FI104655B - Diagnostinen menetelmä - Google Patents

Diagnostinen menetelmä Download PDF

Info

Publication number
FI104655B
FI104655B FI922666A FI922666A FI104655B FI 104655 B FI104655 B FI 104655B FI 922666 A FI922666 A FI 922666A FI 922666 A FI922666 A FI 922666A FI 104655 B FI104655 B FI 104655B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
cells
prosome
proteins
directed against
leu
Prior art date
Application number
FI922666A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI922666A0 (fi
Inventor
Klaus Scherrer
Jean Paul Bureau
Faycal Bey
Original Assignee
Pro Soma Sarl
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pro Soma Sarl filed Critical Pro Soma Sarl
Publication of FI922666A0 publication Critical patent/FI922666A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI104655B publication Critical patent/FI104655B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56977—HLA or MHC typing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/974—Aids related test
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Electrotherapy Devices (AREA)
  • Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)

Description

104655
Diagnostinen menetelmä
Tekninen ala Tämä keksintö liittyy menetelmiin, jotka ovat 5 käyttökelpoisia HIV-infektion diagnoosissa.
Keksinnön tausta
Hankittu immuunipuutossyndrooma ("AIDS") on tauti, jonka arvellaan todennäköisemmin olevan ihmisen immuuni-puutostautiviruksen ("HIV") aiheuttama. HIV:n tärkeimmät io kohteet ovat kaksi erilaista solua, T4-lymfosyytti ja mak-rofagi. T4-lymfosyyttipopulaatio alkaa tavallisesti pienentyä infektoitumisensa jälkeen. T4-lymfosyyttien tapauksesta poiketen HIV-infektio ei tapa makrofagia vaan tämä voi itse asiassa toimia viruksen varastona. Gallo ja Mon-15 tagneir, "AIDS in 1988", Scientific American, (lokakuu 1988) s. 25.
HIV-infektioon sairastuneiden potilaiden varhaiseen diagnoosiin kuuluu tavallisesti diagnostisten tutkimusten käyttö sen määrittämiseksi, onko kyseisellä henki-20 löllä HIVrtä vastaan suunnattuja vasta-aineita vai ei. Varhainen diagnoosi on erityisen tärkeää HIV-infektiossa sen vuoksi, että potilaalle voidaan tämän avulla antaa parasta mahdollista lääketieteellistä hoitoa taudin ensi vaiheista lähtien ja sen vuoksi, että taudin leviäminen : 25 edelleen voidaan ehkäistä. Redfield ja Burke "HIV Infecti on: The Clinical Picture", Scientific American, s.70.
EP-patenttihakemusjulkaisussa nro 219 368 A (joka vastaa US-patenttihakemusjulkaisua nro 07/298 791) kuvataan tiettyjä monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on 30 suunnattu "prosomin" rakenneosina toimivia proteiineja
r t J
• vastaan. Prosomit ovat solupartikkeleita, jotka on kuvattu julkaisussa Schmid et ai., "The prosome: an ubiquitous morphologically distinct RNP particle associated with repressed mRNPs and containing specific ScRNA and a characte-35 ristic set of proteins", The EMBO Journal, 3(1) (1984) 29 - 34.
* 104655 2
Muita prosomeista käytettyjä nimityksiä ovat myös "proteasomi" tai "mcp" (multicatalytic protease, monikata-lyyttinen proteaasi). EP-patenttihakemusjulkaisussa nro 0 345 750 A2 on kuvattu "polyfunktionaalinen proteaasi" ja 5 tätä vastaan suunnattuja vasta-aineita. Tässä patenttiha-kemusjulkaisussa kuvattu polyfunktionaalinen proteaasi voi olla prosomi. Vuoden 1990 alkuvaiheista lukien on prosomin proteiineja vastaan suunnattuja hiiren monoklonaalisia vasta-aineita ollut kaupallisesti saatavilla yhtiöstä Or-10 ganon Teknika nv Turnhout, Belgia. Kaupallisesti saatavilla olevat monoklonaaliset vasta-aineet ovat olleet sellaisia, jotka on suunnattu prosomiproteiineja p23K, p25K, p27K, p29K (p28K, p33K), p30/33K ja p31K vastaan ja p2lK:ta ("prosomia muistuttava partikkeli") vastaan. Näitä 15 vasta-aineita on kuvattu tarkemmin julkaisussa Research Reagent News, (tammikuu 1990), joka on saatavilla yhtiöstä Organon Teknika nv.
EP-patenttijulkaisussa 219 368 AI kuvataan myös, että prosomit voivat liittyä useisiin fysiologisiin pro-20 sesseihin, jotka liittyvät solujen ja organismien erilaistumiseen, solujen väliseen kommunikaatioon ja autoimmuunisairauksiin. Siinä on myös tuotu esiin se seikka, että prosomeja vastaan suunnatut monoklonaaliset vasta-aineet voivat olla käyttökelpoisia esimerkiksi syövän r . 25 diagnostiikassa.
Julkaisussa Research Reagent News kuvattuihin pro-somi-roteiineja vastaan suunnattujen monoklonaalisten vasta-aineiden käyttömuotoihin kuuluvat prosomien molekulaa-ribiologian tutkimus, tiettyjen prosomityyppien jakaantu-30 minen normaaleissa ja patologisissa soluissa ja kudoksissa ja lähetti- ja muissa ribonukleoproteiineissa.
Missään ei kuvata tai tehdä ehdotusta, että* yhdelläkään näistä prosomiproteiineja vastaan suunnatuista mo-noklonaalisista vasta-aineista voisi olla mahdollista 35 käyttöä infektiosairauksien, kuten AIDS:n tai HIV-infek-tion diagnoosissa.
104655 3
Keksinnön kuvaus Tässä keksinnössä on havaittu, että HIV-in-fektiopotilailla on soluja (esim. T4- ja T8-lymfosyyttejä sekä B4-soluja), joiden pinta-antigeenit eroavat viruksel-5 la infektoitumattomien henkilöiden solujen pinta-antigee-neista. On yllättäen havaittu, että näiden pinta-antigeenien esiintyminen tietyissä soluissa voidaan havaita tietyillä, leimalla varustetuilla prosomi-proteiineja vastaan suunnatuilla monoklonaalisilla vasta-aineilla (ts.
10 prosomiproteiineja p23K, p25K, p27K, p29K (p28K, p33K), p30/33K ja p3lK vastaan sekä p2lK:ta ("prosomia muistuttava partikkeli") vastaan suunnatuilla vasta-aineilla.
Tälle keksinnölle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksissa on esitetty. Erityisesti tämä keksintö 15 koskee tämän johdosta menetelmää HIV-infektion diagnostisoimiseksi, jolloin menetelmälle on tunnusomaista, että a) tutkitaan potilaasta otetusta ruumiinnesteestä solun pinnoilla esiintyviä proteiineja käyttäen leimalla varustettuja vasta-aineita, leimalla varustettuja vasta- 20 ainefragmentteja tai näiden seoksia, jolloin mainitut proteiinit reagoivat vasta-aineiden kanssa, jotka on suunnattu prosomiproteiineja tai prosomia muistuttavaa partikkelia vastaan, sellaisten solujen määrän tai prosentuaalis-nen osuuden, joiden pinnalla tämä proteiini esiintyy, mää-: 25 rittämiseksi kvantitatiivisesti; ja b) verrataan näin saatua määrää tai prosentuaalista osuutta standardiin, joka on saatu ihmisen immuunipuu-tostautiviruksella infektoitumattomasta henkilöstä. Menetelmää voidaan käyttää sen määrittämiseksi, ovatko T4-so- 30 lut infektoituneet, jopa ennen niiden HIV:n aiheuttamaa 9 · kuolemaa, mikä mahdollistaa menetelmän käyttämisen varhaisen diagnoosin apuvälineenä HIV-infektion diagnostisoimiseksi.
Prosomiproteiineja p27K ja p33K vastaan suunnattu- Γ 35 ja monoklonaalisia vasta-aineita voidaan saada syntymään käyttämällä niiden tiettyjä polypeptidejä tai fragmentteja 104655 4 tai johdannaisia. Nämä polypeptidit omaavat tavallisesti kokonaan tai osittain sekvenssissä nro 1 tai nro 3 esitettyjen polypeptidien primaarirakenteen konformaation, ja niitä voidaan tuottaa ilmentämällä ulkoista DNA-lähdettä 5 prokaryoottisessa tai eukaryoottisessa järjestelmässä.
Tähän keksintöön sisältyy myös prosomiproteiineja vastaan suunnattujen vasta-aineiden käyttö solun pinnalla esiintyvien antigeenien tutkimiseen, jota tutkimusta käytetään esimerkiksi solun fenotyypin määrittämiseksi. Kek-10 sinnön tämän kohteen osalta käytetään kuvioissa 1-8 esitettyjä profiileja tuntemattoman valkosolun tunnistamiseksi .
Kuvioiden lyhyt kuvaus
Kuvio 1 on graafinen esitys niiden T4- 15 lymfosyyttien prosentuaalisesta osuudesta, jotka reagoivat erilaisiin leimalla varustettuihin prosomiproteiineja vastaan suunnattujen monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa sekä HIV:lla infektoitumattomissa ("verrokit") että HIV:lla infektoituneissa potilaissa.
20 Kuvio 2 on graafinen esitys, joka esittää niiden potilaan veressä olevien T4-lymfosyyttien lukumäärää kuu-tiomillimetriä kohti, jotka reagoivat erilaisten leimalla varustettujen prosomiproteiineja vastaan suunnattujen monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa sekä HIV:11a infek- . 25 toitumattomissa ("verrokit") että HIV:11a infektoituneissa potilaissa.
Kuvio 3 on graafinen esitys, joka esittää niiden veressä olevien luonnollisten tappajasolujen ("NK") prosentuaalista osuutta, jotka reagoivat erilaisten leimalla 30 varustettujen prosomiproteiineja vastaan suunnattujen mo-noklonaalisten vasta-aineiden kanssa sekä HIV:lla infek toitumattomissa ("verrokit") että HIV:lla infektoituneissa potilaissa.
Kuvio 4 on graafinen esitys, joka esittää niiden 35 NK-solujen lukumäärää mm3:ssa potilaan verta, jotka reagoivat erilaisten leimalla varustettujen prosomiproteiineja « 104655 5 vastaan suunnattujen monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa sekä HlVrlla infektoitumattomissa ("verrokit") että HlVrlla infektoituneissa potilaissa.
Kuvio 5 on graafinen esitys, joka esittää veressä 5 olevien niiden T3-solujen prosentuaalista osuutta, jotka reagoivat erilaisten leimalla varustettujen prosomi-proteiineja vastaan suunnattujen monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa sekä HIV:lla infektoitumattomissa ("verrokit") että HIV:lla infektoituneissa potilaissa. io Kuvio 6 on graafinen esitys, joka esittää niiden T3-solujen lukumäärää mm3:ssa potilaan verta, jotka reagoivat erilaisten leimalla varustettujen prosomiproteiineja vastaan suunnattujen monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa sekä HlVrlla infektoitumattomissa ("verrokit") että 15 HlVrlla infektoituneissa potilaissa.
Kuvio 7 on graafinen esitys, joka esittää veressä olevien niiden T8-solujen prosentuaalista osuutta, jotka reagoivat erilaisten leimalla varustettujen prosomiproteiineja vastaan suunnattujen monoklonaalisten vasta-ai-20 neiden kanssa sekä HlVrlla infektoitumattomissa ("verro kit") että HlVrlla infektoituneissa potilaissa.
Kuvio 8 on graafinen esitys, joka esittää veressä olevien niiden B4-solujen prosentuaalista osuutta, jotka reagoivat erilaisten leimalla varustettujen prosomi- ; ; . 25 proteiineja vastaan suunnattujen monoklonaalisten vasta- aineiden kanssa sekä HlVrlla infektoitumattomissa ("verrokit") että HlVrlla infektoituneissa potilaissa.
Kuvio 9 esittää humaani-p27K-prosomiproteiinia koodaavaa cDNArta ja tämän proteiinin aminohappojaksoa.
30 Kuvio 10 esittää humaani-p33K-prosomiproteiinia - * ’’J koodaavaa DNA: ta ja tämän proteiinin aminohappo jaksoa .
Keksinnön paras käyttötapa I Polypeptidit
Polypeptidi tai peptidi on lineaarinen sarja ami-35 nohappoja, jotka ovat liittyneet toisiinsa vierekkäisten aminohappojen a-amino- ja karboksiryhmien välisin peptidi- * 104655 6 sidoksin. Edulliset polypeptidit, jotka on tarkoitettu käytettäväksi tässä keksinnössä käytettävien vasta-aineiden tuottamiseen, on esitetty sekvenssissä nro 1 ja sekvenssissä nro 3.
5 Proteiini tai polypeptidi voi olla peräisin koko naisista prosomeista, jotka esiintyvät solujen sisällä, erillisinä veressä ja solun membraanien pinnoilla.
Peptidien tai näiden fragmenttien valmistus voi tapahtua yhdistelmä-DNA-menetelmiä tai jotakin tunnettua 10 peptidisynteesiin käytettävää kemiallista menetelmää käyttäen .
Orgaanisen kemian menetelmät ovat erityisen käyttökelpoisia halutun aktiivisuuden (esim. käytettävyyden vasta-aineiden tuottamiseen) omaavien pienehköjen peptidi-15 fragmenttien synteesiin. Sitten kun fragmentin jakso on saatu selville, sen synteesi on melko suoraviivaista tavallisen ammattitaidon omaavalle peptidikemistille. Peptidisynteesiin käytettäviin orgaanisen kemian menetelmiin kuuluvat vaadittujen aminohappojen kytkentä kondensaatio-20 reaktion avulla joko homogeenisessa faasissa tai Merri- fieldin kuvaaman kiinteän faasin avulla. Katso esimerkiksi Merrifield, J. Am. Chem. Society, 85 (1963) 2149 ja Wang, J. Am. Chem. Soc., 95 (1974) 1328.
Kiinteän faasin synteesin osalta tunnetaan erilai- • J 25 siä kiinteitä kantajia ja erilaisia strategioita, joita on esitetty esimerkiksi julkaisuissa Barany ja Merrifield, teoksessa The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Osa 2, E. Gross ja J. Meienhofer, toim., (Acad. Press, N.Y., 1980), Kneib-Cordonier ja Mullen, Int. J. Peptide Protein 30 Res. 30 (1987) 705 - 739 ja Fields ja Noble, Int. J. Pep- I, tide Protein Res. 35 (1990) 161 - 214.
Yhdistelmä-DNA-menetelmiin kuuluu halutun peptidin tai tämän fragmentin valmistus käyttäen yhdistelmä-poly-nukleotidin ilmentämistä sopivassa isäntä-mikro-organis-35 missä sellaista polynukleotidijaksoa käyttäen, joka koodaa yhtä tai useampaa kyseessä olevaa peptidiä. Tavallisesti • « 104655 7 tähän menetelmään liittyy se, että kloonauskantajaan (esimerkiksi plasmidiin, fagi-DNA:han tai muuhun isäntäsolussa replikoitumaan kykenevään DNA-jaksoon) tuodaan sellainen DNA-jakso, joka on kuvattu kuvioissa 1 tai 2; mainittu 5 kloonauskantaja tuodaan sopivaan eukaryoottiseen tai pro-karyoottiseen isäntäsoluun; ja viljellään näin transformoitua isäntäsolua. Tyypillisiin isäntäsoluihin kuuluvat bakteerit, kuten E. coli, Pseudomonas ja Bacillus subti-lis. Eukaryootit, kuten hiivakannat ja nisäkkäiden solu-io linjat, ovat myös hyvin käyttökelpoisia.
Tässä keksinnössä käyttökelpoisten fragmenttien määrittämiseen voidaan ryhtyä heti, kun peptidit ovat valmiita. Sopivia immunokemiallisesti aktiivisia peptidifrag-mentteja voidaan saada "pep-scan"-menetelmään perustuvan 15 menetelmän mukaisesti, joka on kuvattu Geysen et ai.'n patenttihakemusjulkaisussa WO 86/06487 ja julkaisuissa Geysen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei., 81 (1984) 3998 - 4002, ja Geysen et ai., J. Immunol. Meth., 102 (1987) 259 - 274. Tässä menetelmässä syntetisoidaan sarjat tois-20 tensa kanssa limittäisiä peptidejä, jotka vastaavat tarkasteltavana olevan täydellisen peptidin osittaisia jaksoja, ja tutkitaan näiden reagointikyky asianmukaisten vasta-aineiden kanssa.
Fragmenttien tai peptidien ei luonnollisesti ole ’ ! 25 oltava tarkalleen sekvenssissä nro 1 ja jaksokuvauksessa nro 3 esitetyn kuvauksen mukaisia. On itsestään selvää, että yksi tai useampi peptideihin kuuluva aminohappo voidaan korvata muilla aminohapoilla tai aminohappoanalogeil-la tai johdannaisilla, mikäli nämä eivät merkittävällä ta-30 valla häiritse immunokemiallista aktiivisuutta.
* ‘ ! I. Peptideistä voidaan myös käyttää lisäksi toimin nallisella ryhmällä varustettuja johdannaisia. Näihin toiminnallisen ryhmän sisältäviin johdannaisiin kuuluvat peptidien happoadditiosuolat (kuten hydrokloori-, hydro-35 bromi-, fumaari-, fosfori-, askorbiini-, viini-, sitruuna-, maito-, maleiini-, palmitiini- ja muut tunnetut ha- • I « 1046-55 8 pot; peptidien amidit ja erityisesti C-terminaaliset amidit; esterit ja erityisesti C-terminaaliset esterit; ja N-asyylijohdannaiset, erityisesti N-terminaaliset asyyli-johdannaiset ja erityisesti N-asetyylijohdannaiset. Kaik-5 kien toiminnallisen ryhmän sisältävien johdannaisten katsotaan olevan tässä keksinnössä käyttökelpoisia "polypeptidejä", "peptidejä" ja "peptidifragmentteja".
Sekvenssin nro 1 ja sekvenssin nro 3 nukleiinihap-pojaksoihin voidaan samoin tehdä substituutioita. Geneet-10 tisen koodin degeneratiivisuus mahdollistaa kodonissa olevien emästen korvaamisen siten, että muodostuu toinen ko-doni, mutta tämä koodaa kuitenkin samaa aminohappoa. Esimerkiksi glutamiini-aminohappoa vastaava kodoni on sekä GAG että GAA. Tämän johdosta on selvää, että sekvenssissä 15 nro 1 tai sekvenssissä nro 3 esitetyn aminohappojakson omaavan polypeptidin tai tämän antigeenisen fragmentin ilmentämiseen voidaan käyttää kuvioissa esitetystä nukle-iinihappojaksosta poikkeavaa, vaihtoehtoisen kodonikoos-tumuksen tai vaihtoehtoisia koostumuksia omaavaa nukle-20 iinihappojaksoa.
Tähän keksintöön liittyy myös nukleiinihappojakso, joka hybridisoituu rajoittavissa olosuhteissa sekvenssissä nro 1 ja sekvenssissä nro 3 esitettyyn nukleiinihappojak-soon. Nämä hybridisoitavissa olevat nukleiinihappojaksot • « ’·! 25 ovat huomattavan homologisia sekvenssissä nro 1 tai 3 esi tetyn nukleiinihappojakson tai sen fragmentin suhteen, mutta ne voivat käsittää nukleotidisubstituutioita, mutaatioita, insertioita, deleetioita, inversioita jne. ja koodata proteiinia tai polypeptidiä, joka vastaa toiminnalli-30 sesti prosomiproteiinia tai prosomia muistuttavasta par- * ,·; tikkelista peräisin olevaa proteiinia. Tuloksena oleva toiminnallisesti vastaava proteiini, polypeptidi tai fragmentti ei ole identtinen sellaisen proteiinin tai tämän fragmentin suhteen, joka on esitetty sekvenssissä nro 1 35 tai sekvenssissä nro 3, vaan sillä on vastaavanlaiset antigeeniset ominaisuudet.
104655 9 II Vasta-aineet
Vasta-aineita käytetään edullisesti tutkittavana olevan potilaan solujen (ts. potilaan B4-solujen, T4-so-lujen, T8-solujen, luonnollisten tappajasolujen, T3-5 lymfosyyttien tai näiden solujen seosten) eristämiseen tai tunnistamiseen. Nämä vasta-aineet ovat edullisesti mono-klonaalisia vasta-aineita tai monospesifisiä poly-klonaalisia (esim. affiniteettipuhdistusta käyttäen saatuja) vasta-aineita, vaikka polyklonaalisia vasta-aineita 10 ja vasta-ainefragmentteja voidaan myös käyttää. Useita eri soluja vastaan suunnattuja monoklonaalisia vasta-aineita on kaupallisesti saatavilla joistakin yhtiöistä, kuten Ortho Diagnostics tai Coultronics, Pariisi, Ranska, tai näitä voidaan valmistaa. Luonnollisia tappajasoluja vas-15 taan suunnattuja vasta-aineita on esimerkiksi kuvattu patenttijulkaisussa WO 8 903 396 (jonka etuoikeushakemus on US-patenttihakemus, jonka sarjanumero on 109 730 ja joka on jätetty 16.10.1987).
Tämän keksinnön mukaisissa diagnostisissa testi-20 pakkauksissa ja menetelmissä käytettäväksi tarkoitetut prosomiproteiineja vastaan suunnatut vasta-aineet ovat edullisesti useita eri prosomiproteiineja vastaan suunnattuja monoklonaalisia vasta-aineita. Kuitenkin voidaan käyttää polyklonaalisia vasta-aineita ja modifioituja po- « » 25 lyklonaalisia vasta-aineita.
Näitä proteiineja vastaan valmistettuja monoklonaalisia vasta-aineita voidaan tuottaa kuolemattomaksi tehtyjen vasta-ainetta tuottavien solujen biologisesti puhtaita solulinjoja käyttämällä. Kuolemattomaksi tehtyjä 30 vasta-aineita tuottavia soluja voidaan saada käyttäen min-.· kä tahansa usean erilaisen tällä alalla tunnetun menetel män mukaisesti, ja näihin kuuluvat tavallisesti vaiheet, jotka ovat 1) sopivien solujen, kuten lymfosyyttien, in-dusointi tuottamaan spesifisiä vasta-aineita (esimerkiksi 35 ruiskuttamalla immunogeeniä, kuten sekvenssin nro 1 tai sekvenssin nro 3 mukaista polypeptidiä), 2) näiden solujen 104655 10 tekeminen kuolemattomiksi, ja 3) sellaisten näistä soluista peräisin olevien kloonien valinta, jotka tuottavat halutun spesifisyyden ja affiniteetin omaavia vasta-aineita. Esimerkiksi yksi tällainen menetelmä on julkaisussa Kohler 5 ja Millstein, Nature 256 (1975) 495 - 497, kuvattu mene telmä. Tämä menetelmä käsittää sen, että hiiriä immunisoidaan tietyllä nimenomaisella peptidillä (esimerkiksi sekvenssin nro 1 tai sekvenssin nro 3 mukaisella peptidillä), eristetään pernasolut ja fuusioidaan nämä solut hiiren my-10 eloomasoluihin hybridoomien aikaansaamiseksi. Voidaan myöskin käyttää muita eläimiä kuin hiiriä.
Kaikkia erikseen mainittuja vasta-aineita (esimerkiksi sellaisia, jotka on suunnattu proteiineja p21K, p23K, p25K, p27K, p29K (p28K, p33K) , p30/33K, ja p31K) 15 vastaan, on kaupallisesti saatavilla yhtiöstä Organon Tek-nika nv. p27K:ta ja p31K:ta vastaan suunnattuja monoklo-naalisia vasta-aineita tuottavia solulinjoja on talletettu talletuslaitokseen Collection Nationale de Cultures des Microorganismes of the Pasteur Institute hakunumeroilla 20 1-588 ja 1-589. Vasta-aineita voidaan samoin tehdä EP-pa- tenttijulkaisussa 291 368 Ai esitetyn kuvauksen mukaisesti (joka vastaa US-patenttihakemusjulkaisua sarjanumero 07/298 791) .
Potilaan T4-solujen tutkimiseen, joka on tarkoi-25 tettu mahdollisen HIV-infektion määrittämiseen, on edullista käyttää p27K:ta vastaan suunnattua vasta-ainetta (p = 0,01) ja p30-33K:ta vastaan suunnattua vasta-ainetta (p = 0,001) (kuviot 1 ja 2). Voidaan kuitenkin käyttää p21K:ta (p = 0,01) ja p23K:ta (p = 0,001) vastaan valmis-30 tettua vasta-ainetta (kuvio 1).
t .· Potilaalla mahdollisesti olevan HIV-infektion mää rittämiseen voidaan käyttää mitä tahansa prosomiproteii-neista 25K, p29K (p28K, p33K), p30/33K, ja p3lK tai samanlaista p21K:ta vastaan suunnattua monoklonaalista vasta-35 ainetta, kuviot 3 ja 4).
104655 11
Mitä tahansa seuraavista antiprosomaalista proteiinia p23K, p25K, p29K (p28K, p33K) , p30/33K, ja p3lK tai samanlaista p2lK:ta vastaan valmistettua monoklonaalista vasta-ainetta voidaan käyttää potilaan T3-lymfosyyttien 5 tutkimiseen tämän potilaan mahdollisen HIV-infektion määrittämiseksi. Edullisia vasta-aineita ovat proteiineja p21K, p23K, p29K, p30-33K ja p31K vastaan suunnatut vasta-aineet.
Vaikka mitä tahansa anti-prosomiproteiinia (p23K, 10 p25K, p27K, p29K (p28K, p33K) , p30/33K, ja p31K) tai sa manlaista anti-p21K:ta ("prosomia muistuttava partikkeli") vastaan suunnattua vasta-ainetta voidaan käyttää potilaan T8-solujen tutkimiseksi potilaan mahdollisen HIV-infektion määrittämiseksi, ovat edullisia p27K:ta vastaan valmistet-15 tu vasta-aine ja p30-33K:ta vastaan valmistettu vasta-aine (kuvio 7).
p23K:ta vastaan valmistettu vasta-aine on edullinen käytettäväksi potilaan B4-solujen tutkimiseen potilaan mahdollisen HIV-infektion määrittämiseksi (kuvio 8).
20 III Diagnoosimenetelmät Tämän keksinnön mukaisessa edullisessa diagnoosi-menetelmässä käytetään suoraan tai epäsuorasti leimalla varustettuja (esimerkiksi fykoerytriiniä käyttäen) vasta-aineita, jotka on suunnattu eri soluja vastaan (esimerkik-* 25 si T3-lymfosyyttiä, T4-lymfosyyttiä, T8-solua, B4-solua tai luonnollista tappajasolua) näiden solujen tunnistamiseen tai eristämiseen näitä soluja sisältävästä potilaan verestä. Solu-vasta-aine-komplekseja inkuboidaan tämän jälkeen sellaisia prosomiproteiineja vastaan suunnattujen 30 vasta-aineiden kanssa, jotka ovat myös varustettuja lei-maila, esimerkiksi fluoresoivalla yhdisteellä. Tätä menettelytapaa noudattaen leiman saaneiden solujen määrä mitataan tai lasketaan ja mittausta verrataan normiin tai standardimittaukseen.
12 104655 Tätä menetelmää voidaan käyttää useissa erilaisissa laitteissa.
Tässä keksinnössä "immunokemiallinen reagenssi" tarkoittaa, että sopivaa selektiivisyyttä omaavat vasta-5 aineet on sidottu sopivaan kantaja-aineeseen tai ne on varustettu leimana toimivalla aineella. Käytettyihin kantaja-aineisiin kuuluvat tyypillisesti mikrotestikuopan sisäseinä tai kyvetti, putki tai kapillaariputki, membraa-nisuodatin, testiliuska tai partikkelin, kuten lateksipar-10 tikkelin, pinta, helmi, erytrosyytti, väriainesooli, metalli (esimerkiksi kulta-) -sooli tai soolipartikkelina oleva metalliyhdiste. Leimalla varustamiseen tyypillisesti käytettäviin aineisiin kuuluvat erilaiset radioaktiiviset isotoopit, fluoresoivat yhdisteet, entsyymit, väriainesoo-15 lit tai soolipartikkeleina käytetyt metalliyhdisteet.
Yhdessä menetelmässä, jota käytetään HIV-infektion esiintymisen havaitsemiseen tutkittavassa nesteessä, joka sisältää kuvattuja soluja (esimerkiksi HIV:lle altistuneiksi arvellun henkilön ruumiinneste, kuten veri, lymfa-20 neste tai plasma), tuodaan tämän keksinnön mukainen immunokemiallinen reagenssi kosketukseen tutkittavan nesteen kanssa. Tämän jälkeen mitataan vasta-aineiden ja kuvattujen solujen pinta-antigeenien kesken muodostuneiden immuu-nikompleksien esiintyminen tutkittavassa nesteessä immuno-25 kemiallisen reaktion tapahtumisen osoittamiseksi. Immunokemiallinen reaktio on edullisesti kerrosreaktio (käyttäen leimalla varustettua vasta-ainetta), agglutinaatioreaktio (sellainen reaktio, jossa myös käytetään sooleja), kom-petitioreaktio tai inhibitioreaktio.
30 Yhdentyyppisessä immunomäärityksessä kiinnitetään .· tutkittavaa solua tai tutkittavia soluja vastaan suunnat tuja vasta-aineita kiinteään faasiin, esimerkiksi koeputken sisäseinämään. Ruumiinneste, joka sisältää haluttuja soluja, lisätään tämän jälkeen putkeen, jotta nämä 35 solut sitoutuisivat vasta-aineeseen. Antigeeni-vasta-aine-kompleksilla päällystettyyn putkeen lisätään immunologinen 104655 13 reagenssi, joka sisältää tunnetun määrän sopivaa prosomi-proteiinia vastaan suunnattua ja fluoresoivasta yhdisteestä muodostuvalla leimalla varustettua tarkoituksenmukaista vasta-aineita tai tällaisia vasta-aineita. Fluoresens-5 sin määrä mitataan ja tätä verrataan normiin.
Alan ammattimiehet tuntevat muita diagnostisia testipakkauksia, joita voidaan soveltaa tässä keksinnössä käytettäväksi. Immunologisiin diagnostisiin testipakkauksiin kuuluvat esimerkiksi radioimmunomääritykset tai ent-10 syymi-immunoaktiivisuusmääritykset ("EIA"), jotka on kuvattu Schuurs et ai.:Ile myönnetyssä US-reissue-patentti-julkaisussa nro 32 696. Valonsirontaimmunomääritysjärjes-telmä on kuvattu EP-patenttijulkaisussa 0 254 430 A2, joka on myönnetty yhtiölle Ortho Diagnostic Systems, Inc. (joka 15 vastaa US-patenttijulkaisua sarjanumero 879 236, joka on jätetty 26.7.1986). Diagnostisia testipakkauksia, joissa käytetään kahta korkean sitoutumisaktiivisuuden omaavaa monoklonaalista vasta-ainetta, on kuvattu patenttijulkaisuissa US-patentti nrot 4 376 110 ja 4 486 530, jotka on 20 myönnetty Hybritech, Inc -yhtiölle.
Valkosolujen fenotyypin määrittämiseen käytettävä menetelmä käsittää sen, että inkuboidaan soluja prosomi-proteiinin kanssa reaktiokykyisten leimalla varustettujen vasta-aineiden kanssa ja tutkitaan leimalla varustetun *·' 25 proteiinin kanssa reagoivien proteiinien esiintyminen so lun pinnasta käyttäen hyväksi leiman aktiivisuutta.
Esimerkki I
Kaksoismerkintäimmunologia
Erilaiset tutkittavat solut tunnistettiin ja eris-30 tettiin seuraavan menetelmän mukaisesti. Fykoerytriini ("PE") -leimalla varustettuja monoklonaalisia vasta-aineita pipetoitiin 0,1 millilitran (ml) eriin verta, ja inku-boinnin annettiin tapahtua 10 minuutin ajan huoneenlämmössä. Eri näytteisiin käytetyt monoklonaaliset vasta-aineet 35 olivat anti-CD3 (T3-PE), anti-CD4 (T4-PE), anti-CD8 104655 14 (T8-PE) anti-CD2 (11-PE), anti-CD19 (B4-PE), anti-NK (NK-PE). Punasolut hajotettiin ja kiinnitettiin QPREP-vir-taussytometrissä suoritettavaa käsittelyä varten (muura-haishappo/formaldehydi - Coultronics Ranska, Pariisi, 5 Ranska) solukalvon kiinnittämiseksi sen varmistamiseksi, ettei se tuhoudu valmistuksen aikana.
Esimerkki II
Kaksoismerkintäimmunologia
Hiiren seerumia inkuboitiin 4-5 tuntia 4 °C:ssa. 10 Se pestiin kerran väkevällä PBS:lla. Se sekoitettiin tämän jälkeen prosomiproteiineja vastaan suunnattujen monoklo-naalisten vasta-aineiden kanssa, inkuboitiin ja reaktio-seoksen annettiin jäähtyä huoneenlämpöön 30 minuutin kuluttua. Se pestiin uudelleen kerran väkevällä PBS:lla. 15 Vuohen hiirtä vastaan valmistettu fluoreskeiini-isotiosya-naatti ("GAM-FITC") lisättiin, jotta voitaisiin havaita prosomiproteiineja vastaan suunnatut monoklonaaliset vasta-aineet (30 minuutin inkubointi huoneenlämmössä). Tämä pestiin uudelleen väkevällä PBS:lla yhden kerran. Tämä 20 suspendoitiin kerran uudelleen 0,5 ml:aan väkevää PBS:aa. Fluoresenssi tutkittiin CFM:lla (virtaussytometrillä).
Esimerkki III
Kahdestakymmenestä HIV-positiivisesta henkilöstä (joista 2 sairasti AIDS:ia) saatua verta verrattiin infek-25 toitumattomista henkilöistä koostuvan ryhmän vereen esimerkkien I ja II mukaisia menetelmiä käyttäen. Henkilöiden (HIV-1) seerumien vertailun tulokset on esitetty graafisesti kuvioissa 1-8.
Esimerkki IV
30 Sekvenssi nro 1 esittää 266 aminohapon mittaista .* polypeptidiä ja tätä koodaavaa DNA:ta. Tätä proteiinia koodaava cDNA eristettiin Hela-solu-cDNA-ilmentämis-kirjastosta [(lambda) gtll] käyttäen p27K-prosomiproteii-nia vastaan suunnattua monoklonaalista vasta-ainetta 35 (Organon Teknika). Insertti jatkokloonattiin pTZl8R-plas- 15 104655 midivektorissa sekvenssointia varten. cDNArsta puuttuu noin 50 5'-pään puoleista nukleotidia (Northern-blottaus-tutkimuksen mukaisesti). DNA:n pituus on 980 nukleotidia, ja tämän koodaava alue on 798 nukleotidin (266 aminohapon) 5 suuruinen.
Esimerkki V
Sekvenssi nro 3 esittää 269 aminohapon suuruista polypeptidia ja tätä koodaavaa DNA:ta. Tätä proteiinia koodaava cDNA eristettiin Hela-solu- cDNA-ilmentämiskir-10 jastosta [(lambda) gtll] käyttäen p33K-prosomiproteiinia vastaan suunnattua monoklonaalista vasta-ainetta (62A32). Insertti jatkokloonattiin pTZ18R-plasmidivektorissa sekvenssointia varten. Insertin sekvenssointi kumpaankin suuntaan paljasti avoimen lukukehyksen, jonka koko oli 810 15 nukleotidiä ja täysimittaisen jakson, jossa oli suuri 5'-signaalijakso. DNA:n pituus on 1264 nukleotidia ja tämän koodaava alue on 810 nukleotidin (269 aminohapon) suuruinen .
Esimerkki VI
20 Esimerkin IV (ts. sekvensssi nro l:n) mukaista proteiinia käytettiin p27K-prosomiproteiinia vastaan suunnattujen monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseksi. Tämä menetelmä käsittää sen, että tällä peptidillä immunisoidaan hiiriä, hiiristä eristetään pernasolut ja nämä t ’ 25 fuusioidaan hiiren myeloomasoluihin hybridoomien muo dostamiseksi. Hybridoomista seulotaan esille ne, jotka muodostavat vasta-aineita p27K-proteiinia vastaan.
Esimerkki VII
Esimerkin V (ts. sekvenssin nro 3:n mukaisen pro-30 teiinin) mukaista polypeptidiä vastaan suunnattuja mono-klonaalisia vasta-aineita valmistetaan esimerkissä VI kuvatun tavan mukaisesti.
Jaksokuvaus (1) yleiset tiedot 35 (i) hakija
(A) nimi: PRO-SOMA SARL
104655 16 (B) katuosoite: 9, Rue Larrey (C) kaupunki: Pariisi (E) maa: Ranska (F) Postinumero F 75 005 5 (ii) Keksinnön otsikko: Diagnostinen menetelmä (iii) Sekvenssien lukumäärä: 4 (2) Sekvenssiä nro 1 koskevat tiedot: (i) sekvenssin ominaisuudet: (A) pituus: 980 nukleotidia 10 (B) tyyppi: nukleotidi (C) nauhamuoto: kaksinauhainen (D) topologia: lineaarinen
(ii) molekyylityyppi: cDNA
(vi) alkuperäinen lähde: 15 (A) organismi: ihminen (vii) välitön lähde: ' (A) kirjasto: Hela-solujen cDNA- ilmentämis- kirjasto (lambda)gtll (ix) erityispiirre: 20 (B) sijainti: 4..804 (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 1 CGG TGC CTG GTG CGG GAG CTA CGG GGC CCA GGG ATT GTG TTT AAA GTA 48
Cys Leu Vai Arg Glu Leu Arg Gly Pro Gly Ile Vai Phe Lys Vai 15 10 15 ’· 25 GTG CTT CTA CCA ACA TGT CCC GTG GTT CCA GCG CCG GTT TTG ACC GCC 96
Vai Leu Leu Pro Thr Cys Pro Vai Vai Pro Ala Pro Vai Leu Thr Ala 20 25 30 ACA TTA CCA TTT TTT TCA CCC GAG GGT CGG CTC TAC CAA GTA GAA TAT 144
Thr Leu Pro Phe Phe Ser Pro Glu Gly Arg Leu Tyr Gin Vai Glu Tyr 35 40 45 GCT TTT AAG GCT ATT AAC CAG GGT GGC CTT ACA TCA GTA GCT GTC AGA 192 30 Ala Phe Lys Ala Ile Asn Gin Gly Gly Leu Thr Ser Vai Ala Vai Arg • 50 55 60 a GGG AAA GAC TGT GCA GTA ATT GTC ACA CAG AAG AAA GTA CCT GAC AAA 240
Gly Lys Asp Cys Ala Vai Ile Vai Thr Gin Lys Lys Vai Pro Asp Lys 65 70 75 TTA TTG GAT TCC AGC ACA GTG ACT CAC TTA TTC AAG ATA ACT GAA AAC 288
Leu Leu Asp Ser Ser Thr Vai Thr His Leu Phe Lys Ile Thr Glu Asn 35 80 85 90 95 17 104655 ATT GGT TGT GTG ATG ACC GGA ATG ACA GCT GAC ACC AGA TCC CAG GTA 336
Ile Gly Cys Val Met Thr Gly Met Thr Ala Asp Ser Arg Ser Gin Val 100 105 110 CAG AGG GCA CGC TAT GAG GCA GCT AAC TGG AAA TAC AAG TAT GGC TAT 384
Gin Arg Ala Arg Tyr Glu Ala Ala Asn Trp Lys Tyr Lys Tyr Gly Tyr S 115 120 125 GAG ATT CCT GTG GAC ATG CTG TGT AAA AGA ATT GCC GAT ATT TCT CAG 432
Glu He Pro Val Asp Met Leu Cys Lys Arg He Ala Asp He Ser Gin 130 135 140 GTC TAC ACA CAG AAT GCT GAA ATG AGG CCT CTT GGT TGT TGT ATG ATT 480 val Tyr Thr Gin Asn Ala Glu Met Arg Pro Leu Gly Cys Cys Met He 145 150 155 10 TTA ATT GGT ATA GAT GAA GAG CAA GGC CCT CAG GTA TAT AAG TGT GAt 528
Leu He Gly He Asp Glu Glu Gin Gly Pro Gin Val Tyr Lys Cys Asp 160 165 170. 175 CCT GCA GGT TAC TAC TGT GGG TTT AAA GCC ACT GCA GCG GGA GTT AAA 576
Pro Ala Gly Tyr Tyr Cys Gly Phe Lys Ala Thr Ala Ala Gly Val Lys 180 185 190 15 CAA ACT GAG TCA ACC AGC TTC CTT GAA AAA AAA GTG AAG AAG AAA TTT 6 24
Gin Thr Glu Ser Thr Ser Phe Leu Glu Lys Lys Val Lys Lys Lys Phe 195 200 205 GAT TGG ACA TTT GAA CAG ACA GTG GAA ACT GCA ATT ACA TGC CTG TCT 672
Asp Trp Thr Phe Glu Gin Thr Vai Glu Thr Ala He Thr Cys Leu Ser 210 215 220 ACT GTT CTA TCA ATT GAT TTC AAA CCT TCA GAA ATA GAA GTT GGA GTA 720 20 Thr Val Leu Ser He Asp Phe Lys Pro Ser Glu He Glu Val Gly Val 225 230 235 GTG ACn GTT GAA AAT CCT AAA TTC AGG ATT CTT ACA GAA GCA GAG ATT 768
Val Thr Val Glu Asn Pro Lys Phe Arg He Leu Thr Glu Ala Glu He 240 245 250 255 GAT GCT CAC CTT GTT GCT CTA GCA GAG AGA GAC TAAACATTGT CGTTAGTTTA 821
Asp Ala His Leu Val Ala Leu Ala Glu Arg Asp '·' 25 260 265 CCAGATCCGT GATGCCACTT ACCTGTGTGT TTGGTAACAA CAAACAAACA TCATGGAGGT 881 CCCTGGATTG AAAAAGGAGC CTCTCCCACT CCTCCTACCA CCGAAGTGGT TAGGACTCTA 941 TATAAATAAA AACAAGGCTT TTGGAAAAAA AAAAAAAAA 980 30 (2) Sekvenssiä nro 2 koskevat tiedot: (i) sekvenssin ominaisuudet: (A) pituus: 266 aminohappoa (B) tyyppi: aminohappo (C) topologia: lineaarinen 35 (ii) molekyylityyppi: proteiini 1β 104655 (vi) alkuperäinen lähde: (A) organismi: ihminen (xi) sekvenssin kuvaus: sekvenssikuvaus nro 2 5
Cys Leu Vai Arg Glu Leu Arg Gly Pro Gly Ile Vai Phe Lys Vai 15 10 15
Vai Leu Leu Pro Thr Cys Pro Vai Vai Pro Ala Pro Vai Leu Thr Ala 20 25 30
Thr Leu Pro Phe Phe Ser Pro Glu Gly Arg Leu Tyr Gin Vai Glu Tyr 10 35 40 45
Ala Phe Lys Ala Ile Asn Gin Gly Gly Leu Thr Ser Vai Ala Vai Arg 50 55 60
Gly Lys Asp Cys Ala Vai Ile Vai Thr Gin Lys Lys Vai Pro Asp Lys 65 70 75
Leu Leu Asp Ser Ser Thr Vai Thr His Leu Phe Lys Ile Thr Glu Asn 15 80 85 90 95
Ile Gly Cys Vai Met Thr Gly Met Thr Ala Asp Ser Arg Ser Gin Vai 100 105 110
Gin Arg Ala Arg Tyr Glu Ala Ala Asn Trp Lys Tyr Lys Tyr Gly Tyr 115 120 125
Glu Ile Pro Vai Asp Met Leu Cys Lys Arg Ile Ala Asp Ile Ser Gin 20 130 135 140
Vai Tyr Thr Gin Asn Ala Glu Met Arg Pro Leu Gly Cys Cys Met Ile 145 150 155
Leu lii· Gly Ile Asp Glu Glu Gin Gly Pro Gin Vai Tyr Lys Cys Asp 160 -- 165 170 175
Pro Ala Gly Tyr Tyr Cys Gly Phe Lys Ala Thr Ala Ala Gly Vai Lys *· 25 1®® 185 190
Gin Thr Glu Ser Thr Ser Phe Leu Glu Lys Lys Vai Lys Lys Lys Phe 195 200 205
Asp Trp Thr Phe Glu Gin Thr Vai Glu Thr Ala Ile Thr Cys Leu Ser 210 215 220
Thr Vai Leu Ser Ile Asp Phe Lys Pro Ser Glu Ile Glu Vai Gly Vai 30 225 230 235 • .·; Vai Thr Vai Glu Asn Pro Lys Phe Arg Ile Leu Thr Glu Ala Glu Ile ’ ' 240 245 250 255
Asp Ala His Leu Vai Ala Leu Ala Glu Arg Asp 260 265 35 104655 19 (2) Sekvenssikuvausta nro 3 koskevat tiedot: (i) sekvenssin ominaisuudet: (A) pituus: 1264 emäsparia (B) tyyppi: nukleiinihappo 5 (C) nauhamuoto: kaksinauhainen (D) topologia: lineaarinen (ii) molekyylityyppi: cDNA (vi) alkuperäinen lähde: (A) organismi: ihminen 10 (vii) välitön lähde: (A) kirjasto: Hela-solujen cDNA- ilmentämis- kirjasto (lambda)gtll (ix) erityispiirre: (B) sijainti: 328..1137 15 (xi) Sekvenssin kuvaus: sekvenssi nro 3 CGCGAGCCGG GACCACGCCG ACCCAGCGTG CCCAGGCCGA GGAAAGCGCG GCGGCGGCAG 60 TCCGAAGACC CACCGGACTG AAAGAGAAGG ACGAGGTCAT CTTCGGACGG GAGGGGCAAG 120 CCAGCCATCC TGGGACCCCA GGCGTGCAGG TTCTCTTTGA GGGTATTCCA CCCTGCAAAA 180 20 AGCATGTATT CATGGTCAGC TCTCAGCAAG GCCAGTAGCA GAGTGGTAAA GGCCTTGGCC 240 CTCCAAGGCT GGGAAAAGAC AATGACAAGT CAAATCCAGA CCTATGTTGG ATGTTGGTCT 300 ACTAGGTGAC TGTCTCCTGG AAATGTT ATG CAG CTC AGO AAG GTG AAG TTT CGA 354
Met Gin Leu Ser Lys Vai Lys Phe Arg 1 5 AAT CAC TAT GAC AAT GAT GTC ACT GTT TGG ACC GCC CAG GGC AGG ATT 402 ·.; Asn Gin Tyr Asp Asn Asp Vai Thr Vai Trp Thr Ala Gin Gly Arg Ile 10 15 20 25 CAT CAA ATT GAA TAT GCA ATG GAA GCT GTTAAA CAA GGT TCA GCC ACA 450
His Gin Ile Glu Tyr Ala Met Glu Ala Vai Lys Gin Gly Ser Ala Thr 30 35 40 GTT GGT CTG AAA TCA AAA ACT CAT GCA GTT .TTG GTT GCA TTG AAA AGG 498
Vai Gly Leu Lys Ser Lys Thr His Ala Vai Leu Vai Ala Leu Lys Arg 45 50 55 ' !. GCG CAA TCA GAG CTT GCA GCT CAT CAG AAA AAA ATT CTC CAT GTT GAC 546 • < Ala Gin Ser Glu Leu Ala Ala His Gin Lys Lys Ile Leu His Vai Asp 60 65 70 AAC CAT ATT GGT ATC TCA ATT GCG GGG CTT ACT GCT GAT GCT AGA CTG 594
Asn His Ile Gly Ile Ser Ile Ala Gly Leu Thr Ala Asp Ala Arg Leu 75 80 85 TTA TGT AAT TTT ATG CGT CAG GAG TGT TTG GAT TCC AGA TTT GTA TTC 642
Leu Cys Asn Phe Met Arg Gin Glu Cys Leu Asp Ser Arg Phe Vai Phe 90 95 100 105 20 104655 GAT AGA CCA CTG CCT GTG TCT CGT CTT GTA TCT CTA ATT GGA AGC AAG 690
Asp Arg Pro Leu Pro Val Ser Arg Leu Val Ser Leu lie Gly Ser Lys 110 115 120 ACC CAG ATA CCA ACA CAA CGA TAT GGC CGG AGA CCA TAT GGT GTT GGT 738 5 Thr Gin lie Pro Thr Gin Arg Tyr Gly Arg Arg Pro Tyr Gly Val Gly 125 130 135 CTC CTT ATT GCT GGT TAT GAT GAT ATG GGC CCT CAC ATT TTC CAA ACC 786
Leu Leu lie Ala Gly Tyr Asp Asp Met Gly Pro His lie Phe Gin Thr 140 145 150 TGT CCA TCT GCT AAC TAT TTT GAC TGC AGA GCC ATG TCC ATT GGA GCC 834 cys Pro Ser Ala Asn Tyr Phe Asp Cys Arg Ala Met Ser lie Gly Ala 10 155 160 165 CGT TCC CAA TCA GCT CGT ACT TAC TTG GAG AGA CAT ATG TCT GAA TTT 882
Arg Ser Gin Ser Ala Arg Thr Tyr Leu Glu Arg His Met Ser Glu Phe 170 175 180 185 ATG GAG TGT AAT TTA AAT GAA CTA GTT AAA CAT GGT CTG CGT GCC TTA 930
Met Glu Cys Asn Leu Asn Glu Leu Val Lys His Gly Leu Arg Ala Leu 190 195 200 15 AGA GAG ACG CTT CCT GCA GAA CAG GAC CTG ACT ACA AAG AAT GTT TCC 978
Arg Glu Thr Leu Pro Ala Glu Gin Asp Leu Thr Thr Lys Asn Val Ser 205 210 215 ATT GGA ATT GTT GGT AAA GAC TTG GAG TTT ACA ATC TAT GAT GAT GAT 1026 lie Gly lie Val Gly Lys Asp Leu Glu Phe Thr lie Tyr Asp Asp Asp 220 225 230 GAT GTG TCT CCA TTC CTG GAA GGT CTT GAA GAA AGA CCA CAG AGA AAG 1074 20 Asp Val Ser Pro Phe Leu Glu Gly Leu Glu Glu Arg Pro Gin Arg Lys 235 240 245 GCA CAG CCT GCT CAA CCT GCT GAT GAA CCT GCA GAA AAG GCT GAT GAA 1122
Ala Gin Pro Ala Gin Pro Ala Asp Glu Pro Ala Glu Lys Ala Asp Glu 250 255 260 265 CCA ATG GAA CAT TAAGTGATAA GCCAGTCTAT ATATGTATTA TCAAATATGT 1174 . Pro Met Glu His :*. 25 AAGAATACAG GCACCACATA CTGATGACAA TAATCTATAC TTTAACCAAA AGTTGCAGAG 1234 TGGTGGAATG CTATTTTTTA GGAATCAGTC 1264 (2) Sekvenssiä nro 4 koskevat tiedot: 30 (i) sekvenssin ominaisuudet: *| (A) pituus: 269 aminohappoa (B) tyyppi: aminohappo (C) topologia: lineaarinen (ii) molekyylityyppi: proteiini 35 (vi) alkuperäinen lähde: (A) organismi: ihminen 104655 21 (xi) sekvenssin kuvaus: sekvenssi nro 4
Met Gin Leu Ser Lys Vai Lys Phe Arg 1 5 5
Asn Gin Tyr Asp Asn Asp Vai Thr Vai Trp Thr Ala Gin Gly Arg Ile 10 15 20 25
His Gin Ile Glu Tyr Ala Met Glu Ala Vai Lys Gin Gly Ser Ala Thr 30 35 40
Vai Gly Leu Lys Ser Lys Thr His Ala Vai Leu Vai Ala Leu Lys Arg 45 50 55 10 Ala Gin Ser Glu Leu Ala Ala His Gin Lys Lys Ile Leu His Vai Asp 60 65 70
Asn His Ile Gly Ile Ser Ile Ala Gly Leu Thr Ala Asp Ala Arg Leu 75 80 85
Leu cys Asn Phe Met Arg Gin Glu cys Leu Asp Ser Arg Phe Vai Phe 90 95 100 105 15 Asp Arg Pro Leu Pro Vai Ser Arg Leu Vai Ser Leu Ile Gly Ser Lys 110 115 120
Thr Gin Ile Pro Thr Gin Arg Tyr Gly Arg Arg Pro Tyr Gly Vai Gly 125 130 135
Leu Leu Ile Ala Gly Tyr Asp Asp Het Gly Pro His Ile Phe Gin Thr 140 145 150 20 Cys Prr ~er Ala Asn Tyr Phe Asp Cys Arg Ala Met Ser Ile Gly Ala 155 160 165
Arg Ser Gin Ser Ala Arg Thr Tyr Leu Glu Arg His Met Ser Glu Phe 170 175 180 185
Met Glu Cys Asn Leu Asn Glu Leu Vai Lys His Gly Leu Arg Ala Leu 190 195 200 ·.: ' 25
Arg Glu Thr Leu Pro Ala Glu Gin Asp Leu Thr Thr Lys Asn Vai Ser 205 210 215
Ile Gly Ile Vai Gly Lys Asp Leu Glu Phe Thr Ile Tyr Asp Asp Asp 220 225 - 230
Asp Vai Ser Pro Phe Leu Glu Gly Leu Glu Glu Arg Pro Gin Arg Lys 235 240 245 . Ala Gin Pro Ala Gin Pro Ala Asp Glu Pro Ala Glu Lys Ala Asp Glu ' ,· 250 255 260 265
Pro Met Glu His

Claims (10)

104655
1. Menetelmä ihmisen immuunipuutostautivirusinfek-tion diagnostisoimiseksi potilaassa, tunnettu 5 siitä, että a) tutkitaan potilaasta otetusta ruumiinnesteestä solun pinnoilla esiintyviä proteiineja käyttäen leimalla varustettuja vasta-aineita, leimalla varustettuja vasta-ainefragmentteja tai näiden seoksia, jolloin mainitut pro-10 teiinit reagoivat vasta-aineiden kanssa, jotka on suunnattu prosomiproteiineja tai prosomia muistuttavaa partikkelia vastaan, sellaisten solujen määrän tai prosentuaalis-nen osuuden, joiden pinnalla tämä proteiini esiintyy, määrittämiseksi kvantitatiivisesti; ja 15 b) verrataan näin saatua määrää tai prosentuaalis ta osuutta standardiin, joka on saatu ihmisen immuunipuu-tostautiviruksella infektoitumattomasta henkilöstä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aineet tai vasta-aine- 20 fragmentit ovat prosomiproteiineja p23K, p25K, p27K, p29K (p28K, p33K), p30/33K, ja p3lK tai prosomia muistuttavan partikkelin p21K-proteiinia vastaan suunnattuja vasta-aineita, tai ovat peräisin näistä vasta-aineista. « I
• 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että solut ovat potilaan B4-soluja ja vasta-aine on p23K:ta vastaan suunnattu monoklonaalinen vasta-aine.
4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solut ovat potilaan T4-soluja 30 ja vasta-aine on p27K:ta vastaan suunnattu vasta-aine, joka on nostatettu sekvenssissä nro 2 identifioitua proteiinia tai tämän antigeenistä fragmenttia vastaan.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 104655 tunnettu siitä, että vasta-aine on vasta-aine, joka on nostatettu sekvenssissä nro 4 identifioitua proteiinia tai tämän antigeenistä fragmenttia vastaan.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että solut ovat potilaan T8-soluja ja vasta-aineet ovat monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on suunnattu mitä tahansa prosomiproteiineista p23K, p25K, p27K, p29K (p28K, p33K) , p30/33K ja p3lK vastaan tai pro-somia muistuttavan partikkelin p2lK-proteiinia vastaan.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solut ovat potilaan luonnollisia tappajasoluja ja vasta-aineet ovat monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on suunnattu mitä tahansa prosomiproteiineista p25K, p29K (p28K, p33K) , p30/33K ja p31K vas-15 taan tai prosomia muistuttavan partikkelin p2lK-proteiinia vastaan.
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solut ovat potilaan T3-lymfosyyttejä ja vasta-aineet ovat vasta-aineita, jotka on 20 suunnattu mitä tahansa prosomiproteiineista p23K, p25K, p29K (p28K, p33K), p30/33K ja p31K vastaan tai prosomia muistuttavan partikkelin p2lK-proteiinia vastaan.
... 9. In vitro -menetelmä ihmisen immuunipuutostauti- virusinfektion diagnostisoimiseksi, tunnettu sii-25 tä, että tunnistetaan tai eristetään soluja, jotka ovat B4-soluja, T4-soluja, T8-soluja, luonnollisia tappajasoluja, T3-lymfosyyttejä tai näiden solujen seoksia käyttäen näitä soluja vastaan suunnattuja vasta-aineita; 30 inkuboidaan tällä tavoin eristettyjä soluja proso- miproteiineja tai prosomia muistuttavaa partikkelia vastaan suunnattuja ja leimalla varustettuja monoklonaalisia vasta-aineita käyttäen; ja 104655 tutkitaan näiden avulla solun pinnalla esiintyviä proteiinej a.
10. Ihmisen immuunipuutostautivirusinfektion diagnoosiin soveltuva diagnostinen testipakkaus, tun-5 n e t t u siitä, että se käsittää vasta-aineita, jotka on suunnattu B4-soluja, T4-soluja, T8-soluja, luonnollisia tappajasoluja, T3-lymfosyyttejä tai näiden solujen seoksia vastaan ja jotka on liitetty kiinteään pintaan; ja diagnoosiin käytettävän nesteen, joka sisältää 10 prosomiproteiineja tai prosomia muistuttavaa partikkelia vastaan suunnattuja leimattuja vasta-aineita. 15 25 1 0 4 6-55
FI922666A 1990-10-11 1992-06-09 Diagnostinen menetelmä FI104655B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP90402838 1990-10-11
EP90402838 1990-10-11
PCT/EP1991/001945 WO1992007269A1 (en) 1990-10-11 1991-10-10 Diagnostic method
EP9101945 1991-10-10

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FI922666A0 FI922666A0 (fi) 1992-06-09
FI104655B true FI104655B (fi) 2000-03-15

Family

ID=8205759

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI922666A FI104655B (fi) 1990-10-11 1992-06-09 Diagnostinen menetelmä

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5635345A (fi)
EP (1) EP0504371B1 (fi)
JP (1) JPH05503712A (fi)
AT (1) ATE146596T1 (fi)
AU (1) AU652193B2 (fi)
CA (1) CA2069424A1 (fi)
DE (1) DE69123723T2 (fi)
FI (1) FI104655B (fi)
WO (1) WO1992007269A1 (fi)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA923679B (en) * 1991-06-21 1993-01-27 Pro Soma Sarl Diagnostic method
US6544750B1 (en) 1999-08-17 2003-04-08 Thromgen, Inc. Peptide analogs as selective inhibitors of thrombin activation of protease activated receptor 1
EP2550362B1 (en) 2010-03-25 2017-01-04 Oregon Health&Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
PT2691530T (pt) 2011-06-10 2018-05-10 Univ Oregon Health & Science Glicoproteínas e vectores recombinantes cmv
US20130189754A1 (en) 2011-09-12 2013-07-25 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
ES2631608T3 (es) 2012-06-27 2017-09-01 International Aids Vaccine Initiative Variante de la glicoproteína Env del VIH-1
US20150065381A1 (en) 2013-09-05 2015-03-05 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel hiv-1 immunogens
EP2873423B1 (en) 2013-10-07 2017-05-31 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
EP3069730A3 (en) 2015-03-20 2017-03-15 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
EP3072901A1 (en) 2015-03-23 2016-09-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2586814A1 (fr) * 1985-08-30 1987-03-06 Centre Nat Rech Scient Anticorps monoclonaux anti-proteines p 27 k et p 31 k de prosomes et leur application a titre de reactifs de diagnostic et/ou d'identification de cellules
JPH01309686A (ja) * 1988-06-08 1989-12-14 Otsuka Pharmaceut Co Ltd 多機能プロテアーゼ

Also Published As

Publication number Publication date
DE69123723T2 (de) 1997-04-17
DE69123723D1 (de) 1997-01-30
AU8741691A (en) 1992-05-20
EP0504371B1 (en) 1996-12-18
AU652193B2 (en) 1994-08-18
US5635345A (en) 1997-06-03
FI922666A0 (fi) 1992-06-09
CA2069424A1 (en) 1992-04-12
WO1992007269A1 (en) 1992-04-30
JPH05503712A (ja) 1993-06-17
ATE146596T1 (de) 1997-01-15
EP0504371A1 (en) 1992-09-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111217920B (zh) 新冠病毒n-s优势表位融合蛋白、制备方法、应用，及表达蛋白、微生物、应用，试剂盒
EP0199438B1 (en) Htlv iii polypeptides
Chambers et al. Isolation and analysis of cDNA clones expressing human lupus La antigen.
US6406841B1 (en) Methods for the detection of HTLV-II antibodies employing novel HTLV-II NRA envelope peptides
JP2574224B2 (ja) ペプチド
WO1995001457A9 (en) Htlv-iinra compositions and assays for detecting htlv infection
FI104655B (fi) Diagnostinen menetelmä
JP2858467B2 (ja) 分子クローニングにより得られたランゲルハンス島細胞の抗原
CA2499926A1 (en) Antibody against von willebrand factor cleaving enzyme and assay system using the same
EP1242450B1 (en) Organ transplant rejection and associated conditions
JP2007145775A (ja) ノロウイルスｇｉの高感度検出方法
CA1231047A (en) Diagnostic test for rheumatological diseases
EP0908466B1 (en) Anti-human lect2 antibody, cells producing the same, and method and kit for assaying the same
CA2387576C (en) Immuno-interactive fragments of the .alpha.c subunit of inhibin
EP0506914B1 (en) Method for the diagnosis of hiv infections
CN116789834B (zh) 一种抗人cd56工程抗体及应用
AU782490B2 (en) Immuno-interactive fragments of the alphaC subunit of inhibin
US20040234537A1 (en) Carcinoma-related peptides
JP2000002709A (ja) 白血病の検出方法及び検出キット
CN117434275A (zh) 一种嵌合抗原受体检测试剂及其制备与应用
CN117186221A (zh) 大内皮素-1特异性抗体及其制备方法和应用
CN117700534A (zh) 一种抗猴痘病毒a35r蛋白的抗体及其应用
US6620913B1 (en) Polypeptides of a novel hantavirus
WO1991004341A1 (en) Hdv-specific peptides
JPH0694707A (ja) 診断方法

Legal Events

Date Code Title Description
MA Patent expired