JPS60214261A - ヒト癌胎児性抗原反応性モノクローナル抗体の製造法 - Google Patents
ヒト癌胎児性抗原反応性モノクローナル抗体の製造法Info
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- JPS60214261A JPS60214261A JP7242984A JP7242984A JPS60214261A JP S60214261 A JPS60214261 A JP S60214261A JP 7242984 A JP7242984 A JP 7242984A JP 7242984 A JP7242984 A JP 7242984A JP S60214261 A JPS60214261 A JP S60214261A
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- C07K—PEPTIDES
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- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、ヒト癌胎児性抗原（以下、ＣＥＡと略称する
こともある。）の精製法、ＣＥＡ反応性モノクローナル
抗体、その製造法およびその使用法に関する。
こともある。）の精製法、ＣＥＡ反応性モノクローナル
抗体、その製造法およびその使用法に関する。
従来の技術
ＣＥＡは１９６５年Ｇｏｌｄ らによって、ヒト大腸癌
組織の過塩素酸抽出物中に見い出され、しかも胎児期の
消化管上皮にも存在するこ吉から癌胎児性抗原（ｃａｒ
ｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）と名付
けられた。ＣＥＡは分子量約１８万、約５０％の糖を含
む蛋白である。ＣＥＡは胃癌、大腸癌、膵癌、肺癌など
の種々の癌患者で、癌組織や体液中に比較的高レベルで
検出される場合が多く、癌の診断ならびに予後管理用と
して繁用されている。
組織の過塩素酸抽出物中に見い出され、しかも胎児期の
消化管上皮にも存在するこ吉から癌胎児性抗原（ｃａｒ
ｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）と名付
けられた。ＣＥＡは分子量約１８万、約５０％の糖を含
む蛋白である。ＣＥＡは胃癌、大腸癌、膵癌、肺癌など
の種々の癌患者で、癌組織や体液中に比較的高レベルで
検出される場合が多く、癌の診断ならびに予後管理用と
して繁用されている。
従来より、ＣＥＡの酵素免疫測定法（以下、ＥＩＡと略
称することもある。）については、サンドイツチ法が繁
用されてきた。サンドインチ法は一般に次のように行な
われる。未知量のＣＥＡを含む被検液に担体上に保持さ
れた過剰量の抗体を加えて反応させ（第１反応）、次に
酵素で標識した過剰量の抗体の一定量を加えて反応させ
る（第２反応）。担体上に保持された酵素もしくは担体
上に保持されなかった酵素の活性を測定する。第１反応
、第２反応は同時に行なってもよいし時間をずらして行
なってもよい。
称することもある。）については、サンドイツチ法が繁
用されてきた。サンドインチ法は一般に次のように行な
われる。未知量のＣＥＡを含む被検液に担体上に保持さ
れた過剰量の抗体を加えて反応させ（第１反応）、次に
酵素で標識した過剰量の抗体の一定量を加えて反応させ
る（第２反応）。担体上に保持された酵素もしくは担体
上に保持されなかった酵素の活性を測定する。第１反応
、第２反応は同時に行なってもよいし時間をずらして行
なってもよい。
第１反応および第２反応で用いられている抗体は同一の
免疫動物で得られた抗血清、あるいは異なる免疫動物か
ら得られた抗血清、さらにこれらの抗体の１種類と細胞
融合法で得られた１種類の七ツクローナル抗体、あるい
は２種類のモノクローナル抗体などが用いられている。
免疫動物で得られた抗血清、あるいは異なる免疫動物か
ら得られた抗血清、さらにこれらの抗体の１種類と細胞
融合法で得られた１種類の七ツクローナル抗体、あるい
は２種類のモノクローナル抗体などが用いられている。
ＣＥＡは一般にＫｒｕｐｅｙらの方法〔イムノケミスト
リー（Ｉｍｍｕｎｏｃｂｅｍｉｓｔｒｙ）、第９巻（１
９７２年）、第６１７頁〕に準じてヒト大腸癌組織の過
塩素酸抽出物を、ゲルクロマトグラフィー、アフィニテ
ィクロマトグラフィーもしくは電気泳動法の各手法を組
み合せて精製されていた。
リー（Ｉｍｍｕｎｏｃｂｅｍｉｓｔｒｙ）、第９巻（１
９７２年）、第６１７頁〕に準じてヒト大腸癌組織の過
塩素酸抽出物を、ゲルクロマトグラフィー、アフィニテ
ィクロマトグラフィーもしくは電気泳動法の各手法を組
み合せて精製されていた。
しかし、これらの方法で得られだＣＥＡは、操作中に強
い酸性溶媒にさらされているため、変性している恐れが
あるという欠点を有する。このために緩和な条件でＣＥ
Ａを抽出精製する方法が報告されているが〔キャノサー
・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ）、第
３５巻（１９７５年）、第２９２８頁〕、繁雑であり、
またその有用性も明らかでない。更に抽出のだめに用い
られるヒト癌化組織としては通常、大腸癌の転移肝癌が
用いられるが原発部組織さ完全に一致する性質を有する
ものかどうかについては解明されているとは言えない。
い酸性溶媒にさらされているため、変性している恐れが
あるという欠点を有する。このために緩和な条件でＣＥ
Ａを抽出精製する方法が報告されているが〔キャノサー
・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ）、第
３５巻（１９７５年）、第２９２８頁〕、繁雑であり、
またその有用性も明らかでない。更に抽出のだめに用い
られるヒト癌化組織としては通常、大腸癌の転移肝癌が
用いられるが原発部組織さ完全に一致する性質を有する
ものかどうかについては解明されているとは言えない。
更にＣＥＡと共通の抗原決定基を有するＣＥＡ関連抗原
が正常組織や新生児胎便中から発見されておりＮＣＡ（
Ｎｏｎｓｐｅｃｉｆ ｉｃｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｎｇ
ａｎｔｉｇｅｎｉ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ
ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ５ｃ
ｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕ、Ｓ、Ａ、第６９巻（
１９７２年）、第２４９２頁〕やＮＣＡ−２ＣＮｏｎｓ
ｐｅｃｉｆｉｃｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇａｎｔｉ
ｇｅｎ−２； Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ。
が正常組織や新生児胎便中から発見されておりＮＣＡ（
Ｎｏｎｓｐｅｃｉｆ ｉｃｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｎｇ
ａｎｔｉｇｅｎｉ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ
ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ５ｃ
ｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕ、Ｓ、Ａ、第６９巻（
１９７２年）、第２４９２頁〕やＮＣＡ−２ＣＮｏｎｓ
ｐｅｃｉｆｉｃｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇａｎｔｉ
ｇｅｎ−２； Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ。
第１１１巻（１９７３年）、第１９２６頁〕などと名付
られている。これらのＣＥＡ関連抗原と交差反応する抗
ＣＥＡ抗体を利用すると、その交差反応性のためＫＣＥ
Ａ測定値に影響を与え、正確な測定値が得られない。
られている。これらのＣＥＡ関連抗原と交差反応する抗
ＣＥＡ抗体を利用すると、その交差反応性のためＫＣＥ
Ａ測定値に影響を与え、正確な測定値が得られない。
また、ＥＩＡで用いられる標識用酵素としては、定安で
高感度測定が可能であり、標識化反応時に損傷を受けな
いことが望ましい。これまでにペルオキシダーゼ、β−
Ｄ−ガラクトシダーセ゛、アルカリフオスファクーセ゛
、クルコースオキシダーゼなどが用いられているが、上
記の酵素のうち、ペルオキシダーゼは分子量約４万の極
めて安定な酵素で、酵素活性も高いため最も繁用されて
いる。
高感度測定が可能であり、標識化反応時に損傷を受けな
いことが望ましい。これまでにペルオキシダーゼ、β−
Ｄ−ガラクトシダーセ゛、アルカリフオスファクーセ゛
、クルコースオキシダーゼなどが用いられているが、上
記の酵素のうち、ペルオキシダーゼは分子量約４万の極
めて安定な酵素で、酵素活性も高いため最も繁用されて
いる。
ペルオキシダーゼをＥＩＡに利用するにあたって、ペル
オキシダーゼと免疫化学的活性物質とを予め結合させる
必要があるが、通常行なわれている方法では、それぞれ
欠点を有し、改善が切望されていた。
オキシダーゼと免疫化学的活性物質とを予め結合させる
必要があるが、通常行なわれている方法では、それぞれ
欠点を有し、改善が切望されていた。
問題を解決するための手段
本発明者らは、上記の事情に鑑み更に検討を重ねたとこ
ろ、ＣＥＡを含有する癌化組織から非イオン性界面活性
剤を含む中性塩溶液で抽出することによりＣＥＡを変性
させることなく精製できること、またこのようにして精
製されたＣＥＡを用いて製造されたＣＥＡ反応性モノク
ローナル抗体を、２種の抗ＣＥＡ抗体を用いるサンドイ
ンチ法によるＥＩＡにおいて、該２種の抗体のうち少な
くとも一方に上記モノクローナル抗体を用い、標識剤と
してベルオキシグーゼを用いこれと抗体とを一般式 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合または
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わ
される化合物で結合させたものを用いると、ＣＥＡを高
感度、高精度でしかも微量のＣＥＡを測定できることを
見い出し、これらの知見に基ついてさらに研究した結果
、本発明を完成した。
ろ、ＣＥＡを含有する癌化組織から非イオン性界面活性
剤を含む中性塩溶液で抽出することによりＣＥＡを変性
させることなく精製できること、またこのようにして精
製されたＣＥＡを用いて製造されたＣＥＡ反応性モノク
ローナル抗体を、２種の抗ＣＥＡ抗体を用いるサンドイ
ンチ法によるＥＩＡにおいて、該２種の抗体のうち少な
くとも一方に上記モノクローナル抗体を用い、標識剤と
してベルオキシグーゼを用いこれと抗体とを一般式 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合または
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わ
される化合物で結合させたものを用いると、ＣＥＡを高
感度、高精度でしかも微量のＣＥＡを測定できることを
見い出し、これらの知見に基ついてさらに研究した結果
、本発明を完成した。
本発明は、（１）ヒト癌胎児性抗原を含有する癌化組織
から、非イオン性界面活性剤を含む中性塩溶液で抽出し
、精製することを特徴とするヒト癌胎児性抗原の精製法
、 （２） ヒト癌胎児性抗原を含有する癌化組織から、非
イオン性界面活性剤を含む中性塩溶液で抽出し、精製さ
れたヒト癌胎児性抗原で免疫されだ哺乳動物のリンパ球
とミエローマ細胞との融合細胞から得られたヒト癌胎児
性抗原反応性モノクローナル抗体、 （３） ヒト癌胎児性抗原を含有する癌化組織から、非
イオン性界面活性剤を含む中性塩溶液で抽出し、ヒト癌
胎児性抗原を精製し、これを哺乳動物のリンパ球に免疫
し、これとミエローマ細胞との融合細胞を製造し、つい
でこれをクローニングすることを特徴とするヒト癌胎児
性抗原反応性モノクローナル抗体の製造法、および（４
） ヒト癌胎児性抗原を含有する癌化組織から、非イオ
ン性界面活性剤を含む中性塩溶液で抽出し、精製された
ヒト癌胎児性抗原で免疫された哺乳動物のリンパ球とミ
エローマ細胞との融合細胞から得られたヒト癌胎児性抗
原反応性モノクローナル抗体を、担体上に保持された抗
体、抗原および標識剤を結合させた抗体を用いるヒト癌
胎児性抗原の免疫化学的測定法において、担体上に保持
させる抗体と標識剤を結合させる抗体とが互いに抗原決
定部位を重複しない２種の抗体のうち少なくとも一方に
用い、標識剤とシテベルオキシダーゼを用い、これと抗
体とを一般式 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合または
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わ
される化合物で結合させたものを用いてヒト癌胎児性抗
原を免疫化学的に測定することを特徴とするヒト癌胎児
性抗原反応性モノクローナル抗体の使用法である。
から、非イオン性界面活性剤を含む中性塩溶液で抽出し
、精製することを特徴とするヒト癌胎児性抗原の精製法
、 （２） ヒト癌胎児性抗原を含有する癌化組織から、非
イオン性界面活性剤を含む中性塩溶液で抽出し、精製さ
れたヒト癌胎児性抗原で免疫されだ哺乳動物のリンパ球
とミエローマ細胞との融合細胞から得られたヒト癌胎児
性抗原反応性モノクローナル抗体、 （３） ヒト癌胎児性抗原を含有する癌化組織から、非
イオン性界面活性剤を含む中性塩溶液で抽出し、ヒト癌
胎児性抗原を精製し、これを哺乳動物のリンパ球に免疫
し、これとミエローマ細胞との融合細胞を製造し、つい
でこれをクローニングすることを特徴とするヒト癌胎児
性抗原反応性モノクローナル抗体の製造法、および（４
） ヒト癌胎児性抗原を含有する癌化組織から、非イオ
ン性界面活性剤を含む中性塩溶液で抽出し、精製された
ヒト癌胎児性抗原で免疫された哺乳動物のリンパ球とミ
エローマ細胞との融合細胞から得られたヒト癌胎児性抗
原反応性モノクローナル抗体を、担体上に保持された抗
体、抗原および標識剤を結合させた抗体を用いるヒト癌
胎児性抗原の免疫化学的測定法において、担体上に保持
させる抗体と標識剤を結合させる抗体とが互いに抗原決
定部位を重複しない２種の抗体のうち少なくとも一方に
用い、標識剤とシテベルオキシダーゼを用い、これと抗
体とを一般式 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合または
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わ
される化合物で結合させたものを用いてヒト癌胎児性抗
原を免疫化学的に測定することを特徴とするヒト癌胎児
性抗原反応性モノクローナル抗体の使用法である。
（以下＃−臼）
本発明において用いられる担体上に保持された抗体にお
ける担体としては、たとえば、ゲル粒子（例、アカロー
スゲルＣ例、セファロース４Ｂ。
ける担体としては、たとえば、ゲル粒子（例、アカロー
スゲルＣ例、セファロース４Ｂ。
セファロース６Ｂ（ファルマシア・ファインケミカル社
（スエーテン）製〕、テキストラノケル〔例、士ファテ
ノクスＧ−７５．−１＝ファテノクスＧ−１００，セフ
ァテックスＧ−２００（ファルマシア・ファインケミカ
ル社製）〕、〕ポリアクリルアミ１−ケル例、バイオケ
ルＰ−８０，バイオケルＰ−６０，バイオケルＰ−１０
０（バイオラット・ラホラトリース社（米国）））、セ
ルロース粒子〔例、アヒセル（脂化成製）、イオン交換
セルロース［ｌＪ、ジエチルアミンエチルセルロース、
カルボキシメチルセルロース）〕、物理的吸着剤〔例、
カラス（例、ガラス球、カラスロフト。
（スエーテン）製〕、テキストラノケル〔例、士ファテ
ノクスＧ−７５．−１＝ファテノクスＧ−１００，セフ
ァテックスＧ−２００（ファルマシア・ファインケミカ
ル社製）〕、〕ポリアクリルアミ１−ケル例、バイオケ
ルＰ−８０，バイオケルＰ−６０，バイオケルＰ−１０
０（バイオラット・ラホラトリース社（米国）））、セ
ルロース粒子〔例、アヒセル（脂化成製）、イオン交換
セルロース［ｌＪ、ジエチルアミンエチルセルロース、
カルボキシメチルセルロース）〕、物理的吸着剤〔例、
カラス（例、ガラス球、カラスロフト。
アミノアルキルカラス球、アミノアルキルガラスロンド
）、シリコン片、スチレン系樹脂（例、ポリスチレン球
、ポリスチレン粒子）、イムノアッセイ用プレート（例
、ヌンク社（テンマーク）製）〕、イオン交換樹脂（例
、弱酸性陽イオン交換樹脂〔例、アンバーライトＩＲＣ
−５１）（ローム０アンド・ハース社（米国）＃）、セ
オカーブ２２６（パームチット社（西ドイツ）製）〕９
９弱塩基性陰イオン交換樹脂例、アノパーライトＩＲ−
４Ｂ。
）、シリコン片、スチレン系樹脂（例、ポリスチレン球
、ポリスチレン粒子）、イムノアッセイ用プレート（例
、ヌンク社（テンマーク）製）〕、イオン交換樹脂（例
、弱酸性陽イオン交換樹脂〔例、アンバーライトＩＲＣ
−５１）（ローム０アンド・ハース社（米国）＃）、セ
オカーブ２２６（パームチット社（西ドイツ）製）〕９
９弱塩基性陰イオン交換樹脂例、アノパーライトＩＲ−
４Ｂ。
タウエックス３（ダウケミカル社（米国）製）〕）など
が挙げられる。
が挙げられる。
担体に抗体を保持させるには、公知の常套手段を応用し
得るが、たとえば゛代謝″、第８巻（１９７１年）、第
６９６頁に記載されているブロムシアン法、クルタルア
ルテヒト法などが挙げられる。また、より簡易な方法と
して物理的に担体表面に吸着させてもよい。
得るが、たとえば゛代謝″、第８巻（１９７１年）、第
６９６頁に記載されているブロムシアン法、クルタルア
ルテヒト法などが挙げられる。また、より簡易な方法と
して物理的に担体表面に吸着させてもよい。
本発明で用いられる抗体としてはモノクローナル抗ＣＥ
Ａ抗体もしくはポリクローナル抗ＣＥＡ抗体が用いられ
る。抗体の製造における免疫に用いる抗原としては、自
体公知の方法（Ｋｒｕｐｅｙら。
Ａ抗体もしくはポリクローナル抗ＣＥＡ抗体が用いられ
る。抗体の製造における免疫に用いる抗原としては、自
体公知の方法（Ｋｒｕｐｅｙら。
イムノケミストリー（Ｉｍｍｕｎｏｃｌ＋ｅｍｉｓＬｒ
ｙ ） 、第９巻（１９７２年）、第６１７頁〕で精製
したＣＥＡ、更に望ましくは、ヒト癌組織から非イオン
性界面活性剤を含む中性塩溶液により抽出、精製された
ＣＥＡ画分が用いられる。
ｙ ） 、第９巻（１９７２年）、第６１７頁〕で精製
したＣＥＡ、更に望ましくは、ヒト癌組織から非イオン
性界面活性剤を含む中性塩溶液により抽出、精製された
ＣＥＡ画分が用いられる。
ヒト癌化組織としてはＣＥＡを含有するヒト癌化組織な
らいずれでも用いることができるが、特にヒト大腸癌組
織が望ましい。ヒト大腸癌組織としては、あらゆる段階
の大腸癌組織を用いることができるが、テユークス（Ｄ
ｕｋｅａ ）ＣもしくはＤの段階のものが望ましい。
らいずれでも用いることができるが、特にヒト大腸癌組
織が望ましい。ヒト大腸癌組織としては、あらゆる段階
の大腸癌組織を用いることができるが、テユークス（Ｄ
ｕｋｅａ ）ＣもしくはＤの段階のものが望ましい。
非イオン性界面活性剤としては、細胞成分を可溶化でき
るものならばいずれでも良いか、とリオ〕ケエチレンオ
キシド系非イオン界面活性剤〔例、Ｔｗｅｅｎ ２０．
Ｔｗｅｅｎ ４０．Ｔｗｅｅｎ ８０． Ｔｒｉｔｏｎ
Ｎ −１０１、ＴｒｉもｏｎＸ −１００、Ｌｏｂｒ
ｏｌ ＷＸ、 Ｂｒ１ｊｉ ９ ６ など、シグマ社（
米国）製〕か用いられる。
るものならばいずれでも良いか、とリオ〕ケエチレンオ
キシド系非イオン界面活性剤〔例、Ｔｗｅｅｎ ２０．
Ｔｗｅｅｎ ４０．Ｔｗｅｅｎ ８０． Ｔｒｉｔｏｎ
Ｎ −１０１、ＴｒｉもｏｎＸ −１００、Ｌｏｂｒ
ｏｌ ＷＸ、 Ｂｒ１ｊｉ ９ ６ など、シグマ社（
米国）製〕か用いられる。
中性塩としてはたとえば塩化ナトリウム、塩化カリウム
、硫酸ナトリウムなどが良好に用いられる。ヒト癌化組
織あたり、約１ないし１０倍量の約０．１ないし４％エ
チレンオキシド系非イオン界面活性剤を含む約０．０５
Ｍないし８Ｍ塩化ナトリウムもしくは塩化カリウムを抽
出用溶媒として用いることが好ましい。
、硫酸ナトリウムなどが良好に用いられる。ヒト癌化組
織あたり、約１ないし１０倍量の約０．１ないし４％エ
チレンオキシド系非イオン界面活性剤を含む約０．０５
Ｍないし８Ｍ塩化ナトリウムもしくは塩化カリウムを抽
出用溶媒として用いることが好ましい。
更にＣＥＡの抽出に際しては、抽出効率を向上させるた
め、攪拌、振盪、超音波処理などを行なってもよい。
め、攪拌、振盪、超音波処理などを行なってもよい。
上記の方法で得られｊ： ＣＥ Ａ抽出液は自体公知の
精製手段（例、グルクロマトグラフィー、アフィニティ
・クロマトグラフィー、ケル電気泳動法）で更に精製す
ることができる（ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉａｔｒｙ、
第９巻（１９７２年）、第６１７頁。ＣａｎｃｅｒＲｅ
ｓｅａｒｃｈ 、第３５巻（１９７５年）、第２９２８
頁参照〕。
精製手段（例、グルクロマトグラフィー、アフィニティ
・クロマトグラフィー、ケル電気泳動法）で更に精製す
ることができる（ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉａｔｒｙ、
第９巻（１９７２年）、第６１７頁。ＣａｎｃｅｒＲｅ
ｓｅａｒｃｈ 、第３５巻（１９７５年）、第２９２８
頁参照〕。
これらの精製手段によＩ） ＣＥ Ａの純度を蛋白量あ
たり約数パーセットから数１０パーセノ］・マでに濃縮
することかできる。
たり約数パーセットから数１０パーセノ］・マでに濃縮
することかできる。
モノクローナル抗ＣＥＡ抗体はＭｉｌｓＬｅｉｎらの方
法〔ネイチュア（Ｎａｔｕｒｅ ） 、 ！ ２５６巻
（１９７５年）、第４９５頁〕と同様の方法で作製する
ことができる。例えば、上記精製ＣＥＡを抗原として免
疫して得られたマウス牌細胞とマウスのミエローマ細胞
とを融合させることにより、モノクローナル抗ＣＥＡ抗
体を分泌する融合細胞（ハイブリドーマ）を作製するこ
とができる。
法〔ネイチュア（Ｎａｔｕｒｅ ） 、 ！ ２５６巻
（１９７５年）、第４９５頁〕と同様の方法で作製する
ことができる。例えば、上記精製ＣＥＡを抗原として免
疫して得られたマウス牌細胞とマウスのミエローマ細胞
とを融合させることにより、モノクローナル抗ＣＥＡ抗
体を分泌する融合細胞（ハイブリドーマ）を作製するこ
とができる。
ナな６ち、ハイブリドーマは精製ＣＥＡであらかじめ免
疫しておいたマウス（たとえばＢ Ａ Ｌ Ｂ／Ｃ系）
から得られた牌細胞と、同系マウスのミエローマ細胞（
たとえばＮ５−１．ＰＳ−Ｕｔなど）とを細胞融合剤（
たとえばポリエチレングリコール、センタイウィルスな
ど）の存在下で混合し、融合、培養することによって得
られる。牌細胞とミエローマ細胞との混合比は１：工な
いし１０：１種度が有利に用いられる。
疫しておいたマウス（たとえばＢ Ａ Ｌ Ｂ／Ｃ系）
から得られた牌細胞と、同系マウスのミエローマ細胞（
たとえばＮ５−１．ＰＳ−Ｕｔなど）とを細胞融合剤（
たとえばポリエチレングリコール、センタイウィルスな
ど）の存在下で混合し、融合、培養することによって得
られる。牌細胞とミエローマ細胞との混合比は１：工な
いし１０：１種度が有利に用いられる。
ハイブリドーマはヒボキサンチン−アミノブチリン−チ
ミジン培地ＣＨＡＴ培地：ネイチュアー。
ミジン培地ＣＨＡＴ培地：ネイチュアー。
第２５６巻（１９７５年）、第４９５頁〕等を用いて選
択的に増殖させることができる。
択的に増殖させることができる。
細胞培養液中に目的とする抗体が含まれているかどうか
については自体公知の酵素免疫測定法を用いて検定する
ことができる。ＣＥＡに特異性の高い抗体を産生ずるハ
イブリドーマはさらに通常の限界希釈法によりモノクロ
ーン化される。得られた目的とするハイブリドーマは通
常の液体培地または哨乳動物の腹腔内で増殖させること
ができる。ハイブリドーマが産生ずるモノクローナル抗
体は公知の方法（たとえば硫酸アンモニウムにょる塩析
、ＤＥＡＥ−にルロースヵラムクロマトグラフィーなど
）により濃縮精製される。
については自体公知の酵素免疫測定法を用いて検定する
ことができる。ＣＥＡに特異性の高い抗体を産生ずるハ
イブリドーマはさらに通常の限界希釈法によりモノクロ
ーン化される。得られた目的とするハイブリドーマは通
常の液体培地または哨乳動物の腹腔内で増殖させること
ができる。ハイブリドーマが産生ずるモノクローナル抗
体は公知の方法（たとえば硫酸アンモニウムにょる塩析
、ＤＥＡＥ−にルロースヵラムクロマトグラフィーなど
）により濃縮精製される。
モノクローナル抗体はＣＥＡに対して反応性が高く、正
常組織や非担癌患者由来の試料に対（７ては反応性がは
るかに小さい性質を有する抗体が選ばれる。サンドイツ
チ法によるＥＩＡ用として２種類のモノクローナル抗体
が用いられる場合、それぞれの抗体の抗原決定部位が異
なっているものが選ばれる。
常組織や非担癌患者由来の試料に対（７ては反応性がは
るかに小さい性質を有する抗体が選ばれる。サンドイツ
チ法によるＥＩＡ用として２種類のモノクローナル抗体
が用いられる場合、それぞれの抗体の抗原決定部位が異
なっているものが選ばれる。
ポリクローナル抗ＣＥＡ抗体は通常の方法で調製するこ
とができる。即ち、精製ＣＥＡがヒト以外の温血動物に
接種される。ヒト以外の温血動物としては、たとえば咄
乳温血動物（例、ウサギ、ヒツジ、ラット、マウス、モ
ルモット、ウシ、ウマ、フタ）、鳥類（例、ニワトリ、
ハト、アヒル。
とができる。即ち、精製ＣＥＡがヒト以外の温血動物に
接種される。ヒト以外の温血動物としては、たとえば咄
乳温血動物（例、ウサギ、ヒツジ、ラット、マウス、モ
ルモット、ウシ、ウマ、フタ）、鳥類（例、ニワトリ、
ハト、アヒル。
カチョウ、ウズラ）などが挙げられる。該抗原をヒト以
外の温血動物に接種する方法としては、動物に接種する
抗原は抗体を産生ずるに有効な量でよく、たとえばウサ
ギに１回約０．１〜１０ｍｇを等容量（１ｍＬ ）の生
理食塩水およびフロイントの完全アジュバントで乳化し
て、背部ならびに後肢掌皮下に４週問おきに５回接種す
ると抗体を産生させ得る場合が多い。
外の温血動物に接種する方法としては、動物に接種する
抗原は抗体を産生ずるに有効な量でよく、たとえばウサ
ギに１回約０．１〜１０ｍｇを等容量（１ｍＬ ）の生
理食塩水およびフロイントの完全アジュバントで乳化し
て、背部ならびに後肢掌皮下に４週問おきに５回接種す
ると抗体を産生させ得る場合が多い。
このようにして、温血動物中に形成された抗体を採取す
る方法としては、たとえばウサギでは、通常最終接種後
７日から１２日の間に耳静脈から採血し、遠心分離して
血清として得られる。得られた抗血清は、公知の方法に
従って塩析し、通常、ＣＥＡを保持させた担体を用いる
アフィニティクロマトグラフィーで吸着した両分を回収
することによりポリクローナル抗ＣＥＡ抗体を精製する
ことができる。
る方法としては、たとえばウサギでは、通常最終接種後
７日から１２日の間に耳静脈から採血し、遠心分離して
血清として得られる。得られた抗血清は、公知の方法に
従って塩析し、通常、ＣＥＡを保持させた担体を用いる
アフィニティクロマトグラフィーで吸着した両分を回収
することによりポリクローナル抗ＣＥＡ抗体を精製する
ことができる。
本発明で用いられる２種の抗体は、モノクローナル抗Ｃ
ＥＡ抗体でもポリクローナル抗ＣＥＡ抗体であってもよ
いが、少なくとも一方がモノクローナル抗体であるのが
好ましい。また、抗体分子はＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２も
しくはＦａｂ’であってもよい。
ＥＡ抗体でもポリクローナル抗ＣＥＡ抗体であってもよ
いが、少なくとも一方がモノクローナル抗体であるのが
好ましい。また、抗体分子はＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２も
しくはＦａｂ’であってもよい。
このようにして得られた抗ＣＥＡモノクローナル抗体は
、ＣＥＡのサンドイツチ法によるＥＩＡにおける試薬と
して用いることができる。
、ＣＥＡのサンドイツチ法によるＥＩＡにおける試薬と
して用いることができる。
標識剤であるベルオキシターセとしては、種々＼
の起源のものを用いることができるが、その例としては
たとえば西洋わさび、パイナツプル、イチジク、せ諸、
ソラマメ、トウモロコノなどから得られるペルオキシタ
ーセが挙げられ、特に西洋オつさびから抽出されたホー
スラディツシュ０ペルオキシグーセ゛ −（ｈｏｒｓｅ
ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（ＨＲＰ）が好
ましい。
たとえば西洋わさび、パイナツプル、イチジク、せ諸、
ソラマメ、トウモロコノなどから得られるペルオキシタ
ーセが挙げられ、特に西洋オつさびから抽出されたホー
スラディツシュ０ペルオキシグーセ゛ −（ｈｏｒｓｅ
ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（ＨＲＰ）が好
ましい。
ベルオキシターセと抗体とを化合物［１］で結合するに
あたり、あらかしめベルオキシターセにチオール基を導
入したものを用いると好都合である。
あたり、あらかしめベルオキシターセにチオール基を導
入したものを用いると好都合である。
チオール基をベルオキシターセに導入する方法としては
、ベルオキシターセのアミノ基を介して＼ チオール基を導入することができる。たとえば、Ｓ−ア
セチルメルカプトサクシニックアンハイドライド（ＡＭ
ＳＡと略称することもある。５−ａｃｅＬｙｌ ｍｅｒ
ｃａｐＬｏｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）
、Ｎ−サクノニミンル８−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオネート［５ＰＤＰと略称することもある； Ｎ −
ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ８− （２−ｐｙｒｉｄｙ
ｌｄｉＬｈｉｏ ） ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ ：］など
通常のチオール基導入試薬が有利に用いられる。
、ベルオキシターセのアミノ基を介して＼ チオール基を導入することができる。たとえば、Ｓ−ア
セチルメルカプトサクシニックアンハイドライド（ＡＭ
ＳＡと略称することもある。５−ａｃｅＬｙｌ ｍｅｒ
ｃａｐＬｏｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）
、Ｎ−サクノニミンル８−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオネート［５ＰＤＰと略称することもある； Ｎ −
ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ８− （２−ｐｙｒｉｄｙ
ｌｄｉＬｈｉｏ ） ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ ：］など
通常のチオール基導入試薬が有利に用いられる。
したかって、チオール基をベルオキシターセとの間に一
定の基か入っていることとなってもよい。
定の基か入っていることとなってもよい。
ＡＭＳＡを用いる場合、ベルオキシターゼ約０１ないし
１０ｍｇを中性の緩衝液（たとえばＯＩＭ ＩＪン酸緩
衝液）約０２ないし２ ｒｎＬに溶解し、約０１ないし
４ ｍｇのＡＭＳＡを約０．Ｏｌないし０．１ｍＬかＮ
、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解して加え、約１０〜
１２０分間、約４〜３５℃で反応させる。次に約０２〜
２Ｍヒドロキシルアミンを加えて約４〜３５°Ｃで約１
〜６０分間反応させ、ゲルクロマトグラフィーで精製し
、てチオール化ベルオキシクーセを得ることができる。
１０ｍｇを中性の緩衝液（たとえばＯＩＭ ＩＪン酸緩
衝液）約０２ないし２ ｒｎＬに溶解し、約０１ないし
４ ｍｇのＡＭＳＡを約０．Ｏｌないし０．１ｍＬかＮ
、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解して加え、約１０〜
１２０分間、約４〜３５℃で反応させる。次に約０２〜
２Ｍヒドロキシルアミンを加えて約４〜３５°Ｃで約１
〜６０分間反応させ、ゲルクロマトグラフィーで精製し
、てチオール化ベルオキシクーセを得ることができる。
５ＰＤＰを用いる場合、ベルオキシダーセ約０゜１ない
しＬｏｎｇを中性の緩衝液（たとえば０．１Ｍリン酸緩
衝液）約０．１〜１耐に溶解し、約０．１〜８ ｍｇの
５ＰＤＰのエタノール溶液を加えて約４〜３５°Ｃで約
１０〜１２０分間反応させる。ゲルクロマ１−グラフィ
ーで過剰の試薬を除去したのち、ジチオ７、 レイトー
ル（ｄｉＬｈｉｏＬｈｒｅｉＬｏｌ ） などの還元用
試薬を加えて還元し、更にケルクロマトグラフィーで精
製してチオール化ベルオキシターセを得ることができる
。
しＬｏｎｇを中性の緩衝液（たとえば０．１Ｍリン酸緩
衝液）約０．１〜１耐に溶解し、約０．１〜８ ｍｇの
５ＰＤＰのエタノール溶液を加えて約４〜３５°Ｃで約
１０〜１２０分間反応させる。ゲルクロマ１−グラフィ
ーで過剰の試薬を除去したのち、ジチオ７、 レイトー
ル（ｄｉＬｈｉｏＬｈｒｅｉＬｏｌ ） などの還元用
試薬を加えて還元し、更にケルクロマトグラフィーで精
製してチオール化ベルオキシターセを得ることができる
。
ベルオキシターセと抗体とを結合させる化合物として、
一般式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
される化合物を用いるが、上記式中、Ｒて表わされる２
価の６員環状炭化水素残基としては、飽和のもの、不飽
和のもののいずれてもよい。飽和の２価の６員環状炭化
水素の例としては、たとえば１．２−．１．８−＋ １
．４−シクロヘキシレンが挙げられ、不飽和の２価の６
＠環状炭化水素残基の例としては、たとえば１．２−＋
１．８−．１．４〜フエニレンなどが挙げられる。
一般式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
される化合物を用いるが、上記式中、Ｒて表わされる２
価の６員環状炭化水素残基としては、飽和のもの、不飽
和のもののいずれてもよい。飽和の２価の６員環状炭化
水素の例としては、たとえば１．２−．１．８−＋ １
．４−シクロヘキシレンが挙げられ、不飽和の２価の６
＠環状炭化水素残基の例としては、たとえば１．２−＋
１．８−．１．４〜フエニレンなどが挙げられる。
該化合物［１）において、ｎとしては工ないし５の整数
が好ましく、特に１が好ましい。Ｒとしては２価の６＠
環状炭化水素残基が好ましく、特に１，４−シクロヘキ
シレンが好マしい。
が好ましく、特に１が好ましい。Ｒとしては２価の６＠
環状炭化水素残基が好ましく、特に１，４−シクロヘキ
シレンが好マしい。
本発明の方法において用いられる化合物〔■〕は、たと
えばす・ジャーナル・オフ・ノーイオケミストリ−（Ｔ
ｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ） 第７９巻２３３頁（１９７６年）、ヨーロピア
ン・ジャーナル・オフ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏ
ｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ）第１０１巻３９５頁（１９７９年）、特開昭５
２−８５１６３号公報、特開昭５２−８５１’６４号公
報等に記載の方法あるいはこれらの方法に準じて製造す
ることができる。たとえば、一般式 Ｅ式中、Ｘは水酸基またはハロゲン原子を示す。
えばす・ジャーナル・オフ・ノーイオケミストリ−（Ｔ
ｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ） 第７９巻２３３頁（１９７６年）、ヨーロピア
ン・ジャーナル・オフ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏ
ｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ）第１０１巻３９５頁（１９７９年）、特開昭５
２−８５１６３号公報、特開昭５２−８５１’６４号公
報等に記載の方法あるいはこれらの方法に準じて製造す
ることができる。たとえば、一般式 Ｅ式中、Ｘは水酸基またはハロゲン原子を示す。
ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わされるマ
レイミド化合物〔■〕と一般式 〔式中、Ｙは水素原子またはアルカリ金属原子を示す。
レイミド化合物〔■〕と一般式 〔式中、Ｙは水素原子またはアルカリ金属原子を示す。
〕で表わされるサクシノイミド化合物〔■〕とを脱水剤
あるいは脱酸剤の存在下で反応させることにより製造す
ることかできる。上記一般式において、ハロゲン原子と
しては塩素、臭素などが挙げられ、アルカリ金属原子と
してはたとえばナトリウム、カリウムなどが挙げられる
。また反応に用いられる脱水剤としてはたとえば、硫駿
。
あるいは脱酸剤の存在下で反応させることにより製造す
ることかできる。上記一般式において、ハロゲン原子と
しては塩素、臭素などが挙げられ、アルカリ金属原子と
してはたとえばナトリウム、カリウムなどが挙げられる
。また反応に用いられる脱水剤としてはたとえば、硫駿
。
ンノクロヘキシルカルホンイ２ドなどが、脱酸剤として
はたとえばピリジノ、トリエチルアミンなどが挙げられ
る。
はたとえばピリジノ、トリエチルアミンなどが挙げられ
る。
前記化合物〔■〕は、たとえば特開昭５２−８５１６４
号公報に記載の方法あるいはこれに準して製造すること
ができる。たとえば一般式％式％ 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
される化合物（ＩＶ）を脱水閉環せしめることにより得
られる。該脱水閉環させるには、脱水剤たとえば無水酢
酸又は無水酢酸と酢酸ナトリウム（無水物）を用い、温
和に加熱することにより反応させることができる。 ″ さらに別法として、ヘルヘティカ・キミ力・アクタ（Ｈ
ｅ１ｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ ＡｃＬａ ）第５
８巻（１９７５年）５３１頁に記載されている方法ある
いはこれに準じて製造することができる。たとえば、一
般式 〔式中、Ｚはアルキル基を示す〕で表わされるＮ−アル
コキシカルボニルマレイ芝ト［Ｖ］と、一般式 ％式％ 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
されるアミノ酸ＣＶＩＩ）とを反応させて、一般式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
されるマレイミド化合物〔■〕を得る。次ニ一般式ＣＩ
ＩＩ ］で表わされるサクシンイミド化合物［１１１）
を加え先に述べたと同様の脱水剤もしくは脱酸剤の存在
下で反応させることにより製造することができる。
号公報に記載の方法あるいはこれに準して製造すること
ができる。たとえば一般式％式％ 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
される化合物（ＩＶ）を脱水閉環せしめることにより得
られる。該脱水閉環させるには、脱水剤たとえば無水酢
酸又は無水酢酸と酢酸ナトリウム（無水物）を用い、温
和に加熱することにより反応させることができる。 ″ さらに別法として、ヘルヘティカ・キミ力・アクタ（Ｈ
ｅ１ｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ ＡｃＬａ ）第５
８巻（１９７５年）５３１頁に記載されている方法ある
いはこれに準じて製造することができる。たとえば、一
般式 〔式中、Ｚはアルキル基を示す〕で表わされるＮ−アル
コキシカルボニルマレイ芝ト［Ｖ］と、一般式 ％式％ 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
されるアミノ酸ＣＶＩＩ）とを反応させて、一般式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
されるマレイミド化合物〔■〕を得る。次ニ一般式ＣＩ
ＩＩ ］で表わされるサクシンイミド化合物［１１１）
を加え先に述べたと同様の脱水剤もしくは脱酸剤の存在
下で反応させることにより製造することができる。
上記一般式〔■〕で表わされる化合物においてＺで表わ
されるアルキルとしては、たとえばメチル、エチルが挙
げられる。
されるアルキルとしては、たとえばメチル、エチルが挙
げられる。
ベルオキシターセに化合物〔Ｉ〕を反応させるには、両
者をｐＨ約６ないし８の緩衝液中で約１０ないし５０°
Ｃの温塵で約１０分ないし２４時間反応させることによ
って行なわれる。該緩衝液としては、たとえばｐＨ７，
０の０．１ Ｍ ’）ン酸緩衝液。
者をｐＨ約６ないし８の緩衝液中で約１０ないし５０°
Ｃの温塵で約１０分ないし２４時間反応させることによ
って行なわれる。該緩衝液としては、たとえばｐＨ７，
０の０．１ Ｍ ’）ン酸緩衝液。
ｐＨ６，３の０．０５Ｍ’Ｊン酸緩衝液などが挙げられ
る。
る。
このようにして得られたマレイミド化ベルオキシターセ
の精製は、たとえばゲルクロマトグラフィーなどにより
行なうことができる。該ゲルクロマトグラフィーを行な
う際に用いられる担体としてはたとえばセファテックス
Ｇ−２５〔ファルマシア・ファインケミカル社（スエー
テノ）製〕。
の精製は、たとえばゲルクロマトグラフィーなどにより
行なうことができる。該ゲルクロマトグラフィーを行な
う際に用いられる担体としてはたとえばセファテックス
Ｇ−２５〔ファルマシア・ファインケミカル社（スエー
テノ）製〕。
バイオケルＰ−２〔バイオ・ランド・ラホラトリーズ社
（米国）製〕などが挙げられる。
（米国）製〕などが挙げられる。
マレイミド化ベルオキソターセを抗ＣＥＡ抗体と反応さ
せる場合、抗ＣＥＡ抗体工ｇＧあるいはペプシン分解し
て得られたＦ（ｎｂ’）２両分を、メルカプトエチルア
ミン類の存在下で還元し、ケルクロマトクラフィーによ
って精製された抗ＣＥＡ抗体ＩｇＧもしくはＦａｂ’
とマレイミド化ベルオキシターセとを反応させる。
せる場合、抗ＣＥＡ抗体工ｇＧあるいはペプシン分解し
て得られたＦ（ｎｂ’）２両分を、メルカプトエチルア
ミン類の存在下で還元し、ケルクロマトクラフィーによ
って精製された抗ＣＥＡ抗体ＩｇＧもしくはＦａｂ’
とマレイミド化ベルオキシターセとを反応させる。
該反応は、両者を緩衝液中で約０°Ｃないし４０℃の温
度で、約１ないし４８時間反応させることにより行なう
ことができる。該緩衝液としては、たとえばｐ Ｈ６，
０の５ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む
Ｑ、 Ｉ Ｍ ＩＪノ酸緩衝液などが挙げられる。
度で、約１ないし４８時間反応させることにより行なう
ことができる。該緩衝液としては、たとえばｐ Ｈ６，
０の５ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む
Ｑ、 Ｉ Ｍ ＩＪノ酸緩衝液などが挙げられる。
このようにして得られたベルオキシターセ標識抗体は、
たとえばゲルクロマトグラフィーなどにより精製するこ
とができる。該ケルクロマトグラフィーに用いられる担
体としては、たとえばウルトロゲルＡｃＡ４４［ＬＫＢ
社（フランス）製〕、セファクリルＳ−２００［ファル
マシア・ファインケミカル（スエーテン）製〕などが挙
げられる。
たとえばゲルクロマトグラフィーなどにより精製するこ
とができる。該ケルクロマトグラフィーに用いられる担
体としては、たとえばウルトロゲルＡｃＡ４４［ＬＫＢ
社（フランス）製〕、セファクリルＳ−２００［ファル
マシア・ファインケミカル（スエーテン）製〕などが挙
げられる。
匝
本発明の測定方法を以下に具体的に説明する。
まず、■：担体に保持された抗体に、測定すべきＣＥＡ
含有の分析対象物を加えて抗原抗体反応を行った後これ
に前記で得られたベルオキシターセと抗ＣＥＡ抗体との
結合物を加えて反応させる。
含有の分析対象物を加えて抗原抗体反応を行った後これ
に前記で得られたベルオキシターセと抗ＣＥＡ抗体との
結合物を加えて反応させる。
本発明の酵素免疫測定法において測定対象となるＣＥＡ
を含む被検試料としては、尿、血清、血漿、髄液あるい
は各種臓器抽出物等が挙げられ、とりわけ尿、血清およ
び血漿が繁用される。
を含む被検試料としては、尿、血清、血漿、髄液あるい
は各種臓器抽出物等が挙げられ、とりわけ尿、血清およ
び血漿が繁用される。
■：■で得られた反応生成物にベルオキシターセの基質
を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定す
ることにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。
を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定す
ることにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。
■：上記■−■の操作を既知量のＣＥＡの標準溶液に対
し予め行ない、ＣＥＡと吸光度もｌ、 ＜は蛍光強度と
の関係を標準曲線として作成しておく。
し予め行ない、ＣＥＡと吸光度もｌ、 ＜は蛍光強度と
の関係を標準曲線として作成しておく。
■：未知量のＣＥＡを含む分析対象物について得られた
吸光度もしくは蛍光強度を標準曲線にあてはめ、分析対
象物中のＣＥＡ含量を測定する。
吸光度もしくは蛍光強度を標準曲線にあてはめ、分析対
象物中のＣＥＡ含量を測定する。
本発明のサンドイツチ法によるＣＥＡの免疫化学的測定
法に用いられる定量用キットとしては、ＣＡＩ主として
、 （１）担体上に保持された抗ＣＥＡ抗体（２）本発明方
法により得られたベルオキシターセで標識化された抗Ｃ
ＥＡ抗体（化合物〔Ｉ〕を用いて結合されている。） 上記（１）および（２）の２種の抗体のうち少なくとも
−４はモノクローナル抗体である。
法に用いられる定量用キットとしては、ＣＡＩ主として
、 （１）担体上に保持された抗ＣＥＡ抗体（２）本発明方
法により得られたベルオキシターセで標識化された抗Ｃ
ＥＡ抗体（化合物〔Ｉ〕を用いて結合されている。） 上記（１）および（２）の２種の抗体のうち少なくとも
−４はモノクローナル抗体である。
（３）標準ＣＥＡ
（４）上記（２）〜（３）の試薬および被検試料の希釈
に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた約
１０％牛血清および約１％牛血清アルブミン（以下、Ｂ
ＳＡと略称することもある。）を含むｐＨ約６ないし９
のリン酸緩衝液またはグツシン緩衝液が挙げられる。）
。
に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた約
１０％牛血清および約１％牛血清アルブミン（以下、Ｂ
ＳＡと略称することもある。）を含むｐＨ約６ないし９
のリン酸緩衝液またはグツシン緩衝液が挙げられる。）
。
（５）ペルオキシダー老酒性測定に必要な試薬。その−
例として蛍光法の場合、酵素基質としてｐ−ハイドロキ
ンフェニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、０−フェ
ニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用いる
緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停止
液。
例として蛍光法の場合、酵素基質としてｐ−ハイドロキ
ンフェニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、０−フェ
ニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用いる
緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停止
液。
が挙げられる。
ＣＢ’）主として、
（１） 担体上に保持された抗ＣＥＡ抗体。
（２）本発明方法により得られたベルオキシターセで標
識化された抗ＣＥＡ抗体（チオール化されたベルオキシ
ターセと抗ＣＥＡ抗体とが化合物〔■〕を用いて結合さ
れている。）。
識化された抗ＣＥＡ抗体（チオール化されたベルオキシ
ターセと抗ＣＥＡ抗体とが化合物〔■〕を用いて結合さ
れている。）。
（３）標準ＣＥＡ。
（４）上記（２）〜（３）の試薬および被検試料の希釈
に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた約
１０％ヒツジ血清および約１％牛血清アルブミン（以下
、ＢＳＡと略称することもある。）を含むｐＨ約６ない
し９のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げられる
。）。
に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた約
１０％ヒツジ血清および約１％牛血清アルブミン（以下
、ＢＳＡと略称することもある。）を含むｐＨ約６ない
し９のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げられる
。）。
（５）ベルオキシターゼ活性測定に必要な試薬。その−
例として蛍光法の場合、酵素基質としてｐ−ハイドロキ
シフェニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、Ｏ−フェ
ニレンシアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用いる
緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停止
液。
例として蛍光法の場合、酵素基質としてｐ−ハイドロキ
シフェニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、Ｏ−フェ
ニレンシアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用いる
緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停止
液。
が挙げられる。
さらに〔Ｃ〕主として、
（１）担体上に保持された抗ＣＥＡ抗体。
（２）本発明方法により得られたベルオキシターセで標
識化された抗ＣＥＡ抗体（チオール化されたベルオキシ
ターセと抗ＣＥＡ抗体とが化合物〔■〕を用いて結合さ
れている。） 上記（１）および（２）の２種の抗体のうち少なくとも
一方はモノクローナル抗体である。
識化された抗ＣＥＡ抗体（チオール化されたベルオキシ
ターセと抗ＣＥＡ抗体とが化合物〔■〕を用いて結合さ
れている。） 上記（１）および（２）の２種の抗体のうち少なくとも
一方はモノクローナル抗体である。
（３）標準ＣＥＡ。
（４）上記（２）〜（３）の試薬および被検試料の希釈
に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた約
１０％ヒツジ血清および約１％牛血清アルブミンく以下
、ＢＳＡと略称することもある。）を含むｐＨ約６ない
し９のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げられる
。） （５）ベルオキシターセ活性測定に必要な試薬。その−
例として蛍光法の場合、酵素基質としてＰ−ハイドロキ
シフェニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、０−フェ
ニレンシアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用いる
緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停止
液。
に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた約
１０％ヒツジ血清および約１％牛血清アルブミンく以下
、ＢＳＡと略称することもある。）を含むｐＨ約６ない
し９のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げられる
。） （５）ベルオキシターセ活性測定に必要な試薬。その−
例として蛍光法の場合、酵素基質としてＰ−ハイドロキ
シフェニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、０−フェ
ニレンシアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用いる
緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停止
液。
が挙げられる。
上記のキットは例えば下記の方法により使用することが
できる。
できる。
標準ＣＥＡもしくは被検夜釣１０ないし２００μｅに試
薬（４）を加えて希釈し、一定量の試薬（１）を加えて
約０ないし４０°Ｃで約１ないし４８時間反応させる。
薬（４）を加えて希釈し、一定量の試薬（１）を加えて
約０ないし４０°Ｃで約１ないし４８時間反応させる。
担体を水洗後、試薬（２）の約１０ないし３００ ｕ、
ｌを加えたのち、約０ないし４００Ｃで反応させる。約
１ないし４８時間反応後、担体を洗浄し担体上に結合し
ているベルオキシダーセ活性を測定する。即ちベルオキ
シターセの基質夜釣１０〜１０００μ４を加えて約２０
〜４０°Ｃで約０２〜２４時間反応させたのち、酵素反
応を停止さセ、反応液中の吸光度もしくは蛍光強度を測
定する。
ｌを加えたのち、約０ないし４００Ｃで反応させる。約
１ないし４８時間反応後、担体を洗浄し担体上に結合し
ているベルオキシダーセ活性を測定する。即ちベルオキ
シターセの基質夜釣１０〜１０００μ４を加えて約２０
〜４０°Ｃで約０２〜２４時間反応させたのち、酵素反
応を停止さセ、反応液中の吸光度もしくは蛍光強度を測
定する。
本発明の免疫化学的分析法用試薬を用いれば、通常の臨
床検査室において簡単な操作でＣＥＡＯ高感度測定が可
能となる。
床検査室において簡単な操作でＣＥＡＯ高感度測定が可
能となる。
実施例
参考例１ 過塩素酸抽出法による精製およびモノクロー
ナル抗体の作製 （１）抗原の精製 Ｋｒｕｐｅｙらの方法〔イムノケミストリー（Ｉｍｍｕ
ｎｏ−Ｃｈｅｍｉ ｓむす）、第９巻（１９７２年）、
第６１７頁〕に準じてＣＥＡを精製した。すなわち大腸
癌組織１００ｇを細断し、これに４００ ｍｌの蒸留水
を加えてホモジナイザーで水冷下１時間破砕して懸濁液
を調製した。次に、等容量の２Ｍ過塩素酸を加えて室温
で３０分間攪拌して抽出した。次に遠心分離し、その上
清について蒸留水に対して透析したのち凍結乾燥した。
ナル抗体の作製 （１）抗原の精製 Ｋｒｕｐｅｙらの方法〔イムノケミストリー（Ｉｍｍｕ
ｎｏ−Ｃｈｅｍｉ ｓむす）、第９巻（１９７２年）、
第６１７頁〕に準じてＣＥＡを精製した。すなわち大腸
癌組織１００ｇを細断し、これに４００ ｍｌの蒸留水
を加えてホモジナイザーで水冷下１時間破砕して懸濁液
を調製した。次に、等容量の２Ｍ過塩素酸を加えて室温
で３０分間攪拌して抽出した。次に遠心分離し、その上
清について蒸留水に対して透析したのち凍結乾燥した。
次に０．１５ Ｍ ＮａＣ１を含む０．０５Ｍリン酸緩
衝液を用いてセファロース４Ｂ１７フアルマシア製（ス
エーデン）〕のカラム（２，８ｃｍｘ１００ｃｍ）にか
けてゲルクロマトグラフィーを行なった。ＣＥＡを含む
フラクションを透析し、凍結乾燥後、更にセファデック
スＧ−２００のカラム（２，８ｃｍＸ １００ｃｍ ）
でゲルクロマトグラフィーを行ない、ＣＥＡ溶出画分を
透析、凍結乾燥してＣＥＡの精製抗原を得た（ ８ ｍ
ｇ）。
衝液を用いてセファロース４Ｂ１７フアルマシア製（ス
エーデン）〕のカラム（２，８ｃｍｘ１００ｃｍ）にか
けてゲルクロマトグラフィーを行なった。ＣＥＡを含む
フラクションを透析し、凍結乾燥後、更にセファデック
スＧ−２００のカラム（２，８ｃｍＸ １００ｃｍ ）
でゲルクロマトグラフィーを行ない、ＣＥＡ溶出画分を
透析、凍結乾燥してＣＥＡの精製抗原を得た（ ８ ｍ
ｇ）。
（２） モノクローナル抗ＣＥＡ抗体の作製前項（１）
で得た精製抗原７０μｇを生理食塩水１５０７７．１に
溶解し、これにフロイツトの完全アジュバント（Ｆｒｅ
ｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ 、
″免疫の生化学、橘ら著、第２６頁、共立出版株式会
社（１９６７年）〕２５０μｌを加えてよく混和して乳
剤を作り、これをＢＡＬＢ／Ｃマウス皮下に投与した。
で得た精製抗原７０μｇを生理食塩水１５０７７．１に
溶解し、これにフロイツトの完全アジュバント（Ｆｒｅ
ｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ 、
″免疫の生化学、橘ら著、第２６頁、共立出版株式会
社（１９６７年）〕２５０μｌを加えてよく混和して乳
剤を作り、これをＢＡＬＢ／Ｃマウス皮下に投与した。
更に、２週毎に２回、フロイントの不完全アジュバント
を用いて免疫し、最終免疫として精製抗原１３０μｇを
生理食塩水に溶解して得た４００μｌを静脈投与し、３
日後牌臓を取り出した。次に、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ
ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｍ Ｅ Ｍ 培地でよく洗浄したの
ち、当該肺細胞Ｉ Ｘ １０８個とマウスミエローマ細
胞（Ｐ８Ｕｌ）２×１０７個とを混合し、７００ ｒｐ
ｍで１５分間遠心してペレットをつくった。次にポリエ
チレングリコール６０００をＲＰＭＩ−１６４０に４５
％に溶解した液０．４ ｍｌを加えて、更にＲＰＭＩ−
１６４０，１５ｍ１を徐々に加えて希釈したのち、７０
０ ｒｐ＋ｎて１５分間遠心分離し、細胞を２０％牛脂
児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地１００ ｍｌに分
散させた。次に２４ウエルの培養プレート〔フロー社製
（米国）〕に上記細胞分散液２． Ｏｍｌずつ注入し、
更に２日目。
を用いて免疫し、最終免疫として精製抗原１３０μｇを
生理食塩水に溶解して得た４００μｌを静脈投与し、３
日後牌臓を取り出した。次に、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ
ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｍ Ｅ Ｍ 培地でよく洗浄したの
ち、当該肺細胞Ｉ Ｘ １０８個とマウスミエローマ細
胞（Ｐ８Ｕｌ）２×１０７個とを混合し、７００ ｒｐ
ｍで１５分間遠心してペレットをつくった。次にポリエ
チレングリコール６０００をＲＰＭＩ−１６４０に４５
％に溶解した液０．４ ｍｌを加えて、更にＲＰＭＩ−
１６４０，１５ｍ１を徐々に加えて希釈したのち、７０
０ ｒｐ＋ｎて１５分間遠心分離し、細胞を２０％牛脂
児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地１００ ｍｌに分
散させた。次に２４ウエルの培養プレート〔フロー社製
（米国）〕に上記細胞分散液２． Ｏｍｌずつ注入し、
更に２日目。
５白目、および８日目に培養上清の半量をＨＡＴ培地に
おきかえた。１４日後における培養上清について抗体価
を測定したところ、計１２０ウェル中１２ウェルに陽性
を認めた。
おきかえた。１４日後における培養上清について抗体価
を測定したところ、計１２０ウェル中１２ウェルに陽性
を認めた。
次に、これら陽性ハイブリドーマのりＣ−ニングを牛胎
児血清２０％およびＢＡＬＢ／Ｃマウス胸腺細胞をフィ
ーター（ｆｅｅｄｅｒ ）として加えた。
児血清２０％およびＢＡＬＢ／Ｃマウス胸腺細胞をフィ
ーター（ｆｅｅｄｅｒ ）として加えた。
ＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈し、限界希釈（ｌｉｍ−
ｉＬｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ）法を繰り返して行な
い最終的にはモノクローナル抗ＣＥＡ抗体を産生する１
２種類のハイブリドーマが得られた。これらを鉱油で処
理されたＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に゛注入−し、２
〜３週間後に腹水を採取することにより、モノクローナ
ル抗ＣＥＡ抗体を得た。これらのモノクローナル抗体を
硫酸アンモニウム法で塩析し、それぞれグロブリン画分
を得た（ＭＱ〜に１〜ＭＯ〜に１２）。
ｉＬｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ）法を繰り返して行な
い最終的にはモノクローナル抗ＣＥＡ抗体を産生する１
２種類のハイブリドーマが得られた。これらを鉱油で処
理されたＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に゛注入−し、２
〜３週間後に腹水を採取することにより、モノクローナ
ル抗ＣＥＡ抗体を得た。これらのモノクローナル抗体を
硫酸アンモニウム法で塩析し、それぞれグロブリン画分
を得た（ＭＱ〜に１〜ＭＯ〜に１２）。
参考例２ 過ヨウ素酸架橋法
伸根らの方法〔す・ジャーナル・オブ・ヒストケミスト
リー・アンド・サイトケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ ＨｉｓＬｏｃｈｅｍｉ８Ｌｒｙ ａｎｄ
Ｃｙｔｏｃｈｅ−ｍｉｓもｒｙ ）第２２巻（１９７
４年）第１０８４頁〕に従って行なった。７ｍｇの西洋
わさびベルオキシターセを１ ｍＬの０．３ Ｍ重炭酸
ナトリウム溶液（ｐＨ８１）にとかし、０．１ ａｔの
１％１−フルオロ−２，４−ジニトロヘノセンを加えて
室温で１時間反応させた。次に０．０６ Ｍ Ｎａ Ｉ
Ｏ２１ｍｌを加えて室温で３０分間攪拌したのち、０．
１６Ｍエチレングリコール水溶液１ ａｔを加えて室温
で１時間放置した。０．０１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ９，５）に対して１夜透析した。
リー・アンド・サイトケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ ＨｉｓＬｏｃｈｅｍｉ８Ｌｒｙ ａｎｄ
Ｃｙｔｏｃｈｅ−ｍｉｓもｒｙ ）第２２巻（１９７
４年）第１０８４頁〕に従って行なった。７ｍｇの西洋
わさびベルオキシターセを１ ｍＬの０．３ Ｍ重炭酸
ナトリウム溶液（ｐＨ８１）にとかし、０．１ ａｔの
１％１−フルオロ−２，４−ジニトロヘノセンを加えて
室温で１時間反応させた。次に０．０６ Ｍ Ｎａ Ｉ
Ｏ２１ｍｌを加えて室温で３０分間攪拌したのち、０．
１６Ｍエチレングリコール水溶液１ ａｔを加えて室温
で１時間放置した。０．０１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ９，５）に対して１夜透析した。
後述の実施例１−（２）で得られたモノクローナル抗Ｃ
ＥＡ抗体カンマ・グロブリンフラクション（Ｍｏ−Ｔ３
）５ｍｇをＱ、ＯＩＭ、炭酸ナトリウム緩衝液（ＪＩＨ
９，５） １ ｒｎＬにとかし、先に調製したアルデヒ
ドペルオキシダー士と混合して室温で３時間反応させて
から、５ ｍｇの水素化硼素ナトリウムに加えて４°Ｃ
で１夜反応させた。０．１５ Ｍ ＮａＣ１を含む０．
０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，１）に対して４℃で１夜
透析した後、ウルトロケルＡｃＡ４４を充てんしたカラ
ム（１，５ｃ＋ｎＸ４５ｃｍ）を用いるゲルクロマトグ
ラフィーにかけ、０１Ｍリン酸緩衝液 （ｐＨ６，５）
で溶出させた。後述の実施例１−（５）と同様に溶出液
の２８０および４０，３ｎｍの吸光度ならびに酵素活性
を測定して目的フラクションを分取した。得られたモノ
クローナル抗ＣＥＡ抗体−ＨＲＰ複合体はＢＳＡとして
０．１％、マーチオレートとして０．００５％になるよ
うにして４℃で保存した。
ＥＡ抗体カンマ・グロブリンフラクション（Ｍｏ−Ｔ３
）５ｍｇをＱ、ＯＩＭ、炭酸ナトリウム緩衝液（ＪＩＨ
９，５） １ ｒｎＬにとかし、先に調製したアルデヒ
ドペルオキシダー士と混合して室温で３時間反応させて
から、５ ｍｇの水素化硼素ナトリウムに加えて４°Ｃ
で１夜反応させた。０．１５ Ｍ ＮａＣ１を含む０．
０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，１）に対して４℃で１夜
透析した後、ウルトロケルＡｃＡ４４を充てんしたカラ
ム（１，５ｃ＋ｎＸ４５ｃｍ）を用いるゲルクロマトグ
ラフィーにかけ、０１Ｍリン酸緩衝液 （ｐＨ６，５）
で溶出させた。後述の実施例１−（５）と同様に溶出液
の２８０および４０，３ｎｍの吸光度ならびに酵素活性
を測定して目的フラクションを分取した。得られたモノ
クローナル抗ＣＥＡ抗体−ＨＲＰ複合体はＢＳＡとして
０．１％、マーチオレートとして０．００５％になるよ
うにして４℃で保存した。
実施例 １
（１）抗原の精製
大腸癌組織２００ｇを細断し、これに６００ ｍｌの１
％Ｔｗｅｅｎ ２０ 〔ングマ社（米国）製〕を含む０
、１５ Ｍ ＮａＣ１溶液を加えてホモジナイザーで水
冷下１０分間破砕して懸濁液を調製した。さらに超音波
発生機で水冷下１時間処理したのち、１２゜０００ｒｐ
ｍ２０分間遠心分離した。上清を蒸留水に対して透析し
たのち凍結乾燥した。次に０．２Ｍクエン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，５）に溶解し、同じ緩衝液を用いて調製したコン
カナバリンＡ結合セファロース４Ｂ〔ファルマシア製（
スエーテン）〕のカラム（２，２ｃｍ Ｘ ２６ ｃｍ
）にかけた。カラムに保持された物質をα−メチル−
Ｄ−マンノサイトを含む緩衝液を用いて溶出した。蒸留
水に対して透析したのち凍結乾燥した。次に０．２ Ｍ
クエン酸緩衝液（ｐＨ６，５）を用いてウルトロゲルＡ
ｃＡ−３４〔Ｌ谷Ｂ社製（フランス）〕のカラム（２，
：ｌｌｃ＋ｎＸ１００ｃｍ）にかけてゲルクロマトグラ
フィーを行ない、２８０〜８５０ ｍｌの画分を蒸留水
に対して透析し、凍結乾燥してＣＥＡの精製抗原を得た
（５ ｍｇ ）。
％Ｔｗｅｅｎ ２０ 〔ングマ社（米国）製〕を含む０
、１５ Ｍ ＮａＣ１溶液を加えてホモジナイザーで水
冷下１０分間破砕して懸濁液を調製した。さらに超音波
発生機で水冷下１時間処理したのち、１２゜０００ｒｐ
ｍ２０分間遠心分離した。上清を蒸留水に対して透析し
たのち凍結乾燥した。次に０．２Ｍクエン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，５）に溶解し、同じ緩衝液を用いて調製したコン
カナバリンＡ結合セファロース４Ｂ〔ファルマシア製（
スエーテン）〕のカラム（２，２ｃｍ Ｘ ２６ ｃｍ
）にかけた。カラムに保持された物質をα−メチル−
Ｄ−マンノサイトを含む緩衝液を用いて溶出した。蒸留
水に対して透析したのち凍結乾燥した。次に０．２ Ｍ
クエン酸緩衝液（ｐＨ６，５）を用いてウルトロゲルＡ
ｃＡ−３４〔Ｌ谷Ｂ社製（フランス）〕のカラム（２，
：ｌｌｃ＋ｎＸ１００ｃｍ）にかけてゲルクロマトグラ
フィーを行ない、２８０〜８５０ ｍｌの画分を蒸留水
に対して透析し、凍結乾燥してＣＥＡの精製抗原を得た
（５ ｍｇ ）。
（２）モノクローナル抗ＣＥＡ抗体の作製前項（１）で
得た精製抗原７０μｇを生理食塩水１５０μｌに溶解し
、これにフロイントの完全アジュバント〔Ｆｒｅｕｎｄ
’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ 、 ”免
疫の生化学“、橘ら著、第２６頁、共立出版株式会社（
１９６７年）〕２５０μｌを加えてよく混和して乳剤を
作り、これをＢＡＬＢ／Ｃマウス皮下に投与した。更に
、２週毎に２回、フロイントの不完全アジュバントを用
いて免疫し、最終免疫として精製抗原１３０μｇを生理
食塩水に溶解して得た４００μｔに静脈投与し、３日後
牌臓を取り出した。
得た精製抗原７０μｇを生理食塩水１５０μｌに溶解し
、これにフロイントの完全アジュバント〔Ｆｒｅｕｎｄ
’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ 、 ”免
疫の生化学“、橘ら著、第２６頁、共立出版株式会社（
１９６７年）〕２５０μｌを加えてよく混和して乳剤を
作り、これをＢＡＬＢ／Ｃマウス皮下に投与した。更に
、２週毎に２回、フロイントの不完全アジュバントを用
いて免疫し、最終免疫として精製抗原１３０μｇを生理
食塩水に溶解して得た４００μｔに静脈投与し、３日後
牌臓を取り出した。
次に、Ｄｕｌｔ＋ｅｃｃｒ＋’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ
Ｍ Ｅ Ｍ培地でよく洗浄したのち、当該肺細胞１×１
０個とマウスミエローマ細胞（ＰａＵ＋） ２ ｘ １
ｏ７個とを混合し、７００ｒｌ１ｍで１５分間遠心して
ペレットをつくった。次にポリエチレングリコール６０
００をＲＰＭＩ−１６４０に４５％に溶解した液０．４
ｒａｔを加えて、更にＲＰＭＩ−１６４０１５ｔａＬ
を徐々に加えて希釈したのち、７００ ｒｐｍで１５分
間遠心分離し、細胞を２０％牛脂児血清を含むＲＰ’Ｍ
Ｉ−１６４０散液２． Ｏｍｌずつ注入し、更に２白目
、５日目、および８日日に培養上清の半量をＨＡＴ培地
におきえた。１４日後における培養上清について抗体価
を測定したところ、計７２ウェル中９ウェルに陽性を認
めた。
Ｍ Ｅ Ｍ培地でよく洗浄したのち、当該肺細胞１×１
０個とマウスミエローマ細胞（ＰａＵ＋） ２ ｘ １
ｏ７個とを混合し、７００ｒｌ１ｍで１５分間遠心して
ペレットをつくった。次にポリエチレングリコール６０
００をＲＰＭＩ−１６４０に４５％に溶解した液０．４
ｒａｔを加えて、更にＲＰＭＩ−１６４０１５ｔａＬ
を徐々に加えて希釈したのち、７００ ｒｐｍで１５分
間遠心分離し、細胞を２０％牛脂児血清を含むＲＰ’Ｍ
Ｉ−１６４０散液２． Ｏｍｌずつ注入し、更に２白目
、５日目、および８日日に培養上清の半量をＨＡＴ培地
におきえた。１４日後における培養上清について抗体価
を測定したところ、計７２ウェル中９ウェルに陽性を認
めた。
次に、これら陽性ハイフリドーマのクローニングを牛胎
児血清２０％およびＢＡＬＢ／Ｃマウス胸腺細胞をフィ
ークー（ｆｅｅｄｅｒ ）として加えたＲＰＭＩ−１６
４０培地で希釈し、限界希釈（１１−ｍｉｔｉｎｇ ｄ
ｉｌｕＬｉｏ口）法を繰り返して行ない最終的にはモノ
クローナル抗ＣＥＡ抗体を産生ずる５種類のハイブリド
ーマが得られた。これらを鉱油で処理されたＢＡＬＢ／
Ｃマウスの腹腔内に注入し、２〜３週間後に腹水を採取
することにより、モノクローナル抗ＣＥＡ抗体を得た。
児血清２０％およびＢＡＬＢ／Ｃマウス胸腺細胞をフィ
ークー（ｆｅｅｄｅｒ ）として加えたＲＰＭＩ−１６
４０培地で希釈し、限界希釈（１１−ｍｉｔｉｎｇ ｄ
ｉｌｕＬｉｏ口）法を繰り返して行ない最終的にはモノ
クローナル抗ＣＥＡ抗体を産生ずる５種類のハイブリド
ーマが得られた。これらを鉱油で処理されたＢＡＬＢ／
Ｃマウスの腹腔内に注入し、２〜３週間後に腹水を採取
することにより、モノクローナル抗ＣＥＡ抗体を得た。
これらのモノクローナル抗体を硫酸アンモニウム法で塩
析し、それぞれグロフリン画分を得た（Ｍｏ−Ｔ＋−Ｍ
Ｏ−Ｔ６）。
析し、それぞれグロフリン画分を得た（Ｍｏ−Ｔ＋−Ｍ
Ｏ−Ｔ６）。
（３）ポリクローナル抗ＣＥＡ抗体の作製前項（１）で
得た精製抗原２ ｍｇを生理食塩水１ ａｔに溶解し、
これにフロイントの完全アジュバントＩＩ＋ｌＬを加え
てよく混和して乳剤を作り、これをウサキの両大關部筋
肉内および背部皮下数箇所に注射した。以上の操作を３
週毎に５回行ない最終免疫後１週間で採血して抗血清を
得た。硫酸アンモニウム法で塩析してグロブリン画分を
調製したのち、ＣＥＡ結合セファロース４Ｂのカラムを
用いるアフィニティ・クロマトクラフィーに供した。カ
ラムに保持された抗体画分を０．１７Ｍグリシン−塩酸
緩衝液（ｐＨ２，８）で溶出することにより、 ＣＥＡ
に強い親和性を有するポリクローナル抗体を得た。
得た精製抗原２ ｍｇを生理食塩水１ ａｔに溶解し、
これにフロイントの完全アジュバントＩＩ＋ｌＬを加え
てよく混和して乳剤を作り、これをウサキの両大關部筋
肉内および背部皮下数箇所に注射した。以上の操作を３
週毎に５回行ない最終免疫後１週間で採血して抗血清を
得た。硫酸アンモニウム法で塩析してグロブリン画分を
調製したのち、ＣＥＡ結合セファロース４Ｂのカラムを
用いるアフィニティ・クロマトクラフィーに供した。カ
ラムに保持された抗体画分を０．１７Ｍグリシン−塩酸
緩衝液（ｐＨ２，８）で溶出することにより、 ＣＥＡ
に強い親和性を有するポリクローナル抗体を得た。
（４）モノクローナル抗体の反応性の比較前項（２）お
よび参考例１で得られた各種モノクローナル抗体のＣＥ
Ａおよび関連抗原に対する反応性を調へた。
よび参考例１で得られた各種モノクローナル抗体のＣＥ
Ａおよび関連抗原に対する反応性を調へた。
試薬：
■ 前項（２）および参考例１で得られたモノクローナ
ル抗ＣＥＡ抗体感作マイクロプレート■ 西洋わさびベ
ルオキシダーセ （以下ＨＲＰと略称する）標識抗ＣＢ
Ａ抗体複合体（ＤＡＫＯＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（
テンマーク）］■ ＣＥＡおよびＣＥＡ関連抗原 ■ 緩衝液Ｂ（１０％子牛血清、０．１５Ｍ ＮａＣ１
を含むｐＨ７，０の０．０２Ｍ’Ｊン酸緩衝液）、緩衝
Ａ （０，１５ＭＮａＣｌを含むｐ）（７，０の０．０
２Ｍ リン酸緩衝液） ■ ベルオキシターセ活性測定に必要な試薬００２％過
酸化水素と０１５％０−フェニレンジアミンを含むｐ
Ｈ４，８の０，１Ｍクエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝
液および反応停止液（２Ｎ−硫酸）。
ル抗ＣＥＡ抗体感作マイクロプレート■ 西洋わさびベ
ルオキシダーセ （以下ＨＲＰと略称する）標識抗ＣＢ
Ａ抗体複合体（ＤＡＫＯＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（
テンマーク）］■ ＣＥＡおよびＣＥＡ関連抗原 ■ 緩衝液Ｂ（１０％子牛血清、０．１５Ｍ ＮａＣ１
を含むｐＨ７，０の０．０２Ｍ’Ｊン酸緩衝液）、緩衝
Ａ （０，１５ＭＮａＣｌを含むｐ）（７，０の０．０
２Ｍ リン酸緩衝液） ■ ベルオキシターセ活性測定に必要な試薬００２％過
酸化水素と０１５％０−フェニレンジアミンを含むｐ
Ｈ４，８の０，１Ｍクエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝
液および反応停止液（２Ｎ−硫酸）。
抗体感作マイクロプレートの調！ｌｌ！：ＥＩＡ用イム
ノプレート■〔ヌンク社（テンマーク）製〕の各ウェル
に０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９６）で希釈して調製した
前項（２）あるいは参考例１のモノクローナル抗ＣＥＡ
抗体溶液（５０Ｍｇ／ｍＬ ）を１００１Ｌｅずつ注入
して４℃で一夜放置して感作させた。０．１％ＢＳＡを
含む０．０１Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，ｏ）で洗浄し
たのち、用時まで冷所保存した。
ノプレート■〔ヌンク社（テンマーク）製〕の各ウェル
に０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９６）で希釈して調製した
前項（２）あるいは参考例１のモノクローナル抗ＣＥＡ
抗体溶液（５０Ｍｇ／ｍＬ ）を１００１Ｌｅずつ注入
して４℃で一夜放置して感作させた。０．１％ＢＳＡを
含む０．０１Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，ｏ）で洗浄し
たのち、用時まで冷所保存した。
測定：
緩衝液Ｂに溶解させたＣＥＡ標準溶液１００μｌを各ウ
ェルに注入し、３７°Ｃて３時間反応させた。
ェルに注入し、３７°Ｃて３時間反応させた。
各ウェルを緩衝液Ａて洗浄後、ＨＲＰ標識抗ＣＥＡ複合
体溶液（ＨＲＰとして３０１ｇ／ウェル）１００μｌを
加えて２５°Ｃて３５時間さらに反応させた。緩衝液Ａ
で洗浄し、これに０．０２％過酸化７Ｊ（ｉと０１５％
０−フェニレンジミンヲ含ム０、１ Ｍクエン酸−リン
酸二ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，８）１００μ４を加え
て３０°Ｃて３０分間反応させ、２Ｎ−硫酸１００μｅ
ずつ加えて反応を停止させてから、マイクロプレート用
自動比色計〔タイターチック・マルチスキャノ；フロー
社（米国）製〕を用い、ブランクを対照にして４９０
ｎｍにおける吸光度を測定した。
体溶液（ＨＲＰとして３０１ｇ／ウェル）１００μｌを
加えて２５°Ｃて３５時間さらに反応させた。緩衝液Ａ
で洗浄し、これに０．０２％過酸化７Ｊ（ｉと０１５％
０−フェニレンジミンヲ含ム０、１ Ｍクエン酸−リン
酸二ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，８）１００μ４を加え
て３０°Ｃて３０分間反応させ、２Ｎ−硫酸１００μｅ
ずつ加えて反応を停止させてから、マイクロプレート用
自動比色計〔タイターチック・マルチスキャノ；フロー
社（米国）製〕を用い、ブランクを対照にして４９０
ｎｍにおける吸光度を測定した。
結果を第１表に示したが、前記（２）で得られたモノク
ローナル抗ＣＥＡ抗体は、６抗体中４抗体てＣＥＡ関連
抗原であるＮ ＣＡ （ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｒ
ｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ ）やＮ
ＣＡ −２（ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃｃｒｏｓｓｒｅａ
ｃｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ−２） と反応せず、した
がって高い確率でＣＥＡに特異的なモノクローナル抗Ｃ
ＥＡ抗体の得られることが分った。一方、参考例１て得
られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体は１２抗体中１抗体
（ＭＯ−に６）たけかＮＣＡならびにＮＣＡ−２とは反
応せず残りの１１抗体はこれらのＣＥＡ関連抗原と反応
した。
ローナル抗ＣＥＡ抗体は、６抗体中４抗体てＣＥＡ関連
抗原であるＮ ＣＡ （ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｒ
ｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ ）やＮ
ＣＡ −２（ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃｃｒｏｓｓｒｅａ
ｃｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ−２） と反応せず、した
がって高い確率でＣＥＡに特異的なモノクローナル抗Ｃ
ＥＡ抗体の得られることが分った。一方、参考例１て得
られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体は１２抗体中１抗体
（ＭＯ−に６）たけかＮＣＡならびにＮＣＡ−２とは反
応せず残りの１１抗体はこれらのＣＥＡ関連抗原と反応
した。
（以下余白）
第１表
ＭＯ−Ｋｌ−、＋＋
に２ − ＋ ＋
に３ ＋ ＋ ＋
に４ − − ＋
に５ − ＋ ＋
に６ − − −
に７ ＋ ＋ ＋
に８ ＋ ＋ −１−
に９ ＋ ＋ ＋
ＫＩＯ−−＋
Ｋｌｌ −−＋ ＋
に１２ − ＋ ＋
ＭＱ −Ｔ Ｉ ＋ ＋ ＋
Ｔ２ − − −
Ｔ８ − − −
Ｔ４ −− − −
Ｔ５ →−＋ ＋
Ｔ６ − −− −
＋２反応性あり −：反応性なし
く５）ポリクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’） ＨＲ
Ｐ複合体の製造 （ａ） マレイミド基の導入 ６ ｍｇの西洋わさびベルオキシターセ〔べ−ＩＪ ’
７ガーマンハイム社（西ドイツ）製〕を１ ｍｌの０１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、５０ｕ、（１
のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドにとかした結合試薬Ｍ
ＭＣ（一般式ＣＩ）において、ｎ−１，Ｒ＝シクロへキ
シレノである化合物） ４．８ ｍｇを加えて３０６Ｃ
で６０分間攪拌しながら反応させた。
Ｐ複合体の製造 （ａ） マレイミド基の導入 ６ ｍｇの西洋わさびベルオキシターセ〔べ−ＩＪ ’
７ガーマンハイム社（西ドイツ）製〕を１ ｍｌの０１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、５０ｕ、（１
のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドにとかした結合試薬Ｍ
ＭＣ（一般式ＣＩ）において、ｎ−１，Ｒ＝シクロへキ
シレノである化合物） ４．８ ｍｇを加えて３０６Ｃ
で６０分間攪拌しながら反応させた。
生成した沈殿を遠心分離して除去し、上清をセファテッ
クスＧ−２５のカラム（ｔｏｘ４５ｃ＋ｎ）に通し、０
．１ Ｍ ＩＪノ酸緩衝液で溶出させた。タンパクを含
む両分を分取し、コロジオン膜を用いて濃縮した。この
ようにして調製したマレイミド化ベルオキシターセにお
いてベルオキシダーセ１分子あたり導入されたマレイミ
ド基の数は１０〜１．２個であった（ベルオキシターセ
の分子量を４０，０００、Ｅ２８０ｎ″′−２２７５と
して計算）。
クスＧ−２５のカラム（ｔｏｘ４５ｃ＋ｎ）に通し、０
．１ Ｍ ＩＪノ酸緩衝液で溶出させた。タンパクを含
む両分を分取し、コロジオン膜を用いて濃縮した。この
ようにして調製したマレイミド化ベルオキシターセにお
いてベルオキシダーセ１分子あたり導入されたマレイミ
ド基の数は１０〜１．２個であった（ベルオキシターセ
の分子量を４０，０００、Ｅ２８０ｎ″′−２２７５と
して計算）。
１％
（ｂ） マレイミド化ベルオキシダーセと抗ＣＥＡ抗体
（Ｆａｂ’フラグメント）との複合体の製造前項（３）
で得られたポリタローナル抗ＣＥＡ抗体５ ｍｇニ０．
１ ｍｇのペプシンを加え３０°Ｃで一夜反応後、セフ
ァデックスＧ−１５０カラム（直径２．５印、長さ５５
ｃｍ ）で精製した。得られた抗体Ｆ（ａｂ’）２
画分を２−メルカプトエチルアミンで還元し、セファテ
ックスＧ−２５のカラムによるケルクロマトグラフィー
で精製してウサキ抗ＣＥＡ抗体（Ｆｕｂ″フラクメノ１
−）を得た。
（Ｆａｂ’フラグメント）との複合体の製造前項（３）
で得られたポリタローナル抗ＣＥＡ抗体５ ｍｇニ０．
１ ｍｇのペプシンを加え３０°Ｃで一夜反応後、セフ
ァデックスＧ−１５０カラム（直径２．５印、長さ５５
ｃｍ ）で精製した。得られた抗体Ｆ（ａｂ’）２
画分を２−メルカプトエチルアミンで還元し、セファテ
ックスＧ−２５のカラムによるケルクロマトグラフィー
で精製してウサキ抗ＣＥＡ抗体（Ｆｕｂ″フラクメノ１
−）を得た。
上記（ａ）−Ｃ調製したマレイミド化ベルオキシターセ
１５ｍｇを０．１ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，ｏ ）
０１５ｍ１に溶解し、先に得た抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’
フラグメント） １．８ ｍｇをとかした５ｍＭエチ
レンレアミノ四酢酸ナトリウム塩を含む０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ６，０） ０．１５ ｍｌを加えて４℃で
２０時間反応させた。反応後、ウルトロゲルＡｃＡ ４
４を充てんしたカラム（１，５Ｘ ４５ ｃｌｎ）を用
いるゲルクロマトグラフィーにかけ、０．１ Ｍ ＩＪ
ン酸緩衝液（ｐＨ６，５）で溶出させた。溶出液の２８
０ ｎｍの吸光度ならびに酵素活性を測定した。ベルオ
キシターセとウサキ抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’ フラグメ
ント）との複合体が生成していることを、以下の方法で
確認した。
１５ｍｇを０．１ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，ｏ ）
０１５ｍ１に溶解し、先に得た抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’
フラグメント） １．８ ｍｇをとかした５ｍＭエチ
レンレアミノ四酢酸ナトリウム塩を含む０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ６，０） ０．１５ ｍｌを加えて４℃で
２０時間反応させた。反応後、ウルトロゲルＡｃＡ ４
４を充てんしたカラム（１，５Ｘ ４５ ｃｌｎ）を用
いるゲルクロマトグラフィーにかけ、０．１ Ｍ ＩＪ
ン酸緩衝液（ｐＨ６，５）で溶出させた。溶出液の２８
０ ｎｍの吸光度ならびに酵素活性を測定した。ベルオ
キシターセとウサキ抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’ フラグメ
ント）との複合体が生成していることを、以下の方法で
確認した。
まず、酵素活性の測定はギルバルトらの方法（アナリテ
ィカル・ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅ
−ｍｉｓＬｒｙ ） 、第４０巻（１９６８年）、１２
５６頁〕で行なった。即ち、溶出液の各フラクションを
０１％ウシ血清アルブミンを含む０．１ Ｍリン酸緩衝
液（ＰＨ７，０）で１８００倍に希釈した。この１０μ
ｌに０１％ウシ血清アルブミンを含む０．０５Ｍ酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５，０）に溶解した０゜５％Ｐ−
ハイドロキシフェニル酢酸０．２５ ｍＬを加えて混合
し３０°Ｃで５分間インキュベートした。
ィカル・ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅ
−ｍｉｓＬｒｙ ） 、第４０巻（１９６８年）、１２
５６頁〕で行なった。即ち、溶出液の各フラクションを
０１％ウシ血清アルブミンを含む０．１ Ｍリン酸緩衝
液（ＰＨ７，０）で１８００倍に希釈した。この１０μ
ｌに０１％ウシ血清アルブミンを含む０．０５Ｍ酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５，０）に溶解した０゜５％Ｐ−
ハイドロキシフェニル酢酸０．２５ ｍＬを加えて混合
し３０°Ｃで５分間インキュベートした。
次に００１％過酸化水素０．０５ ｍＬを加えて３０°
Ｃで２０分反応させた。０．１ Ｍグリシン緩衝液（ｐ
Ｈ１０，１）２．５１＋ｌｌを加えて酵素反応を停止さ
せ、ｌμｇ ／ｍｌのキニンの蛍光強度を１００とし励
起光３２０ ｎｍにおける４０５ｎｍの蛍光強度を測定
した。
Ｃで２０分反応させた。０．１ Ｍグリシン緩衝液（ｐ
Ｈ１０，１）２．５１＋ｌｌを加えて酵素反応を停止さ
せ、ｌμｇ ／ｍｌのキニンの蛍光強度を１００とし励
起光３２０ ｎｍにおける４０５ｎｍの蛍光強度を測定
した。
結果を第１図に示す。第１図において、−〇−は２８０
ｎｍにおける吸光度を、−一はペルオキシダーゼ活性
（蛍光強度として）をそれぞれ示す。
ｎｍにおける吸光度を、−一はペルオキシダーゼ活性
（蛍光強度として）をそれぞれ示す。
フラクション３８付近においてベルオキシターセと抗Ｃ
ＥＡ抗体（Ｆ ａ ｂ’ フラグメント）との複合体の
生成が極めて良好であるこ之が分かった。
ＥＡ抗体（Ｆ ａ ｂ’ フラグメント）との複合体の
生成が極めて良好であるこ之が分かった。
（６）モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆａ ｂ’ ）
−ＨＲＰ複合体の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体γ−
グロブリンフラクンヨノ（Ｍｏ Ｔ８）５＋＋＋ｐを０
，１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，２） １ ｍｌに溶解し０
２５ ｍｇのペプシンを加え３７°Ｃで一夜反応させる
。
−ＨＲＰ複合体の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体γ−
グロブリンフラクンヨノ（Ｍｏ Ｔ８）５＋＋＋ｐを０
，１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，２） １ ｍｌに溶解し０
２５ ｍｇのペプシンを加え３７°Ｃで一夜反応させる
。
中和後セファデックスＧ−１５０カラム（直径２５ ｃ
ｍ 、長さ５５印）で精製した。得られたＦ （ａ ｂ
’）２画分を２−メルカプトエチルアミンで還元し、セ
ファテックスＧ−２５のカラムによるケルクロマトグラ
フィーで精製してモノクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｔ
ｙ’フラグメント）を得た。
ｍ 、長さ５５印）で精製した。得られたＦ （ａ ｂ
’）２画分を２−メルカプトエチルアミンで還元し、セ
ファテックスＧ−２５のカラムによるケルクロマトグラ
フィーで精製してモノクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｔ
ｙ’フラグメント）を得た。
次ニｉｔｒ 項（５） −（ａ）で調製したマレイミド
化ベルオキシダーセ１．５ ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐ’１６．ｏ ）０、１５ ｒ＋ＬＬに溶解し、先
に得たモノクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’フラグメ
ント） １．８ ｍｇをとかした５ｍＭエチレンジアミ
ン四酢酸ナトリウム塩を含む０．１ Ｍ リ：／酸緩衝
液（ｐＨ６，０） ０．１５ ａｔを加えて４℃で一夜
反応させた。反応後、ウル）・ロゲルＡｃＡ ４４を充
てんしたカラム（１５ｘ４５ｃｍ）を用いるゲルクロマ
トグラフィーにかけ、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６
，５）で溶出させた。前項（５）と同様に溶出液の２８
０ ｎｍの吸光度ならびに酵素活性を測定して目的フラ
クションを分取した。得られたモノクローナル抗ＣＥＡ
抗体（Ｆ ａ １３’ ） −ＨＲＰ複合体はＢＳＡと
して０１％、マーチオレートとして０００５％になるよ
うに調整して４°Ｃで保存した。
化ベルオキシダーセ１．５ ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐ’１６．ｏ ）０、１５ ｒ＋ＬＬに溶解し、先
に得たモノクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’フラグメ
ント） １．８ ｍｇをとかした５ｍＭエチレンジアミ
ン四酢酸ナトリウム塩を含む０．１ Ｍ リ：／酸緩衝
液（ｐＨ６，０） ０．１５ ａｔを加えて４℃で一夜
反応させた。反応後、ウル）・ロゲルＡｃＡ ４４を充
てんしたカラム（１５ｘ４５ｃｍ）を用いるゲルクロマ
トグラフィーにかけ、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６
，５）で溶出させた。前項（５）と同様に溶出液の２８
０ ｎｍの吸光度ならびに酵素活性を測定して目的フラ
クションを分取した。得られたモノクローナル抗ＣＥＡ
抗体（Ｆ ａ １３’ ） −ＨＲＰ複合体はＢＳＡと
して０１％、マーチオレートとして０００５％になるよ
うに調整して４°Ｃで保存した。
（７）モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）−ＨＲＰ
複合体の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体カッ
マグロプリンフラクション（Ｍｏ−Ｔ２）５ｍｇを０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐ）４６．５ ） １ ａｔに溶解
し４０μｅのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドにとがした
結合試薬ＭＭＣ（一般式〔Ｉ〕において、ｎ−１・Ｒ−
シクロヘキシレンである化合物）０．２２ｍ９を加えて
２５°Ｃで４５分間攪拌しながら反応させた。生成した
沈殿を遠心分離して除去し、上清をセファデックスＧ−
２５のカラム（１，ＯＸ４５ｃｍ）に通し、０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ５，３）で溶出させた。タンパクを含
む両分を分取し、コロジオン膜を用いて濃縮した。この
ようにして調製したマレイミド化ＩｇＧにおいて工ｇＧ
１分子あたり導入されたマレイミド基の数は５９個であ
った。
複合体の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体カッ
マグロプリンフラクション（Ｍｏ−Ｔ２）５ｍｇを０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐ）４６．５ ） １ ａｔに溶解
し４０μｅのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドにとがした
結合試薬ＭＭＣ（一般式〔Ｉ〕において、ｎ−１・Ｒ−
シクロヘキシレンである化合物）０．２２ｍ９を加えて
２５°Ｃで４５分間攪拌しながら反応させた。生成した
沈殿を遠心分離して除去し、上清をセファデックスＧ−
２５のカラム（１，ＯＸ４５ｃｍ）に通し、０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ５，３）で溶出させた。タンパクを含
む両分を分取し、コロジオン膜を用いて濃縮した。この
ようにして調製したマレイミド化ＩｇＧにおいて工ｇＧ
１分子あたり導入されたマレイミド基の数は５９個であ
った。
別に、１０ｍｇのＨＲＰを１．４ ｍｌの０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ６，５）に溶解し、１００μｌのエタノ
ールにとかした結合試薬５ＰＤＰ［Ｎ−サクシニミジル
−８−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネ−ト ；
Ｎ −ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−８−（２−ｐｙｒｉ
ｄｙｌｄｉｔｈｉｏ ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｔＪ １．
２５ ｒｎｇを加えて２５℃で８０分間攪拌しながら反
応させた。反応液はセファデックスＧ−２５のカラム（
１，０Ｘ４５Ｃ＋＋１）に通し０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５，０）で溶出させて５ＰＤＰを除去した。次にジチ
オスレイトール（ｄｉＬｈｉｏＬｈｒｅ−ｉＬｏ＋）
１７ ｍｇを加えて還元し、再びセファデックスＧ−２
５のカラム（１，０ｃｍｘ４５ｃｍ）を用いるゲルクロ
マトグラフィーで精製してチオール化ＨＲＰを得た。
酸緩衝液（ｐＨ６，５）に溶解し、１００μｌのエタノ
ールにとかした結合試薬５ＰＤＰ［Ｎ−サクシニミジル
−８−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネ−ト ；
Ｎ −ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−８−（２−ｐｙｒｉ
ｄｙｌｄｉｔｈｉｏ ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｔＪ １．
２５ ｒｎｇを加えて２５℃で８０分間攪拌しながら反
応させた。反応液はセファデックスＧ−２５のカラム（
１，０Ｘ４５Ｃ＋＋１）に通し０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５，０）で溶出させて５ＰＤＰを除去した。次にジチ
オスレイトール（ｄｉＬｈｉｏＬｈｒｅ−ｉＬｏ＋）
１７ ｍｇを加えて還元し、再びセファデックスＧ−２
５のカラム（１，０ｃｍｘ４５ｃｍ）を用いるゲルクロ
マトグラフィーで精製してチオール化ＨＲＰを得た。
次に先に調製し０．２ ｍｌに濃縮したマレイミド化Ｉ
ｇＧ ８ ｍｙと、０．２ ｍｌに濃縮したチオール化
ＨＲＰ６ｍｇとを４℃で１６時間反応させた。反応後、
ウルトロゲルＡｃＡ ４ ｄ ＣＬ Ｋ Ｂ社製（フラ
ンス）〕を充てんしたカラム（１，５ｃｍＸ４５α）を
用いるゲルクロマトグラフィーにかけ、０．１ Ｍリン
酸緩衝液（ＰＨ６，５）で溶出させた。前項（５）と同
様に溶出液の２８０ ｎｍの吸光度ならびに酵素活性を
測定して目的フラクションを分取した。得られたモノク
ローナル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）−ＨＲＰ複合体はＢＳ
Ａとして０１％、マーチオレー１〜として０００５％に
なるように調整して４°Ｃで保存した。
ｇＧ ８ ｍｙと、０．２ ｍｌに濃縮したチオール化
ＨＲＰ６ｍｇとを４℃で１６時間反応させた。反応後、
ウルトロゲルＡｃＡ ４ ｄ ＣＬ Ｋ Ｂ社製（フラ
ンス）〕を充てんしたカラム（１，５ｃｍＸ４５α）を
用いるゲルクロマトグラフィーにかけ、０．１ Ｍリン
酸緩衝液（ＰＨ６，５）で溶出させた。前項（５）と同
様に溶出液の２８０ ｎｍの吸光度ならびに酵素活性を
測定して目的フラクションを分取した。得られたモノク
ローナル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）−ＨＲＰ複合体はＢＳ
Ａとして０１％、マーチオレー１〜として０００５％に
なるように調整して４°Ｃで保存した。
（８） モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）−ＨＲ
Ｐ複合体の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体ガン
マグロブリンフラクション（ＭＯ−Ｔ２）５ｍｇを０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐ［（６，５） １ ｍｌに溶解し
、０、６ ｍｇのＳ−アセチルメルヵプトサクシニック
アンハイドライド（Ｓ −ａｃｅｔｙｉｍｅｒｃａｐも
ｏ ５ｕｃｃｉｎｉｃ ａｎｈｙ−ｄｒｉｄｅ）を４０
μｌのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解して加え３
０分間２５℃で反応させた。
Ｐ複合体の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体ガン
マグロブリンフラクション（ＭＯ−Ｔ２）５ｍｇを０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐ［（６，５） １ ｍｌに溶解し
、０、６ ｍｇのＳ−アセチルメルヵプトサクシニック
アンハイドライド（Ｓ −ａｃｅｔｙｉｍｅｒｃａｐも
ｏ ５ｕｃｃｉｎｉｃ ａｎｈｙ−ｄｒｉｄｅ）を４０
μｌのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解して加え３
０分間２５℃で反応させた。
０、１ Ｍ トリス緩衝液（ｐＨ７，０） ０．２ｍｌ
およびＩＭヒドロキシルアミンＱ、 ２ ｍｌを加えて
、さらに５分間３０°Ｃで反応させたのち、セファデッ
クスＧ−２５のカラム（１，０Ｘ４５Ｇ）を用いるゲル
クロマトグラフィーで精製してチオール化モノクローナ
ル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）を得た。
およびＩＭヒドロキシルアミンＱ、 ２ ｍｌを加えて
、さらに５分間３０°Ｃで反応させたのち、セファデッ
クスＧ−２５のカラム（１，０Ｘ４５Ｇ）を用いるゲル
クロマトグラフィーで精製してチオール化モノクローナ
ル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）を得た。
次に前項（５） −（ａ）で調製したマレイミド化ベル
オキシターセ１．５ ｍｇを０，１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，０）０、２ ｍｌに溶解し、先に得たチオール化
モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）８ ｍｙと５
ｍ Ｍ ｘチレンシアミン四酢酸ナトリウム塩とを含む
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０） ０．２ｍｌを加
えて４°Ｃで一夜反応させた。反応後、ウルトロゲルＡ
ｃＡ ８４を充てんしたカラム（１，５Ｘ４５Ｃ＋＋＋
）を用いるゲルクロマトグラフィーにかけ、０１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ６，５）で溶出させた。前項（５）と同
様に溶出液の２８０ ｎｍの吸光度ならびに酵素活性を
測定して目的フラクションを分取した。得られたモノク
ローナル抗ＣＥＡ （ＩｇＧ）−ＨＲＰ複合体はＢＳＡ
として０．１％、マーチオレートとして０．００５％に
なるように調整して４°Ｃで保存した。
オキシターセ１．５ ｍｇを０，１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，０）０、２ ｍｌに溶解し、先に得たチオール化
モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）８ ｍｙと５
ｍ Ｍ ｘチレンシアミン四酢酸ナトリウム塩とを含む
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０） ０．２ｍｌを加
えて４°Ｃで一夜反応させた。反応後、ウルトロゲルＡ
ｃＡ ８４を充てんしたカラム（１，５Ｘ４５Ｃ＋＋＋
）を用いるゲルクロマトグラフィーにかけ、０１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ６，５）で溶出させた。前項（５）と同
様に溶出液の２８０ ｎｍの吸光度ならびに酵素活性を
測定して目的フラクションを分取した。得られたモノク
ローナル抗ＣＥＡ （ＩｇＧ）−ＨＲＰ複合体はＢＳＡ
として０．１％、マーチオレートとして０．００５％に
なるように調整して４°Ｃで保存した。
実施例２
（ａ）各種１（ＲＰ複合体の比較（感度、非特異的吸着
） 実施例１て得られた各種ＨＲＰ複合体の性能について調
べるためＥＩＡを行なった。ＥＩＡ用の試薬として、次
のものを用いた。
） 実施例１て得られた各種ＨＲＰ複合体の性能について調
べるためＥＩＡを行なった。ＥＩＡ用の試薬として、次
のものを用いた。
試薬：
■ 抗ＣＥＡ抗体感作マイクロプレート■ 実施例１、
参考例２て得られたＨＲＰ複合体、あるいはＤＡＫＯイ
ムノグロブリノ社製（テンマーク）抗ＣＥＡ抗体ＨＲＰ
複合体■ 標準ＣＥＡ ■ 緩衝液Ｂ（１０％子牛血清、Ｑ、 １５ Ｍ Ｎａ
Ｃ１を含むｐＨ７，０の００２Ｍリン酸緩衝液）。
参考例２て得られたＨＲＰ複合体、あるいはＤＡＫＯイ
ムノグロブリノ社製（テンマーク）抗ＣＥＡ抗体ＨＲＰ
複合体■ 標準ＣＥＡ ■ 緩衝液Ｂ（１０％子牛血清、Ｑ、 １５ Ｍ Ｎａ
Ｃ１を含むｐＨ７，０の００２Ｍリン酸緩衝液）。
緩衝液Ａ （Ｑ、 ｌ ５ Ｍ ＮａＣ１を含むｐ）４
７．０の０゜０２Ｍリン酸緩衝液） ■ ベルオキシターゼ活性測定に必要な試薬００２％過
酸化水素と０１５％０−フェニレンジアミン、を含むｐ
Ｈ４，Ｂの０．１ Ｍクエン酸−リン酸二す） ＩＪウ
ム緩衝液および反応停止液（２Ｎ−硫酸） 抗体感作マイクロプレートの調製： ＥＩＡ用イムノプレートＩ〔ヌンク社（テンマーク）製
〕の各ウェルにポリクローナル抗ＣＥＡ抗体〔タコ・イ
ムノグロブリン社（テンマーク）製〕を０，１Ｍ炭酸緩
衝液（ｐＨ９，６）で希釈して調製した抗体溶液（５０
μｙ／ａＬ’）を１００μｅずつ注入して４°Ｃて一夜
放置して感作させた。０１％ＢＳＡを含む０．０１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄したのち、用時まで冷
所保存した。
７．０の０゜０２Ｍリン酸緩衝液） ■ ベルオキシターゼ活性測定に必要な試薬００２％過
酸化水素と０１５％０−フェニレンジアミン、を含むｐ
Ｈ４，Ｂの０．１ Ｍクエン酸−リン酸二す） ＩＪウ
ム緩衝液および反応停止液（２Ｎ−硫酸） 抗体感作マイクロプレートの調製： ＥＩＡ用イムノプレートＩ〔ヌンク社（テンマーク）製
〕の各ウェルにポリクローナル抗ＣＥＡ抗体〔タコ・イ
ムノグロブリン社（テンマーク）製〕を０，１Ｍ炭酸緩
衝液（ｐＨ９，６）で希釈して調製した抗体溶液（５０
μｙ／ａＬ’）を１００μｅずつ注入して４°Ｃて一夜
放置して感作させた。０１％ＢＳＡを含む０．０１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄したのち、用時まで冷
所保存した。
測定：
緩衝液Ｂに溶解させたＣＥＡ標準溶液１００μｌを各ウ
ェルに注入し、３７°Ｃで３時間反応させた。
ェルに注入し、３７°Ｃで３時間反応させた。
各ウェルを緩衝液Ａで洗浄後、実施例１で得られりＨＲ
Ｐ複合体あるいはタコ・イムノグロブリン（Ｄ Ａ Ｋ
ＯＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ）社製ポリクロ
ーナル抗ＣＥＡ抗体−ＨＲＰ複合体溶液（それぞれ酵素
活性一定；ＨＲＰとしてａｏｎ、、、’ウェル）１００
μｌ を加えて２５°Ｃで３５時間さらに反応させた緩
衝液Ａで洗浄し、これに０．０２％過酸化水素と０１５
％０−フェニレンジアミンを含ム０゜１Ｍクエン酸−リ
ン酸二ナトリウム緩衝液（ｐ）（４，８）１００μｌ
を加えて３０℃で３０分間反応させ、２Ｎ−硫＠１００
．Ｊずつ加えて反応を停止させてから、マイクロプレー
ト用自動比色計〔タイターチック・マルチスキャン・フ
ロー社（米国）製〕を用い、ブランクを対照にして４９
０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を第２表に示し
たが、参考例２で得られたＨＲＰ複合体およびタコ・イ
ムノグロブリン社製ＨＲＰ複合体〔２ステツプ グルタ
ルアルテヒド法；イムノケこストリー（Ｉｍｍｕｎｏ−
ｃｈｅｍｉ ５Ｌｒｙ ）、第８巻（１９７１年）、第
１１７５頁〕と比べて実施例１で得られた本発明のＨＲ
Ｐ複合体はそれぞれウェルへの非特異的吸着は極めて小
さく、また高感度を与えた。
Ｐ複合体あるいはタコ・イムノグロブリン（Ｄ Ａ Ｋ
ＯＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ）社製ポリクロ
ーナル抗ＣＥＡ抗体−ＨＲＰ複合体溶液（それぞれ酵素
活性一定；ＨＲＰとしてａｏｎ、、、’ウェル）１００
μｌ を加えて２５°Ｃで３５時間さらに反応させた緩
衝液Ａで洗浄し、これに０．０２％過酸化水素と０１５
％０−フェニレンジアミンを含ム０゜１Ｍクエン酸−リ
ン酸二ナトリウム緩衝液（ｐ）（４，８）１００μｌ
を加えて３０℃で３０分間反応させ、２Ｎ−硫＠１００
．Ｊずつ加えて反応を停止させてから、マイクロプレー
ト用自動比色計〔タイターチック・マルチスキャン・フ
ロー社（米国）製〕を用い、ブランクを対照にして４９
０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を第２表に示し
たが、参考例２で得られたＨＲＰ複合体およびタコ・イ
ムノグロブリン社製ＨＲＰ複合体〔２ステツプ グルタ
ルアルテヒド法；イムノケこストリー（Ｉｍｍｕｎｏ−
ｃｈｅｍｉ ５Ｌｒｙ ）、第８巻（１９７１年）、第
１１７５頁〕と比べて実施例１で得られた本発明のＨＲ
Ｐ複合体はそれぞれウェルへの非特異的吸着は極めて小
さく、また高感度を与えた。
第２表
（ｂ）ＣＥＡの免疫化学的測定キットおよびＣＥＡの測
定 下記のＣＥＡ免疫化学的測定キットを用い、下記の操作
法に従って正常人および担癌患者血清中のＩＩＣＧ濃度
を測定した。
定 下記のＣＥＡ免疫化学的測定キットを用い、下記の操作
法に従って正常人および担癌患者血清中のＩＩＣＧ濃度
を測定した。
ＣＥＡの免疫化学的測定キット：
（１）実施例１． （２）で得られたモノクローナル抗
ＣＥＡ抗体ガンマグロブリンフラクション（ＭＱ−Ｔ４
）の１５ μｇ／ ｍＬ ０．０１ Ｍ ＮａＣ１−０
，０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨｓ、ｏ ） ｌｏ ｏ ｍ
ｔ中にポリスチレン球（直径４．８ｍ１Ｐｒｅｃｉｓｉ
ｏｎ Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｂａ１ｌ Ｃｏ、、Ｃｈｉｃ
ａｇｏ。
ＣＥＡ抗体ガンマグロブリンフラクション（ＭＱ−Ｔ４
）の１５ μｇ／ ｍＬ ０．０１ Ｍ ＮａＣ１−０
，０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨｓ、ｏ ） ｌｏ ｏ ｍ
ｔ中にポリスチレン球（直径４．８ｍ１Ｐｒｅｃｉｓｉ
ｏｎ Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｂａ１ｌ Ｃｏ、、Ｃｈｉｃ
ａｇｏ。
Ｕ、Ｓ、Ａ、） １５００個を浸し、５°Ｃで１夜イン
キユベートし、更に０．１％ＢＳＡを含む００５Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄してなる抗体感作ポリス
チレン球 （２） 実１１１［１ｉ例１、（７）で得られるベルオ
キシターセ標識抗ＣＥＡ抗体複合体 （８） ｏ 〜２００ｎｇの標準ＣＥＡ（４）上記（３
）の試薬および被検試料の希釈上用いる緩衝液Ｂおよび
緩衝液Ａ（前項（ａ）参照）（５）０−フェニレンジア
ミン （６）上記（２）の試薬の希釈に用いる緩衝液Ｃ；ｏ１
％ウシ血清アルブミン、０．００２％メルチオレートを
含むＰＨ７，５の０．１ Ｍリン酸緩衝液（７）上記（
５）の溶解に用いる緩衝液ＤｉＯ，０２％過酸化水素０
．００２％メルチオレー１・を含むＰ４．８の０．１Ｍ
クエン酸緩衝液 （８）停止液；２Ｎ硫酸 操作方法 標準ＣＥＡ溶液あるいは被検試料５０μｌに試薬（４）
緩衝液Ｂ２５０μｌおよび試薬（１）１個を添加し、室
温で１日間反応させた。ポリスチレン球を緩衝液Ａで水
洗後、試薬（６）で希釈した試薬（２） ３００μｌ（
複合体として約ａ ｏ ｎｇ）を添加し、４°Ｃで１日
間反応させた。ポリスチレン球を緩衝液Ａで水洗し、試
薬（７）で溶解した０、１５％の試薬（５） ５００μ
ｌを加えて室温で４０分間反応させたのち、２Ｎ硫酸１
．５ ｍｌを添加して反応を停止させ、４９２ｒ＋ｍの
吸光度を測定した。
キユベートし、更に０．１％ＢＳＡを含む００５Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄してなる抗体感作ポリス
チレン球 （２） 実１１１［１ｉ例１、（７）で得られるベルオ
キシターセ標識抗ＣＥＡ抗体複合体 （８） ｏ 〜２００ｎｇの標準ＣＥＡ（４）上記（３
）の試薬および被検試料の希釈上用いる緩衝液Ｂおよび
緩衝液Ａ（前項（ａ）参照）（５）０−フェニレンジア
ミン （６）上記（２）の試薬の希釈に用いる緩衝液Ｃ；ｏ１
％ウシ血清アルブミン、０．００２％メルチオレートを
含むＰＨ７，５の０．１ Ｍリン酸緩衝液（７）上記（
５）の溶解に用いる緩衝液ＤｉＯ，０２％過酸化水素０
．００２％メルチオレー１・を含むＰ４．８の０．１Ｍ
クエン酸緩衝液 （８）停止液；２Ｎ硫酸 操作方法 標準ＣＥＡ溶液あるいは被検試料５０μｌに試薬（４）
緩衝液Ｂ２５０μｌおよび試薬（１）１個を添加し、室
温で１日間反応させた。ポリスチレン球を緩衝液Ａで水
洗後、試薬（６）で希釈した試薬（２） ３００μｌ（
複合体として約ａ ｏ ｎｇ）を添加し、４°Ｃで１日
間反応させた。ポリスチレン球を緩衝液Ａで水洗し、試
薬（７）で溶解した０、１５％の試薬（５） ５００μ
ｌを加えて室温で４０分間反応させたのち、２Ｎ硫酸１
．５ ｍｌを添加して反応を停止させ、４９２ｒ＋ｍの
吸光度を測定した。
上記の方法により、正常人および担癌患者血清中のＣＥ
ＡＩＩ度を測定した。結果は第３表に示される。
ＡＩＩ度を測定した。結果は第３表に示される。
第３表
正常人血清 ２１０
正常人血清 ３０７
正常人血清 ４１．６
正常人血清 ５１２
胆のう癌患者
血 清 １ ８７
血 清 ２ １０３
肝 癌 患 者
血 清 １ ６４
血 清 ２ ２０８
胃癌患者
血 清 １ １４
血 情 ２ ９６
血 清 ３ ５０
結腸癌患者
血 清 １ ５６５
血 情 ２ ３８５
血 清 ３ １１３
牌臓癌患者
血 清 １ ５．７
測定の結果、正常人血清のＣＥＡ値は０．５〜１゜２ｎ
ｇ／ｍＬ（平均１． Ｏｎｇ／、ｍｌ ）であったが各
種癌患者血清のＣＥＡ値は高値を与え最大５６５ ｎｇ
／ ａｔとなった。
ｇ／ｍＬ（平均１． Ｏｎｇ／、ｍｌ ）であったが各
種癌患者血清のＣＥＡ値は高値を与え最大５６５ ｎｇ
／ ａｔとなった。
発明の効果
本発明の試薬を用いると、高感度かつ正確にＣＥＡが測
定され、大腸癌などの消化器癌や他の癌などの診断、予
後管理などに対して極めて有用である。すなオつち、本
発明におけるチオール基を導入したベルオキシターセで
標識された抗体を用いた場合は、固相に対する非特異的
な吸着か小さいのでＣＥＡの測定の盲検値が小さくした
がって測定の信頼性が増大する。また、本発明で得られ
たモノクローナル抗体はＣＥＡに対して親和性が強く、
他のＣＥＡ関連抗原に対する交差反応性がはるかに小さ
いので被検液に同時に存在するＣＥＡ関連抗原からの影
響を受け難い。更に、モノクローナル抗体を試薬の構成
成分としているので製品の供給が容易であり、測定の再
現性が高い。
定され、大腸癌などの消化器癌や他の癌などの診断、予
後管理などに対して極めて有用である。すなオつち、本
発明におけるチオール基を導入したベルオキシターセで
標識された抗体を用いた場合は、固相に対する非特異的
な吸着か小さいのでＣＥＡの測定の盲検値が小さくした
がって測定の信頼性が増大する。また、本発明で得られ
たモノクローナル抗体はＣＥＡに対して親和性が強く、
他のＣＥＡ関連抗原に対する交差反応性がはるかに小さ
いので被検液に同時に存在するＣＥＡ関連抗原からの影
響を受け難い。更に、モノクローナル抗体を試薬の構成
成分としているので製品の供給が容易であり、測定の再
現性が高い。
また、本発明の方法で得られたＣＥＡを免疫原として作
製されたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体は、ＣＥＡに対す
る反応性が高くしかもＣＥＡ関連抗原ＮｃＡ、ＮＣＡ−
２との交差反応を有しないモノクローナル抗ＣＥＡ抗体
である頻度が高く、従ってモノクローナル抗ＣＥＡ抗体
作製方法として有用である。
製されたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体は、ＣＥＡに対す
る反応性が高くしかもＣＥＡ関連抗原ＮｃＡ、ＮＣＡ−
２との交差反応を有しないモノクローナル抗ＣＥＡ抗体
である頻度が高く、従ってモノクローナル抗ＣＥＡ抗体
作製方法として有用である。
これらの選択されたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体は免疫
化学的診断剤を構成する成分として利用することができ
る。例えばサンドインチ法による酵素免疫試験法におい
ては担体上に保持された抗体および（もしくは）酵素で
標識された抗体におけるモノクローナル抗ＣＥＡ抗体と
して用いることができる。これらの診断剤は大腸癌など
の消化器癌や他の癌の診断、予後管理などに利用できる
。
化学的診断剤を構成する成分として利用することができ
る。例えばサンドインチ法による酵素免疫試験法におい
ては担体上に保持された抗体および（もしくは）酵素で
標識された抗体におけるモノクローナル抗ＣＥＡ抗体と
して用いることができる。これらの診断剤は大腸癌など
の消化器癌や他の癌の診断、予後管理などに利用できる
。
更にこれらの抗体は治療目的にも利用することができる
。
。
第１図は、実施例１−（５）で得られたベルオキシダー
セとポリクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’ フラグメ
ント）との反応生成物のゲルクロマトグラフィーにおけ
る溶出パターンを表わす。 竿 １ 区 ブラクシｉン導（
セとポリクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’ フラグメ
ント）との反応生成物のゲルクロマトグラフィーにおけ
る溶出パターンを表わす。 竿 １ 区 ブラクシｉン導（
Claims (4)
- （１） ヒト癌胎児性抗原を含有する癌化組織から、非
イオン性界面活性剤を含む中性塩溶液で抽出し、精製す
ることを特徴とするヒト癌胎児性抗原の精製法。 - （２） ヒト癌胎児性抗原を含有する癌化組織から、非
イオン性界面活性剤を含む中性塩溶液で抽出し、精製さ
れたヒト癌胎児性抗原で免疫された哺乳動物のリンパ球
とミエローマ細胞との融合細胞から得られたヒト癌胎児
性抗原反応性モノクローナル抗体。 - （３） ヒト癌胎児性抗原を含有する癌化組織から、非
イオン性界面活性剤を含む中性塩溶液で抽出し、ヒト癌
胎児性抗原を精製し、これを哺乳動物（７）リンパ球に
免疫し、これとミエローマ細胞との融合細胞を製造し、
ついでこれをクローニングすることを特徴とするヒト癌
胎児性抗原反応性モノクローナル抗体の製造法。 - （４） ヒト癌胎児性抗原を含有する癌化組織から、非
イオン性界面活性剤を含む中性塩溶液で抽出し、精製さ
れたヒト癌胎児性抗原で免疫された哺乳動物のリンパ球
とミエローマ細胞との融合細胞から得られたヒト癌胎児
性抗原反応性モノクローナル抗体を、担体上に保持され
た抗体、抗原および標識剤を結合させた抗体を用いるヒ
ト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法において、担体上に
保持される抗体と標識剤を結合させる抗体とが互いに抗
原決定部位を重複しない２種の抗体のうち少なくとも一
方に用い、標識剤としてペルオキシダーゼを用い、これ
と抗体とを一般式 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合または
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わ
される化合物で結合させたものを用いてヒト癌胎児性抗
原を免疫化学的に潰１定することを特徴さするヒト癌胎
児性抗原反応性モノクローナル抗体の使用法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59072429A JP2507982B2 (ja) | 1984-04-10 | 1984-04-10 | ヒト癌胎児性抗原反応性モノクロ―ナル抗体の製造法 |
| EP85104133A EP0158291A3 (en) | 1984-04-10 | 1985-04-04 | A method for purifying carcinoembryonic antigen and a method for producing a carcinoembryonic antigen-reactive monoclonal antibody |
| CA000478552A CA1306427C (en) | 1984-04-10 | 1985-04-09 | Immunochemical assay of carcinoembryonic antigen and reagent therefor |
| US06/721,901 US4816390A (en) | 1984-04-10 | 1985-04-10 | Immunochemical assay of carcinoembryonic antigen and reagent therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59072429A JP2507982B2 (ja) | 1984-04-10 | 1984-04-10 | ヒト癌胎児性抗原反応性モノクロ―ナル抗体の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60214261A true JPS60214261A (ja) | 1985-10-26 |
| JP2507982B2 JP2507982B2 (ja) | 1996-06-19 |
Family
ID=13489037
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59072429A Expired - Lifetime JP2507982B2 (ja) | 1984-04-10 | 1984-04-10 | ヒト癌胎児性抗原反応性モノクロ―ナル抗体の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2507982B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01201158A (ja) * | 1987-10-30 | 1989-08-14 | Abbott Lab | ヘテロ２官能性結合試薬 |
| JPH09136900A (ja) * | 1986-08-13 | 1997-05-27 | Bayer Corp | ペプチド |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58135820A (ja) * | 1981-10-27 | 1983-08-12 | ハイブリテツク・インコ−ポレ−テツド | 放射化モノクロン抗体及びそれを有効成分とする造影剤 |
| JPS595120A (ja) * | 1982-06-30 | 1984-01-12 | Yuji Matsuoka | 単クロ−ン性抗ｃｅａ抗体 |
| JPS60214259A (ja) * | 1984-04-10 | 1985-10-26 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法および試薬 |
-
1984
- 1984-04-10 JP JP59072429A patent/JP2507982B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58135820A (ja) * | 1981-10-27 | 1983-08-12 | ハイブリテツク・インコ−ポレ−テツド | 放射化モノクロン抗体及びそれを有効成分とする造影剤 |
| JPS595120A (ja) * | 1982-06-30 | 1984-01-12 | Yuji Matsuoka | 単クロ−ン性抗ｃｅａ抗体 |
| JPS60214259A (ja) * | 1984-04-10 | 1985-10-26 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法および試薬 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09136900A (ja) * | 1986-08-13 | 1997-05-27 | Bayer Corp | ペプチド |
| JPH01201158A (ja) * | 1987-10-30 | 1989-08-14 | Abbott Lab | ヘテロ２官能性結合試薬 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2507982B2 (ja) | 1996-06-19 |
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