JP2001221801A - ヒトメダラシンの免疫学的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 血液中の白血球成分の一つである顆粒球
の内部に存在するヒトメダラシンを抗ヒトメダラシン抗
体を用いて高精度で、かつ再現性よく定量することが可
能な免疫学的測定方法を提供する。 【解決手段】 抗ヒトメダラシン抗体を用いて血液中の
ヒトメダラシンを測定する際に、ヒト血液試料を血液の
浸透圧と異なる特定の浸透圧を有する水性液体で処理し
て白血球を完全に破壊した後、前記抗ヒトメダラシン抗
体を用いて血液試料中のヒトメダラシンを定量する血液
中のヒトメダラシンの免疫学的測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血液中のヒトメダ
ラシンを正確に測定するための血液試料の前処理を含む
ヒトメダラシンの免疫学的測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】セリンプロテアーゼの一種であるメダラ
シンは顆粒球等に存在し、炎症、特に慢性炎症の発現を
含めて広く生体防御機構において重要な役割を演じてい
ると考えられる。顆粒球メダラシンは多くの慢性炎症性
疾患の増悪期で増大し、寛解期で正常化するが、多発性
硬化症の患者では増悪する数日前に著増し、寛解に先行
して正常化することが認められている。多発性硬化症
は、中枢神経系の白質に限局性の脱髄巣とグリオーシス
の出現を特徴とし、寛解と悪化を繰り返しながら進行
し、多くは、10〜15年の経過で死亡すると云う慢性炎症
性の難病であり、原因については、未だ、はっきりとは
解明されていないが、ウィルスや細菌が免疫系を刺激し
て抗体が自らの神経組織を攻撃する自己免疫疾患の一種
ではないかと考えられている。また、その診断法はなか
なか難しく、核磁気共鳴造影法（ＭＲＩ）等によって行
なわれているのが現状であるが、ＭＲＩ等の方法は非常
に大がかりな装置を用い、測定操作も熟練を要し、経費
もかかるので、簡便な検査で病気の診断、病勢の把握、
予後の推定等が行なえる方法の開発が検討され、血液中
の顆粒球メダラシン活性の測定方法が研究され、簡便に
測定できるメダラシンの免疫学的測定方法の開発が行わ
れている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ヒトメ
ダラシンの免疫学的測定方法において、血液試料を水性
媒体で稀釈して測定する際に、顆粒球中に存在するメダ
ラシンを完全に顆粒球の外に放出させるような処理を施
すことなく測定を行うとその測定値の再現性が必ずしも
良くなく、測定値にばらつきを生じる現象が認められ
た。従って、血液中のヒトメダラシンを免疫学的に再現
性良く定量する測定方法の開発が望まれていたが、本発
明は上記事情に鑑みなされたもので、ヒト血液試料に特
定の前処理を施すことを含むヒト血液中のヒトメダラシ
ンを再現性良く正確に測定できる免疫学的測定方法を提
供することを課題とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を行なった結果、ヒト血液試
料をヒト血液の浸透圧と異なる特定の浸透圧を有する水
性液体で血液を処理して白血球を完全に破壊した後に、
抗ヒトメダラシン抗体を用いてヒトメダラシンを免疫学
的に測定することにより、血液中のヒトメダラシンを再
現性良く正確に測定できることを見い出し、これらの知
見に基づいて本発明の完成に到達したものである。

【０００５】従って、本発明の第一は、ヒト血液試料を
浸透圧が 250mOsm/kg・H₂O より低い水性液体か、又は 3
10mOsm/kg・H₂O より高い水性液体で処理して白血球を完
全に破壊した後に、抗ヒトメダラシン抗体を用いてヒト
血液試料中のヒトメダラシンを定量することを特徴とす
る血液中のヒトメダラシンの免疫学的測定方法に関する
ものである。

【０００６】また、本発明の第二は、ヒト血液試料を浸
透圧が 250mOsm/kg・H₂O より低い水性液体か、又は 310
mOsm/kg・H₂O より高い水性液体で処理して白血球を完全
に破壊した後に、不溶性担体に固定化した抗ヒトメダラ
シン抗体及び標識抗ヒトメダラシン抗体と接触させて抗
原抗体反応によりサンドイッチ錯体を形成させてヒトメ
ダラシンを不溶性担体上に捕捉し、次いで該錯体中の標
識を定量することを特徴とする血液中のヒトメダラシン
の免疫学的測定方法に関するものである。更に、本発明
によれば、抗ヒトメダラシン抗体の少なくとも一つが抗
ヒトメダラシンモノクローナル抗体である血液中のヒト
メダラシンの免疫学的測定方法を提供することができ
る。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下、本発明につき更に詳しく説
明する。本発明において測定されるべきヒト血液試料中
のヒトメダラシンの大部分は、血液中に存在する白血球
成分の一つである顆粒球の内部に存在しているので、顆
粒球を完全に破壊してヒトメダラシンを全て細胞外に放
出させてから測定することが正確な測定値を得るための
必須要件である。従って、この必須要件が完全に満たさ
れない場合には測定値はバラツキが大きく、再現性の乏
しいデータしか得られない。

【０００８】血液試料中の顆粒球を完全に破壊する方法
としては、機械的方法、超音波による方法、凍結融解を
繰り返す方法、及び浸透圧の異なる水性液体で処理する
方法等が考えられるが、血液と異なる浸透圧を有する水
性液体で処理する方法が最も簡便で実用的である。ヒト
血液の浸透圧は約 280〜290mOsm/kg・H₂Oの範囲にあるの
で、 250〜310mOsm/kg・H₂Oの範囲の水性液体では血液中
に存在する顆粒球を完全に破壊することは難しい。従っ
て、ヒト血液中の顆粒球の完全な破壊は浸透圧が 250mO
sm/kg・H₂O より低い水性液体、又は 310mOsm/kg・H₂O よ
り高い水性液体で血液を稀釈することで達成することが
できる。このような水性液体としては、水混和性有機溶
媒を含んでいてもよい精製水、無機酸塩、有機酸塩、糖
類、糖アルコール類、アミノ酸類、及び蛋白質等の水溶
性物質からなる溶質の濃度が非常に高い水溶液、又はこ
れらの溶質の濃度が非常に低い水溶液等の水性液体であ
り、顆粒球を完全に破壊し得る浸透圧を有する水溶液及
び緩衝液などを用いることができる。また、該水性液体
の使用量は、血液試料に対して容積単位で50〜10万倍、
好ましくは100〜1万倍、特に好ましくは500〜2千倍であ
る。

【０００９】このようにして得られた顆粒球を完全に破
壊したヒト血液試料の水性稀釈液を試料とするヒトメダ
ラシンの免疫学的測定方法は、測定試料を標識化した抗
原又は抗体の存在下に抗ヒトメダラシン抗体と接触さ
せ、抗原抗体反応により標識化免疫複合体として捕捉す
る免疫反応段階と、生成した該免疫複合体をその分子中
に存在する標識物質を用いて測定する検出段階とからな
る。免疫反応段階を構成する抗原抗体反応の方法は任意
である。

【００１０】例えば、 不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原
を捕捉させた後に標識抗体を反応させるサンドイッチ
法、 サンドイッチ法において、不溶性担体に結合した抗体
と異なる動物種に由来する抗体を用い、生成したサンド
イッチ錯体に対して、更にこの抗体に対する標識した第
二抗体を反応させる二抗体法、 不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原
をペルオキシダーゼ酵素標識抗原の存在下で反応させる
競合法、 測定すべき抗原を含有する試料にこれらと特異的に反
応する標識抗体を作用させて凝集沈殿させた後、遠心分
離により分離により免疫複合体中の標識物質を検出する
凝集沈殿法、更に、 ビオチン標識抗体に標識アビジンを反応させるビオチ
ン−アビジン法等を非限定的に用いることができる。

【００１１】本発明のヒトメダラシンの免疫学的測定方
法において不溶性担体を用いる場合には、不溶性担体と
しては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプ
ロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ
素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分
子化合物、その他、ガラス、金属、磁性粒子及びこれら
の組み合わせ等が挙げられる。また、不溶性担体の形状
としては、例えば、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤
状、容器状、セル、マイクロプレート、試験管等の種々
の形状で用いることができる。更に、これら不溶性担体
への抗原又は抗体の固定化方法は任意であるが、物理的
吸着法、共有結合法、イオン結合法等を用いることがで
きる。

【００１２】尚、本発明のヒトメダラシンの免疫学的測
定方法において用いられる抗体類のクラスは任意である
が、IgG クラスの抗体が好適に用いられる。また、抗体
はモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれ
を使うことも可能であるが、モノクローナル抗体が好ま
しい。それらの形態としては全抗体又は F(ab')₂、Fab
等の断片を用いることができる。また、抗体の起源は任
意であるが、マウス、ラット、兎、羊、山羊、鶏等に由
来する抗体が好適に用いられる。

【００１３】次に、このようにして捕捉されたヒトメダ
ラシンの標識化免疫複合体を検出段階で測定するための
標識物質としては、酵素、蛍光物質、発光物質及び放射
性物質等を使用するのが好適である。このような酵素と
しては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、蛍光物質としては、フル
オレッセインイソシアネート、フィコビリプロテイン
等、発光物質としては、ルミノール類、ジオキセタン類、
アクリジニウム塩類等、放射性物質としては、¹²⁵Ｉ、¹³¹
Ｉ、¹¹¹Ｉｎ、^99mＴｃ等を非限定的に挙げることができ
る。標識物質が酵素である場合には、その活性を測定す
るために基質、必要により発色剤、蛍光剤、及び発光剤
等が用いられる。酵素としてペルオキシダーゼを用いる
場合には、基質として過酸化水素等を用い、発色剤とし
て2,2'−アジノジ[3−エチルベンズチアゾリンスルホン
酸］アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、 5−アミノサリチル
酸、ｏ−フェニレンジアミン、 4−アミノアンチピリ
ン、 3,3',5,5'−テトラメチルベンジジン等、蛍光剤と
しては 4−ヒドロキシフェニル酢酸、 3−(4−ヒドロキ
シフェニル）プロピオン酸等、発光剤としてはルミノー
ル類、ルシゲニン電荷移動錯体等、酵素としてアルカリ
ホスファターゼを用いる場合には、基質として 4−ニト
ロフェニルホスフェート、 4−メチルウムベリフェリル
ホスフェート、コルチゾール−21−ホスフェート等、酵
素としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合には、
2−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド、 4−メチ
ルウムベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド、 3− (2'
−スピロアダマンタン)− 4−メトキシ− 4(3''−β−
Ｄ−ガラクトシルオキシフェニル)−1,2 −ジオキセタ
ン（ＡＭＰＧＤ）等を用いることができる。

【００１４】本発明のヒトメダラシンの免疫学的方法に
おいて使用することができるポリクローナル抗体は、従
来公知の方法でヒトメダラシンを抗原として動物に免疫
して得られる抗ヒトメダラシン抗血清の抗体成分として
分離精製されたものが好ましい。なかでも例えば、山羊
抗ヒトメダラシン−ポリクローナル抗体、兎抗ヒトメダ
ラシン−ポリクローナル抗体等が好適に用いられる。ま
た、本発明に使用することができるモノクローナル抗体
及びその製造方法については、先に出願された特開平11
−151085（発明の名称「抗ヒトメダラシンモノクローナ
ル抗体、その製造方法及びそれを用いる免疫学的測定方
法」）の特許出願明細書に詳細に説明されている。

【００１５】即ち、本発明のヒトメダラシンの免疫学的
測定方法において使用することのできる抗ヒトメダラシ
ンモノクローナル抗体は、健常人血液から分離した顆粒
球より抽出したヒトメダラシンで免疫した動物から採取
した抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合により
調製されるハイブリドーマを培地上で培養するか、又は
動物腹腔内に投与して腹水内で増殖させた後、該培養物
又は腹水から採取することにより製造される。

【００１６】抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマは、抗原としてメダラシンを用い
て免疫した動物から採取した抗体産生細胞をミエローマ
細胞と融合させることにより得られるハイブリドーマを
選択的に増殖させ、該ハイブリドーマから検索しクロー
ニングにより製造することができる。

【００１７】上記の抗体産生細胞としては、例えばヒト
メダラシン又はこれを含有する組成物又は細胞を投与し
て免疫した動物から得られる脾臓細胞、リンパ節細胞、
Ｂ−リンパ球等が挙げられる。免疫する動物としてはマ
ウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等が挙げら
れる。免疫は、例えばヒトメダラシンをそのまま又は適
当なアジュバントと共に動物の皮下、筋肉内又は腹腔内
に約１μｇ〜１ｍｇ／回を１〜２回／月、１〜６ケ月間
投与することにより行なわれる。抗体産生細胞の分離
は、最終免疫から２〜４日後に免疫動物から採取するこ
とにより行なわれる。ミエローマ細胞としては、マウ
ス、ラット由来のもの等を使用することができる。抗体
産生細胞とミエローマ細胞とは同種動物由来であること
が好ましい。

【００１８】細胞融合の方法は任意でり、限定されるも
のではないが、例えばダルコッペ改変イーグル培地（Ｄ
ＭＥＭ）等の培地中で抗体産生細胞とミエローマ細胞と
をポリエチレングリコール等の融合促進剤の存在で混合
することにより行なうことができる。細胞融合終了後、
ＤＭＥＭ等で適当に希釈し、遠心分離し、沈殿をＨＡＴ
培地等の選択培地に懸濁して培養することによりハイブ
リドーマを選択する。次いで、培養上清を用いて酵素抗
体法により抗体産生ハイブリドーマを検索し、限界希釈
法等によりクローニングを行ない、抗ヒトメダラシンモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ること
ができる。

【００１９】このようにして得られた抗体産生ハイブリ
ドーマを培地中又は生体内で培養しモノクローナル抗体
を培養物から採取する。モノクローナル抗体を大量に製
造するには、該ハイブリドーマをミエローマ細胞の由来
細胞と同種の動物腹腔内に投与し、その腹水中にモノク
ローナル抗体を蓄積させ、腹水から採取する方法を採れ
ばよい。

【００２０】培養物又は腹水からのモノクローナル抗体
の分離は、IgG 精製に通常使用される硫安分画法、陰イ
オン交換体又はプロテインＡ、Ｇ等のカラムによるクロ
マトグラフィーによって行なうことができる。このよう
にして得られた抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体
は、これを産生するハイブリドーマの種類により３Ｆ０
３、３Ｇ０３、２Ｅ０４、及び１Ｇ１２の４種類存在す
る。これらのモノクローナル抗体は、いずれもグロブリ
ンクラスはIgG で、サブクラスはIgG₁であり、いずれの
抗体も抗原であるヒトメダラシンと特異的に反応する。
従って、上記抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体は本
発明のヒトメダラシンの免疫学的測定方法には有用であ
る。

【００２１】

【実施例】以下、参考例と共に、実施例を示し、本発明
を具体的に説明する。もっとも、本発明は実施例等によ
り限定されるものではない。尚、実施例中の％は重量％
を意味する。

【００２２】〔参考例１〕 精製ヒトメダラシンの調製 健常人血液 400mlに、デキストラン（分子量 200,000〜
300,000)の６％生理食塩水溶液を血液：デキストラン水
溶液＝２：１の割合で混合し、ガラス棒等で軽くかき混
ぜてから、 4〜8 ℃の温度で約１時間静置した後、沈殿
した赤血球を上清と分離し、この上清を 15,000rpmで遠
心分離して沈殿を採取して白血球を得た。次に、この白
血球に1mM エチレンジアミン４酢酸２ナトリウム塩（Ｅ
ＤＴＡ）、1mM ｐ−クロロマーキュリー安息香酸（ＰＣ
ＭＢ）を含むpH7.0 の1Mリン酸カリウム緩衝液（ＰＫ
Ｂ）からなる抽出用液を加えて、撹拌下に37℃の温度で
20分間インキュベートした後、15秒間超音波破砕機にか
けて完全に細胞を破砕した。更に、37℃の温度で20分間
インキュベートしてから、 4℃の温度において 12,000r
pmで10分間遠心分離して上清を採取し、この上清を蒸留
水に対して透析し、沈渣は上記と同様の操作を数回繰り
返して抽出を行なった。次いで、この抽出液を50mMＰＫ
Ｂ(pH6.0）で平衡化したＣＭ−セファロースゲルカラム
に通した後、同じ緩衝液で洗浄してから、1MPＫＢ(pH6.
0）で吸着物を溶出し、溶出液を蒸留水に対して一晩透
析して脱塩してから、コロジオン膜で濃縮することによ
り、精製ヒトメダラシン 1.5mgが得られた。

【００２３】〔参考例２〕 抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体の製造 (1) 抗体産生細胞とミエローマ細胞の細胞融合によるハ
イブリドーマの調製 参考例１でヒト顆粒球から抽出、精製したヒトメダラシ
ンを、フロイント完全アジュバントで乳化し、 7週齢の
ＢＡＬＢ／Ｃマウスの皮下に50μg/匹の量で投与した。
そして、 4週間後にこのマウスに初回と同様の方法で追
加免疫を行ない、 7日後に血中に抗体量が増大したこと
を確認した後、更に、その 7日後に最終免疫として抗原
を腹腔に50μg/匹の量で投与した。一方、20％の牛胎児
血清を添加したＤＭＥＭ培地中で、マウスミエローマ細
胞 P3-X63-Ag8-U1（Ｐ３Ｕ１）を維持培養しておき、最
終免疫の 3日後、このマウスから脾臓細胞を採取して、
これをポリエチレングリコール4000を用いてＰ３Ｕ１と
細胞融合させ、96穴マイクロプレートに撒いた。細胞融
合後、培地を 100μM ヒポキサンチン、 0.4μM アミノ
プテリン、16μM チミジンを添加したＤＭＥＭ（ＨＡＴ
培地）に置換して、2〜3 週間選択培養することにより
脾臓細胞とミエローマ細胞との融合体であるハイブリド
ーマが得られた。

【００２４】(2) 抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブリ
ドーマのスクリーニング 次に、このハイブリドーマの培養液中の抗体活性を、Ｅ
ＬＩＳＡ（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay）でス
クリーニングした。即ち、ヒトメダラシンをＥＬＩＳＡ
用のマイクロプレートに吸着させ、 pH7.4の10mMリン酸
緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に 2％の牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）を添加した溶液でブロッキング処理を行なっ
た後、ハイブリドーマ培養液50μl をこのマイクロプレ
ートに添加して１時間放置してから、ハイブリドーマ培
養液を除去して洗浄し、これにペルオキシダーゼ標識山
羊抗マウス IgG−Fc特異抗体の 2μg/mlＰＢＳ溶液 100
μlを添加し、37℃で１時間反応させた。次いで、この
酵素標識抗体溶液を除去し洗浄した後、0.05％ＡＢＴ
Ｓ、及び0.0034％過酸化水素を含む0.1Mリン酸クエン酸
緩衝液 (pH4.6)を 200μl 添加して発色させることによ
り抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブリドーマを選別し
た。

【００２５】(3) 抗体産生株のクローニング及びモノク
ローナル抗体の調製 この抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブリドーマ培養液
を採取し、限界希釈法によるクローニングを行なって最
終的に単一クローンのハイブリドーマ４種類を得た。こ
のハイブリドーマを、それぞれプリスタン投与ＢＡＬＢ
／Ｃマウスの腹腔に投与して増殖させ、モノクローナル
抗体を含む腹水を得た。次いで、得られた腹水に50％飽
和硫安を加えて抗体を沈殿させ、この沈殿を分離してＰ
ＢＳに溶解させ、3MNaCl含有50mMトリス−塩酸緩衝液
(pH7.8)に対して透析してから、プロテインＡ−セファ
ロースＣＬ４Ｂカラム（ファルマシア社製）にかけた
後、吸着した抗体を0.1Mグリシン−塩酸緩衝液 (pH5.0)
で溶出し中和して精製することにより3F03、3GO3、2E0
4、及び1G12からなる 4種類のモノクローナル抗体を得
た。

【００２６】(4) モノクローナル抗体の性質〔ウェスタ
ンブロッティング法〕 モノクローナル抗体に特異的な抗原をウェスタンブロッ
ティング（Westernblotting ）法を用いて固定した。先
ず、ヒト顆粒球由来メダラシンをＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動にかけた後、電解液バッファーに25
mMグリシン、及び20％メタノールを含む溶液を用い、電
圧傾斜が 7V/cm、 2時間の条件でスラブゲルから蛋白を
ニトロセルロースシートへ移した。次に、ニトロセルロ
ースシートの各レーンを切り離し、一方のシートをアミ
ドブラックで蛋白染色し、他方は次の様な酵素免疫アッ
セイを行なった。即ち、 2％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキ
ング処理した後、１次抗体としてマウス抗ヒトメダラシ
ンモノクローナル抗体を加え、２次抗体としてペルオキ
シダーゼ標識山羊抗マウス IgG−Fc特異抗体を加えて反
応させ、洗浄してから、0.04％ 3,3'-ジアミノベンジジ
ン、及び0.0034％過酸化水素を含むＰＢＳからなる基質
溶液を加えて発色させることにより、 4種のマウス抗ヒ
トメダラシンモノクローナル抗体は、ヒト顆粒球由来メ
ダラシンを認識することが確認された。

【００２７】〔インヒビション・アッセイ法〕ＥＬＩＳ
Ａ用マイクロプレートに固定したヒトメダラシンに対し
て、ビオチン化した第一の抗体と非標識の第二の抗体を
共存させて反応させた後、アビジン化ペルオキシダーゼ
を反応させ、次いで、このペルオキシダーゼを基質溶液
の添加により発色させてビオチン化抗体の反応量を測定
するインヒビション・アッセイ（Inhibition assay）法
により、いずれの 2つの組み合わせにおいてもビオチン
化抗体の反応量に変化がないことより、 4種のモノクロ
ーナル抗体はいずれも互いに異なるエピトープ（抗原部
位）を認識することが確認された。

【００２８】〔実施例１〕 ヒトメダラシン測定用検量線の作成 (1) モノクローナル抗体固定化ビーズの調製 ポリスチレン製ビーズ（直径 6mm）をよく洗浄してか
ら、マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（2E0
4）10μg/mlを含むＰＢＳ(pH7.4）溶液中に 4℃の温度
で１昼夜放置した後、ＰＢＳで洗浄し、 1％ＢＳＡ水溶
液に 4℃の温度で１昼夜放置してブロッキング処理を施
すことによりモノクローナル抗体固定化ビーズが得られ
た。

【００２９】(2) ペルオキシダーゼ標識モノクローナル
抗体の調製 マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（2E04）1.
0mg/mlを含むＰＢＳ溶液に、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息
香酸）−Ｎ−サクシンイミドエステル（ＭＢＳ）の 10m
g/mlの濃度のジメチルホルムアミド溶液 0.1mlを添加
し、25℃の温度で30分間反応させた。次いで、この反応
混合液をセファデックスＧ−25を充填したカラムを用
い、0.1Mリン酸緩衝液(pH6.O) でゲル濾過を行ない、マ
レイミド化モノクローナル抗体と未反応ＭＢＳとを分離
した。一方、ペルオキシダーゼ酵素としてホースラディ
ッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の1.0mg/mlのＰＢ
Ｓ溶液に、Ｎ−サクシンイミジル-3-(2-ピリジルチオ）
プロピオネート（ＳＰＤＰ）の 10mg/mlの濃度のエタノ
ール溶液を添加し、25℃の温度で30分間反応させた。次
いで、この反応混合液をセファデックスＧ−25を充填し
たカラムを用い、10mM酢酸緩衝液(pH4.5) でゲル濾過し
て精製、ピリジルジスルフィド化ＨＲＰを含有する画分
を採取し、これをコロジオンバック中において氷冷下に
約10倍に濃縮した。次に、これに0.1Mジチオスレイトー
ルを含有する 0.1M 酢酸緩衝生理食塩水(pH4.5) １mlを
添加して、25℃の温度で30分間撹拌してＨＲＰ分子中に
導入したピリジルジスルフィド基を還元した後、この反
応混合液をセファデックスＧ−25を充填したカラムを用
いてゲル濾過し、チオール化ＨＲＰを含有する画分が得
られた。次に、マレイミド化モノクローナル抗体とチオ
ール化ＨＲＰとを混合し、コロジオンバックを用いて氷
冷下に4mg/mlの蛋白質濃度まで濃縮し、 4℃で一昼夜放
置した後、ウルトロゲルＡｃＡ44（SEPRACOR社）を充填
したカラムを用いてゲル濾過し、ペルオキシダーゼ酵素
標識モノクローナル抗体が得られた。

【００３０】(3) ヒトメダラシンのサンドイッチ酵素免
疫測定方法 マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（3F03）を
固定化したビーズ各１個と、精製したヒトメダラシン
（標準物質）0,1,10,100,200ng/ml の濃度で含有する 2
％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液50μl と 2％ＢＳＡ含有ＰＢＳ
溶液350 μl を加え37℃の温度で30分間インキュベート
し、次いで試験管内の溶液を吸引除去した後、生理食塩
水で洗浄してからＨＲＰ標識マウス抗ヒトメダラシンモ
ノクローナル抗体（2E04)0.2μg/mlの濃度で含有する 2
％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液 400μl を試験管に充填して37
℃の温度で30分間インキュベートした。次に、試験管内
の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄してから、
0.05％ＡＢＴＳ、及び0.0034％過酸化水素を含む0.1Mリ
ン酸クエン酸緩衝液(pH4.6) を 400μl ずつ各試験管内
に加え、37℃の温度で30分間インキュベートした後、反
応停止剤として0.1Nシュウ酸水溶液を１mlずつ加えて酵
素反応を停止させた。次いで、この溶液を分光光度計を
用いて 420nmの波長の吸光度を測定し、これを標準物質
濃度に対してプロットすることにより、図１に示される
ような濃度依存性の良い検量線が得られた。

【００３１】〔実施例２〕 酵素免疫測定方法による臨床検体中のメダラシンの測定 健常人及び多発性硬化症患者の血液をそれぞれ採取して
凍結保存した試料を室温に戻して融解させ、その10μl
を採取して精製水（浸透圧＝0mOsm/kg・H₂O）2ml 中に加
えボルテックスミキサーを用いて十分混合して検体溶液
とした後、その10μl を試験管に添加し、これに 2％Ｂ
ＳＡ含有ＰＢＳ(pH7.4)390μl を加えて希釈した。次
に、この試験管にマウス抗ヒトメダラシンモノクローナ
ル抗体（3F03）を固定化したビーズ各１個を加え37℃の
温度で30分間インキュベートし、次いで試験管内の溶液
を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄してからＨＲＰ標
識マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（2E04)
0.2μg/mlの濃度で含有する 2％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液
400μl を試験管に充填して37℃の温度で30分間インキ
ュベートした。次に、前述の検量線を作成する場合と全
く同じ操作により、洗浄、酵素反応及び反応停止を行な
った後、分光光度計を用いて 420nmの波長の吸光度を測
定し、検量線よりヒトメダラシン濃度を求めた。この測
定の再現性を検討する目的で測定操作を検体稀釈処理か
ら別個に 5回行った結果、検体血液中のヒトメダラシン
濃度は、第１表に示すように非常に良好な再現性を示す
ことが確認された。

【００３２】

【表１】

【００３３】〔比較例１〕 酵素免疫測定方法による臨床検体中のメダラシンの測定 健常人及び多発性硬化症患者の血液をそれぞれ採取して
凍結保存した試料を室温に戻して融解させ、その10μl
を採取しＰＢＳ（pH7.4)（浸透圧＝約290mOsm/kg・H₂O）
2ml 中に加えて均一に混合して検体溶液とした後、その
10μl を試験管に添加し、これに 2％ＢＳＡ含有ＰＢＳ
(pH7.4)390μl を加えて希釈した。次に、この試験管に
マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（3F03）を
固定化したビーズ各１個を加え37℃の温度で30分間イン
キュベートし、次いで試験管内の溶液を吸引除去した
後、生理食塩水で洗浄してからＨＲＰ標識マウス抗ヒト
メダラシンモノクローナル抗体（2E04)0.2μg/mlの濃度
で含有する 2％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液 400μl を試験管
に充填して37℃の温度で30分間インキュベートした。次
に、前述の検量線を作成する場合と全く同じ操作によ
り、洗浄、酵素反応及び反応停止を行なった後、分光光
度計を用いて 420nmの波長の吸光度を測定し、検量線よ
りヒトメダラシン濃度を求めた。この測定の再現性を検
討する目的で測定操作を検体稀釈処理から別個に 5回行
った結果、検体血液中のヒトメダラシン濃度の測定値は
第２表に示すように再現性が必ずしも良好とはいえない
データを示した。

【００３４】

【表２】

【００３５】

【発明の効果】以上説明した本発明の構成により、ヒト
血液試料中のヒトメダラシン量を再現性よく正確に測定
することが可能となり、慢性炎症性疾患、特に多発性硬
化症の血液診断等への利用の可能性が期待される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例１記載の酵素免疫測定方法を用いて
ヒトメダラシン（標準物質）を測定し、その吸光度を抗
原濃度の関数としてプロットして作成したヒトメダラシ
ン測定用の検量線である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/02 15/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 葛城 寿史 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 (72)発明者 青木 洋祐 東京都日野市南平四丁目19番２号 多摩南 平パークスクエア119号 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA44 DA02 GA03 HA15 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4B065 AA92X AB05 AC14 AC15 BA08 CA25

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト血液試料を浸透圧が 250mOsm
   /kg・H₂O より低い水性液体か、又は 310mOsm/kg・H₂O よ
   り高い水性液体で処理して白血球を完全に破壊した後
   に、抗ヒトメダラシン抗体を用いてヒト血液試料中のヒ
   トメダラシンを定量することを特徴とする血液中のヒト
   メダラシンの免疫学的測定方法。
2. 【請求項２】 ヒト血液試料を浸透圧が 250mOsm
   /kg・H₂O より低い水性液体か、又は 310mOsm/kg・H₂O よ
   り高い水性液体で処理して白血球を完全に破壊した後
   に、不溶性担体に固定化した抗ヒトメダラシン抗体及び
   標識抗ヒトメダラシン抗体と接触させて抗原抗体反応に
   よりサンドイッチ錯体を形成させてヒトメダラシンを不
   溶性担体上に捕捉し、次いで該錯体中の標識を定量する
   ことにより、ヒト血液試料中のヒトメダラシンを定量す
   ることを特徴とする血液中のヒトメダラシンの免疫学的
   測定方法。
3. 【請求項３】 前記抗ヒトメダラシン抗体の少な
   くとも一つが抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体であ
   る請求項１又は２に記載のヒトメダラシンの免疫学的測
   定方法。
4. 【請求項４】 前記水性液体が、水混和性有機溶
   媒を含んでいてもよい精製水及び／又は緩衝液である請
   求項１又は２に記載のヒトメダラシンの免疫学的測定方
   法。