JP2858467B2 - 分子クローニングにより得られたランゲルハンス島細胞の抗原 - Google Patents
分子クローニングにより得られたランゲルハンス島細胞の抗原Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、インスリン依存性（Ｉ型）真性糖尿病（di
abetes mellitus）（IDDM）を病む患者の血清中に見い
だされる抗体と結合する、ランゲルハンス島細胞の抗原
に関する。さらに詳しくは、本発明は、小島細胞抗体
（ICA）と結合しそして組み換えDNA（rDNA）または合成
法により調製される、タンパク質およびペプチドに関す
る。本発明は、また、このようなICAタンパク質および
ペプチドをエンコードするクローニングしたDNAに関す
る。本発明のICAタンパク質およびペプチドは、IDDMの
症候前の診断においてイムノアッセイ試薬として有用で
ある。
abetes mellitus）（IDDM）を病む患者の血清中に見い
だされる抗体と結合する、ランゲルハンス島細胞の抗原
に関する。さらに詳しくは、本発明は、小島細胞抗体
（ICA）と結合しそして組み換えDNA（rDNA）または合成
法により調製される、タンパク質およびペプチドに関す
る。本発明は、また、このようなICAタンパク質および
ペプチドをエンコードするクローニングしたDNAに関す
る。本発明のICAタンパク質およびペプチドは、IDDMの
症候前の診断においてイムノアッセイ試薬として有用で
ある。
IDDMに関連する細胞および体液の異常の蓄積する証拠
は、この病気が自己免疫の疾患であるという仮説に導い
た。ランゲルハンス島のインスリン産生細胞に対して向
けられた血清の抗体は、免疫蛍光により検出された［G.
F.Bottazo、A.Florin−Christensen、およびD.Doniach:
自己免疫ポリエンドクリン欠損をもつ真性糖尿病におい
て小島細胞抗体（Islet Cell Antibodies in Diabe
tes Mellitus With Autoimine Polyendocrine Def
iciencies）、Lancet ii:1279−1283（1974）、および
A.C.MacCuish、J.Jordan、C.J.Campbell、L.J.P.Dunca
n、およびW.J.Irvine:共存する自己免疫病をもつインス
リン依存性糖尿病における小島細胞に対する抗体（Anti
bodies to Islet−cell in Insulin−dependent D
iabetics With Coexistant Autoimmune Diseas
e）、Lancet ii:1529−1533（1974）］。これらの自己
抗体は新しく診断された糖尿病（NDD）の70〜80％にお
いて観察されたが、正常の対照被検体において0.1〜１
％で観察されるのみである［C.H.BrogrenおよびA.Lernm
ark:糖尿病において小島細胞抗体（Islet Cell Antib
odies in Diabetes）、Clin.Endocrinol.Metab.11:40
9−430（1982）、およびG.F.Bottazzo、R.Pujol−Borre
ll、およびD.Doniach.:真性糖尿病において体液および
細胞の免疫性（Humoral and Cellular Immunity in
Diabetes Mellitus）、Clin.Immunol.Allergy １:1
39−159（1981）］。ICAはIDDMの１つの断定的因子とし
て受け入れられるようになった。ICAについての現在の
知識の外観は、A.Lernmark,糖尿病の薬物（Diabetic M
edicine）４:285−292（1987）に記載されている。
は、この病気が自己免疫の疾患であるという仮説に導い
た。ランゲルハンス島のインスリン産生細胞に対して向
けられた血清の抗体は、免疫蛍光により検出された［G.
F.Bottazo、A.Florin−Christensen、およびD.Doniach:
自己免疫ポリエンドクリン欠損をもつ真性糖尿病におい
て小島細胞抗体（Islet Cell Antibodies in Diabe
tes Mellitus With Autoimine Polyendocrine Def
iciencies）、Lancet ii:1279−1283（1974）、および
A.C.MacCuish、J.Jordan、C.J.Campbell、L.J.P.Dunca
n、およびW.J.Irvine:共存する自己免疫病をもつインス
リン依存性糖尿病における小島細胞に対する抗体（Anti
bodies to Islet−cell in Insulin−dependent D
iabetics With Coexistant Autoimmune Diseas
e）、Lancet ii:1529−1533（1974）］。これらの自己
抗体は新しく診断された糖尿病（NDD）の70〜80％にお
いて観察されたが、正常の対照被検体において0.1〜１
％で観察されるのみである［C.H.BrogrenおよびA.Lernm
ark:糖尿病において小島細胞抗体（Islet Cell Antib
odies in Diabetes）、Clin.Endocrinol.Metab.11:40
9−430（1982）、およびG.F.Bottazzo、R.Pujol−Borre
ll、およびD.Doniach.:真性糖尿病において体液および
細胞の免疫性（Humoral and Cellular Immunity in
Diabetes Mellitus）、Clin.Immunol.Allergy １:1
39−159（1981）］。ICAはIDDMの１つの断定的因子とし
て受け入れられるようになった。ICAについての現在の
知識の外観は、A.Lernmark,糖尿病の薬物（Diabetic M
edicine）４:285−292（1987）に記載されている。
普通のICAアッセイは、膵臓の切片を血清に暴露し、
蛍光をもつ［G.F.Bottazzo et al.、supra］または酵
素標識をもつ［P.G.Colman、M.Tatkus、A.Rabizadeh、
C.Cahill、およびG.S.Eisenbarth:ラットの膵臓および
ペルオキシダ−ゼプロテインＡを使用する小島細胞抗体
のアッセイ（Assay forIslet Cell Antibodies wit
h Rat Pancreas and Peroxidase Prtein Ａ）、D
iabetes Care 11:367−368（1988）］第２抵抗で着色
し、そして顕微鏡で観察することから成る。他の同様な
方法は、ビオチン−アビジンのサンドイッチおよび免疫
蛍光検出を包含する［T.コバヤシ、T.スギモト、T.イト
ウ、K.コサカ、T.タナカ、S.スワ、K.サトウおよびK.ツ
ジ：間接免疫蛍光によりおよび新規な方法により研究し
た日本のインスリン依存性および非インスリン依存性糖
尿病患者において小島細胞抗体の流行（The Prevalenc
e of Islet Cell Antibodies in Japanese Insl
in−dependent and Non−inslin−dependent Diabet
ic Patiants Studied by Indirect Immunofluores
cence and New Methods）、Diabetes 35:335−340
（1986）］。これらの方法は時間を消費し、労力を要
し、再現が困難であり、そして感度が制限される。ICA
のより便利なイムノアッセイの開発は、疫学およびIDDM
との相関関係の広い試験、および究極にはスクリーニン
グ試験によるこの病気の予測を可能とするであろう。
蛍光をもつ［G.F.Bottazzo et al.、supra］または酵
素標識をもつ［P.G.Colman、M.Tatkus、A.Rabizadeh、
C.Cahill、およびG.S.Eisenbarth:ラットの膵臓および
ペルオキシダ−ゼプロテインＡを使用する小島細胞抗体
のアッセイ（Assay forIslet Cell Antibodies wit
h Rat Pancreas and Peroxidase Prtein Ａ）、D
iabetes Care 11:367−368（1988）］第２抵抗で着色
し、そして顕微鏡で観察することから成る。他の同様な
方法は、ビオチン−アビジンのサンドイッチおよび免疫
蛍光検出を包含する［T.コバヤシ、T.スギモト、T.イト
ウ、K.コサカ、T.タナカ、S.スワ、K.サトウおよびK.ツ
ジ：間接免疫蛍光によりおよび新規な方法により研究し
た日本のインスリン依存性および非インスリン依存性糖
尿病患者において小島細胞抗体の流行（The Prevalenc
e of Islet Cell Antibodies in Japanese Insl
in−dependent and Non−inslin−dependent Diabet
ic Patiants Studied by Indirect Immunofluores
cence and New Methods）、Diabetes 35:335−340
（1986）］。これらの方法は時間を消費し、労力を要
し、再現が困難であり、そして感度が制限される。ICA
のより便利なイムノアッセイの開発は、疫学およびIDDM
との相関関係の広い試験、および究極にはスクリーニン
グ試験によるこの病気の予測を可能とするであろう。
現在のICA試験の主な制限は、含まれる小島細胞抗原
の制限された知識および特性決定である。ICAは低い力
価および親和性をもち、そして特性決定した抗体を使用
してのみアプローチすることができる。免疫蛍光試験に
より検出されるICA抗原は、特別な興味をもたれてい
る；それらは次のものを包含するであろう： （１）小島細胞表面方法部分［N.K.MacLaren、S.W.Hugn
g、およびJ.Fogh:インスリン依存性糖尿病における培養
したヒト島細胞腫細胞に対する抗体（Antibody to Cu
ltured Human Insulinoma Cells in Insulin−dep
endent Diabetes）、Lancet １:997−1000（1975）、
およびA.Lernmark、Z.F.Steiner、R.L.Jackson、R.J.Wi
nterおよびH.S.Traisman:若年型真性糖尿病における小
島細胞表面抗体（Islet−cell−surface Antibodies
in Juvenile Diabetes Mellitus）、N.Engl.J.Med.2
29:375−380（1978）］、 （２）インスリン［J.P.Palmer、C.M.Asplin、P.Clemon
s、K.Lyen、O.Tetpati、P.K.RaghuおよびT.L.Paquette:
インスリン処置前のインスリン依存性糖尿病におけるイ
ンスリン抵抗（Insulin Antibodies in Insulin Tr
eatment）、Science 222:1337−1339（1983）、および
S.Srikanta、A.T.Richer、D.K.McCulloch、J.S.Soeldne
r、G.S.EisenbarthおよびJ.P.Palmer:インスリンに対す
る自己免疫性、ベータ細胞の機能不全、およびインスリ
ン依存性真性糖尿病の進展（Autoimmunity to Insuli
n,Beta Cell Dysfunction,and Development of In
sulin−dependent Diabetes Mellitus）、Diabetes
35:139−142（1986）］、 （３）未知の細胞の局在化の64,000ダルトン（64kd）の
小島タンパク質［S.Baekkeskov、J.H.Nielsen、B.Marne
r、T.Bilde、J.Ludvigsson、およびA.Lernmark:新しく
診断した糖尿病の子供における自己抗体はヒトランゲル
ハンス島細胞タンパク質を免疫沈澱させる（Autoantibo
dies in Newly Diagnosed Diabetic Islet Cell
Proteins）、Nature 298:167−169（1982）］、およ
び （４）細胞質抗原［G.F.Bottazzo、A.Florin−Christen
sen、およびD.Doniach:自己免疫ポリエンドクリン欠損
をもつ真性糖尿病において小島細胞抗体（Islet Cell
Antibodies in Diabetes Mellitus With Autoim
mune Polyendocrine Deficiencies）、Lancet ２:12
79−1283（1974）、A.C.MacCuish、J.Jordan、C.J.Camp
bell、L.J.P.Ducan、およびW.J.Irvine:共存する自己免
疫病をもつインスリン依存性糖尿病における小島細胞に
対する抵抗（Antibodies to Islet−cell in Insul
in−dependent Diabetics With Coexistant Autoim
mune Disease）、Lancet ２:1529−1533（1974）、R.
Lendrum、G.Walker、およびD.R.Gambli:最近の開始の若
年型真性糖尿病において小島細胞抗体（Islet−Cell A
ntibodies in Juvenile Diabetes Mellitus of R
ecent Onset）、Lancet １:880−883（1975）、およ
びW.J.Irvine、C.J.McCallum、R.S.Gray、G.J.Campbel
l、L.J.P.Duncan、J.W.Farquhar、H.Vaughan、およびP.
J.Morris:糖尿病、同時に存在する自己免疫病、およびH
LA型の期間および型と相関関係をもつ真性糖尿病におけ
るランゲルハンス島抗体（Pancreatic Islet Cell A
ntibodies in Diabetes Mellitus Correlated Wit
h The Duration and Type of Diabetes,Co−exis
tent Autoimmune Disease,and HLA−type）、Diabet
es 26:138−147（1977）。
の制限された知識および特性決定である。ICAは低い力
価および親和性をもち、そして特性決定した抗体を使用
してのみアプローチすることができる。免疫蛍光試験に
より検出されるICA抗原は、特別な興味をもたれてい
る；それらは次のものを包含するであろう： （１）小島細胞表面方法部分［N.K.MacLaren、S.W.Hugn
g、およびJ.Fogh:インスリン依存性糖尿病における培養
したヒト島細胞腫細胞に対する抗体（Antibody to Cu
ltured Human Insulinoma Cells in Insulin−dep
endent Diabetes）、Lancet １:997−1000（1975）、
およびA.Lernmark、Z.F.Steiner、R.L.Jackson、R.J.Wi
nterおよびH.S.Traisman:若年型真性糖尿病における小
島細胞表面抗体（Islet−cell−surface Antibodies
in Juvenile Diabetes Mellitus）、N.Engl.J.Med.2
29:375−380（1978）］、 （２）インスリン［J.P.Palmer、C.M.Asplin、P.Clemon
s、K.Lyen、O.Tetpati、P.K.RaghuおよびT.L.Paquette:
インスリン処置前のインスリン依存性糖尿病におけるイ
ンスリン抵抗（Insulin Antibodies in Insulin Tr
eatment）、Science 222:1337−1339（1983）、および
S.Srikanta、A.T.Richer、D.K.McCulloch、J.S.Soeldne
r、G.S.EisenbarthおよびJ.P.Palmer:インスリンに対す
る自己免疫性、ベータ細胞の機能不全、およびインスリ
ン依存性真性糖尿病の進展（Autoimmunity to Insuli
n,Beta Cell Dysfunction,and Development of In
sulin−dependent Diabetes Mellitus）、Diabetes
35:139−142（1986）］、 （３）未知の細胞の局在化の64,000ダルトン（64kd）の
小島タンパク質［S.Baekkeskov、J.H.Nielsen、B.Marne
r、T.Bilde、J.Ludvigsson、およびA.Lernmark:新しく
診断した糖尿病の子供における自己抗体はヒトランゲル
ハンス島細胞タンパク質を免疫沈澱させる（Autoantibo
dies in Newly Diagnosed Diabetic Islet Cell
Proteins）、Nature 298:167−169（1982）］、およ
び （４）細胞質抗原［G.F.Bottazzo、A.Florin−Christen
sen、およびD.Doniach:自己免疫ポリエンドクリン欠損
をもつ真性糖尿病において小島細胞抗体（Islet Cell
Antibodies in Diabetes Mellitus With Autoim
mune Polyendocrine Deficiencies）、Lancet ２:12
79−1283（1974）、A.C.MacCuish、J.Jordan、C.J.Camp
bell、L.J.P.Ducan、およびW.J.Irvine:共存する自己免
疫病をもつインスリン依存性糖尿病における小島細胞に
対する抵抗（Antibodies to Islet−cell in Insul
in−dependent Diabetics With Coexistant Autoim
mune Disease）、Lancet ２:1529−1533（1974）、R.
Lendrum、G.Walker、およびD.R.Gambli:最近の開始の若
年型真性糖尿病において小島細胞抗体（Islet−Cell A
ntibodies in Juvenile Diabetes Mellitus of R
ecent Onset）、Lancet １:880−883（1975）、およ
びW.J.Irvine、C.J.McCallum、R.S.Gray、G.J.Campbel
l、L.J.P.Duncan、J.W.Farquhar、H.Vaughan、およびP.
J.Morris:糖尿病、同時に存在する自己免疫病、およびH
LA型の期間および型と相関関係をもつ真性糖尿病におけ
るランゲルハンス島抗体（Pancreatic Islet Cell A
ntibodies in Diabetes Mellitus Correlated Wit
h The Duration and Type of Diabetes,Co−exis
tent Autoimmune Disease,and HLA−type）、Diabet
es 26:138−147（1977）。
（５）糖接合体［R.C.Nayak、M.A.K.Omar、A.Rabizade
h、S.Srikanta、およびG.S.Eisenbarth、「細胞質」小
島細胞抗体：標的抗原はシアログリココンジュゲートで
ある証拠（“Cytoplasmic"Islet Cell Antibodies:Ev
idence That the Target Antigen is ａ Sialog
lycocnjugate）、Diabetes 34:617−619（1985）;P.Va
rdi、E.E.Dibella、T.J.Pasquarello、およびS.Srikant
a、小島細胞自己抗体：病理生物学および臨床的適用（I
slet Cell Autoantibodies:Pathobiolgy and Clini
cal Applications）、Diabetes Care 10:645−56（1
987）;B.K.Gillard、J.W.Thomas、L.J.NellおよびD.M.M
arcus、Ｉ型真性糖尿病をもつ患者の血清分離された核
酸ガングリオシドGT3に対する抗体（Antibodies Again
st Ganglioside GT3 in the Sera of Patients
with Type Ｉ Diabetes Mellitus）、Jounal of
Immunology 142:3826−32（1989）］。
h、S.Srikanta、およびG.S.Eisenbarth、「細胞質」小
島細胞抗体：標的抗原はシアログリココンジュゲートで
ある証拠（“Cytoplasmic"Islet Cell Antibodies:Ev
idence That the Target Antigen is ａ Sialog
lycocnjugate）、Diabetes 34:617−619（1985）;P.Va
rdi、E.E.Dibella、T.J.Pasquarello、およびS.Srikant
a、小島細胞自己抗体：病理生物学および臨床的適用（I
slet Cell Autoantibodies:Pathobiolgy and Clini
cal Applications）、Diabetes Care 10:645−56（1
987）;B.K.Gillard、J.W.Thomas、L.J.NellおよびD.M.M
arcus、Ｉ型真性糖尿病をもつ患者の血清分離された核
酸ガングリオシドGT3に対する抗体（Antibodies Again
st Ganglioside GT3 in the Sera of Patients
with Type Ｉ Diabetes Mellitus）、Jounal of
Immunology 142:3826−32（1989）］。
64kdの抗原は、放射線標識した小島タンパク質の免疫
沈澱により大きさおよび等電点タンパク質について特性
決定されたが、配列の情報は存在しない。２つの報告
は、前糖尿病の血清ならびに新しく診断した糖尿病血清
中のこのタンパク質を認識するという、抗体の高い流布
を示す［S.Baekkeskov、M.Landin、J.K.Kristensen、S.
Srikanta、G.Jan Bruining、R.Mandrup−Poulsen、C.d
eBeaufort、J.S.Soeldner、G.Eisenbarth、F.Lindgre
n、G.Sundquist、およびA.Lernmark:64,000分子量のヒ
ト小島細胞抗体に対する抗体は、インスリン依存性糖尿
病と臨床的開始より先行する（Antibodies to ａ 6
4,000 MW Human Islet Cell Antigen Preced th
e Clinical Onset of Insulin−dependent Diabet
es）、J.Clin.Invest.79:926−934（1987）、およびM.
A.Atkinson、N.K.Maclaren、W.J.Riley、D.W.Sharpおよ
びL.Holmes:Mr64,000の自己抗体（64KA）の予測インス
リン依存性糖尿病（Mr 64,000 Autoantibodies（64K
A）Predict Insulin Depndent Diabetes）、America
n Diabetes Assoc.48th Annual Meeting（1988）Ab
stract ＃391］。
沈澱により大きさおよび等電点タンパク質について特性
決定されたが、配列の情報は存在しない。２つの報告
は、前糖尿病の血清ならびに新しく診断した糖尿病血清
中のこのタンパク質を認識するという、抗体の高い流布
を示す［S.Baekkeskov、M.Landin、J.K.Kristensen、S.
Srikanta、G.Jan Bruining、R.Mandrup−Poulsen、C.d
eBeaufort、J.S.Soeldner、G.Eisenbarth、F.Lindgre
n、G.Sundquist、およびA.Lernmark:64,000分子量のヒ
ト小島細胞抗体に対する抗体は、インスリン依存性糖尿
病と臨床的開始より先行する（Antibodies to ａ 6
4,000 MW Human Islet Cell Antigen Preced th
e Clinical Onset of Insulin−dependent Diabet
es）、J.Clin.Invest.79:926−934（1987）、およびM.
A.Atkinson、N.K.Maclaren、W.J.Riley、D.W.Sharpおよ
びL.Holmes:Mr64,000の自己抗体（64KA）の予測インス
リン依存性糖尿病（Mr 64,000 Autoantibodies（64K
A）Predict Insulin Depndent Diabetes）、America
n Diabetes Assoc.48th Annual Meeting（1988）Ab
stract ＃391］。
いくつかの他の分子種は、ウェスタン・ブロットによ
り、糖尿病血清により認識される「共通の抗体」である
として特性決定された［D.G.Karouns、V.J.Virta、L.J.
Nell、およびJ.W.Thomas:ヒトおよびRINm5F小島細胞抗
原の分析（Analysis of Human and RINm5F Islet
Antigens）、American Diabetes Assoc.Res.Symp.W
oods Hole、MA.October 1987;Abstract ＃120］。こ
れらの抗原は、150kd、84kd、60kd、49kd、および36kd
の分子量を有する。
り、糖尿病血清により認識される「共通の抗体」である
として特性決定された［D.G.Karouns、V.J.Virta、L.J.
Nell、およびJ.W.Thomas:ヒトおよびRINm5F小島細胞抗
原の分析（Analysis of Human and RINm5F Islet
Antigens）、American Diabetes Assoc.Res.Symp.W
oods Hole、MA.October 1987;Abstract ＃120］。こ
れらの抗原は、150kd、84kd、60kd、49kd、および36kd
の分子量を有する。
本発明は、ランゲルハンス島細胞抗体と選択的に結合
する、１または２以上のタンパク質またはペプチド断片
の遺伝情報を指定する、１系列のクローニングした核酸
を提供する。このようなクローニングした拡散は、受託
された組み換えバクテリオファージATCC40550、40551、
40552、40553、40554、40703、40704、40705、または40
706中のDNAインサートにより特性決定される。
する、１または２以上のタンパク質またはペプチド断片
の遺伝情報を指定する、１系列のクローニングした核酸
を提供する。このようなクローニングした拡散は、受託
された組み換えバクテリオファージATCC40550、40551、
40552、40553、40554、40703、40704、40705、または40
706中のDNAインサートにより特性決定される。
したがって、本発明は、また、クローニングした核酸
によりエンコードされそしてインスリン依存性（Ｉ型）
真性糖尿病（IDDM）の診断において有用である、ICAタ
ンパク質およびペプチド断片を提供する。ICA上の抗体
結合部位に結合するこのようなタンパク質およびペプチ
ドの能力は、また、循環するヒト免疫グロブリン、Ｔ細
胞、およびＢ細胞を包含する、IDDMにおいて含まれるヒ
ト免疫グロブリン、Ｔ細胞またはＢ細胞の結合またはブ
ロッキング（bloking）における実用性を与える。
によりエンコードされそしてインスリン依存性（Ｉ型）
真性糖尿病（IDDM）の診断において有用である、ICAタ
ンパク質およびペプチド断片を提供する。ICA上の抗体
結合部位に結合するこのようなタンパク質およびペプチ
ドの能力は、また、循環するヒト免疫グロブリン、Ｔ細
胞、およびＢ細胞を包含する、IDDMにおいて含まれるヒ
ト免疫グロブリン、Ｔ細胞またはＢ細胞の結合またはブ
ロッキング（bloking）における実用性を与える。
本発明のICAタンパク質およびペプチドは、本発明の
クローニングした核酸の完全なまたは部分的発現のよう
な方法により、必要に応じて引き続く断片化により得ら
れる；そして本発明のクローニングしたcDNAからか、あ
るいは決定することができるかまたは小島細胞の核酸か
ら分離できる全長のICA抗原遺伝子から、決定されたア
ミノ酸配列に基づくペプチドまたはポリペプチドの合成
は、本発明の相補的クローニングしたcDNA配列の助けに
より遊離する。したがって、このようなICAタンパク質
は、小島細胞の中にまたは上に存在する全長のICAタン
パク質を包含し、そして前記ICAタンパク質は本発明の
クローニングしたcDNAの完全な配列と少なくとも部分的
に相補的であるmRNAをもつヒト遺伝子により発現され
る。また、本発明のICAタンパク質およびペプチドに
は、部分的発現によるか、あるいは引き続く断片化、例
えば、制限ヌクレアーゼを使用する断片化により得られ
る、このようなタンパク質の本発明のcDNAインサートお
よび断片からなる組み換えクローニングベヒクル（vehi
cle）により発現されたタンパク質が包含される。本発
明のICAタンパク質およびペプチドは、また、タンパク
質合成により得られたペプチド、例えば、長さが３アミ
ノ酸以上であり、ICAエピトープまたはその類似体また
は誘導体を表すものを包含する。
クローニングした核酸の完全なまたは部分的発現のよう
な方法により、必要に応じて引き続く断片化により得ら
れる；そして本発明のクローニングしたcDNAからか、あ
るいは決定することができるかまたは小島細胞の核酸か
ら分離できる全長のICA抗原遺伝子から、決定されたア
ミノ酸配列に基づくペプチドまたはポリペプチドの合成
は、本発明の相補的クローニングしたcDNA配列の助けに
より遊離する。したがって、このようなICAタンパク質
は、小島細胞の中にまたは上に存在する全長のICAタン
パク質を包含し、そして前記ICAタンパク質は本発明の
クローニングしたcDNAの完全な配列と少なくとも部分的
に相補的であるmRNAをもつヒト遺伝子により発現され
る。また、本発明のICAタンパク質およびペプチドに
は、部分的発現によるか、あるいは引き続く断片化、例
えば、制限ヌクレアーゼを使用する断片化により得られ
る、このようなタンパク質の本発明のcDNAインサートお
よび断片からなる組み換えクローニングベヒクル（vehi
cle）により発現されたタンパク質が包含される。本発
明のICAタンパク質およびペプチドは、また、タンパク
質合成により得られたペプチド、例えば、長さが３アミ
ノ酸以上であり、ICAエピトープまたはその類似体また
は誘導体を表すものを包含する。
本発明はある数の利点を提供する。ICA抗原の分子ク
ローニングは、IDDMの研究、診断、および処置において
使用するために、ならびに小島細胞の破壊およびICAの
出現において含まれる生物学的機構を研究する機械とし
て、大きいおよび再現性可能な量の材料の調製を提供す
る。大量の純粋な抗原の入手可能性は、症候前のIDDMま
たはIDDMを発生させるための素因のための一般的集団の
スクリーニングするために使用できる、高度に感受性の
特異的イムノアッセイの開発を可能とする。
ローニングは、IDDMの研究、診断、および処置において
使用するために、ならびに小島細胞の破壊およびICAの
出現において含まれる生物学的機構を研究する機械とし
て、大きいおよび再現性可能な量の材料の調製を提供す
る。大量の純粋な抗原の入手可能性は、症候前のIDDMま
たはIDDMを発生させるための素因のための一般的集団の
スクリーニングするために使用できる、高度に感受性の
特異的イムノアッセイの開発を可能とする。
ここで使用するとき、用語「ICA抗原」は本発明によ
り提供されるタンパク質およびペプチドを意味すると理
解すべきであるが、ある場合において、ペプチドの形態
は厳格な意味において「抗原」ではない、すなわち、そ
れらはハプテンであろう。なぜなら、それらは宿主動物
における抗体の産生を刺激するために普通の高分子担体
への取り付けを必要とするであろうからである。
り提供されるタンパク質およびペプチドを意味すると理
解すべきであるが、ある場合において、ペプチドの形態
は厳格な意味において「抗原」ではない、すなわち、そ
れらはハプテンであろう。なぜなら、それらは宿主動物
における抗体の産生を刺激するために普通の高分子担体
への取り付けを必要とするであろうからである。
さらに、「クローニングした核酸」、「クローニング
したICA抗原配列」、「cDNAインサート」などは、受託
された組み換えバクテリオファージATCC40550、40551、
40552、40553、40554、40703、40704、40705、または40
706中のインサート、およびまた、このような受託され
た配列からなる、全長の遺伝子の他の核酸配列、または
このような配列の断片を意味する。１または２以上の全
長のICA抗原は、上の受託されたcDNAインサートとの相
同性により特性決定されることが認識されるであろう
が、２またはそれ以上のこのようなcDNAインサートが単
一のICA抗原に相当することが可能である。例えば、ATC
C40703中のインサートはATCC40550およびATCC40554の両
者のためのインサートを包含するように思われ、こうし
てこれらの３つのインサートはすべて単一のICA抗原の
異なるおよび／またはオーバーラップする部分に相当す
ることができる。
したICA抗原配列」、「cDNAインサート」などは、受託
された組み換えバクテリオファージATCC40550、40551、
40552、40553、40554、40703、40704、40705、または40
706中のインサート、およびまた、このような受託され
た配列からなる、全長の遺伝子の他の核酸配列、または
このような配列の断片を意味する。１または２以上の全
長のICA抗原は、上の受託されたcDNAインサートとの相
同性により特性決定されることが認識されるであろう
が、２またはそれ以上のこのようなcDNAインサートが単
一のICA抗原に相当することが可能である。例えば、ATC
C40703中のインサートはATCC40550およびATCC40554の両
者のためのインサートを包含するように思われ、こうし
てこれらの３つのインサートはすべて単一のICA抗原の
異なるおよび／またはオーバーラップする部分に相当す
ることができる。
クローニングしたICA抗原の配列の調製 一般に、本発明のクローニングした抗原の配列は、ヒ
ト遺伝子を適当な組み換えクローニングベヒクル、例え
ば、バクテリオファージ中で発現させ、そして生ずる遺
伝子ライブラリーをIDDM血清でプロービングして、ICA
抗体により認識される抗原を選択する。次いで、組み換
え抗原を糖尿病および正常の血清のパネルでスクリーニ
ングして、同定したクローンの病気の特異性を決定す
る。
ト遺伝子を適当な組み換えクローニングベヒクル、例え
ば、バクテリオファージ中で発現させ、そして生ずる遺
伝子ライブラリーをIDDM血清でプロービングして、ICA
抗体により認識される抗原を選択する。次いで、組み換
え抗原を糖尿病および正常の血清のパネルでスクリーニ
ングして、同定したクローンの病気の特異性を決定す
る。
特定の沈着したクローンは、次の方法でとくに得られ
る（それ以上の詳細は下の実施例中に記載されてい
る）。ヒトcDNAライブラリーは、精製したヒト小島から
RNAを抽出することによって発生させた。このRNAはクロ
マトグラフィーにより分画して、他のRNA、例えば、リ
ボソームのRNAおよび変性したRNAの断片からポリ−Ａ
mRNAを分離した。分離したmRNAを商業的に入手可能なcD
NAキット（Bethesda Research Laboratories）で逆転
写し、EcoR I DNAリンカーに結合し、そして、生体外
パッケージングのためにラムダgt−11アーム中に結合し
た。結合したラムダを商用キット（Stratagene）を使用
してパッケージングし、次いで平板フォーマットでバク
テリア菌叢上で増幅した。
る（それ以上の詳細は下の実施例中に記載されてい
る）。ヒトcDNAライブラリーは、精製したヒト小島から
RNAを抽出することによって発生させた。このRNAはクロ
マトグラフィーにより分画して、他のRNA、例えば、リ
ボソームのRNAおよび変性したRNAの断片からポリ−Ａ
mRNAを分離した。分離したmRNAを商業的に入手可能なcD
NAキット（Bethesda Research Laboratories）で逆転
写し、EcoR I DNAリンカーに結合し、そして、生体外
パッケージングのためにラムダgt−11アーム中に結合し
た。結合したラムダを商用キット（Stratagene）を使用
してパッケージングし、次いで平板フォーマットでバク
テリア菌叢上で増幅した。
ファージライブラリーを、Ｉ型糖尿病の自己免疫患者
からの抗体でスクリーニングした。アガロースの平板を
ファージで感染バクテリアで広げ、そして組み換えタン
パク質の発現を化学的に誘発した。このタンパク質はフ
ィルター上へ沈積させ、次いで血清でプロービングし
た。陽性であると思われるプラークをアガロース平板か
ら分離し、そして２ラウンドの分離により精製した。ク
ローニングニ引き続いて、gt−11ファージを大規模の発
現のために、バクテリア宿主中に感染させた。クローニ
ングしたcDNAにより発現されるタンパク質の特異性は、
クローニングしたヒトタンパク質を含有するバクテリア
抽出物のウェスタン・ブロッティングにより評価した。
調製用ポリアクリルアミドゲルを展開し、そして膜上に
電気ブロッティングし、膜をストリップに切断し、次い
で１系列の正常思われる糖尿病の血清と反応させた。糖
尿病の血清ともっぱらまたは主として反応するタンパク
質を発生したクローンを選択した。
からの抗体でスクリーニングした。アガロースの平板を
ファージで感染バクテリアで広げ、そして組み換えタン
パク質の発現を化学的に誘発した。このタンパク質はフ
ィルター上へ沈積させ、次いで血清でプロービングし
た。陽性であると思われるプラークをアガロース平板か
ら分離し、そして２ラウンドの分離により精製した。ク
ローニングニ引き続いて、gt−11ファージを大規模の発
現のために、バクテリア宿主中に感染させた。クローニ
ングしたcDNAにより発現されるタンパク質の特異性は、
クローニングしたヒトタンパク質を含有するバクテリア
抽出物のウェスタン・ブロッティングにより評価した。
調製用ポリアクリルアミドゲルを展開し、そして膜上に
電気ブロッティングし、膜をストリップに切断し、次い
で１系列の正常思われる糖尿病の血清と反応させた。糖
尿病の血清ともっぱらまたは主として反応するタンパク
質を発生したクローンを選択した。
組み換えクローニングベヒクルおよびサブクローニング 従来この分野において知られているように、本発明の
cDNA転写体、例えば、クローニングベヒクルから切除し
たライブラリーcDNAまたはcDNAインサートは、問題の配
列の増幅および問題のICA抗原の発現のために、種々の
組み換えクローニングベヒクル中に組み込むことができ
る。組み換てクローニングベヒクルは、生化学的分子ま
たは構造体、例えば、DNAであり、これはポリヌクレオ
チドの配列の挿入およびベヒクルが宿主細胞中に適当に
組み込まれたとき、挿入されたポリヌクレオチド配列の
複製を可能とする。発現ベヒクルは、さらに、挿入され
たポリヌクレオチドによりエンコードされるタンパク質
を発現する性質を包含する。発現ベクターにおいて、挿
入されたICA抗原は、適当な宿主中でICA抗原を発現する
ことができる適当な対照配列に操作的に結合する。含ま
れる対照配列は、選択した宿主および形質転換方法に従
い変化するであろう。これらの物質は当業者の範囲内で
ある。
cDNA転写体、例えば、クローニングベヒクルから切除し
たライブラリーcDNAまたはcDNAインサートは、問題の配
列の増幅および問題のICA抗原の発現のために、種々の
組み換えクローニングベヒクル中に組み込むことができ
る。組み換てクローニングベヒクルは、生化学的分子ま
たは構造体、例えば、DNAであり、これはポリヌクレオ
チドの配列の挿入およびベヒクルが宿主細胞中に適当に
組み込まれたとき、挿入されたポリヌクレオチド配列の
複製を可能とする。発現ベヒクルは、さらに、挿入され
たポリヌクレオチドによりエンコードされるタンパク質
を発現する性質を包含する。発現ベクターにおいて、挿
入されたICA抗原は、適当な宿主中でICA抗原を発現する
ことができる適当な対照配列に操作的に結合する。含ま
れる対照配列は、選択した宿主および形質転換方法に従
い変化するであろう。これらの物質は当業者の範囲内で
ある。
適当な組み換えクローニングベヒクルは、プラスミ
ド、ウイルスおよびバクテリオファージ、およびDNAの
組み込み可能な断片（すなわち、組み換えにより宿主ゲ
ノム中に組み込み可能な断片）を包含する。発現ベヒク
ルは、とくに好ましく、そして限定なしに、バクテリア
のpEMBL、pMMB、およびpUK、酵母pAAH％、pYE4、および
pAB112、哺乳動物のpRSV、ワクシニア誘導ベクター、乳
頭腫誘導ベクター、レトロウイルスのベクター、および
シャトルベクター、例えば、pCDM8により例示される。
外観については、参照D.M.Glover、DNAのクローニン
グ：実際のアプローチ（DNA Cloning:A Practical A
pproach）（1985）IRL Press Ltd.。適当な宿主細胞
は、原核細胞、酵母、および哺乳動物を包含する、より
高等の真核細胞を包含する。
ド、ウイルスおよびバクテリオファージ、およびDNAの
組み込み可能な断片（すなわち、組み換えにより宿主ゲ
ノム中に組み込み可能な断片）を包含する。発現ベヒク
ルは、とくに好ましく、そして限定なしに、バクテリア
のpEMBL、pMMB、およびpUK、酵母pAAH％、pYE4、および
pAB112、哺乳動物のpRSV、ワクシニア誘導ベクター、乳
頭腫誘導ベクター、レトロウイルスのベクター、および
シャトルベクター、例えば、pCDM8により例示される。
外観については、参照D.M.Glover、DNAのクローニン
グ：実際のアプローチ（DNA Cloning:A Practical A
pproach）（1985）IRL Press Ltd.。適当な宿主細胞
は、原核細胞、酵母、および哺乳動物を包含する、より
高等の真核細胞を包含する。
cDNAインサートのサブクローニングは、結合のために
インサートを異なるクローニングベヒクルに切除するこ
とを包含とすることができる。インサートは、ものと挿
入において使用するリンカーに相当する制限酵素を使用
するか、あるいはインサートの制限地図から選択される
制限酵素を使用して切除することができる。切除したcD
NAは、必要に応じて配列決定、増幅、または発現のため
に他の適当なベクター中に挿入することができる。もと
のクローニングベヒクル中の末端制限部位が破壊された
とき、他の酵素を使用して、インサートおよび生ずるフ
ランキング領域を、普通の手段により欠失したクローニ
ングベヒクルから回収することができる。
インサートを異なるクローニングベヒクルに切除するこ
とを包含とすることができる。インサートは、ものと挿
入において使用するリンカーに相当する制限酵素を使用
するか、あるいはインサートの制限地図から選択される
制限酵素を使用して切除することができる。切除したcD
NAは、必要に応じて配列決定、増幅、または発現のため
に他の適当なベクター中に挿入することができる。もと
のクローニングベヒクル中の末端制限部位が破壊された
とき、他の酵素を使用して、インサートおよび生ずるフ
ランキング領域を、普通の手段により欠失したクローニ
ングベヒクルから回収することができる。
全長の遺伝子のクローニング 本発明のcDNAインサートの断片は、標準の方法により
適当なライブラリーから、全長のcDNAまたはゲノムのDN
Aのクローンを分離するために使用することができる。
標的ライブラリーを平板上に広げ、増殖させ、フィルタ
ーに移し、そしてDNAプローブと反応させる。このよう
なDNAプローブを、末端標識つけ、ニック翻訳、ランダ
ムプライムド転写、または光化学的手段のような方法に
より、cDNAインサートの制限断片から発生させる。オリ
ゴヌクレオチドを合成し、標識し、そしてハイブリダイ
ゼーションプローブとして使用することができる。RNA
プローブは、また、適当な鋳型からの転写によりサブク
ローニングしたcDNAから発生させることができる、 部分的cDNAクローンと反応すると思われる、組み換え
クローニングベヒクル、例えば、ファージまたはプラス
ミドを再クローニングし、次いで制限マッピングする。
次いで、有望なクローンを配列決定して、もとのブロー
ブのハイブリダイゼーションを確証しかつより大きい断
片上の伸長した配列の情報を得る。全長のクローンがこ
の方法において得られない場合、ヒト遺伝子の遺伝情報
を指定する核酸の完全な配列をクローニングした断片の
オーバーラッピングする配列から一緒に断片化すること
ができる。
適当なライブラリーから、全長のcDNAまたはゲノムのDN
Aのクローンを分離するために使用することができる。
標的ライブラリーを平板上に広げ、増殖させ、フィルタ
ーに移し、そしてDNAプローブと反応させる。このよう
なDNAプローブを、末端標識つけ、ニック翻訳、ランダ
ムプライムド転写、または光化学的手段のような方法に
より、cDNAインサートの制限断片から発生させる。オリ
ゴヌクレオチドを合成し、標識し、そしてハイブリダイ
ゼーションプローブとして使用することができる。RNA
プローブは、また、適当な鋳型からの転写によりサブク
ローニングしたcDNAから発生させることができる、 部分的cDNAクローンと反応すると思われる、組み換え
クローニングベヒクル、例えば、ファージまたはプラス
ミドを再クローニングし、次いで制限マッピングする。
次いで、有望なクローンを配列決定して、もとのブロー
ブのハイブリダイゼーションを確証しかつより大きい断
片上の伸長した配列の情報を得る。全長のクローンがこ
の方法において得られない場合、ヒト遺伝子の遺伝情報
を指定する核酸の完全な配列をクローニングした断片の
オーバーラッピングする配列から一緒に断片化すること
ができる。
より長い断片、および可能ならば全長のクローンを得
る別の方法は、部分的クローンにより発現されたICA抗
原に対してレイズ（raise）された抗体を使用する。問
題の抗原を同定した後、それは免疫原として使用して、
高い力価および親和性のモノクローナル抗体またはポリ
クローナル抗体をレイズすることができる。このような
抗体は、より長いcDNAクローン、およびライブラリー中
により少ない量で存在するcDNAクローンの検出を可能と
する。
る別の方法は、部分的クローンにより発現されたICA抗
原に対してレイズ（raise）された抗体を使用する。問
題の抗原を同定した後、それは免疫原として使用して、
高い力価および親和性のモノクローナル抗体またはポリ
クローナル抗体をレイズすることができる。このような
抗体は、より長いcDNAクローン、およびライブラリー中
により少ない量で存在するcDNAクローンの検出を可能と
する。
抗原およびペプチドの試料 ここで定義するICA抗原は、ある数の異なる方法で、
本発明により提供されるクローンおよび配列の情報から
調製することができる。１つの方法は本発明に従い得ら
れたICA抗原のクローンから、とくに沈積したクローン
からタンパク質を単に発現することができる。このよう
な発現されたタンパク質、またはそれらの断片または消
化産生物は、小島細胞の抗体へ結合するために抗原とし
て使用することができる。しかしながら、バクテリアの
発現の抽出物の直接使用はある場合において可能でない
ことがある。なぜなら、ヒト血清は通常E.coliタンパク
質と非特異的に反応するからである。このような場合に
おいて、発現されたICA抗原は、普通の方法，例えば、
電気泳動の分離および引き続く膜上の固定化（ウェスタ
ン・ブロッティング）によるか、あるいはカラムクロマ
トグラフィーまたは親和精製（例えば、抗ベータガラク
トシダーゼ親和制限クロマトグラフィーまたは他の普通
の生化学的手段、例えば、塩または温度の沈澱）により
分離することができる。
本発明により提供されるクローンおよび配列の情報から
調製することができる。１つの方法は本発明に従い得ら
れたICA抗原のクローンから、とくに沈積したクローン
からタンパク質を単に発現することができる。このよう
な発現されたタンパク質、またはそれらの断片または消
化産生物は、小島細胞の抗体へ結合するために抗原とし
て使用することができる。しかしながら、バクテリアの
発現の抽出物の直接使用はある場合において可能でない
ことがある。なぜなら、ヒト血清は通常E.coliタンパク
質と非特異的に反応するからである。このような場合に
おいて、発現されたICA抗原は、普通の方法，例えば、
電気泳動の分離および引き続く膜上の固定化（ウェスタ
ン・ブロッティング）によるか、あるいはカラムクロマ
トグラフィーまたは親和精製（例えば、抗ベータガラク
トシダーゼ親和制限クロマトグラフィーまたは他の普通
の生化学的手段、例えば、塩または温度の沈澱）により
分離することができる。
あるいは、ペプチド断片は、よく知られた方法によ
り、ICA抗原のクローンの実験的に決定されたDNA配列か
ら推定されたアミノ酸配列から合成することができる。
オーバーラッピングするペプチドを合成し、そしてICA
血清との反応性について試験することができる。反応性
ペプチドが発見されたとき、より小さいペプチドを調製
しつ最小の反応性単位、すなわち、エピトープをマッピ
ングすることができる。
り、ICA抗原のクローンの実験的に決定されたDNA配列か
ら推定されたアミノ酸配列から合成することができる。
オーバーラッピングするペプチドを合成し、そしてICA
血清との反応性について試験することができる。反応性
ペプチドが発見されたとき、より小さいペプチドを調製
しつ最小の反応性単位、すなわち、エピトープをマッピ
ングすることができる。
方法 本発明により提供されるICA抗原の主な使用は、IDDM
の診断および予測である。このような方法において、血
液試料、通常血清試料を選択した１つまたは１系列のIC
A抗原と反応させ、そして普通の技術により免疫反応性
を決定する。さらに、異なるICA抗原との免疫反応性の
プロフィルは病気の性質、例えば、サブタイプ、病気の
状態、病気の開始の接近性、治療の効能、例えば、免疫
治療などに関する診断的に有意の情報を提供することが
できる。
の診断および予測である。このような方法において、血
液試料、通常血清試料を選択した１つまたは１系列のIC
A抗原と反応させ、そして普通の技術により免疫反応性
を決定する。さらに、異なるICA抗原との免疫反応性の
プロフィルは病気の性質、例えば、サブタイプ、病気の
状態、病気の開始の接近性、治療の効能、例えば、免疫
治療などに関する診断的に有意の情報を提供することが
できる。
本発明のICA抗原のそれ以上の使用は、自己反応性Ｂ
細胞の同定、マーキング、または特異的破壊においてで
ある。自己抗体がIDDMにおいて悪い作用を有する場合、
抗Ｂ細胞治療は前糖尿病から臨床的IDDMへの病気の進行
を遅くするか、あるいは止めることができることが考え
られる。
細胞の同定、マーキング、または特異的破壊においてで
ある。自己抗体がIDDMにおいて悪い作用を有する場合、
抗Ｂ細胞治療は前糖尿病から臨床的IDDMへの病気の進行
を遅くするか、あるいは止めることができることが考え
られる。
本発明のICA抗原の使用は、小島反応性Ｔ細胞の集団
の同定においてである。ICA抗原はＴ細胞の培養のため
の抗原を刺激し、有意に改良されたＴ細胞のクローニン
グ、同定、および増殖を可能とする。ICAのＴ細胞の検
出は前糖尿病の状態の診断において意味があること、お
よび自己反応性Ｔ細胞のレベルの監視は病気の進行の指
示および免疫変調治療の利用を与えることが考えられ
る。さらに、ICA Ｔ細胞の培養物の世代は糖尿病の治
療の設計のための生体外モデルを提供する。最後に、Ｔ
細胞の免疫化は自己破壊要素に対する体液の応答を発生
させることによって、自己免疫性を停止または遅延する
ことができる。
の同定においてである。ICA抗原はＴ細胞の培養のため
の抗原を刺激し、有意に改良されたＴ細胞のクローニン
グ、同定、および増殖を可能とする。ICAのＴ細胞の検
出は前糖尿病の状態の診断において意味があること、お
よび自己反応性Ｔ細胞のレベルの監視は病気の進行の指
示および免疫変調治療の利用を与えることが考えられ
る。さらに、ICA Ｔ細胞の培養物の世代は糖尿病の治
療の設計のための生体外モデルを提供する。最後に、Ｔ
細胞の免疫化は自己破壊要素に対する体液の応答を発生
させることによって、自己免疫性を停止または遅延する
ことができる。
ヒトICA免疫グロブリンおよびＴ細胞に結合するICA抗
原の能力を使用して、生体内の小島細胞および小島細胞
成分へのICAの結合をブロッキングすることができ、し
たがって直接の治療効果を提供することが考えられる。
原の能力を使用して、生体内の小島細胞および小島細胞
成分へのICAの結合をブロッキングすることができ、し
たがって直接の治療効果を提供することが考えられる。
次の実施例によって、本発明をさらに説明する。本発
明は、次の実施例により限定されることを意図しない。
明は、次の実施例により限定されることを意図しない。
実施例 １、cDNAライブラリー ランゲルハンス島は、ワシントン大学においてポール
・レイシー（Paul Lacy）およびデイビッド・シャープ
（David Scharrp）博士により、発表された手順従い精
製された［C.Ricordi、P.E.Lacy、E.H.Finke、B.J.Olac
k、およびD.W.Scharp:ヒトランゲルハンス島の分離の自
動化された方法（An Automated Method for Isolat
iion of Human pancreatic Islets）、Diabetes 3
7:413−420（1988）］。簡潔的には、ヒト膵臓をコラゲ
ナーゼで潅流し、次いで粉砕した。フィコール勾配遠心
を使用して、小島を分離し、次いでこれを室温において
１週間培養した。小島を凍結し、そして輸送した。
・レイシー（Paul Lacy）およびデイビッド・シャープ
（David Scharrp）博士により、発表された手順従い精
製された［C.Ricordi、P.E.Lacy、E.H.Finke、B.J.Olac
k、およびD.W.Scharp:ヒトランゲルハンス島の分離の自
動化された方法（An Automated Method for Isolat
iion of Human pancreatic Islets）、Diabetes 3
7:413−420（1988）］。簡潔的には、ヒト膵臓をコラゲ
ナーゼで潅流し、次いで粉砕した。フィコール勾配遠心
を使用して、小島を分離し、次いでこれを室温において
１週間培養した。小島を凍結し、そして輸送した。
受け取ったとき、小島を融解し、プールし、そして洗
浄した。RNAをグアニジニウムチオシアネートで抽出
し、そして塩化リチウムで沈澱させた［G.Cathala、J.
F.Savouret、B.Mendez、B.L.West、M.Karin、J.A.Marti
al、およびJ.D.Baxter:完全な、ツランステイショナリ
ーに活性なリボ核酸の分離の方法（Ａ Method for I
solation of Intact,Transtationally Active Ribo
nucleic Acid）、DNA ２:329−335（1983）］。約770
μｇの全体のRNAを各1mlの遠心した小島から得た。メッ
センジャーRNAをファーマシア・オリゴ（dt）−セルロ
ース７型（Pharmacia Fine Chemicals、米国ニュージ
ャージイ州ピッツバーグ）を使用して、マニアチス（Ma
niatis）ら、の手順［T.Maniatis、E.F.Fritsel、およ
びJ.Sambrool:モレキュラー・クローニング（Molecular
Cloning）、：実験室のマニュアル（Ａ Laboratory
Manual）、（1982）、コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー、コールド・ハーバー（Cold Spring
Harbor Laboratory）、p.197−198］に従いで精製し
た。約30μｇのRNAをクロマトグラフィーにより得た。B
RLキット＃8110（Bethesda Reseach Laboratory、米
国マリイランド州ガイサースバーグ）および35S−メチ
オニンを使用する生体外翻訳は、産生される分子量の広
い範囲を示した。
浄した。RNAをグアニジニウムチオシアネートで抽出
し、そして塩化リチウムで沈澱させた［G.Cathala、J.
F.Savouret、B.Mendez、B.L.West、M.Karin、J.A.Marti
al、およびJ.D.Baxter:完全な、ツランステイショナリ
ーに活性なリボ核酸の分離の方法（Ａ Method for I
solation of Intact,Transtationally Active Ribo
nucleic Acid）、DNA ２:329−335（1983）］。約770
μｇの全体のRNAを各1mlの遠心した小島から得た。メッ
センジャーRNAをファーマシア・オリゴ（dt）−セルロ
ース７型（Pharmacia Fine Chemicals、米国ニュージ
ャージイ州ピッツバーグ）を使用して、マニアチス（Ma
niatis）ら、の手順［T.Maniatis、E.F.Fritsel、およ
びJ.Sambrool:モレキュラー・クローニング（Molecular
Cloning）、：実験室のマニュアル（Ａ Laboratory
Manual）、（1982）、コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー、コールド・ハーバー（Cold Spring
Harbor Laboratory）、p.197−198］に従いで精製し
た。約30μｇのRNAをクロマトグラフィーにより得た。B
RLキット＃8110（Bethesda Reseach Laboratory、米
国マリイランド州ガイサースバーグ）および35S−メチ
オニンを使用する生体外翻訳は、産生される分子量の広
い範囲を示した。
BRL＃8267SAキットをcDNAの合成のために使用した。1
0μｇのポリ−A+RNAを反応において使用した。末端をT4
−DNAポリメラーゼ（Pharmacia）で平滑にし、そしてcD
NAをEcoR Iメチラーゼ（New England Biolabs、米国
マサチュセッツ州）およびＳ−アデノシルメチオニンで
メチル化し、そしてEcoR Iリンカーに結合した。cDNAを
EcoR Iで消化し、バイオゲル（Biogel）A15Mカラム（Bi
oRad Labolatories、米国ニューヨーク州ロックビレ・
センター）で展開してリンカーおよび断片を分離した。
0μｇのポリ−A+RNAを反応において使用した。末端をT4
−DNAポリメラーゼ（Pharmacia）で平滑にし、そしてcD
NAをEcoR Iメチラーゼ（New England Biolabs、米国
マサチュセッツ州）およびＳ−アデノシルメチオニンで
メチル化し、そしてEcoR Iリンカーに結合した。cDNAを
EcoR Iで消化し、バイオゲル（Biogel）A15Mカラム（Bi
oRad Labolatories、米国ニューヨーク州ロックビレ・
センター）で展開してリンカーおよび断片を分離した。
cDNAをラムダgt−11アームに結合し、そしてストラタ
ジーン・ジガパック・プラス（Stratagene Gigapack
Plus）キット（Stratagene Cloning System、米国カ
リフォルニア州ラジョリア）でパッケージングした。ほ
ぼ8.5×105のインサート含有クローンのライブラリー
（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシドで測定した）が得られ、そしてE.co
li Y1090（Stratagene）で増幅した。
ジーン・ジガパック・プラス（Stratagene Gigapack
Plus）キット（Stratagene Cloning System、米国カ
リフォルニア州ラジョリア）でパッケージングした。ほ
ぼ8.5×105のインサート含有クローンのライブラリー
（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシドで測定した）が得られ、そしてE.co
li Y1090（Stratagene）で増幅した。
２、血清 新しく診断した糖尿病の個体からの血清を、フロリダ
大学（米国フロリダ州ガインスビレ）のウィリアム・リ
レー（William Riley）博士およびピッツバーグ子供病
院（米国ペンシルバニア州ピッツバーグ）のアラン・ド
ラッシュ（Alan Drash）から得た。正常血清は実験室
の個体から集めた。血清はフィルターで多数回吸収し
た。フィルターは、（ａ）ラムダ感染E.coliをクロロホ
ルムで溶菌し、そしてこのリゼイト中でニトロセルロー
スのフィルターをソーキングするか、あるいは（ｂ）本
質的にライブラリーのスクリーニングと同一の方法で、
平板のフォーマット中でラムダ感染E.coli上でイソプロ
ピル−β−チオガラクトピラノシド（IPTG）でソーキン
グしたフィルターをオーバーレイしてフィルターを調製
することによって調製した。下に記載するように大まか
な分画後、血清をブロット（blotto）溶液［５％のカー
ネイション（Carnation）−脱脂牛乳、10ミリモルのト
リスpH8.0、150ミリモルのNaCl、0.05％ツイーン−20、
および0.05％のアジ化ナトリウム）中に1/20〜1/200に
希釈した。
大学（米国フロリダ州ガインスビレ）のウィリアム・リ
レー（William Riley）博士およびピッツバーグ子供病
院（米国ペンシルバニア州ピッツバーグ）のアラン・ド
ラッシュ（Alan Drash）から得た。正常血清は実験室
の個体から集めた。血清はフィルターで多数回吸収し
た。フィルターは、（ａ）ラムダ感染E.coliをクロロホ
ルムで溶菌し、そしてこのリゼイト中でニトロセルロー
スのフィルターをソーキングするか、あるいは（ｂ）本
質的にライブラリーのスクリーニングと同一の方法で、
平板のフォーマット中でラムダ感染E.coli上でイソプロ
ピル−β−チオガラクトピラノシド（IPTG）でソーキン
グしたフィルターをオーバーレイしてフィルターを調製
することによって調製した。下に記載するように大まか
な分画後、血清をブロット（blotto）溶液［５％のカー
ネイション（Carnation）−脱脂牛乳、10ミリモルのト
リスpH8.0、150ミリモルのNaCl、0.05％ツイーン−20、
および0.05％のアジ化ナトリウム）中に1/20〜1/200に
希釈した。
３、スクリーニング スクリーニング手順は、標準のプロトコル［T.V.Huyn
h、R.A.YoungおよびR.W.Davus:DNAクローニングにおい
てFgt10およびGft11におけるcDNA1btの構成およびスク
リーニング（Constructing and Screening cDNA Li
braries in Fgt10およびGft11）、D.M.Glover編（198
5）IRL Press P.490−78］。フィルターは、10の150m
mのアガロース平板の各々上に約50,000プラーク形成単
位（pfu）のライブラリーを平板培養することによって
調製した。42℃において約３時間増殖させた後、IPTGを
含有するフィルター（ニトロセルロース、Schleicher
and Schuell、米国ニューハンプシャイヤー州）を平板
上に横たえ、そして増殖を37℃において３〜４時間また
は一夜続けた。フィルターをブロット溶液でブロッキン
グし、そして４℃において貯蔵した。
h、R.A.YoungおよびR.W.Davus:DNAクローニングにおい
てFgt10およびGft11におけるcDNA1btの構成およびスク
リーニング（Constructing and Screening cDNA Li
braries in Fgt10およびGft11）、D.M.Glover編（198
5）IRL Press P.490−78］。フィルターは、10の150m
mのアガロース平板の各々上に約50,000プラーク形成単
位（pfu）のライブラリーを平板培養することによって
調製した。42℃において約３時間増殖させた後、IPTGを
含有するフィルター（ニトロセルロース、Schleicher
and Schuell、米国ニューハンプシャイヤー州）を平板
上に横たえ、そして増殖を37℃において３〜４時間また
は一夜続けた。フィルターをブロット溶液でブロッキン
グし、そして４℃において貯蔵した。
最初に、フィルターとのすべての抗体の反応は室温に
おいて３時間実施した。後の実験において、血清のイン
キュベーションはツイーン−20を含まないブロット溶液
中で４℃において一夜実施し、その間第２抗体反応を室
温において1.5時間実施した。すべてのインキュベーシ
ョンおよび洗浄はプラットホームの震盪装置でおだやか
に回転しながら実施した。
おいて３時間実施した。後の実験において、血清のイン
キュベーションはツイーン−20を含まないブロット溶液
中で４℃において一夜実施し、その間第２抗体反応を室
温において1.5時間実施した。すべてのインキュベーシ
ョンおよび洗浄はプラットホームの震盪装置でおだやか
に回転しながら実施した。
ライブラリーはヒト抗体のプローブで数回スクリーニ
ングした。第１の場合において、抗体を糖尿病の血清か
らHPLCにより精製した。第２および第３の場合におい
て、血清を50％の硫酸アンモニウムで沈澱させ、そして
透析した。第１および第３のスクリーニングについて、
２つの血清の混合物を精製のすべてのラウンドのために
使用した。第２のスクリーニングについて、20の糖尿病
の混合物を予備的精製のために使用した。それ以上のス
クリーニングにおいて、22の血清をプールし、硫酸アン
モニウムで沈澱させ、そして透析し、各血清の最終使用
希釈はツイーン20を含まないブロット溶液中で1/500で
あった。
ングした。第１の場合において、抗体を糖尿病の血清か
らHPLCにより精製した。第２および第３の場合におい
て、血清を50％の硫酸アンモニウムで沈澱させ、そして
透析した。第１および第３のスクリーニングについて、
２つの血清の混合物を精製のすべてのラウンドのために
使用した。第２のスクリーニングについて、20の糖尿病
の混合物を予備的精製のために使用した。それ以上のス
クリーニングにおいて、22の血清をプールし、硫酸アン
モニウムで沈澱させ、そして透析し、各血清の最終使用
希釈はツイーン20を含まないブロット溶液中で1/500で
あった。
糖尿病の血清中のインキュベーション後、フィルター
を各々トリス緩衝化塩類溶液（TBS）、0.05％のツイー
ン20を含むTBS、次いでTBS中で５〜10分間洗浄した。フ
ィルターに結合したヒト抗体を、アルカリ性ホスファタ
ーゼに接合したウサギ抗ヒトIgGとの反応により検出し
た（ブロット中の1/500、Dakopatts抗体Ｄ−336、DAKO
Corp.、米国カリフォルニア州サンタバーバラ）。フ
ィルターをTBS/ツイーン20、TBS、次いで検出緩衝液
（0.1モルのトリス−HC1、pH9.5、0.01モルのNaCl、0.0
5モルMgC12、それらのDNA検出キットNo.8239SAにおける
使用についてBRLにより推奨されている）中で洗浄し
た。発色性基質（ニトロ−ブルーテトラゾリウムおよび
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェー
ト）を添加し、そして反応を光から保護した。色の発現
後、フィルターを水、次いで10ミリモルのトリス（pH8.
0）、１ミリモルのEDTA（TE）で洗浄し、そして乾燥し
た。プラークの最良の観察は、フィルターがなおまだ濡
れているとき、行うことができた。
を各々トリス緩衝化塩類溶液（TBS）、0.05％のツイー
ン20を含むTBS、次いでTBS中で５〜10分間洗浄した。フ
ィルターに結合したヒト抗体を、アルカリ性ホスファタ
ーゼに接合したウサギ抗ヒトIgGとの反応により検出し
た（ブロット中の1/500、Dakopatts抗体Ｄ−336、DAKO
Corp.、米国カリフォルニア州サンタバーバラ）。フ
ィルターをTBS/ツイーン20、TBS、次いで検出緩衝液
（0.1モルのトリス−HC1、pH9.5、0.01モルのNaCl、0.0
5モルMgC12、それらのDNA検出キットNo.8239SAにおける
使用についてBRLにより推奨されている）中で洗浄し
た。発色性基質（ニトロ−ブルーテトラゾリウムおよび
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェー
ト）を添加し、そして反応を光から保護した。色の発現
後、フィルターを水、次いで10ミリモルのトリス（pH8.
0）、１ミリモルのEDTA（TE）で洗浄し、そして乾燥し
た。プラークの最良の観察は、フィルターがなおまだ濡
れているとき、行うことができた。
陽性のプラグは、フィルターとの整列によりもとの平
板上に配置させた。予備的スクリーニングのため、無菌
のパスツールピペットのバットの末端を使用して取り出
した。個々のプラークを区別することができる引き続く
スクリーニングのため、ピペットの先端を使用した。プ
ラークをプラーク貯蔵緩衝液（Maniatis et al.、sup
ra）中に溶離し、そして少なくとも数時間溶離した。
板上に配置させた。予備的スクリーニングのため、無菌
のパスツールピペットのバットの末端を使用して取り出
した。個々のプラークを区別することができる引き続く
スクリーニングのため、ピペットの先端を使用した。プ
ラークをプラーク貯蔵緩衝液（Maniatis et al.、sup
ra）中に溶離し、そして少なくとも数時間溶離した。
上のスクリーニング法は、次のようにして分離したIC
A−12.3を除外して、ここに記載する特別の受託されたI
CAクローンを産生した。
A−12.3を除外して、ここに記載する特別の受託されたI
CAクローンを産生した。
ほぼ106プラーク形成単位のファージライブラリー
を、ICA−12 cDNAと相同性の配列の存在についてDNAの
ハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。20
の寒天平板上のファージプラークを、普通の手順［Bert
onおよびDavis（1977）Science 196:180］により、ナ
イロンフィルター上に複製し、そしてファージDNAを変
性し、そしてハイブリダイゼーションのために固定し
た。ハイブリダイゼーションプローブは、EcoR I消化に
よりそのプラスミドベクターから分離した、クローニン
グしたICA−12cDNAのアガロースゲル精製した試料であ
った。cDNAセグメントは、ランダムプライマー標識付け
法［FeinbergおよびVogelstein（1984）Anal.Biochem.1
33:266］により、32Pで標識付けした。ナイロンフィル
ターへのプローブのハイブリダイゼーションは、ベレン
ト（Berent）et al.（1985）BioTech.3:208に従い実施
した。ICA−12プローブと相同性のDNAを含有すると同定
されたファージプラークをマスター平板から取り上げ、
そしてファージをハイブリダイゼーションスクリーニン
グの第２ラウンドのために複製した。次いで、ICA−12
について陽性のままである個々のプラーグは、cDNAイン
サートの性質に関して特性決定した。クローンICA−12.
3は、DNA配列の分析によリ、ICA−12中で部分的に表さ
れるmRNAの全体のタンパク質解読配列を含有することが
発見された。
を、ICA−12 cDNAと相同性の配列の存在についてDNAの
ハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。20
の寒天平板上のファージプラークを、普通の手順［Bert
onおよびDavis（1977）Science 196:180］により、ナ
イロンフィルター上に複製し、そしてファージDNAを変
性し、そしてハイブリダイゼーションのために固定し
た。ハイブリダイゼーションプローブは、EcoR I消化に
よりそのプラスミドベクターから分離した、クローニン
グしたICA−12cDNAのアガロースゲル精製した試料であ
った。cDNAセグメントは、ランダムプライマー標識付け
法［FeinbergおよびVogelstein（1984）Anal.Biochem.1
33:266］により、32Pで標識付けした。ナイロンフィル
ターへのプローブのハイブリダイゼーションは、ベレン
ト（Berent）et al.（1985）BioTech.3:208に従い実施
した。ICA−12プローブと相同性のDNAを含有すると同定
されたファージプラークをマスター平板から取り上げ、
そしてファージをハイブリダイゼーションスクリーニン
グの第２ラウンドのために複製した。次いで、ICA−12
について陽性のままである個々のプラーグは、cDNAイン
サートの性質に関して特性決定した。クローンICA−12.
3は、DNA配列の分析によリ、ICA−12中で部分的に表さ
れるmRNAの全体のタンパク質解読配列を含有することが
発見された。
４、発現 個々のクローンにより発現されたタンパク質は、E.co
li宿主中のクローンの発現により分析した。ICA−12お
よびICA−13として同定されたクローンを使用する最初
の発現は、標準の手段（Huynh et al.）によりクロー
ンを使用して発生させたリソゲンを使用して実施した。
引き続く発現は、E.coli CAG−456中の感染の発現によ
り実施した［M.Snyder、S.Elledge、D.Sweetser、R.A.Y
oung、およびR.W.Davis:Fgt−11:抗体プローブを使用す
る遺伝子の分離および他の応用（Gene Isolation wit
h Antibody Probes and Other Applications）、M
eth.Enzymology 154:107−128（1987）］。細胞を収穫
し、そしてラエムリ（Laemmli）の試料の緩衝液中の再
懸濁により溶菌した［U.K.Laemmli、Nature 227:680
（1970）］。試料を超音波処理してDNAの大きさを減少
しよりすぐれた電気泳動の結果が得られた。
li宿主中のクローンの発現により分析した。ICA−12お
よびICA−13として同定されたクローンを使用する最初
の発現は、標準の手段（Huynh et al.）によりクロー
ンを使用して発生させたリソゲンを使用して実施した。
引き続く発現は、E.coli CAG−456中の感染の発現によ
り実施した［M.Snyder、S.Elledge、D.Sweetser、R.A.Y
oung、およびR.W.Davis:Fgt−11:抗体プローブを使用す
る遺伝子の分離および他の応用（Gene Isolation wit
h Antibody Probes and Other Applications）、M
eth.Enzymology 154:107−128（1987）］。細胞を収穫
し、そしてラエムリ（Laemmli）の試料の緩衝液中の再
懸濁により溶菌した［U.K.Laemmli、Nature 227:680
（1970）］。試料を超音波処理してDNAの大きさを減少
しよりすぐれた電気泳動の結果が得られた。
タンパク質のゲル電気泳動およびニトロセルロース
（Schleicher and Shuell）またはインモビロン（Imm
obilon）（Millipore Company、米国マサチュセッツ州
ベドフォード）上への半乾燥の電子伝達を実施した。ゲ
ルをクーマッシー（Coomassie）ブルーで染色し、そし
てフィルターを前述のライブラリーのスクリーニングに
使用したのと同一の血清との免疫反応により検出した。
（Schleicher and Shuell）またはインモビロン（Imm
obilon）（Millipore Company、米国マサチュセッツ州
ベドフォード）上への半乾燥の電子伝達を実施した。ゲ
ルをクーマッシー（Coomassie）ブルーで染色し、そし
てフィルターを前述のライブラリーのスクリーニングに
使用したのと同一の血清との免疫反応により検出した。
５、クローンの分析 IDDMの診断のための個々のクローンの有用性をアッセ
イするために、各クローンを糖尿病および正常の血清の
パネルとの反応性について試験した。これは各血清を各
クローンからのウェスタン・ブロットのストリップと反
応させることによって実施した。調製用ゲル電気泳動お
よび引き続くタンパク質のフィルターへの半乾燥電子伝
達を実施した。同一の3mmのストリップをフィルターか
ら切断し、そして種々の血清に暴露した。抗原のバンド
の局在化を分析用ウェスタン・ブロットを参照して実施
し、そしてストリップを抗−ベータ−ガラクトシアーゼ
抗体（1/2000モノクローナル抗体、Promega、米国ウィ
スコンシン州マジソン）と反応させた。抗体のインキュ
ベーションおよび第２抗体を使用する検出は、前述のよ
うにした実施した。
イするために、各クローンを糖尿病および正常の血清の
パネルとの反応性について試験した。これは各血清を各
クローンからのウェスタン・ブロットのストリップと反
応させることによって実施した。調製用ゲル電気泳動お
よび引き続くタンパク質のフィルターへの半乾燥電子伝
達を実施した。同一の3mmのストリップをフィルターか
ら切断し、そして種々の血清に暴露した。抗原のバンド
の局在化を分析用ウェスタン・ブロットを参照して実施
し、そしてストリップを抗−ベータ−ガラクトシアーゼ
抗体（1/2000モノクローナル抗体、Promega、米国ウィ
スコンシン州マジソン）と反応させた。抗体のインキュ
ベーションおよび第２抗体を使用する検出は、前述のよ
うにした実施した。
ICA−12、ICA−13、ICA−208、ICA−302、ICA−313、
ICA−505、およびICA−525と表示する化学発光体の反応
性のプロフィルは、図面の第１図〜第５図、第14図およ
び第15図に示す。同一のフィルターストリップを調製用
電子伝達から切断し、そして糖尿病および正常の血清と
反応させた（ICA−12、ICA−13、ICA−208、ICA−302、
およびICA−313について、ストリップを20の糖尿病血清
および６の正常血清と反応した；これにに対して14の糖
尿病血清および６の正常の血清をICA−505および525に
ついて使用した）。DNAインサートをもたないベクター
（ラムダgt−11）を使用する対照のプロフィルを第６図
に示す。
ICA−505、およびICA−525と表示する化学発光体の反応
性のプロフィルは、図面の第１図〜第５図、第14図およ
び第15図に示す。同一のフィルターストリップを調製用
電子伝達から切断し、そして糖尿病および正常の血清と
反応させた（ICA−12、ICA−13、ICA−208、ICA−302、
およびICA−313について、ストリップを20の糖尿病血清
および６の正常血清と反応した；これにに対して14の糖
尿病血清および６の正常の血清をICA−505および525に
ついて使用した）。DNAインサートをもたないベクター
（ラムダgt−11）を使用する対照のプロフィルを第６図
に示す。
フィルターのストリップは、まな、強度に従って等級
づけた、１＝弱い反応性、２、３および４＝非常に強い
反応性。反応性の等級の要約は、図面の第７図および第
16図に記載する。第７図において、接頭文字「Ｃ」を有
する血清21〜30は正常の対照の血清であり、これに対し
て糖尿病血清はそれらの源の識別番号で表されている。
第16図において、接頭文字「MRC」を有する血清15〜20
は正常の対照の血清であり、これに対して再び糖尿病血
清はそれらの源の識別番号で表されている。両者図面に
おいて、クローンのヘッディングの下に示す番号は、視
的解釈により割り当てた免疫反応性の強度を表す。
づけた、１＝弱い反応性、２、３および４＝非常に強い
反応性。反応性の等級の要約は、図面の第７図および第
16図に記載する。第７図において、接頭文字「Ｃ」を有
する血清21〜30は正常の対照の血清であり、これに対し
て糖尿病血清はそれらの源の識別番号で表されている。
第16図において、接頭文字「MRC」を有する血清15〜20
は正常の対照の血清であり、これに対して再び糖尿病血
清はそれらの源の識別番号で表されている。両者図面に
おいて、クローンのヘッディングの下に示す番号は、視
的解釈により割り当てた免疫反応性の強度を表す。
最初のスクリーニングにおいて同定されたいくつかの
クローンは、ウェスタン・ブロットのフォーマットにお
いて非反応性であることが発見された。これらのクロー
ンの血清反応性を試験するために、ラムダgt−11ファー
ジをE.coli CAG456中で前述のように発現させ、そして
抗原はバクテリアを4mg/mlのリゾチーム（Sigma、米国
ミゾリー州セントルイス）で25ミリモルのトリス、pH
8、10ミリモルのEDTA、50ミリモルのグリコースおよび
２ミリモルの塩化フェニルメチルスルホニル（PMSF）中
で５分間室温において処理することによって抽出した。
細胞を４℃においてペレット化し、そして氷冷緩衝液
（500ミリモルの塩化ナトリウム、１％のNP−40、50ミ
リモルのPMSF、２μg/mlのキミスタチン（Sigma）、２
μg/mlのアンチペイン（Antipain）（Sigma）および２
μg/mlのペプスタチン中に再懸濁した。抗原の抽出は30
分間氷上で進行させ、その間溶液を超音波処理した。試
料をエッペンドルマイクロフーグ中の５分間４℃におい
て回転させ、そして上澄み液を免疫沈澱のために使用し
た。
クローンは、ウェスタン・ブロットのフォーマットにお
いて非反応性であることが発見された。これらのクロー
ンの血清反応性を試験するために、ラムダgt−11ファー
ジをE.coli CAG456中で前述のように発現させ、そして
抗原はバクテリアを4mg/mlのリゾチーム（Sigma、米国
ミゾリー州セントルイス）で25ミリモルのトリス、pH
8、10ミリモルのEDTA、50ミリモルのグリコースおよび
２ミリモルの塩化フェニルメチルスルホニル（PMSF）中
で５分間室温において処理することによって抽出した。
細胞を４℃においてペレット化し、そして氷冷緩衝液
（500ミリモルの塩化ナトリウム、１％のNP−40、50ミ
リモルのPMSF、２μg/mlのキミスタチン（Sigma）、２
μg/mlのアンチペイン（Antipain）（Sigma）および２
μg/mlのペプスタチン中に再懸濁した。抗原の抽出は30
分間氷上で進行させ、その間溶液を超音波処理した。試
料をエッペンドルマイクロフーグ中の５分間４℃におい
て回転させ、そして上澄み液を免疫沈澱のために使用し
た。
免疫反応は、15μの洗浄緩衝液（50ミリモルのトリ
ス、150ミリモルの塩化ナトリウム、１％のNP−40、５
ミリモルのEDTA、２ミリモルのPMSF、2.5μのヒト血
清、および10μの抽出液）から成っていた。反応を一
夜放置した抗原−抗体の複合体を、20μのプロテイン
Ａセファローズ（Sepharose）CL−4B（Pharmacia）の50
％スラリーで氷上で１時間回収した。樹脂を６回500μ
の洗浄緩衝液で洗浄し、そして１回水で洗浄した。PA
GEのための試料緩衝液を添加し、そして試料を５分間沸
騰させ、５分間遠心し、そして８％のゲル上で展開し
た。エレクトロブロッティングを実施し、そしてブロッ
トを抗−ベータ−ガラクトシダーゼ抗体（ブロット溶液
中のSigma ＃G4644の1/1000希釈）と反応させ、次にで
アルカリ性ホスファターゼにカップリングした抗マウス
Ig（DAKO ＃D314）と反応させ、そして染料中で顕色し
た。結果をICA−512の抽出物について第19図に示す。矢
印は組み換え抗原の位置を示す。
ス、150ミリモルの塩化ナトリウム、１％のNP−40、５
ミリモルのEDTA、２ミリモルのPMSF、2.5μのヒト血
清、および10μの抽出液）から成っていた。反応を一
夜放置した抗原−抗体の複合体を、20μのプロテイン
Ａセファローズ（Sepharose）CL−4B（Pharmacia）の50
％スラリーで氷上で１時間回収した。樹脂を６回500μ
の洗浄緩衝液で洗浄し、そして１回水で洗浄した。PA
GEのための試料緩衝液を添加し、そして試料を５分間沸
騰させ、５分間遠心し、そして８％のゲル上で展開し
た。エレクトロブロッティングを実施し、そしてブロッ
トを抗−ベータ−ガラクトシダーゼ抗体（ブロット溶液
中のSigma ＃G4644の1/1000希釈）と反応させ、次にで
アルカリ性ホスファターゼにカップリングした抗マウス
Ig（DAKO ＃D314）と反応させ、そして染料中で顕色し
た。結果をICA−512の抽出物について第19図に示す。矢
印は組み換え抗原の位置を示す。
種々のクローンについてのDNAインサートの大きさ
は、それらを平板リゼイトまたは液体リゼイトの発酵に
おいて増殖させることによって決定した（Maniatis et
al.、supra）。ラムダDNAを抽出し、そしてEcoR Iで
切断し、そしてアガロースゲルの電気泳動により大きさ
について分析した。
は、それらを平板リゼイトまたは液体リゼイトの発酵に
おいて増殖させることによって決定した（Maniatis et
al.、supra）。ラムダDNAを抽出し、そしてEcoR Iで
切断し、そしてアガロースゲルの電気泳動により大きさ
について分析した。
糖尿病血清と主として反応する上の同定したクローン
は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（the American Type Culture Collection、米国マ
リイランド州ロックビレ）に受託された。受託の番号お
よび決定したインサートの大きさを下表１に示す。 表１ クローン＃ ATCC＃ インサートの大きさ（kb） ICA−12 40550 1.400 ICA−13 40553 5.043 ICA−208 40554 0.575 ICA−302 40551 0.794 ICA−313 40552 2.391 ICA−12.3 40703 3.243 ICA−525 40704 3.4 ICA−505 40705 0.346 ICA−512 40706 1.8 DNAインサートをストラタジーン・ブルースクリプト
（Stratagene Bluescript）ベクターに移した。配列決
定は、T7配列決定キット（Pharmacia）をストラタジー
ンExo III/ヤエナリムクレアーゼキットと組み合わせ
使用する標準技術により実施して、プラスミドのオーバ
ーラッピングするネステッド（nested）欠失系列を発生
させた。
は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（the American Type Culture Collection、米国マ
リイランド州ロックビレ）に受託された。受託の番号お
よび決定したインサートの大きさを下表１に示す。 表１ クローン＃ ATCC＃ インサートの大きさ（kb） ICA−12 40550 1.400 ICA−13 40553 5.043 ICA−208 40554 0.575 ICA−302 40551 0.794 ICA−313 40552 2.391 ICA−12.3 40703 3.243 ICA−525 40704 3.4 ICA−505 40705 0.346 ICA−512 40706 1.8 DNAインサートをストラタジーン・ブルースクリプト
（Stratagene Bluescript）ベクターに移した。配列決
定は、T7配列決定キット（Pharmacia）をストラタジー
ンExo III/ヤエナリムクレアーゼキットと組み合わせ
使用する標準技術により実施して、プラスミドのオーバ
ーラッピングするネステッド（nested）欠失系列を発生
させた。
９つの上に同定したクローンのうち８つについての入
手可能配列決定の情報を、図面の第８図〜第13図、第17
図および第18図に記載する。配列はICA−12、302、31
3、208、505、12.3について完全であると考えられる
が、部分的配列決定のみがICA−13および525について入
手可能である。DNA配列は前述のように実験的に誘導し
たものである。両者の向きにおけるすべての３つの可能
なリーディングフレームを、タンパク質の解読能力、す
なわち、長いオープンリーディングフレームについて検
査した。各クローンについての最も可能性のあるタンパ
ク質配列を、DNA配列より下に大文字で表す（入手可能
な情報がタンパク質抗原をエンコードするリーディング
フレームの割り当てを可能としない、ICA−505を除外す
る）。
手可能配列決定の情報を、図面の第８図〜第13図、第17
図および第18図に記載する。配列はICA−12、302、31
3、208、505、12.3について完全であると考えられる
が、部分的配列決定のみがICA−13および525について入
手可能である。DNA配列は前述のように実験的に誘導し
たものである。両者の向きにおけるすべての３つの可能
なリーディングフレームを、タンパク質の解読能力、す
なわち、長いオープンリーディングフレームについて検
査した。各クローンについての最も可能性のあるタンパ
ク質配列を、DNA配列より下に大文字で表す（入手可能
な情報がタンパク質抗原をエンコードするリーディング
フレームの割り当てを可能としない、ICA−505を除外す
る）。
本発明を上に記載しかつ例示した。多くの他の変化お
よび変更を本発明の精神および範囲から逸脱しないで行
うことができることが考えられる。
よび変更を本発明の精神および範囲から逸脱しないで行
うことができることが考えられる。
本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。
１、組み換えクローニングベヒクルATCC40550、40551、
50442、40553、40554、40703、40704、40705、または40
706のDNAインサートによりエンコードされるアミノ酸配
列からなることを特徴とする、分離されたタンパク質ま
たはペプチド、またはこのようなタンパク質またはペプ
チドの断片。
50442、40553、40554、40703、40704、40705、または40
706のDNAインサートによりエンコードされるアミノ酸配
列からなることを特徴とする、分離されたタンパク質ま
たはペプチド、またはこのようなタンパク質またはペプ
チドの断片。
２、ヒト遺伝子により発現された全長のタンパク質であ
り、そのmRNAが組み換えクローニングベヒクルATCC4055
0、40551、40552、40553、40554、40703、40704、4070
5、または40706のDNAインサート完全な配列と部分的に
相補的である。上記第１項記載の分離されたタンパク
質、またはこのようなタンパク質のタンパク質まはペプ
チド断片。
り、そのmRNAが組み換えクローニングベヒクルATCC4055
0、40551、40552、40553、40554、40703、40704、4070
5、または40706のDNAインサート完全な配列と部分的に
相補的である。上記第１項記載の分離されたタンパク
質、またはこのようなタンパク質のタンパク質まはペプ
チド断片。
３、組み換えクローニングベヒクルATCC40550、40551、
40552、40553、40554、40703、40704、40705、または40
706のDNAインサートによりエンコードされるアミノ酸配
列を有するか、あるいは少なくとも３アミノ酸長さであ
るこのような配列のペプチド部分である、上記第１項記
載の分離されたタンパク質またはペプチド。
40552、40553、40554、40703、40704、40705、または40
706のDNAインサートによりエンコードされるアミノ酸配
列を有するか、あるいは少なくとも３アミノ酸長さであ
るこのような配列のペプチド部分である、上記第１項記
載の分離されたタンパク質またはペプチド。
４、このようなタンパク質またはペプチドの遺伝情報を
指定するインサートからなる組み換えDNAベクター中の
発現によるか、あるいは、ペプチド合成により得られ
た、上記第１〜３項のいずれかに記載の分離されたタン
パク質またはペプチド。
指定するインサートからなる組み換えDNAベクター中の
発現によるか、あるいは、ペプチド合成により得られ
た、上記第１〜３項のいずれかに記載の分離されたタン
パク質またはペプチド。
５、患者からた得られる血液試料を上記第１〜４項のい
ずれかに記載のタンパク質またはペプチドからなる抗原
試薬と接触させ、そして抗原試薬への患者の血液試料か
らの抗体の結合を決定することを特徴とする、患者にお
けるインスリン依存性真性糖尿病を診断する方法。
ずれかに記載のタンパク質またはペプチドからなる抗原
試薬と接触させ、そして抗原試薬への患者の血液試料か
らの抗体の結合を決定することを特徴とする、患者にお
けるインスリン依存性真性糖尿病を診断する方法。
６、上記第１〜３項のいずれかに記載のタンパク質また
はペプチド、またはそれとハイブリダイゼーション可能
な分離された核酸の遺伝情報を指定することを特徴とす
る、分離された核酸。
はペプチド、またはそれとハイブリダイゼーション可能
な分離された核酸の遺伝情報を指定することを特徴とす
る、分離された核酸。
７、上記第１〜３項のいずれか記載のタンパク質または
ペプチドの遺伝情報を指定するインサートからなること
を特徴とする、組み換えクローニングベヒクル。
ペプチドの遺伝情報を指定するインサートからなること
を特徴とする、組み換えクローニングベヒクル。
８、上記第７項記載の組み換えクローニングベヒクルで
形質転換されたことを特徴とする、培養可能な細胞。
形質転換されたことを特徴とする、培養可能な細胞。
９、血液試料を上記第１〜４項のいずれかに記載のタン
パク質またはペプチドと接触させ、そしてこのようなタ
ンパク質またはペプチドと血液試料からのＴ細胞または
Ｂ細胞との間の結合を決定することを特徴とする、ヒト
血液試料中のインスリン依存性真性糖尿病において含ま
れるＴ細胞またはＢ細胞の存在を検出する方法。
パク質またはペプチドと接触させ、そしてこのようなタ
ンパク質またはペプチドと血液試料からのＴ細胞または
Ｂ細胞との間の結合を決定することを特徴とする、ヒト
血液試料中のインスリン依存性真性糖尿病において含ま
れるＴ細胞またはＢ細胞の存在を検出する方法。
10、上記第１〜４項のいずれかに記載のタンパク質また
はペプチドからなることを特徴とする、インスリン依存
性真性糖尿病に含まれるヒト免疫グロブリン、Ｔ細胞ま
たはＢ細胞をブロッキングする製剤。
はペプチドからなることを特徴とする、インスリン依存
性真性糖尿病に含まれるヒト免疫グロブリン、Ｔ細胞ま
たはＢ細胞をブロッキングする製剤。
第１図〜第５図、第14図および第15図は、実施例に記載
されている条件下における、本発明に従い調製されたAT
CC受託されたICAクローンと糖尿病および正常の血清の
反応性のプロフイルにおける電気泳動写真である。 第６図は、組み換えインサートをもたないクローニング
ファージを使用する対照プロフイルにおける電気泳動写
真である。 第７図および第16図は、それぞれ、第１図〜第５図およ
び第14図〜第15図におけるプロフィルの視的解釈により
割り当てられた反応性の値を示す、ICAクローンの血清
プロフィルの要約である。 第８図〜第13図、第17図および第18図は、特定のICAク
ローンのDNAおよび推定したタンパク質配列である。 第19図は、糖尿病および正常の血清を使用するICAクロ
ーンの免疫沈澱の結果を示す電気泳動写真である。
されている条件下における、本発明に従い調製されたAT
CC受託されたICAクローンと糖尿病および正常の血清の
反応性のプロフイルにおける電気泳動写真である。 第６図は、組み換えインサートをもたないクローニング
ファージを使用する対照プロフイルにおける電気泳動写
真である。 第７図および第16図は、それぞれ、第１図〜第５図およ
び第14図〜第15図におけるプロフィルの視的解釈により
割り当てられた反応性の値を示す、ICAクローンの血清
プロフィルの要約である。 第８図〜第13図、第17図および第18図は、特定のICAク
ローンのDNAおよび推定したタンパク質配列である。 第19図は、糖尿病および正常の血清を使用するICAクロ
ーンの免疫沈澱の結果を示す電気泳動写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/00 Ｂ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０５５４ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０７０３ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０７０４ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０７０５ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０７０６ (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 14/47 G01N 33/53 C12N 15/12 - 15/28 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＹＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (6)
- 【請求項１】組み換えクローニングベヒクルATCC4055
0、40551、50442、40553、40554、40703、40704、40705
または40706のDNAインサートによりコードされるアミノ
酸配列を含んでなることを特徴とする単離されたタンパ
ク質またはペプチド、またはこのようなタンパク質また
はペプチドの断片。 - 【請求項２】患者から得られる血液試料を特許請求の範
囲第１項記載のタンパク質またはペプチドからなる抗原
試薬と接触させ、そして抗原試薬への患者の血液試料か
らの抗体の結合を決定することを特徴とする、患者にお
けるインスリン依存性真性糖尿病の診断方法。 - 【請求項３】特許請求の範囲第１記載のタンパク質また
はペプチドをコードすることを特徴とする単離された核
酸。 - 【請求項４】特許請求の範囲第１記載のタンパク質また
はペプチドをコードするインサートを含んでなることを
特徴とする、組み換えクローニングベヒクル。 - 【請求項５】特許請求の範囲第４項記載の組み換えクロ
ーニングベヒクルで形質転換されていることを特徴とす
る培養可能な細胞。 - 【請求項６】血液試料を特許請求の範囲第１記載のタン
パク質またはペプチドと接触させ、そしてこのようなタ
ンパク質またはペプチドと血液試料からのＴ細胞または
Ｂ細胞との間の結合を決定することを特徴とする、ヒト
血液試料中のインスリン依存性真性糖尿病に関与するＴ
細胞またはＢ細胞の依存の検出方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US31254389A | 1989-02-17 | 1989-02-17 | |
| US312543 | 1989-02-17 | ||
| US44170389A | 1989-12-04 | 1989-12-04 | |
| US441703 | 1989-12-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0347133A JPH0347133A (ja) | 1991-02-28 |
| JP2858467B2 true JP2858467B2 (ja) | 1999-02-17 |
Family
ID=26978437
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2034016A Expired - Lifetime JP2858467B2 (ja) | 1989-02-17 | 1990-02-16 | 分子クローニングにより得られたランゲルハンス島細胞の抗原 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0383129B1 (ja) |
| JP (1) | JP2858467B2 (ja) |
| AT (1) | ATE122394T1 (ja) |
| AU (1) | AU626636B2 (ja) |
| CA (1) | CA2010275C (ja) |
| DE (1) | DE69019190T2 (ja) |
| DK (1) | DK0383129T3 (ja) |
| ES (1) | ES2072928T3 (ja) |
| FI (1) | FI103730B1 (ja) |
| GR (1) | GR3017019T3 (ja) |
| IE (1) | IE66997B1 (ja) |
| IL (1) | IL93397A (ja) |
| NO (1) | NO306996B1 (ja) |
| PT (1) | PT93166B (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5645998A (en) | 1988-12-13 | 1997-07-08 | University Of Florida Research Foundation | Methods and compositions for the early detection and treatment of insulin dependent diabetes mellitus |
| US6001360A (en) * | 1988-12-13 | 1999-12-14 | University Of Florida | Method and compositions for early detection and treatment of insulin dependent diabetes mellitus |
| JPH02200700A (ja) * | 1989-01-30 | 1990-08-08 | Shionogi & Co Ltd | 新規ｒｅｇ蛋白質 |
| US5744327A (en) * | 1990-02-20 | 1998-04-28 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for producing insulin in response to non-glucose secretagogues |
| US5427940A (en) * | 1991-06-03 | 1995-06-27 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Engineered cells producing insulin in response to glucose |
| US5175085A (en) * | 1990-02-20 | 1992-12-29 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for diagnosing autoimmune insulin dependent diabetes mellitus |
| ATE268908T1 (de) | 1990-09-07 | 2004-06-15 | Univ California | Verfahren zur diagnose und behandlung von diabetes |
| US5674978A (en) * | 1990-09-21 | 1997-10-07 | The Regents Of The University Of California | Peptides derived from glutamic acid decarboxylase |
| US6682906B1 (en) | 1990-09-21 | 2004-01-27 | The Regents Of The University Of California | Cloned glutamic acid decarboxylase |
| US5998366A (en) * | 1990-09-21 | 1999-12-07 | The Regents Of The University Of California | Method for ameliorating glutamic acid decarboxylase associated autoimmune disorders |
| AU8864791A (en) * | 1990-10-02 | 1992-04-28 | Trigen Incorporated | Antibodies and methods for diagnosis and treatment of diabetes |
| CA2103159A1 (en) * | 1991-05-15 | 1992-11-16 | Ake Lernmark | Cloning and expression of human islet glutamic acid decarboxylase autoantigen |
| US5792656A (en) * | 1991-06-03 | 1998-08-11 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods of preparing genetically engineered cells that produce insulin in response to glucose |
| EP0627934A4 (en) * | 1992-02-27 | 1997-01-08 | Univ Leland Stanford Junior | EARLY ANTIGEN FOR AUTOIMMUNE DIABETE. |
| US5200318A (en) * | 1992-05-13 | 1993-04-06 | Miles Inc. | Diagnosis of IDDM with a panel of immunoreagents |
| WO1996038479A1 (fr) * | 1995-05-30 | 1996-12-05 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Procede de diagnostic du diabete sucre insulino-dependant et kit de diagnostic |
| AU1989097A (en) | 1996-03-06 | 1997-09-22 | University Of Washington | Diabetes mellitus 37 kd autoantigen protein-tyrosine phosphatase |
| JP2001527403A (ja) * | 1997-04-25 | 2001-12-25 | ジェネティックス・インスチチュート・インコーポレーテッド | 分泌蛋白およびそれらをコードするポリヌクレオチド |
| CN110244051A (zh) * | 2019-07-05 | 2019-09-17 | 许昌学院 | 一种用于糖尿病的多组分标记免疫检测系统 |
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|---|---|---|---|---|
| ATE53862T1 (de) * | 1982-01-22 | 1990-06-15 | Cetus Corp | Verfahren zur charakterisierung von hla und die darin benutzten cdns-testmittel. |
| IL69686A (en) * | 1983-09-11 | 1988-03-31 | Yeda Res & Dev | Compositions containing cell membrane proteins and process for their preparation |
| EP0229782B1 (en) * | 1985-06-14 | 1992-11-04 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for identifying alleles associated with increased risk of diabetes |
| CA1327162C (en) * | 1987-04-09 | 1994-02-22 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University (The) | Method for prophylactically treating an individual for an autoimmune disease |
| WO1988010120A1 (en) * | 1987-06-24 | 1988-12-29 | Brigham And Women's Hospital | Treatment of autoimmune diseases by oral administration of autoantigens |
-
1990
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- 1990-02-03 DE DE69019190T patent/DE69019190T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-03 ES ES90102179T patent/ES2072928T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-03 EP EP90102179A patent/EP0383129B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-03 AT AT90102179T patent/ATE122394T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-02-03 DK DK90102179.0T patent/DK0383129T3/da active
- 1990-02-14 IL IL93397A patent/IL93397A/xx not_active IP Right Cessation
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- 1990-02-15 PT PT93166A patent/PT93166B/pt not_active IP Right Cessation
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- 1990-02-16 AU AU49883/90A patent/AU626636B2/en not_active Expired
- 1990-02-16 CA CA002010275A patent/CA2010275C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-16 IE IE58990A patent/IE66997B1/en not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-08-02 GR GR950402141T patent/GR3017019T3/el unknown
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