例えば１３９７８球、 Ｔ４リンパ球、Ｔ８細胞、Ｂ４１ＥＩ胞、又はナチュラルキラー細胞）に対する （例えばフィコエリトリンで）直接又は間接的にラベルされた抗体を、該細胞を 含有する被検者の血液中のこれらの細胞を同定又は単離するために用いる。

次いでこの細胞−抗体複合体をプロシーム蛋白質に対する（例えば蛍光化合物に より）同様にラベルされた抗体と共にインキュベートする。こうしてラベルされ た細胞の量を測定又はカウントし、測定値を正常値又は標準測定値と比較する。

本方法には幾つかの装置を使用し得る。

本発明で使用する“免疫化学試薬”という用語は、適当な選択性を示す抗体が適 切な支持体と結合しているか又は標識物質を具備していることを意味する。一般 的に用いられる支持体は、マイクロテストウェルやキュベツト、試験管又は毛細 管の内壁、メンブランフィルタ−１試験用細片、又はラテックス粒子、ビーズ、 赤血球、色素ゾル、金属（例えば金）ゾル又はゾル粒子としての金属化合物など の粒子表面を含む。一般的に用いられる標識物質は種々の放射性同位体、蛍光化 合物、酵素、色素ゾル又はゾル粒子として用いられる金属化合物を含む。

前述の細胞を含有するテスト体液（例えば、ＨＩＶに暴露されたと考えられるヒ トの血液、リンパ液、血漿等の体液）中のＨＩＶ感染の存在を検出する一つの方 法では、本発明の免疫化学試薬をテスト体液と接触させる。この後、抗体とテス ト体液中の該細胞の表面抗原との間で形成された免疫複合体の存在を免疫化学反 応により測定する。免疫化学反応はサンドウィッチ反応（ラベルした抗体を使用 ）、凝集反応（ゾルを使用）、競合反応、又は阻害反応が好ましい。

イムノアッセイの一つの型においては、試験に供される細胞に対する抗体を、固 体層、例えば、試験管の内面に付着させる。

次いで、所望の細胞を含有する体液を試験管に加えて抗体と結合させる。抗原抗 体複合体でコートされた試験管に、蛍光化合物でラベルされた既知量の適切な抗 プロシーム蛋白質抗体を含有する免疫化学試薬を添加する。次いで蛍光の量を測 定し、標準値と比較する。

本発明における使用に適合し得るその他の診断試験キットは当業者には周知であ る。例えば、免疫診断試験キットは５ｃｈｕｕｒｓ　ｅｔ　ａｌの米国再発行特 許Ｎｏ、３２．６９６に記載されているラジオイムノアッセイ又は酵素免疫活性 法（“ＥＩＡ”）を包含する。光散乱イムノアッセイシステムは、０ｒｔｈｏ　 Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ。

のＥ、Ｐ　０．２５４．４．３０　Ａ２　（米国特許Ｓｅｔ、Ｎｏ。

８７９．２３６　１９８６年６月２６日出願と対応）に開示されている。高い結 合親和性の二つのモノクローナル抗体を用いた診断試験キットは、Ｈｙｂｒｉｔ ｅｃｈ　Ｉｎｃ、の米国特許　Ｎｏ、４，３７６．１１０及び４，４８６．５３ ０に記載されている。

白血球細胞の表現型決定方法は、プロシーム蛋白質と反応性のあるラベルした抗 体と細胞をインキュベートし、ラベルの活性によって細胞の表面を調べてラベル した抗体と反応性のある蛋白質の存在を分析することから成る。

実施例ｒ ダブルマーキング免疫学 分析される種々の細胞を次の方法にしたがって同定又は単離した。フィコエリト リン（ＰＥ”）でラベルされたモノクローナル抗体を０．１ｍｌアリコートの血 液に加え、室温で１０分間インキュベートした。種々のアリコートに使用したモ ノクローナル抗体は、抗−ＣＤ３　（Ｔ３−ＰＥ）、抗−ＣＤ４（Ｔ４−ＰＥ） 、抗−ＣＤ８　（Ｔ８−ＰＥ）、抗−ＣＤ２　（１１−ＰＥ）、抗ＣＤ−１９（ Ｂ４−ＰＥ）、抗ＮＫ　（ＮＫ−ＰＥ）である。調製の間に細胞膜が破壊されな いため、赤血球細胞を溶解し、フローサイトメーターＱＰＲＥＰ　（蟻酸／フォ ルムアルデヒド−Ｆｒａｎｃｅ、ＰａｒｔｓのＣｏｕｌ　ｔｒｏｎｉｃＳ）を通 過させて細胞膜を固定した。。

実施例１１ ダブルマーキング免疫学 マウスの血清を４℃で４〜５時間インキュベートした。これを濃縮ＰＢＳにて一 回洗浄した。次いでプロシーム蛋白質に対するモノクローナル抗体と混合、培養 し、３０分後室温にもどした。これを再度濃縮ＰＢＳにて一回洗浄した。ヤギ抗 マウス蛍光イソチオシアネート（“ＣＡＭ−Ｆ　ＩＴＣ”　）を加えプロシーム 蛋白質に対するモノクローナル抗体を示した（室温で３０分インキュベージタン した）。これを再度濃縮ＰＢＳにて一回洗浄した。次いでこれを０．５ｍｌの濃 縮ＰＢＳに一回再懸濁した。いずれの蛍光の分析もＣＦＭ　（フラックスサイト メトリー）により行った。

実施例ＩＩ＋ 実施例■及びＩＩの方法を用いて、ＨＩＶ陽性の２０人（内２人はエイズ感染者 ）の血液と非感染者群の血液をそれぞれ比較した。被検者（ＨＩＶ−１）の血清 を比較した結果を図１〜８にグラフで示した。

実施例ＩＶ 配列番号、１は２６６のアミノ酸からなるポリペプチドを、それをコードするＤ ＮＡに沿って表わしている。この蛋白質をコードするｃ　’Ｄ　Ｎ　Ａはヘーラ 細胞ｃＤＮＡ発現ライブラリー（（ｌ　ａｍｂｄａ）ｇ　ｔ　１１）からｐ２７ にプロシーム蛋白質に対するモノクローナル抗体（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉ ｋａ）を用いて単離した。この挿入部を、配列決定するためにｐＴＺ１８Ｒプラ スミドベクターでサブクローン化した。このＣＤＮＡは５′末端において約５０ のヌクレオチドを欠損している（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉ ｓにより示された）。ＤＮＡの長さは７９８のヌクレオチド（２６６のアミノ酸 ）からなるコード領域を含む９８０のヌクレオチドである。

実施例Ｖ 配列番号：３は２６９のアミノ酸からなるポリペプチドを、それをコードするＤ ＮＡに沿って表わしている。この蛋白質をコードするｃ　ＤＮＡはヘーラ細胞ｃ ＤＮＡ発現ライブラリー（（ｌａｍｂｄａ）ｇｔｌｌ）からｐ３３にプロシーム 蛋白質に対するモノクローナル抗体（６２Ａ３２）を用いて単離した。

この挿入部を、配列決定するためにｐＴＺ１８Ｒプラスミドベクターでサブクロ ーン化した。両方向についての挿入部の配列決定により、８１０のヌクレオチド のオープンリーディングフレーム及び大°きな５゛リーダーを伴う全長配列が認 められ゛た。

ＤＮＡの長さは８１０のヌクレオチド（２６９のアミノ酸）からなるコード領域 を含む１２６４のヌクレオチドである。

実施例ＶＩ 実施例ＴＶの蛋白質（すなわち配列番号＝１）を使用してｐ２７にプロシーム蛋 白質に対するモノクローナル抗体を産生ずる。この方法はマウスをペプチドで免 疫化し、マウスから膵臓細胞を単離し、これらをマウスのミエローマ細胞と融合 させてハイブリドーマを得ることから成る。これらのハイブリドーマのｐ２７に 蛋白質に対する抗体産生性をスクリーニングした。

実施例Ｖ１１ 実施例Ｖのポリペプチド（すなわち配列番号＝３の蛋白質）に対するモノクロー ナル抗体を実施例Ｖｌの記載と類似の方法で産生ずる。

配列表 （１）一般的な情報 （ｉ）出願人 （Ａ）氏名：ＰＲＯ−３ＯＭＡ　５ＡＲＬ（Ｂ）通り：９．Ｒｕｅ　Ｌａｒｒｓ ｙ（Ｃ）都市名：Ｐａｒｉｓ （Ｅ）国名：Ｆｒａｎｃｅ （Ｆ）郵便番号：Ｆ　７５　００５ （ｉ　ｉ）発明の名称１診断方法 （ｉ　ｉ　ｉ）配列の数・４ （２）配列番号：１の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝９８０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （１１）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｖｉ）起源： （Ａ、　）生物名：ヒト （ｖｉｉ）直接の起源 （Ａ）ライブラリー名：　Ｈｅ１ａ　ｃｅｌｌ　ｃＤＮＡＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 　ｌｉｂｒａｒｙ（ｌａｍｂｄａ）ｇｔｌｌ （１ｘ）配列の特徴 （Ｂ）存在位置：４．．８０４ （ｘｉ）配列：配列番号：１： （２）配列番号：２の情報 （１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝２６６アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）トポロジー二直鎖 （ｉ　ｉ）配列の種類：タンＩくり質 （ｘｌ）配列：配列番号：２： Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　 Ｇｌｙ　Ｈｅ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｖａｌｌ　ｓ　ｘｏ　１５ （２）配列番号＝３の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ・１２６４塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数、二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （１１）配列の種類　ｃＤＮＡ （ｖｌ）起源： （Ａ）生物名：ヒト （ｖｉｉ）［接の起源 （Ａ）ライブラリー名：　Ｈｅ１ａ　ｃｅｌｌ　ｃＤＮＡＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 　ｌｉｂｒａｒｙ（ｌａｍｂｄａ）ｇｔｌｌ （ｉｘ）配列の特徴 （Ｂ）存在位置：　３２８．．１１３７（ｘｉ）配列：配列番号：３： ＣＧＣＧＡＧＣＣＧＧ　Ｇ入ＣＣＡＣＧＣＣＧ　ＡＣＣＣＡＧＣＧＴＧ　ＣＣＣ ＡＧＧＣＣＧＡ　ＧＧＡＡＡＧＣＧＣＧ　ＧＣＧＧＣＧＧＣ■i、６０ （２）配列番号　４の情報 （＋）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　２６９アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）トポロジー　直鎖 （ｉ　ｉ）配列の糧類；タンｌくり質 （ｖｉ）起源。

（Ａ）生物色・ヒト （ｘｌ）配列、配列番号：４゜ Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　ＬｙＳ　Ｖａｌ　ＬＹＳ　Ｐｈｅ　ＡｒｇＶ ａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　入１ａ　Ｖ ａｌ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　入１ａ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｒｑ４５　Ｓｏ　５５ 人１ａ　にｋｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　λ１ａ　入１ａ　Ｈｉｓ　Ｇｉｎ　 Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　工１ｅ　Ｌｅｕ　Ｉ（ｉｓ　Ｖａｌ　λ５■ ＾ｓｎ　Ｈｉｓ　Ｈｅ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　５ｅｒ　工１＠　入１ａ　Ｇｌｙ　Ｌ ｅｕ　Ｔｈｒ　入１ａ　Ａｓｐ　λ１ａ　入ｒｇ　Ｌ＊ｕλｓｐ　入ｒｑ　Ｐｒ ｏ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　入ｒｑ　Ｌ４ｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅ ｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓｌｌｏ　１１５　１２０ Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　 入ｒ９　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ、Ｖａｌ　ＧＬｙ１２５　１コ０　１ ３５ Ｃｙｓ　Ｐｒｒ　；ｅｒ　入１ａ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　 入ｚ９　人１ａ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　工１ｅ　Ｇｌｙ　ＡｌａＭｅセ　Ｇｌｕ　Ｃ ｙｓ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　入Ｓｎ　Ｃ１ｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｇ ＩＹ　Ｌａｕ　入ｒｇ　入１ａ　Ｌａｕエエｅ　Ｇｌｙ　工１ｅ　Ｖａｌ　Ｇｌ ｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　工ｌｅ　Ｔｙｒ　Ａｓ ｐ　入５ｐ　λ５ｐ３０ＡｓｐＶａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌ ｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　入ｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｙ ■ Ｐｒｏ　Ｍｅｔに１ｕ　Ｈｉｓ ＦＸＧ＋　１ ％Ｔ４．ｘｘＫ　／　％Ｔ４ ■灯、　＠　）４．１．Ｖ。

Ｆ工Ｇ−３ ％ＮＫ、ｘｘＫ　ｒ’　％ＮＫ ２１Ｋ　２３Ｋ　２５Ｋ　２７Ｋ　２９Ｋ　３Ｏ−３３Ｋ　３１にＦ工ａ、４ ＮＫ、ｘｘＫ Ｆ工Ｇ、５ ％Ｔ３．ｘｘＫ　／　％丁３ ２１Ｋ　２３Ｋ　２５Ｋ　２７Ｋ　２９Ｋ　３Ｏ−３３Ｋ　３１ＫＴ工０．　７ ％Ｔ８．ｘｘＫ　／％Ｔ８−Ｐ＜０．１％２：Ｋ　２３Ｋ　２５Ｋ　２７Ｋ　２ ９Ｋ　３０−３３に　３１ＫＦＩ０．　８ ％８４ｘｘＫ　／　％Ｂ４ Ｆｉｇｕｒｅ、１０ τＣＣ−；　ＴＣＡ　ＧＣＴ　ＣＧＴ　ＡＣｒ　’ｆＡｃ　ＴＴＧ　ＧＡＧ　Ａ ＣＡ　ＣＡＴ　ＡＴＧ　Ｔ’ＣＴ　ＧＡＡ　７７丁　＾τＧpＡＧ　丁Ｇ丁　Ｂ ９１ Ｓ　Ｑ　Ｓ　Ａ　ＲＴ　Ｙ　Ｌ　Ｅ　ＲＢ　Ｍ　Ｓ　Ｅ　ｉ’　Ｍ　Ｅ　Ｃ１８ １１ＧＡｊｔ　ＧＡＡ　ＭＪ　ＣＣＡ　ＣＡＧ　ＡＧＡ　ＡＡＧ　ＧＣＡ　ＧＡ Ｇ　ＣＧＴ　ＧＣＴ　ＣＭ　ＣＧＴ　ＧＣＴ　ＣＡＴ　ＧＡＡＣbテ　ｃｃ＾　 １１０７ ＥＥＲＰＱＦＩＫＡＱＰＡＱＰＡＤＥＰ　＾　２６０Ｇ＾Ａ　ＡＡＧ　ＧＣＴ　 Ｇ入ＴＱ＾ＡＣＣ＾　ＡＴＧ　Ｇ＾ＡＣＡ丁　τ＾＾　Ｃ丁α入テＡＡＧｅＣＡ Ｇ〒Ｃ丁Ａ丁Ａ丁Ａ〒Ｇ丁八〒テ`’ｊ’Ｃ＾＾　１１６Ｂ ＥＫＡＤＥＰＭＥ）１６　７７０ ＡＴＡＴＧＴＡＡＧＭＴＡＣＡＧＧＣＡＣＣＩＩＣＡ？ＡＣＴＧＡＴＧＡＣＡＡ ＴＪＷＣＴＡ？ＡＣ！！ＴＡＡＣ１２４０八＾τＧＣＴＡ丁丁ＴＴＴＴ＾ＧＧ＾ ＾丁ＣＡＧＴＣ１１６４要約書 ＨＩＶの診断に有用な方法を開示している。本方法では１以上の抗体を含有する 免疫化学試薬を使用する。通常この方法は、ＨＩＶに感染している疑いのある被 検者から血液を入手し、血液を前述の免疫化学試薬と接触させ、該抗体と細胞の 表面上に存在していて該抗体と反応性を有するペプチドとの間で形成された免疫 複合体の存在を検出する。

国際調査報告　ＱｒＴ／ＨＯ０１／ｎｌＯ直４、　Ｎ＠ＰＣＴ／ＥＰ　９１１０ １９４５

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）ラベルした抗体、ラベルした抗体フラグメント又はそれらの混合物を 用いて、被検者から採取した体液中の細胞表面に存在する蛋白質を分併し（該蛋 白質はブロゾーム蛋白質またはプロゾーム類似蛋白質に対する抗体と反応性を有 する）、その表面に蛋白質を現している細胞の量又は割合を定量し、（ｂ）先に 得た量又は割合を、ヒト免疫不全ウイルスに感染していないヒトから得た標準値 と比較することから成る被検者のヒト免疫不全ウイルス感染の診断方法。
2. ２．該抗体又は抗体フラグメントがプロゾーム蛋白質ｐ２３Ｋ，Ｐ２５Ｋ，Ｐ２ ７Ｋ，Ｐ２９Ｋ（Ｐ２８Ｋ，Ｐ３３Ｋ〕，ｐ３０／３３Ｋ，及びｐ３１Ｋ又はブ ロゾーム類似粒子ｐ２１Ｋに対する抗体から成る群より選択又は誘導される請求 項１に記載の方法。
3. ３．該細胞が被検者のＢ４細胞であり該抗体が抗ｐ２３Ｋモノクローナル抗体で ある請求項２に記載の方法。
4. ４．該細胞が被検者のＴ４細胞であり該抗体が配列番号：２で定義される蛋白質 又はその抗原性フラグメントを用いることにより得られた抗ｐ２７Ｋ抗体である 請求項２に記載の方法。
5. ５．該抗体が配列番号：４で定義される蛋白質又はその抗原性フラグメントを用 いることにより得られた抗体である請求項１に記載の方法。
6. ６．該細胞が被検者のＴ８細胞であり該抗体が抗ブロゾーム蛋白質ｐ２３Ｋ，ｐ ２５Ｋ，ｐ２７Ｋ，ｐ２９Ｋ（ｐ２８１Ｋ，ｐ３３Ｋ〕，ｐ３０／３３Ｋ，及び ｐ３１Ｋモノクローナル抗体のいずれか又は抗ｐ２１Ｋである請求項１に記載の 方法。
7. ７．該細胞が被検者のナチュラルキラー細胞であり該抗体が次の蛋白質ｐ２５Ｋ ，ｐ２９Ｋ（ｐ２８Ｋ，ｐ３３Ｋ），ｐ３０／３３Ｋ，及びｐ３１Ｋのいずれか 又は類似ｐ２１Ｋに対するモノクローナル抗体である請求項１に記載の方法。
8. ８．該細胞が被検者のＴ３リンパ球であり該抗体が次の抗ブロゾーム蛋白質：ｐ ２３Ｋ，ｐ２５Ｋ，ｐ２９Ｋ（ｐ２８Ｋ，ｐ３３Ｋ），ｐ３０／３３Ｋ，及びｐ ３１Ｋ、又はｐ２１Ｋ蛋白質のいずれかに対する抗体である請求項１に記載の方 法。
9. ９．Ｂ４細胞、Ｔ４細胞、Ｔ８細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｔ３リンパ球、又 はこれらの細胞の混合物から成る群より選択される細胞をこれらの細胞に対する 抗体で同定又は単離し、こうして単離又は同定された細胞をプロゾーム蛋白質に 対するラベルされたそノクロ−ナル抗体と共にインキュベートし、細胞の表面に 存在する蛋白質を分析することから成るヒト免疫不全ウイルス感染の診断方法。
10. １０．固体の表面に付着させたＢ４細胞、Ｔ４細胞、Ｔ８細胞、ナチュラルキラ ー細胞、Ｔ３リンパ球、又はこれらの細胞の混合物から成る群より選択される細 胞に対する抗体、及び、抗プロゾーム蛋白質に対するラベルされた抗体を含有す る診断用流体から成るヒト免疫不全ウイルス感染診断用診断テストキット。
11. １１．外因性ＤＮＡ源の原核生物又は真核生物の発現産物であることを特徴とす る配列番号：１で表わされるポリペプチドの一次構造コンフォメーションの全部 又は一部を有するポリペプチド。
12. １２．外因性ＤＮＡ源の原核生物又は真核生物の発現産物であることを特徴とす る配列番号：３で表わされるポリペプチドの一次構造コンフォメーションの全部 又は一部を有するポリペプチド。
13. １３．配列番号：１又は配列番号：３から成る精製及び単離されたポリペプチド 。
14. １４．配列番号：１又は配列番号：３で表わされるポリペプチドの一次構造の少 なくとも一部を有するペプチド生成物の原核生物宿主細胞又は真核生物宿主細胞 における発現を確実にするために使用され、 （ａ）配列番号：１若しくは配列番号：３で表わされるＤＮＡ配列又はそれらの 相補鎖、 （ｂ）緊縮条件下で、（ａ）で定義されたＤＮＡ配列の蛋白質コード領域とハイ ブリダイズするＤＮＡ配列又はそれらのフラグメント、及び （ｃ）遺伝コードの縮重がなければ（ａ）および（ｂ）で定義されたＤＮＡ配列 とハイブリダイズするはずのＤＮＡ配列、から成る群より選択されるＤＮＡ配列 。
15. １５．請求項１４に記載のＤＮＡ配列を含有する生物学上の機能を有する環状プ ラスミド又はウイルス性ＤＮＡベクター。
16. １６．請求項１４に記載のＤＮＡ配列によりトランスフォーム又はトランスフェ クトされた原核生物宿主細胞又は真核生物宿主細胞。