JPH0694707A - 診断方法 - Google Patents
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- JPH0694707A JPH0694707A JP4161996A JP16199692A JPH0694707A JP H0694707 A JPH0694707 A JP H0694707A JP 4161996 A JP4161996 A JP 4161996A JP 16199692 A JP16199692 A JP 16199692A JP H0694707 A JPH0694707 A JP H0694707A
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
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- G—PHYSICS
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- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/285—Demyelinating diseases; Multipel sclerosis
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】多発性硬化症の特異的診断に有用な方法及びキ
ットを提供する。 【構成】本方法は、１種以上のプロソーム抗原を含む免
疫化学試薬を使用することを含む。この方法は通常、多
発性硬化症に罹患しているものと思われる患者から血清
を得、免疫化学試薬と血清とを接触させ、次いでプロソ
ーム抗原と血清中に存在するこれと反応性の抗体との間
に形成した免疫複合体の存在を検出することを含む。
ットを提供する。 【構成】本方法は、１種以上のプロソーム抗原を含む免
疫化学試薬を使用することを含む。この方法は通常、多
発性硬化症に罹患しているものと思われる患者から血清
を得、免疫化学試薬と血清とを接触させ、次いでプロソ
ーム抗原と血清中に存在するこれと反応性の抗体との間
に形成した免疫複合体の存在を検出することを含む。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、多発性硬化症（multip
le sclerosis）の特異的診断に有用な方法及び装置に関
する。
le sclerosis）の特異的診断に有用な方法及び装置に関
する。
【０００２】
【従来の技術】多発性硬化症（ＭＳ）は、通常、１箇所
または多数箇所の神経巣の機能不全が周期的発作の形で
現れる病気である。その症状は、多様且つ曖昧で、視力
減衰、眼振、言語障害、振動感覚及び位置感覚の減衰、
意図振戦、筋肉協調不能、四肢弱化または麻痺、痙縮並
びに膀胱障害が挙げられる［Harrison's Principles of
Internal Medicine，p.1995-2000（11版，1987）］。あ
いにく、ＭＳの有効な治療法は知られていない。
または多数箇所の神経巣の機能不全が周期的発作の形で
現れる病気である。その症状は、多様且つ曖昧で、視力
減衰、眼振、言語障害、振動感覚及び位置感覚の減衰、
意図振戦、筋肉協調不能、四肢弱化または麻痺、痙縮並
びに膀胱障害が挙げられる［Harrison's Principles of
Internal Medicine，p.1995-2000（11版，1987）］。あ
いにく、ＭＳの有効な治療法は知られていない。
【０００３】ＭＳの明確な診断法を確立するためには、
神経欠損の少なくとも２つの挿間状態（episode）が、
中枢神経系内の１以上の部位に傷害があることを示す他
覚的な臨床兆候と共に発生しなければならない。このよ
うな診断方法に関する１つの問題は、神経欠損の各挿間
状態の間に10年〜20年も経過するということである。 Ｉｄ． もう１つの問題は、ＭＳの症状は非常に曖昧なので他の
幾つかの容態と混同する恐れがあるということである。
従って、患者を特異的に診断するには、効果的に治療す
ることのできる似たような症状を有する容態を除外する
ことが重要である。例えば、患者は、種々の処方薬の副
作用（例えば、フェニトインによって起こる眼振、めま
い及び筋肉弱化など）、悪性貧血または種々の感染症に
罹患しているかもしれない。通常、このような容態は、
効果的に治療され得る。
神経欠損の少なくとも２つの挿間状態（episode）が、
中枢神経系内の１以上の部位に傷害があることを示す他
覚的な臨床兆候と共に発生しなければならない。このよ
うな診断方法に関する１つの問題は、神経欠損の各挿間
状態の間に10年〜20年も経過するということである。 Ｉｄ． もう１つの問題は、ＭＳの症状は非常に曖昧なので他の
幾つかの容態と混同する恐れがあるということである。
従って、患者を特異的に診断するには、効果的に治療す
ることのできる似たような症状を有する容態を除外する
ことが重要である。例えば、患者は、種々の処方薬の副
作用（例えば、フェニトインによって起こる眼振、めま
い及び筋肉弱化など）、悪性貧血または種々の感染症に
罹患しているかもしれない。通常、このような容態は、
効果的に治療され得る。
【０００４】従って、ＭＳに罹患しているかどうかの決
定に有用な比較的単純な手段が必要である。
定に有用な比較的単純な手段が必要である。
【０００５】
【発明の概要】驚くべきことに、非常に多くのＭＳ患者
（一連の試験で試験した内の90%以上）が、プロソーム
に対する抗体を血流中に循環させて保有していること、
一方この病気に罹患していない者は、殆どこのような抗
体を有していないこと（試験した内の＜３%）が知見さ
れた。
（一連の試験で試験した内の90%以上）が、プロソーム
に対する抗体を血流中に循環させて保有していること、
一方この病気に罹患していない者は、殆どこのような抗
体を有していないこと（試験した内の＜３%）が知見さ
れた。
【０００６】本発明は、多発性硬化症の特異的診断に於
いて、源に拘わらない「プロソーム抗原（prosomal ant
igen）」（例えば、プロソーム、プロソーム蛋白質、フ
ラグメントまたはその誘導体など）を使用する方法であ
る。通常、このような方法は、１種以上のプロソーム抗
原を含む免疫化学試薬を使用する。
いて、源に拘わらない「プロソーム抗原（prosomal ant
igen）」（例えば、プロソーム、プロソーム蛋白質、フ
ラグメントまたはその誘導体など）を使用する方法であ
る。通常、このような方法は、１種以上のプロソーム抗
原を含む免疫化学試薬を使用する。
【０００７】このような方法は通常、多発性硬化症に罹
患していると思われる患者から血清を得、所望の免疫化
学試薬を血清と接触させ、次いでプロソーム抗原と、血
清中に存在するこれと反応性の任意の抗体との間に形成
した免疫複合体の存在を検出することを含む。
患していると思われる患者から血清を得、所望の免疫化
学試薬を血清と接触させ、次いでプロソーム抗原と、血
清中に存在するこれと反応性の任意の抗体との間に形成
した免疫複合体の存在を検出することを含む。
【０００８】
Ｉ．プロソーム抗原 本明細書中使用する「プロソーム抗原」という用語は、
源に拘わらない、例えば、細胞または遺伝子工学方法に
より産生された、プロソーム、プロソーム蛋白質、フラ
グメントまたはその誘導体を意味する。
源に拘わらない、例えば、細胞または遺伝子工学方法に
より産生された、プロソーム、プロソーム蛋白質、フラ
グメントまたはその誘導体を意味する。
【０００９】プロソームは、どこにでもある種々の組成
のリボ核蛋白質粒子の一種である。これらは、約95%以
上の蛋白質（プロソーム蛋白質）と約5%以下のＲＮＡ
（ｐＲＮＡ）からなる。プロソームは、蛋白質及びＲＮ
Ａ組成が個々によって種々変わるが、大きさ12-nmのキ
イチゴ状または筒状の粒子であって、形態学的及び生物
物理学的に同一種のものを意味する。少なくとも25種類
の種々のプロソーム蛋白質が発見されている。プロソー
ムは、このように試験した総ての種類の細胞中に検出さ
れた。しかしながら、本発明では、ヒト由来のプロソー
ム（及びプロソーム抗原）が好ましい。
のリボ核蛋白質粒子の一種である。これらは、約95%以
上の蛋白質（プロソーム蛋白質）と約5%以下のＲＮＡ
（ｐＲＮＡ）からなる。プロソームは、蛋白質及びＲＮ
Ａ組成が個々によって種々変わるが、大きさ12-nmのキ
イチゴ状または筒状の粒子であって、形態学的及び生物
物理学的に同一種のものを意味する。少なくとも25種類
の種々のプロソーム蛋白質が発見されている。プロソー
ムは、このように試験した総ての種類の細胞中に検出さ
れた。しかしながら、本発明では、ヒト由来のプロソー
ム（及びプロソーム抗原）が好ましい。
【００１０】プロソームは、単離可能である。通常の細
胞のポストミトコンドリア上清を差動遠心により分画
し、ポリソーム、ポストポリソーム粒子のペレット及び
ゾル性細胞質の画分を製造する。プロソームは、ポスト
ポリソームペレットからイオン強度の高い緩衝液中の蔗
糖密度勾配沈降により得られた［Martins de Saら、“P
rosomes:ubiquity and inter-species structural vari
ation”J.Molec.Biol.，187:151-158（1986）；Schmid
ら，“The prosome an ubiquitous morphologically di
stinct RNP particle associated with repressed mRNP
s and containingScRNA and a characteristic set of
proteins”,EMBO J.，3：29-34（1984）参照］。これら
の条件下では、プロソームは、約19Sの沈降値を有する
鋭いピークとして沈降する。
胞のポストミトコンドリア上清を差動遠心により分画
し、ポリソーム、ポストポリソーム粒子のペレット及び
ゾル性細胞質の画分を製造する。プロソームは、ポスト
ポリソームペレットからイオン強度の高い緩衝液中の蔗
糖密度勾配沈降により得られた［Martins de Saら、“P
rosomes:ubiquity and inter-species structural vari
ation”J.Molec.Biol.，187:151-158（1986）；Schmid
ら，“The prosome an ubiquitous morphologically di
stinct RNP particle associated with repressed mRNP
s and containingScRNA and a characteristic set of
proteins”,EMBO J.，3：29-34（1984）参照］。これら
の条件下では、プロソームは、約19Sの沈降値を有する
鋭いピークとして沈降する。
【００１１】プロソーム作成を助長するプロソーム蛋白
質も特徴付けられた（Schmidら，上記参照）。プロソー
ム蛋白質p27K及びp33K［各々、約27及び33キロダルトン
の分子量を有する蛋白質に対応する］は、共願で、係属
中の国際出願第PCT/EP91/01945号（国際公表番号第WO92
/07269，1992年４月30日発行）に於いて、各々SEQ IDN
O:2及びSEQ ID NO:4として配列分析され、同定されてい
る。「フラグメント」は通常、プロソーム蛋白質のエピ
トープ部分である。
質も特徴付けられた（Schmidら，上記参照）。プロソー
ム蛋白質p27K及びp33K［各々、約27及び33キロダルトン
の分子量を有する蛋白質に対応する］は、共願で、係属
中の国際出願第PCT/EP91/01945号（国際公表番号第WO92
/07269，1992年４月30日発行）に於いて、各々SEQ IDN
O:2及びSEQ ID NO:4として配列分析され、同定されてい
る。「フラグメント」は通常、プロソーム蛋白質のエピ
トープ部分である。
【００１２】本発明で使用するためのペプチドまたはそ
のフラグメントは、組換体ＤＮＡ方法またはペプチド合
成法として公知の有機化学方法の１つにより製造し得
る。
のフラグメントは、組換体ＤＮＡ方法またはペプチド合
成法として公知の有機化学方法の１つにより製造し得
る。
【００１３】有機化学方法は、所望の活性を有する小さ
なペプチドフラグメント合成に特に有用である。フラグ
メントの配列が公知になれば、その合成はペプチド分野
の当業者にとっては比較的簡単である。ペプチド合成の
有機化学方法としては、均一相または固相を用いる縮合
反応による必要なアミノ酸のカップリングが挙げられ
る。固相方法は、Merrifield，J．Am．Chem．Society，
85，2149（1963）及びWang，J．Am．Chem．Soc.，95，1
328（1974）に記載されている。
なペプチドフラグメント合成に特に有用である。フラグ
メントの配列が公知になれば、その合成はペプチド分野
の当業者にとっては比較的簡単である。ペプチド合成の
有機化学方法としては、均一相または固相を用いる縮合
反応による必要なアミノ酸のカップリングが挙げられ
る。固相方法は、Merrifield，J．Am．Chem．Society，
85，2149（1963）及びWang，J．Am．Chem．Soc.，95，1
328（1974）に記載されている。
【００１４】組換体ＤＮＡ方法としては、問題の１種以
上のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を持つ
組換体ポリヌクレオチドを、宿主としての好適な微生物
中に発現させることにより、所望のペプチドまたはフラ
グメントを製造する方法が挙げられる。通常、この方法
は、クローニングビヒクル（例えば、宿主細胞中で複製
し得るプラスミド、ファージＤＮＡまたは他のＤＮＡ配
列など）にＤＮＡ配列を導入し、前記クローニングビヒ
クルを好適な宿主細胞に導入し、次いでこのように形質
転換した宿主細胞を培養する。通常、宿主細胞として
は、例えばE.coli、Pseudomonas及びBacillus subtilis
が挙げられる。
上のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を持つ
組換体ポリヌクレオチドを、宿主としての好適な微生物
中に発現させることにより、所望のペプチドまたはフラ
グメントを製造する方法が挙げられる。通常、この方法
は、クローニングビヒクル（例えば、宿主細胞中で複製
し得るプラスミド、ファージＤＮＡまたは他のＤＮＡ配
列など）にＤＮＡ配列を導入し、前記クローニングビヒ
クルを好適な宿主細胞に導入し、次いでこのように形質
転換した宿主細胞を培養する。通常、宿主細胞として
は、例えばE.coli、Pseudomonas及びBacillus subtilis
が挙げられる。
【００１５】ペプチドを作成すると、本発明で有用なフ
ラグメントも決定し得る。好適な免疫学的に活性なペプ
チドフラグメントは、特許出願第WO 86/06487号（Geyse
n等）；Proc.Nat'l.Acad.Sci.，（81）3998-4002，（19
84）（Geysen等）；及び“pep-scan”法をベースとする
J.Immunol Meth.，（102）259-274（1987）（Geysen
等）に記載されている方法により知見され得る。この方
法では、当該完全体ペプチドの部分配列に対応する一連
の部分ペプチドも合成し、且つその抗体に対する活性も
研究している。
ラグメントも決定し得る。好適な免疫学的に活性なペプ
チドフラグメントは、特許出願第WO 86/06487号（Geyse
n等）；Proc.Nat'l.Acad.Sci.，（81）3998-4002，（19
84）（Geysen等）；及び“pep-scan”法をベースとする
J.Immunol Meth.，（102）259-274（1987）（Geysen
等）に記載されている方法により知見され得る。この方
法では、当該完全体ペプチドの部分配列に対応する一連
の部分ペプチドも合成し、且つその抗体に対する活性も
研究している。
【００１６】さらにこのペプチドの官能基誘導体も使用
し得る。このような官能基誘導体としては、ペプチドの
酸付加塩（例えば、塩酸、臭化水素酸、フマル酸、リン
酸、アスコルビン酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、マレイ
ン酸、パルミチン酸及び他の公知の酸など）；ペプチド
のアミド特に、Ｃ-末端アミド；エステル特に、Ｃ-末端
エステル；及びＮ-アシル誘導体、特にＮ-末端アシル誘
導体特にＮ-アセチル誘導体が挙げられる。本発明では
官能基誘導体は総て、「ポリペプチド」、「ペプチド」
及び「ペプチドフラグメント」と見なされる。
し得る。このような官能基誘導体としては、ペプチドの
酸付加塩（例えば、塩酸、臭化水素酸、フマル酸、リン
酸、アスコルビン酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、マレイ
ン酸、パルミチン酸及び他の公知の酸など）；ペプチド
のアミド特に、Ｃ-末端アミド；エステル特に、Ｃ-末端
エステル；及びＮ-アシル誘導体、特にＮ-末端アシル誘
導体特にＮ-アセチル誘導体が挙げられる。本発明では
官能基誘導体は総て、「ポリペプチド」、「ペプチド」
及び「ペプチドフラグメント」と見なされる。
【００１７】幾つかのプロソーム、プロソーム蛋白質、
フラグメント及び誘導体は、Organon Teknika（nv Turn
hout；ベルギー）より市販の特定の抗体との反応性によ
り識別し得る。市販のモノクローナル抗体は、プロソー
ム蛋白質p23K、p25K、p27K、p29K（p28K、p33K）、p30/
33K、及びp31K並びに抗-p21K（プロソーム様粒子）に対
するものである。これらの抗体は、Research Reagent N
ews,（1990年１月）（Organon Teknika nv）にさらに詳
しく記載されている。
フラグメント及び誘導体は、Organon Teknika（nv Turn
hout；ベルギー）より市販の特定の抗体との反応性によ
り識別し得る。市販のモノクローナル抗体は、プロソー
ム蛋白質p23K、p25K、p27K、p29K（p28K、p33K）、p30/
33K、及びp31K並びに抗-p21K（プロソーム様粒子）に対
するものである。これらの抗体は、Research Reagent N
ews,（1990年１月）（Organon Teknika nv）にさらに詳
しく記載されている。
【００１８】II．抗体 Ａ．被験者の抗体 試験サンプルは、被験者の抗体を含んでいなければなら
ない。このようなサンプルとしては、血液及び血液画分
（例えば、血漿または血清など）が挙げられる。血液サ
ンプルは、被験者から通常静脈穿刺（veinpunctues）に
より得られ、赤血球及び血餅は除去するのが好ましい。
次いで抗体を任意の好適な方法により分離し得る。
ない。このようなサンプルとしては、血液及び血液画分
（例えば、血漿または血清など）が挙げられる。血液サ
ンプルは、被験者から通常静脈穿刺（veinpunctues）に
より得られ、赤血球及び血餅は除去するのが好ましい。
次いで抗体を任意の好適な方法により分離し得る。
【００１９】Ｂ．他の抗体 本発明の診断キット及び診断方法に使用するための他の
抗体物質は、使用する特別な試験に応じて選択される。
例えば、ヒトＩｇＧ抗体に対する標識抗体は、被験者か
ら採取したサンプルに存在し、プロソーム抗原と反応す
る抗体を検出するための本発明の特定の態様に於いて有
用である。これらの抗体の免疫学的に活性な抗体フラグ
メントも同様に有用である。プロソーム蛋白質に対する
抗体は、固体担体にプロソームを結合させるために好適
である（このような抗体はヒト抗体またはヒト型に変型
した抗体でなくてもよい）。このような抗体は、ポリク
ローナルまたはモノクローナル抗体であってもよい。
抗体物質は、使用する特別な試験に応じて選択される。
例えば、ヒトＩｇＧ抗体に対する標識抗体は、被験者か
ら採取したサンプルに存在し、プロソーム抗原と反応す
る抗体を検出するための本発明の特定の態様に於いて有
用である。これらの抗体の免疫学的に活性な抗体フラグ
メントも同様に有用である。プロソーム蛋白質に対する
抗体は、固体担体にプロソームを結合させるために好適
である（このような抗体はヒト抗体またはヒト型に変型
した抗体でなくてもよい）。このような抗体は、ポリク
ローナルまたはモノクローナル抗体であってもよい。
【００２０】通常使用する標識物質としては、種々の放
射性同位体、蛍光化合物、ラテックス、酵素、染料ゾル
またはゾル粒子として使用される金属化合物が挙げられ
る。
射性同位体、蛍光化合物、ラテックス、酵素、染料ゾル
またはゾル粒子として使用される金属化合物が挙げられ
る。
【００２１】（例えば、ペルオキシダーゼで標識した）
標識抗-ヒト抗体は、例えばMiles Laboratories Ltd.
（Slogh,イギリス）より市販されている。
標識抗-ヒト抗体は、例えばMiles Laboratories Ltd.
（Slogh,イギリス）より市販されている。
【００２２】ヒト抗体に対し産生されたモノクローナル
抗体も、不滅化抗体産生細胞の生物学的に純粋な細胞系
より産生し得る。不滅化抗体産生細胞は、当業界で公知
の種々の方法のいずれかにより得ることができ、通常 １）例えばリンパ球などの好適な細胞を特異的抗体を産
生するように誘導し、 ２）これらの細胞を不滅化し、次いで ３）これらの細胞の中から所望の特異性及び親和性を持
つ抗体を産生するクローンを選択する 段階を含む。例えば、１つの方法としては、Kohler及び
Millstein、Nature，vol.256，495-497（1975）の方法
が挙げられる。この方法は、マウスをヒト抗体で免疫感
作し、脾臓細胞を単離し、次いでこの細胞とマウス骨髄
腫細胞とを融合し、ハイブリドーマを得ることからな
る。無論、マウス以外の他の動物も同様に使用し得る。
抗体も、不滅化抗体産生細胞の生物学的に純粋な細胞系
より産生し得る。不滅化抗体産生細胞は、当業界で公知
の種々の方法のいずれかにより得ることができ、通常 １）例えばリンパ球などの好適な細胞を特異的抗体を産
生するように誘導し、 ２）これらの細胞を不滅化し、次いで ３）これらの細胞の中から所望の特異性及び親和性を持
つ抗体を産生するクローンを選択する 段階を含む。例えば、１つの方法としては、Kohler及び
Millstein、Nature，vol.256，495-497（1975）の方法
が挙げられる。この方法は、マウスをヒト抗体で免疫感
作し、脾臓細胞を単離し、次いでこの細胞とマウス骨髄
腫細胞とを融合し、ハイブリドーマを得ることからな
る。無論、マウス以外の他の動物も同様に使用し得る。
【００２３】抗体を産生する他の方法は、米国特許第4,
816,397号（組換体抗体の産生法）及び米国特許第4,81
6,567号（組換体キメラ抗体）に記載されている。
816,397号（組換体抗体の産生法）及び米国特許第4,81
6,567号（組換体キメラ抗体）に記載されている。
【００２４】III．診断方法 ＭＳ抗体に対し抗原性を示すプロソーム抗原は、ヒトに
於けるこれらの抗体の存在を検出するために設計された
方法及びキットで使用し得る。
於けるこれらの抗体の存在を検出するために設計された
方法及びキットで使用し得る。
【００２５】例えば、本発明の組換体ＤＮＡ分子により
形質転換された宿主により産生された所望の免疫活性を
示すプロソーム抗原は、免疫診断試験キットまたは免疫
化学試薬として使用し得る。
形質転換された宿主により産生された所望の免疫活性を
示すプロソーム抗原は、免疫診断試験キットまたは免疫
化学試薬として使用し得る。
【００２６】本明細書中「免疫化学試薬」という用語
は、プロソーム抗原、または好適な担体に直接若しくは
間接的に結合したプロソーム抗原を意味する。通常使用
する担体としては、マイクロテストウエル若しくはキュ
ベットの内壁、チューブ若しくはキャピラリー、膜フィ
ルター、テストストリップ、または粒子（例えば、ラテ
ックス粒子、ビーズ、赤血球、染料ゾル、金属ゾル若し
くはゾル粒子としての金属化合物など）の表面が挙げら
れる。
は、プロソーム抗原、または好適な担体に直接若しくは
間接的に結合したプロソーム抗原を意味する。通常使用
する担体としては、マイクロテストウエル若しくはキュ
ベットの内壁、チューブ若しくはキャピラリー、膜フィ
ルター、テストストリップ、または粒子（例えば、ラテ
ックス粒子、ビーズ、赤血球、染料ゾル、金属ゾル若し
くはゾル粒子としての金属化合物など）の表面が挙げら
れる。
【００２７】試験液体（例えば、多発性硬化症に罹患し
たと思われるヒトの血清など）中にこの蛋白質に対する
抗体が存在するかどうかを検出する１方法では、本発明
の免疫化学試薬を試験液体と接触させる。この後、この
ペプチドと試験液体中の抗体との間に形成した免疫複合
体の存在を、免疫化学反応の存在で測定する。免疫化学
反応は、サンドイッチ反応（標識ペプチド若しくは標識
抗-ヒト抗体を使用）、凝集反応（ゾルを使用）、競合
反応または阻害反応であるのが好ましい。
たと思われるヒトの血清など）中にこの蛋白質に対する
抗体が存在するかどうかを検出する１方法では、本発明
の免疫化学試薬を試験液体と接触させる。この後、この
ペプチドと試験液体中の抗体との間に形成した免疫複合
体の存在を、免疫化学反応の存在で測定する。免疫化学
反応は、サンドイッチ反応（標識ペプチド若しくは標識
抗-ヒト抗体を使用）、凝集反応（ゾルを使用）、競合
反応または阻害反応であるのが好ましい。
【００２８】免疫診断試験キットとしては、米国再発行
特許第32,696号（Schuurs等）に記載のラジオイムノア
ッセイまたは酵素免疫活性アッセイ（EIA）及び米国特
許第4,313,734号（Leuvering）に記載の金属ゾル粒子イ
ムノアッセイ（SPIA）が挙げられる。SPIA試験キットで
は金属、金属化合物または金属若しくは金属化合物で被
覆したポリマー核の水性ゾル懸濁液を使用する。
特許第32,696号（Schuurs等）に記載のラジオイムノア
ッセイまたは酵素免疫活性アッセイ（EIA）及び米国特
許第4,313,734号（Leuvering）に記載の金属ゾル粒子イ
ムノアッセイ（SPIA）が挙げられる。SPIA試験キットで
は金属、金属化合物または金属若しくは金属化合物で被
覆したポリマー核の水性ゾル懸濁液を使用する。
【００２９】ＭＳ抗体を検出する好ましいイムノアッセ
イでは、プロソーム抗原の予定量を固相、即ち蛋白質結
合面に吸着させる。次いで抗体を分析すべき試験サンプ
ル（例えば、患者の血清など）を、プロソーム抗原が結
合した表面と接触させると、試験サンプル中の抗体は固
定化された抗原に結合する。放射性または酵素-標識免
疫グロブリンプローブ（例えば、ヒトＩｇＧとのみ反応
する抗体または抗体フラグメントなど）をこの表面と接
触させ、固定化された抗体と結合させる。固体担体に結
合した標識プローブ量は検出され、試験サンプル中の抗
体の存在を表示する。
イでは、プロソーム抗原の予定量を固相、即ち蛋白質結
合面に吸着させる。次いで抗体を分析すべき試験サンプ
ル（例えば、患者の血清など）を、プロソーム抗原が結
合した表面と接触させると、試験サンプル中の抗体は固
定化された抗原に結合する。放射性または酵素-標識免
疫グロブリンプローブ（例えば、ヒトＩｇＧとのみ反応
する抗体または抗体フラグメントなど）をこの表面と接
触させ、固定化された抗体と結合させる。固体担体に結
合した標識プローブ量は検出され、試験サンプル中の抗
体の存在を表示する。
【００３０】ラジオイムノアッセイの一例に於いては、
プロソーム抗原に対する抗体［例えば、米国特許第5,05
9,521号（Scherrer等）に記載］を、固相（例えば、試
験管の内壁）につける。ついでプロソーム抗原を試験管
に添加し、これらの抗体と結合させる。このように形成
した抗原−抗体複合体で被覆された試験管に、患者の血
清サンプルを、プロソーム抗原に対する抗体であって、
放射性同位体（例えば、放射性ヨウ素など）で標識した
ものの既知量と共に添加する。患者の血清由来のプロソ
ーム抗原に対する抗体は総て、抗原−抗体複合体上の遊
離結合部位で標識抗体と競合する。血清が充分相互作用
したら、過剰の液体を除去し、試験管を洗浄し、放射能
量を測定する。陽性（即ち、患者の血清が抗体を含む場
合）であれば、放射能カウント数は比較的低い。
プロソーム抗原に対する抗体［例えば、米国特許第5,05
9,521号（Scherrer等）に記載］を、固相（例えば、試
験管の内壁）につける。ついでプロソーム抗原を試験管
に添加し、これらの抗体と結合させる。このように形成
した抗原−抗体複合体で被覆された試験管に、患者の血
清サンプルを、プロソーム抗原に対する抗体であって、
放射性同位体（例えば、放射性ヨウ素など）で標識した
ものの既知量と共に添加する。患者の血清由来のプロソ
ーム抗原に対する抗体は総て、抗原−抗体複合体上の遊
離結合部位で標識抗体と競合する。血清が充分相互作用
したら、過剰の液体を除去し、試験管を洗浄し、放射能
量を測定する。陽性（即ち、患者の血清が抗体を含む場
合）であれば、放射能カウント数は比較的低い。
【００３１】ＥＩＡ試験の一例では、ミクロ滴定プレー
トをプロソーム抗原で被覆し、これに患者の血清サンプ
ルを添加する。総ての抗体を抗原と相互作用させるイン
キュベーション期間後、プレートを洗浄し、抗-ヒト抗
体の製剤（即ち、実験室動物中で産生させ、次いで酵素
標識と結合させたもの）を添加し、インキュベートさせ
て反応を実施させ、プレートを再び洗浄する。その後、
酵素基質をミクロ滴定プレートに添加し、酵素が基質上
に働くような時間インキュベートし、最終的に製剤の吸
収量を測定する。吸収に於ける大きな変化は陽性である
ことを示す。
トをプロソーム抗原で被覆し、これに患者の血清サンプ
ルを添加する。総ての抗体を抗原と相互作用させるイン
キュベーション期間後、プレートを洗浄し、抗-ヒト抗
体の製剤（即ち、実験室動物中で産生させ、次いで酵素
標識と結合させたもの）を添加し、インキュベートさせ
て反応を実施させ、プレートを再び洗浄する。その後、
酵素基質をミクロ滴定プレートに添加し、酵素が基質上
に働くような時間インキュベートし、最終的に製剤の吸
収量を測定する。吸収に於ける大きな変化は陽性である
ことを示す。
【００３２】あるいは、プロソーム蛋白質を抽出し、次
いでマトリックス中で分画してもよい。分離した蛋白質
を、膜へ移して固定化させ、被験者由来の抗体と反応さ
せる。それから膜を洗浄するのが好ましい。（直接また
は間接的）標識抗-ヒト抗体を次いで反応させ、被験者
の抗体とプロソーム蛋白質との間の結合が発生したかど
うかを決定する。
いでマトリックス中で分画してもよい。分離した蛋白質
を、膜へ移して固定化させ、被験者由来の抗体と反応さ
せる。それから膜を洗浄するのが好ましい。（直接また
は間接的）標識抗-ヒト抗体を次いで反応させ、被験者
の抗体とプロソーム蛋白質との間の結合が発生したかど
うかを決定する。
【００３３】本発明の診断試験キットは、緩衝液、基準
物質（陰性及び陽性）及び標識検出に必要な材料（例え
ば、化学物質）などの助剤も含んでもよい。標識が酵素
である場合、この酵素の基質は試験キット中に含まれて
いてもよい。標識が、染料、金属または金属化合物のゾ
ル粒子である場合、試験キットは、検出を促進するため
に固体担体に結合した標識を溶解する化学物質を含んで
いてもよい。
物質（陰性及び陽性）及び標識検出に必要な材料（例え
ば、化学物質）などの助剤も含んでもよい。標識が酵素
である場合、この酵素の基質は試験キット中に含まれて
いてもよい。標識が、染料、金属または金属化合物のゾ
ル粒子である場合、試験キットは、検出を促進するため
に固体担体に結合した標識を溶解する化学物質を含んで
いてもよい。
【００３４】本発明は、以下の例示的実施例を参照とし
てさらに説明されよう。
てさらに説明されよう。
【００３５】
【実施例】HeLa細胞由来のプロソームを、米国特許第5,
059,521号（Scherrer等，1991年10月22日）の実施例１
の方法により得た。これらのプロソームを、0.5% サル
コシル勾配を通してさらに精製した。
059,521号（Scherrer等，1991年10月22日）の実施例１
の方法により得た。これらのプロソームを、0.5% サル
コシル勾配を通してさらに精製した。
【００３６】多発性硬化症に罹患したものと診断された
かまたは罹患していると思われる27人の患者から血清を
得た（グループＡ）。多発性硬化症に罹患していないと
思われる35人の血清を負の対照として試験した（グルー
プＢ）。HeLa細胞由来の精製プロソームを、13%ポリア
クリルアミドSDS-ゲル（SDS-PAGE）にかけた。電気泳動
後、プロソーム蛋白質をニトロセルロース膜（Bio-Ra
d）上にブロットした。膜片を切り取り、PBS中５%スキ
ムミルクで１時間飽和させた。次いでこれらを室温で種
々の血清と２時間インキュベートした（希釈率１:100
0）。飽和緩衝液で３回洗浄後、これらの血清の反応し
た抗体は、抗-ヒトＩｇＧ抗体とペルオキシダーゼ（Mil
es Labs.Ltd.，Slough，England）との組み合わせを用
いて、室温で２時間インキュベートし、さらにH2O2-ク
ロロナフトールで着色することによって二次的に検出し
た。負の対照は、希釈緩衝液を代わりに用いた。
かまたは罹患していると思われる27人の患者から血清を
得た（グループＡ）。多発性硬化症に罹患していないと
思われる35人の血清を負の対照として試験した（グルー
プＢ）。HeLa細胞由来の精製プロソームを、13%ポリア
クリルアミドSDS-ゲル（SDS-PAGE）にかけた。電気泳動
後、プロソーム蛋白質をニトロセルロース膜（Bio-Ra
d）上にブロットした。膜片を切り取り、PBS中５%スキ
ムミルクで１時間飽和させた。次いでこれらを室温で種
々の血清と２時間インキュベートした（希釈率１:100
0）。飽和緩衝液で３回洗浄後、これらの血清の反応し
た抗体は、抗-ヒトＩｇＧ抗体とペルオキシダーゼ（Mil
es Labs.Ltd.，Slough，England）との組み合わせを用
いて、室温で２時間インキュベートし、さらにH2O2-ク
ロロナフトールで着色することによって二次的に検出し
た。負の対照は、希釈緩衝液を代わりに用いた。
【００３７】グループＡの27血清の内25（93%）が、分
子量範囲25〜35キロダルトンでプロソーム陽性反応を示
した。この血清の殆どは、種々の分子量範囲（即ち、約
25Kd、27Kd、31Kd及び33Kd）のシングルまたダブル蛋白
質バンと陽性反応をした。結果を、図１及び図２に示
す。
子量範囲25〜35キロダルトンでプロソーム陽性反応を示
した。この血清の殆どは、種々の分子量範囲（即ち、約
25Kd、27Kd、31Kd及び33Kd）のシングルまたダブル蛋白
質バンと陽性反応をした。結果を、図１及び図２に示
す。
【００３８】グループＢ由来の血清の１つは、プロソー
ム陽性反応を示した。
ム陽性反応を示した。
【００３９】これらの特異的な実施例及び態様は、特許
請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定するも
のではない。
請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定するも
のではない。
【図１】多発性硬化症患者19人の血清とHeLa細胞由来の
精製プロソームとの免疫反応の写真複写物を示す図であ
る。
精製プロソームとの免疫反応の写真複写物を示す図であ
る。
【図２】別の多発性硬化症患者８人の血清とHeLa細胞由
来の精製プロソームとの免疫反応の写真複写物を示す図
である。
来の精製プロソームとの免疫反応の写真複写物を示す図
である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年７月１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】多発性硬化症患者１９人の血清とHeLa細胞由来
の精製プロソームとの免疫反応を示す電気泳動の写真で
ある。
の精製プロソームとの免疫反応を示す電気泳動の写真で
ある。
【図２】別の多発性硬化症患者８人の血清とHeLa細胞由
来の精製プロソームとの免疫反応を示す電気泳動の写真
である。
来の精製プロソームとの免疫反応を示す電気泳動の写真
である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】
Claims (10)
- 【請求項１】 （ａ）被験者の抗体を含むサンプルを、
プロソーム抗原を含有する免疫化学試薬と接触させ、次
いで、（ｂ）プロソーム抗原とサンプル中に存在するこ
れと反応性の抗体との間に形成した免疫複合体の存在を
検出することを含む多発性硬化症の特異的診断に有用な
方法。 - 【請求項２】 プロソーム抗原が、ヒト細胞由来のプロ
ソームである請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 プロソーム抗原が、分子量約25、27、31
及び33キロダルトンであるプロソーム蛋白質の群から選
択される請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 被験者のサンプル中に存在する免疫学的
に反応性の抗体と免疫学的に反応させるために存在させ
たプロソーム抗原と、前記抗体がプロソーム抗原と反応
したかどうかを検出する手段を含む、多発性硬化症であ
ると思われるヒト被験者の多発性硬化症の診断に使用す
るための診断試験キット。 - 【請求項５】 被験者のサンプル中に存在する免疫学的
に反応性の抗体と免疫学的に反応させるために存在させ
たプロソーム抗原と、プロソーム抗原と反応した被験者
の抗体と反応させるための標識抗-ヒト抗体または標識
抗-ヒト抗体フラグメントを含む多発性硬化症であると
思われるヒト被験者の多発性硬化症の診断に使用するた
めの診断試験キット。 - 【請求項６】 抗-ヒト抗体または抗-ヒト抗体フラグメ
ントを標識するのに使用する標識が、放射性同位体、蛍
光化合物、非-ペルオキシダーゼ酵素、染料ゾルまたは
ゾル粒子として使用した金属化合物からなる群から選択
される請求項５に記載の診断試験キット。 - 【請求項７】 （ａ）固体キャリヤの表面にプロソーム
抗原を結合し、（ｂ）被験者の抗体を含むサンプルと前
記結合プロソーム抗原を接触させ、（ｃ）プロソーム抗
原とサンプル中に存在するこれと反応性の抗体との間の
免疫学的反応が起きるように十分な時間放置し、このよ
うにして第１の固相及び第１の液相を形成させ、（ｄ）
第１の液相と第１の固相を分離し、（ｅ）前記第１の固
相と、前記被験者が属する種の免疫グロブリンに対する
免疫グロブリンがつけられた金属粒子懸濁金属ゾルを含
有する試薬とを接触させ、金属ゾル粒子と抗-被験者種
免疫グロブリンとの結合体を形成し、（ｆ）前記試薬
と、被験者の抗-プロソーム抗原免疫グロブリン結合体
とが結合する第２の免疫学的反応が起きるに充分な時間
放置し、前記試薬が工程（Ｃ）の反応によって生成した
前記結合抗原に結合して、第２の固相と第２の液相を形
成し、（ｇ）第２の固相と第２の液相を分離し、次いで
（ｈ）第２の固相または第２の液相のいずれかに金属ゾ
ルが存在するかどうかまたはその量を検出する工程を含
む多発性硬化症の診断に有用な診断方法。 - 【請求項８】 プロソーム抗原で被覆した固相、酵素標
識に直接または間接的に結合した抗-ヒト抗体または抗-
ヒト抗体フラグメントを含有する非固相及び、標識に使
用した酵素用基質を含む多発性硬化症の特異的診断に使
用するための試験キット。 - 【請求項９】 プロソーム抗原が、ヒト細胞由来のプロ
ソームである請求項４〜８のいずれか１項に記載の診断
試験キット。 - 【請求項１０】 プロソーム抗原が、分子量約25、27、
31または33キロダルトンのプロソーム蛋白質の群から選
択される請求項４〜８のいずれか１項に記載の診断試験
キット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP91401443 | 1991-06-21 | ||
| FR91401443.6 | 1991-06-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0694707A true JPH0694707A (ja) | 1994-04-08 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| EP (1) | EP0519536B1 (ja) |
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| KR (1) | KR930000951A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| FR2586814A1 (fr) * | 1985-08-30 | 1987-03-06 | Centre Nat Rech Scient | Anticorps monoclonaux anti-proteines p 27 k et p 31 k de prosomes et leur application a titre de reactifs de diagnostic et/ou d'identification de cellules |
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| JPH01309686A (ja) * | 1988-06-08 | 1989-12-14 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | 多機能プロテアーゼ |
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- 1994-05-02 US US08/237,966 patent/US5472848A/en not_active Expired - Fee Related
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