JPS60214259A - ヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法および試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト癌胎児性抗原（以下、ＣＥＡと略称する
こともある。）のサンドインチ法による免疫化学的測定
法およびその試薬に関する。

従来の技術 ＣＥＡは１９６５年Ｇｏｌｄらによって、ヒト大腸癌組
織の過塩素酸油田物中に見い出され、しかも胎児期の消
化管上皮にも存在することから癌胎児性抗原（ｃａｒｃ
ｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ）と名付け
られた。ＣＥＡは分子量約１８万、約５０％の糖を含む
蛋白である。ＣＥＡは胃癌、大腸癌、膵癌、肺癌などの
種々の癌思者で、癌組織や体液中に比較的高レベルで検
出される場合が多く、癌の診断ならびに予後管理用とし
て繁用されている。

従来より、ＣＥＡの酵素免疫測定法（以下、ＥＩＡと略
称することもある。）については、サンドインチ法が繁
用されてきだ。サンドインチ法は一般に次のように行な
われる。未知量のＣＥＡを含む被検液に担体上に保持さ
れた週刊量の抗体を加えて反応させ（第１反応）、次に
酵素で標識した過剰量の抗体の一定量を加えて反応させ
る（第２反応）。担体上に保持された酵素もしくは担体
上に保持されなかった酵素の活性を測定する。第１反応
、第２反応は同時に行なってもよいし時間をずらして行
なってもよい。

第１反応および第２反応で用いられている抗体は同一の
免疫動物で得られた抗血清、あるいは異なる免疫動物か
ら得られた抗血清、さらにこれらの抗体の１種類と細胞
融合法で得られた１種類のモノクローナル抗体、あるい
け２種類のモノクローナル抗体などが用いられている。

発明が解決しようとする問題点 ＣＥＡは一般に１（ｒｕｐｅｙらの方法〔イムノケミス
トリー（Ｉ　ｍｍｕｎｏｃｂｅｍｉｓｔｒｙ　）、第９
巻（１９７２年）、第６１７頁〕に準じてヒト大腸癌組
織の過塩素酸抽出物を、ゲルクロマトクリフィー、アフ
ィニテイクロマトグラフィーもしくは電気泳動法の各手
法を組み合せて精製されていた。しかし、これらの方法
で得られたＣＥＡは、操作中に強い酸性溶媒にさらされ
ているため、変性している恐れがあるという欠点を有す
る。このだめに緩和な条件でＣＥＡを抽出精製する方法
が報告されているが〔キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃ
ｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ　）　、第８５巻（１９７５年）
、第２９２８頁〕、繁雑であり、まだその有用性も明ら
かでない。更に抽出のために用いられるヒト癌化組織と
しては通常、大腸癌の転移肝癌が用いられるが原発部組
縁と完全に一致する性質を有するものかどうかについて
は解明されてトるとは言えない。更にＣＥＡと共通の抗
原決定基を有するＣＥＡ関連抗原が正常組織や新生児胎
便中から発見されており、ＮＣＡ　（Ｎｏｎｓｐｅｃｉ
ｆｉｃ　ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇ　ａｎｔｉｇｅ
ｎ　：　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａ
ｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ
　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕ、Ｓ、Ａ、第６９巻（１９７２年）
。

第２４９２頁〕やＮＣＡ−２（Ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ
　ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇａｎｔｉｇｅｎ−２；
　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１
１１巻（１９７３年）、第１９２６頁〕などと名付られ
ている。これらのＣＥＡ関連抗原と交差反応する抗ＣＥ
Ａ抗体を利用すると、その交差反応性のためにＣＥＡ測
定値に影響を与え、正確な測定値が得られない。

また、ＥＩＡで用いられる標識用酵素としては、安定で
高感度測定が可能であり、標識化反応時に損傷を受けな
いことが望ましい。これまでにペルオキシダーゼ、β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフオスファクーゼ、グ
ルコースオキシグーゼなどが用いられているが、上記の
酵素のうち、ペルオキシダーゼは分子量約４万の極めて
安定な酵素で、酵素活性も高いため最も繁用されている
。

ペルオキシダーゼ゛をＥＩＡに利用するにあたって、ペ
ルオキシダーゼと免疫化学的活性物質とを予め結合させ
る必要があるが、通常行なわれている方法では、それぞ
れ欠点を有し改善が切望されていた。

問題点を解決するだめの手段 本発明者らは、上記の事情に鑑み更に検討を重ねたとこ
ろ、サンドイツチ法によるＥＩＡにおいて２種の抗ＣＥ
Ａ抗体を用い、該２種の抗体のうち少々くとも一方がモ
ノクローナル抗体を用い、該サンドイツチ法におけるＥ
ＩＡにおいて標識剤としてペルオキシダーゼを用いこれ
と抗体とを一般式 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合捷たは
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わ
される化合物で結合させたものを用いると、ＣＥＡを高
感度、高精度でしかも微量のＣＥＡを測定できることを
見い出し、また、ＣＥＡを含有する癌化組織から非イオ
ン性界面活性剤を含む中性塩溶液で抽出することにより
ＣＥＡを変性させることなく精製でき、またこのように
して精製されたＣＥＡを用いて製造されたＣＥＡ反応反
応性クツクローナル抗体記サンドイツチ法によるＥＩＡ
に用いると、さらに高精度でＣＥＡを測定することがで
きることを見い出し、さらに研究した結果、本発明を完
成した。

本発明は、（１）担体上に保持された抗体、抗原および
標識剤を結合させた抗体を用いるヒト癌胎児性抗原の免
疫化学的測定法において、担体上に保持される抗体と標
識剤を結合させる抗体とが互いに抗原決定部位を重複し
ない２種の抗体であり、該２種の抗体のうち少なくとも
一方がモノクローナル抗体であり、標識剤としてペルオ
キシダーゼを用いこれと抗体とを一般式〔式中、ｎは０
ないし５の整数を、Ｒは化学結合捷たは２価の６員環状
炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わされる化合物で
結合させたものを用いるとさを特徴とするヒト癌胎児性
抗原の免疫化学的測定法、および （２）、■ペルオキシダーゼと抗体とを一般式〔式中、
ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合捷たは２価の６
員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わされる化
合物で結合させたもの、および■ペルオキシダーゼに結
合させる抗体と互いに抗原決定部位を重複せずヒト癌胎
児性抗原に反応する抗体を担体上に保持したものであっ
て、該２種の抗体のうち少なくとも一方が七ツクローナ
ル抗体であるものを含有するヒト癌胎児性抗原の免疫化
学的測定用試薬である。

本発明における七ツクローナル抗体は、ヒト癌胎児性抗
原を含有する癌化組織から、非イオン性界面活性剤を含
む中性塩溶液で抽出し、精製されたヒト癌胎児性抗原で
免疫された哺乳動物のリンパ球とミエローマ細胞さの融
合細胞から得られたヒト癌胎児性抗原反応性モノクロー
ナル抗体であることがさらに好ましい。

捷た、本発明におけるペルオキシダーゼと抗体との結合
に際し、ペルオキシダーゼにあらかじめチオール基を導
入したものを用いることがさらに好捷しい。

本発明において用いられる担体上に保持された抗体にお
ける担体としては、たとえば、ケル粒子（例、アカロー
スケル〔例、セファロース４Ｂ。

セファロース６Ｂ（ファルマシア・ファインケミカル社
（スエーテン）製〕、テキストランゲル〔例、セファテ
ックスＧ−７５．セファテックスＧ−１００，セファテ
ックスＧ−２００（ファルマシア・ファインケミカル社
製）〕、ボリアクリルア２ドケル〔例、バイオケルＰ−
８０，バイオゲルＰ〜６０．バイオケルＰ−１００（バ
イオラット・ラホラトリース社（米国）））１．セルロ
ース粒子〔例、アヒセル（脂化成製）、イオン交換セル
ロース（例、ジエチルアミノエチルセルロース、カルボ
キノメチルセルロース）］、４［曲設着剤〔例、カラス
（例、カラス球、カラスロット。

アミノアルキルカラス球、アミノアルキルカラスロンド
）、シリコン片、スチレン系樹脂（例、ポリスチレン球
、ホリスチレン粒子）、イムノアッセイ用プレート（例
、ヌンク社（テンマーク）製）〕、イオン交換樹脂（例
、弱酸性陽イオン交換樹脂〔例、アンバーライトＩＲＣ
−５０（ロームＯアンド・ハース社（米国）＃）、ゼオ
カーブ２２６（パームチット社（西ドイツ）製）〕９弱
塩基性陰イオン交換樹脂〔例、アノパーライトＩＲ−４
Ｂ。

タウエックス３（タウケミカル社（米国）製）〕）など
が挙げられる。

担体に抗体を保持させるには、公知の常套手段を応用し
得るが、たとえば゛代謝″、第８巻（１９７１年）、第
６９６頁に記載されているプロムンアン法、グルタルア
ルテヒド法なとが挙げられる。また、より簡易な方法と
して物理的に担体表面に吸着させてもよい。

本発明で用いられる抗体としてはモノクローナル抗ＣＥ
Ａ抗体もしくはポリクローナル抗ＣＥＡ抗体が用いられ
る。抗体の製造における免疫に用いる抗原としては、自
体公知の方法ＣＫｒｕｐａｙら。

イムノケミストリー（Ｉｍｒｎｕｎｏｃｔ＋ｅｍｉ　５
Ｌｒｙ　）　、第９巻（１９７２年）、第６１７頁〕で
精製しｔこＣＥＡ、更に望ましくは、ヒト癌組織から非
イオン性界面活性剤を含む中性塩溶液により抽出、精製
されたＣＥＡ画分が用いられる。

ヒト癌化組織としてはＣＥＡを含有するヒト癌化組織な
らいずれでも用いることかできるか、持にヒト大腸癌組
織か望ましい。ヒト大腸癌組織としては、あらゆる段階
の大腸癌組織を用いることができるが、テユークス（Ｄ
ｕｋｅｓ　）ＣもしくはＤの段階のものが望ましい。

非イオンｌ’Ｌ界面活性剤としては、細胞成分を可溶化
できるものならばい１“れでも良いか、とりわけエチレ
ンオキシド系非イオン界面活性剤〔例、Ｔｗｅｅｎ　２
０．　Ｔｗｅｅｎ　４０．　Ｔｗｅｅｎ　８０．　Ｔｒ
ｉＬｏｎ　Ｎ−１０１、ＴｒｉｔｏｎＸ　−１００、Ｌ
ｏｂｒｏｌ　ＷＸ、　Ｂｒ１ｊｉ９６など、シグマ社（
米国）製〕か用いられる。

中性塩としてはたとえば塩化ナトリウム、塩化カリウム
、硫酸すトリウムなどが良好に用いられる。ヒト癌化組
織あたり、約１ないし１０倍量の約０．１ないし４％エ
チレンオキシド系非イオン界面活性剤を含む約０．０５
Ｍないし３Ｍ塩化ナトｌ）ラムもしくは塩化カリウムを
抽出用溶媒として用いることが好ましい。

更にＣＥＡの抽出に際しては、抽出効率を向上させるた
め、攪拌、振盪、超音波処理などを行なってもよい。

上記の方法で得られたＣＥＡ抽出液は自体公知の精％手
段（例、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティ・クロ
マトグラフィー、ゲル電気泳ｍ法）で更に精製すること
がてきるＣ　ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓＬｒｙ、第９巻
（１９７２年）、第６１７頁。ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａ
ｒｃｌ＋　、第３５巻（１９７５年）、第２９２８頁参
照〕。

これらの精製手段によりＣＥＡの純度を蛋白量あたり約
数パーセントから数１０パーセントまでに濃縮すること
かできる。

モノクローナル抗ＣＥＡ抗体はＭｉｌｓｔｅｉｎらの方
法〔ネイチュア（ＮａＬｕｒｅ　）　、第２５６巻（１
９７５年）、第４９５頁〕と同様の方法で作製すること
ができる。例えば、上記精製ＣＥＡを抗原として免疫し
て得られたマウス牌細胞とマウスの２工ローマ細胞とを
融合させることにより、モノクローナル抗ＣＥＡ抗体を
分泌する融合細胞（ハイブリドーマ）を作製することが
できる。

すなわち、ハイブリドーマは精製ＣＥＡであらかじめ免
疫しておいたマウス（たとえばＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃ系）
から得られた牌細胞と、同系マウスのミエローマ細胞（
たとえばＮ５−１．ＰＳ−Ｕｔなと）とを細胞融合剤（
たとえばポリエチレングリコール、十ンダイウィルスな
ど）の存在下で混合し、融合、培養することによって得
られる。牌細胞とミエローマ細胞との混合比は１：１な
いし１０：１種度が有利に用いられる。

ハイブリドーマはヒポキサンチン−アミノブチリン−チ
ミジン培地ＣＨＡＴ培地：ネイチュアー。

第２５６巻（１９７５年）、第４９５頁〕等を用いて選
択的に増殖させることができる。

細胞培養液中に目的とする抗体が含まれているかどうか
については自体公知の酵素免疫測定法を用いて検定する
ことができる。ＣＥＡに特異性の高い抗体を産生ずるハ
イブリドーマはさらに通常の限界希釈法によりモノクロ
ーン化される。得られた目的とするハイブリドーマは通
常の液体培地または哺乳動物の腹腔内で増殖させること
ができる。ハイブリドーマが産生ずるモノクローナル抗
体は公知の方法（たとえば硫酸アンモニウムによる塩析
、ＤＥＡＥ−１！ルロースカラムクロマトグラフイーな
ど）により濃縮精製される。

モノクローナル抗体はＣＥＡに対して反応性が高く、正
常組織や非担癌患者由来の試料に対１７ては反応性がは
るかに小さい性質を有する抗体が選ばれる。サンドイツ
チ法によるＥＩＡ用として２種類のモノクローナル抗体
が用いられる場合、それぞれの抗体の抗原決定部位が異
なっているものが選ばれる。

ポリクローナル抗ＣＥＡ抗体は通常の方法で調製するこ
とができる。即ち、精製ＣＥＡがヒト以外の温血動物に
接種される。ヒト以外の温血動物としては、たとえば哺
乳温血動物（例、ウサギ、ヒツジ、ラット、マウス、モ
ルモット、ウシ、ウマ、ブタ）、鳥類（例、ニワトリ、
ハト、アヒル。

ガチョウ、ウズラ）などが挙げられる。該抗原をヒト以
外の温血動物に接種する方法としては、動物に接種する
抗原は抗体を産生ずるに有効な量でよく、たとえばウサ
ギに１回約０１〜１０ｍｇを等容量（１ｍＬ　）の生理
食塩水およびフロイントの完全アジュバントで乳化して
、背部ならびに後肢掌皮下に４週問おきに５回接種する
と抗体を産生させ得る場合が多い。

このようにして、温血動物中に形成された抗体を採取す
る方法としては、たとえばウサギでは、通常最終接種後
７日から１２日の間に耳静脈から採血し、遠心分離して
血清として得られる。得られた抗血清は、公知の方法に
従って塩析し、通常、ＣＥＡを保持させた担体を用いる
アフィニティクロマトグラフィーで吸着した両分を回収
することによりポリクローナル抗ＣＥＡ抗体を精製する
ことができる。

本発明で用いられる２種の抗体は、モノクローナル抗Ｃ
ＥＡ抗体でもポリクローナル抗ＣＥＡ抗体であってもよ
いが、少なくとも一万がモノクローナル抗体であるのが
好ましい。また、抗体分子はＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２も
しくはＦａｂ’であってもよい。

このようにして「られた抗ＣＥＡモノクローナル抗体は
、ＣＥＡのサンドイツチ法によるＥＩＡにおける試薬と
して用いることができる。

標識剤であるペルオキシダーゼとしては、種々の起源の
ものを用いることができるが、その例としてはたとえば
西洋わさび、パイナツプル、イチジク、せ諸、ソラマメ
、トウモロコシなどから得られるペルオキシダーゼが挙
げられ、特に西洋わさびから抽出されたホースラディツ
シュ・ペルオキシダーゼ゛（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　
ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（ＨＲＰ）が好ましい。

ペルオキシダーゼと抗体とを化合物〔Ｉ〕で結合するに
あたり、あらかじめペルオキシダーゼにチオール基を導
入したものを用いると好都合である。

チオール基をペルオキシダーゼに導入する方法としては
、ペルオキシダーゼのアミノ基を介してチオール基を導
入することができる。たとえば、Ｓ−アセチルメルカプ
トサクシニックアンハイドライド（ＡＭＳＡと略称する
こともある；５−ａｃｅＬｙｌ　ｍｅｒｃａｐＬｏｓｕ
ｃｃｉｎｉｃ　ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）　、Ｎ−サクシニ
ミジル８−（２−ピリシルンチオ）プロピオネート（Ｓ
ＰＤＰと略称することもある；　Ｎ　−ｓｕｃｃｉｎｉ
ｍｉｄｙｌ　８−　（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ
　）　ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ　、］　など通常のチオー
ル基導入試薬が有利に用いられる。

したがって、チオール基をベルオキシターセとの間に一
定の基が入っていることとなってもよい。

ＡＭＳＡを用いる場合、ベルオキシターセ約０１ないし
１０ｍｙを中性の緩衝液（たとえば０．１Ｍリン酸緩衝
液）約０．２ないし２ｍＬに溶解し、約０．１ないし４
　ｍｇのＡＭＳＡを約０．０１ないし０．１ｒａＬかＮ
、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解して加え、約１０〜
１２０分間、約４〜３５℃で反応させる。次に約０．２
〜２Ｍヒドロキシルアミンを加えて約４〜３５°Ｃで約
１〜６０分間反応させ、ゲルクロマトグラフィーで精製
してチオール化ベルオキシダーセを得ることができる。

５ＰＤＰを用いる場合、ペルオキシダーゼ約０゜１ない
し１０ｍ９を中性の緩衝液（たとえば０．１Ｍリン酸緩
衝液）約０．１〜１　ｒａｔに溶解し、約０．１〜８　
ｍｇの５ＰＤＰのエタノール溶液を加えて約４〜３５℃
で約１０〜１２０分間反応させる。ゲルクロマトグラフ
ィーで過剰の試薬を除去したのち、ジチオスレイトール
（ｄｉＬｈｉｏＬｈｒｅｉｔｏｌ　）　などの還元用試
薬を加えて還元し、更にケルクロマトグラフィーで精製
してチオール化ベルオキシターセを得ることができる。

ベルオキシターセと抗体とを結合させる化合物として、
一般式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
される化合物を用いるが、上記式中、Ｒで表わされる２
価の６員環状炭化水素残基としては、飽和のもの、不飽
和のもののいずれでもよい。飽和の２価の６員環状炭化
水素の例としては、たとえば１．２−．１．８−．１．
４−シクロヘキンレンが挙げられ、不飽和の２価の６＠
環状炭化水素残基の例としては、−たとえば１．２−．
１．８−．１．４−フェニレンなどが挙げられる。

該化合物〔■〕において、ｎとしては工ないし５の整数
が好ましく、特に１か好ましい。Ｒとしては２価の６員
環状炭化水素残基が好ましく、机に１，４−’ｉミクロ
ヘキシレン好マしい。

本発明の方法において用いられる化合物〔Ｉ〕は、たと
えばす・ンヤーナル・オフ・バイオケミストリー（Ｔｈ
ｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓもｒｙ
　）　第７９巻２３３頁（１９７６年）、ヨーロピアン
・ンヤーナル・オフ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐ
ｅａｎＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ　）第１０１巻３９５頁（１９７９年）、特開昭５２
−８５１６８号公報、特開昭５２−８５１６４号公報等
に記載の方法あるいはこれらの方法に準じて製造するこ
とかできる。たとえば、一般式 〔式中、Ｘは水酸基または／’１０ゲン原子を示すっｎ
およびＲは前記と同意義を有する。〕で表わされるマレ
イミド化合物ＣＩｌ、　］と一般式〔式中、Ｙは水素原
子またはアルカリ金属原子を示す。〕で表わされるサク
シンイミド化合物〔■〕とを脱水剤あるいは脱酸剤の存
在下で反応させることにより製造することかできる。上
記一般式において、ハロゲン原子としては塩素、臭素な
どが挙げられ、アルカリ金属原子としてはたとえばナト
リウム、カリウムなどが挙げられる。また反応に用いら
れる脱水剤としてはたとえば、硫酸。

ジシクロへキシル力ルホノイミトなどか、脱酸剤として
はたとえばピリジノ、トリエチルア２ンなどが挙げられ
る。

前記化合物ＣＩｆ　’］は、たとえば特開昭５２−８５
１６４号公報に記載の方法あるいはこれに準じて製造す
ることができる。たとえば一般式％式％ ） 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
される化合物［’ｌＶ）を脱水閉環せしめることにより
得られる。該脱水閉環させるには、脱水剤たとえば無水
酢酸又は無水酢酸と酢酸ナトリウム（無水物）を用い、
温和に加熱することにより反応させることができる。　
゛ さらに別法として、ヘルベティ力・キミカ・アクタ（Ｈ
ｅ１ｖｅｔｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ　）第５
８巻（１９７５年）５３１頁に記載されている方法ある
いはこれに準じて製造することができる。たとえば、一
般式 〔式中、Ｚはアルキル基を示す〕で表わされるＮ−アル
コキシカルボニルマレイミド〔■〕と、一般式 ％式％ 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
されるアミノ酸（ＶＩ〕とを反応させて、一般式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
されるマレイミド化合物〔■〕を得る。次に一般式［ｌ
１１）で表わされるサクシンイミド化合物〔■〕を加え
先に述べたと同様の脱水剤もしくは脱酸剤の存在下で反
応させることにまり製造することができる。

上記一般式〔■〕で表わされる化合物において２で表わ
されるアルキルとしては、たとえばメチル、エチルが挙
げられる。

ベルオキシターセに化合物ＣＩ）を反応させるには、両
者をｐＨ約６ないし８の緩衝液中で約１０ないし５００
Ｃの温度で約１０分ないし２４時間反応させることによ
って行なわれる。該緩衝液としては、たとえばｐＨＴ、
ｏの０．１Ｍリン酸緩衝液。

ｐ）（６，ａの０．０５Ｍリン酸緩衝液などが挙げられ
る。

このようにして得られたマレイミド化ペルオキシダーゼ
の精製は、たとえばケルクロマトグラフィーなどにより
行なうことができる。該ゲルクロマトグラフィーを行な
う際に用いられる担体としてはたとえばセフ７テノクス
Ｇ−２５［ファルマシア・ファインケミカル社（スエー
テン）り。

バイオケルＰ−２〔バイオ・ランド・ラホラトリース社
（米国）製〕などが挙げられる。

マレイミド化ペルオキシダーゼを抗ＣＥＡ抗体と反応さ
せる場合、抗ＣＥＡ抗体１ｇＧあるいはペプシン分解し
て得られたＦ（ａｂ’）２画分を、メルカプトエチルア
ミン類の存在下で還元し、ケルクロマトグラフィーによ
って精製された抗ＣＥＡ抗体工ｇＧもしくはＦａｂ’　
とマレイミド化ペルオキシダーゼとを反応させる。

該反応は、両者を緩衝液中で約０°Ｃないし４００Ｃの
温度て、約１ないし４８時間反応させることにより行な
うことができる。該緩衝液としては、たとえばｐｉ−１
６，０の５ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を
含むＱ、　Ｉ　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液などが挙げられる。

このようにして得られたベルオキシダーセ標識抗体は、
たとえばケルクロマトグラフィーなどにより精製するこ
とができる。該ゲルクロマトグラフィーに用いられる担
体としては、たとえばウルトロケルＡｃＡ　４４（ＬＫ
Ｂ社（フランス）製〕、セファクリルＳ−２００Ｃファ
ルマシア・ファインケミカル（スエーテン）製〕などが
挙げられる。

旦 本発明の測定方法を以下に具体的に説明する。

まず、■：担体に保持された抗体に、測定すべきＣＥＡ
含有の分析対象物を加えて抗原抗体反応を行った後これ
に前記で得られたベルオキシターセと抗ＣＥＡ抗体との
結合物を加えて反応させる。

本発明の酵素免疫測定法において測定対象となるＣＥＡ
を含む被検試料としては、尿、血清、血漿、髄液あるい
は各種臓器抽出物等が挙げられ、とりオつけ尿、血清お
よび血漿が繁用される。

■：■で得られた反応生成物にベルオキシターゼの基質
を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定す
ることにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。

■二上記の一■の操作を既知量のＣＥＡの標準溶液に対
し予め行ない、ＣＥＡと吸光度もしくは蛍光強度との関
係を標準曲線として作成しておく。

■：未知量のＣＥＡを含む分析対象物について得られた
吸光度もしくは蛍光強度を標準曲線にあてはめ、分析対
象物中のＣＥＡ含量を測定する。

本発明のサンドインチ法によるＣＥＡの免疫化学的測定
法に用いられる定量用キットとしては、［Ａ）主として
、 （１）担体上に保持された抗ＣＥＡ抗体（２）本発明方
法により得られたベルオキシターゼで標識化された抗Ｃ
ＥＡ抗体（化合物ＣＩ）を用いて結合されている。） 上記（１）および（２）の２種の抗体のうち少なくとも
一方はモノクローナル抗体である。

（３）標準ＣＥＡ （４）上記（２）〜（３）の試薬および被検試料の希釈
に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた約
１０％牛血清および約１％牛血清アルブミン（以下、Ｂ
ＳＡと略称することもある。）を含むｐＨ約６ないし９
のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げられる。）
。

（５）ベルオキシダーセ活性測定に必要な試薬。その−
例として蛍光法の場合、酵素基質としてＰ−ハイドロキ
ンフェニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、０−フエ
ニレノジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用いる
緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停止
液。

が挙げられる。

二Ｂ〕主として、 （１）担体上に保持された抗ＣＥＡ抗体。

（２）本発明方法により得られたベルオキシターセで標
識化された抗ＣＥＡ抗体（チオール化されたベルオキシ
ターセと抗ＣＥＡ抗体とが化合物〔Ｉ〕を用いて結合さ
れている。）。

（３）標準ＣＥＡ。

（４）上記（２）〜（３）の試薬および被検試料の希釈
に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた約
１０％ヒツジ血清および約１％牛血清アルブミン（以下
、ＢＳＡと略称することもある。）を含むＰＨ約６ない
し９のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げられる
。）。

（５）ベルオキシターセ粘性測定に必要な試薬。その−
例として蛍光法の場合、酵素基質としてｐ−ハイドロキ
シフェニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、０−フエ
ニレノシアミノと過酸化水素。酵素基質の溶解に用いる
緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停止
液。

が挙げられる。

さらに〔Ｃ〕主として、 （１）担体上に保持された抗ＣＥＡ抗体。

（２）本発明方法により得られたベルオキシターセで標
識化された抗ＣＥＡ抗体（チオール化されたベルオキシ
ターセと抗ＣＥＡ抗体とが化合物ＣＩ’）を用いて結合
されている。） 上記（１）および（２）の２種の抗体のうち少なくとも
−７５はモノクローナル抗体である。

（３）標準ＣＥＡ。

（４）上記（２）〜（３）の試薬および被検試料の希釈
に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた約
１０％ヒツジ血清および約１％牛血清アルブミン（以下
、ＢＳＡと略称することもある。）を含むｐＨ約６ない
し９のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げられる
。） （５）ベルオキシターセ活性測定に必要な試薬。その−
例として蛍光法の場合、酵素基質としてｐ−ハイドロキ
シフェニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、０−フエ
ニレノジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用いる
緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停止
液。

が挙げられる。

上記のキットは例えば下記の方法により使用することが
できる。

標準ＣＥＡもしくは被検液約１０ないし２００μｌに試
薬（４）を加えて希釈し、一定量の試薬（１）を加えて
約Ｏないし４０°Ｃで約１ないし４８時ｍ１反応させる
。担体を水洗後、試薬（２）の約１０ないし３００μｅ
を加えたのち、約０ないし４０℃で反応させる。約１な
いし４８時間反応後、担体を洗浄し担体上に結合してい
るベルオキシターセ活性を測定する。即ちベルオキシタ
ーセの基質液約１０〜１Ｏ００μ４を加えて約２０〜４
０℃で約０．２〜２４時間反応させたのち、酵素反応を
停止させ、反応液中の吸光度もしくは蛍光強度を測定す
る。

本発明の免疫化学的分析法用試薬を用いれば、通常の臨
床検査室において簡単な操作でＣＥＡの高感度測定が可
能となる。

実施例 参考例１　過塩素酸抽出法による精製およびモノクロー
ナル抗体の作製 （１）抗原の精製 Ｋｒｕｐｅｙらの方法〔イムノケミストリー（Ｉｍｍｕ
ｎｏ−Ｃｈｅｍｉ　Ｉ！ｔｒｙ　）　、第９巻（１９７
２年）、第６１７頁〕に準じてＣＥＡを精製した。すな
わち大腸癌組織１００ｇを細断し、これに４００　ａｔ
の蒸留水を加えてホモジナイザーで水冷下１時間破砕し
て懸濁液を調製した。次に、等容量の２Ｍ過塩素酸を加
えて室温で３０分間攪拌して抽出した。次に遠心分離し
、その上清について蒸留水に対して透析したのち凍結乾
燥した。次に０．１５　Ｍ　ＮａＣ＋　を含む０．０５
　Ｍ　！Ｊン酸緩衝液を用いてセファロース４Ｂ〔ファ
ルマシア製（スエーテン）〕のカラム（２，８ｃｍＸ　
１００ｃｍ　）にかけてゲルクロマトグラフィーを行な
った。ＣＥＡを含むフラクシヲンを透析し、凍結乾燥後
、更にセファテックスＧ−２００のカラム（２，３ｃｍ
Ｘ１００Ｇ）でゲルクロマトグラフィーを行ない、ＣＥ
Ａ溶出画分を透析、凍結乾燥してＣＥＡの精製抗原を得
た（　８　ｍｙ　）。

（２）　モノクローナル抗ＣＥＡ抗体の作製前項（１）
で得た精製抗原７０μｇを生理食塩水１５０μ４に溶解
し、これにフロイントの完全アジユバノド［Ｆｒｅｕｔ
＋ｄ’ｓ　ｃｏｒｎｐｌｅｔａ　ａｄｊｕｖａｎＬ　、
　”免疫の生化学、橘ら著、第２６頁、共立出版株式会
社（１９６７年）〕２５０μ４を加えてよく混和して乳
剤を作り、これをＢＡＬＢ／Ｃマウス皮下に投与した。

更に、２週毎に２回、フロイントの不完全アジュバント
を用いて免疫し、最終免疫として精製抗原１３０μｇを
生理食塩水に溶解して得た４００μｌを静脈投与し、３
日後牌臓を取り出した。次に、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　
ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　培地でよく洗浄したの
ち、当該牌細胞Ｉ　Ｘ　Ｉ　０８個とマウスミエローマ
細胞（Ｐ３Ｕ１　）　２　Ｘ　１０個とを混合し、７０
０’　ｒｐｍで１５分間遠心してペレットをつくった。

次にポリエチレングリコール６０００をＲＰＭＩ−１６
４０に４５％に溶解した液０．４　ｍｌを加えて、更に
ＲＰＭＩ−１６４０，１５ｔ＋ＬＬを徐々ニ加えて希釈
したのち、７００　ｒｐｍで１５分間遠心分離し、細胞
を２０％牛脂児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地１０
０　ｍｌに分散させた。次に２４ウエルの培養プレート
〔フロー社ｆＲ（米国）〕に上記細胞分散液２．　Ｏｍ
ｔずつ注入し、更に２日月。

５白目、および８日日に培養上清の半量をＨＡＴ培地に
おきかえた。１４日後における培養上清について抗体価
を測定したところ、計１２０ウェル中１２ウェルに陽性
を認めた。

次に、これら陽性ハイブリドーマのクローニングを牛胎
児血清２０％およびＢＡＬＢ／Ｃマウス胸腺細胞をフィ
ーダー（ｆｅｅｄｅｒ　）として加えた。

ＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈し、限界希釈（Ｉｉｍ−
ｉｔｉｎｇ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　）法を繰り返して行な
い最終的にハモツクローナル抗ＣＥＡ抗体を産生ずる１
２種類のハイブリドーマが得られた。これらを鉱油で処
理されたＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウスの腹腔内に注入し、
２〜３週間後に腹水を採取することにより、モノクロー
ナル抗ＣＥＡ抗体を得た。これらのモノクローナル抗体
を硫酸アンモニウム法で塩析し、それぞれグロブリン画
分を得た（Ｍｏ−に１〜ＭＱ〜に１２）。

参考例２　過ヨウ素酸架橋法 伸根らの方法〔す・ジャーナル・オブ・ヒストケミスト
リー・アンド・サイトケミストリー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｒ　Ｈｉｓｔｏｃｌ＋ｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎ
ｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅ−ｍｉｓｔｒｙ　）第２２巻（１９
７４年）第１０８４頁〕に従って行なった。７　ｍｇの
西洋わさびベルオキシターセを１　ｍｌの０．３　Ｍ重
炭酸すｌ・リウム溶液（ｐＨ８，１）にとかし、０．１
　ｍＬの１％１−フルオロ−２，４−ジニトロヘンセン
を加えて室温で１時間反応させた。次に０．０６　Ｍ　
Ｎａ　ＩＯ２１ｍｌを加えて室温で３０分間攪拌したの
ち、０．１６Ｍエチレングリコール水溶液１　ａｔを加
えて室温で１時間放置した。０．０１Ｍ炭酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ９，５）に対して１夜透析した。

後述の実施例１−（２）で得、られたモノクローナル抗
ＣＥＡ抗体カンマ・グロブリンフラａジョン（Ｍｏ−Ｔ
ａ）５ｍｇを０．０１Ｍ炭酸す、ｌｌつＡ緩衝１（ｐＨ
９，５）　１　ｍｌにとかし、先に調製したアルデヒド
ペルオキシダーセと混合して室温で３時間反応させてか
ら、５　ｍｇの水素化硼素ナトリウムに加えて４°Ｃで
１夜反応させた。０．１５　Ｍ　ＮａＣ１を含む０．０
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，１）に対して４°Ｃで１夜
透析した後、ウルトロゲルＡｃＡ４４を充てんしたカラ
ム（１，５ｃｍＸ　４５σ）を用いるゲルクロマトグラ
フィーにかけ、０１Ｍリン酸緩衝液　（ｐＨ６，５）で
溶出させた。後述の実施例１−（５）と同様に溶出液の
２８０および４０３ｎｍの吸光度ならびに酵素活性を測
定して目的フラクションを分取した。得られたモノクロ
ーナル抗ＣＥＡ抗体−ＨＲＰ複合体はＢＳＡとして０．
１％、マーチオレートとして０．００５％になるように
して４°Ｃで保存した。

実施例　１ （１）抗原の精製 大腸癌組織２００ｇを細断し、これに６００　ｍｌの１
％Ｔｗｅｅｎ　２０　（シグマ社（米国）製〕を含む０
、１５　Ｍ　ＮａＣ１溶液を加えてホモジナイザーで水
冷下１０分間破砕して懸濁液を調製した。さらに超音波
発生機で水冷下１時間処理したのち、１２゜０００ｒｐ
ｍ２０分間遠心分離した。上清を蒸留水に対して透析し
たのち凍結乾燥した。次に０．２Ｍクエン酸緩衝液（Ｐ
Ｈ６，５）に溶解し、同じ緩衝液を用いて調製したコン
カナバリンＡ結合セフ１０−ス４Ｂ〔ファルマシア製（
スエーデン）〕のカラム（２，２ＣＩ＋ｌＸ２６α）に
かけた。カラムに保持された物質をα−メチル−Ｄ−マ
ンノサイドを含む緩衝液を用いて溶出した。蒸留水に対
して透析したのち凍結乾燥した。次に０．２　Ｍクエン
酸緩衝液（ｐＨ６，５）を用いてウルトロゲルＡｃＡ−
３４１丁、＼ｙ ＣＬＫＢ社製（フラツフ）〕のカラム（２，３α×１０
０　ｃｍ　）にかけてゲルクロマトグラフィーを行ない
、２８０〜３５０耐の両分を蒸留水に対して透析し、凍
結乾燥してＣＥＡの精製抗原を得たく５　ｍｇ　）。

（２）モノクローナル抗ＣＥＡ抗体の作製前項（１）で
得た精製抗原７０μｇを生理食塩水１５０μｌに溶解し
、これにフロイントの完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ
’ｓ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ　、　”免
疫の生化学、橘ら著、第２６頁、共立出版株式会社（１
９６７年）〕２５０μｌを加えてよく混和して乳剤を作
り、これをＢＡＬＢ／Ｃマウス皮下に投与した。更に、
２週毎に２回、フロイントの不完全アジュバントを用い
て免疫し、最終免疫として精製抗原１３０μｇ　を生理
食塩水に溶解して得た４００記に静脈投与し、３日後牌
臓を取り出した。

次に、Ｄｕｌｂｅｃｃ＃ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｍ　Ｅ
　Ｍ培地でよく洗浄したのら、当該牌細胞１×１０個と
マウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１　）　２　Ｘ　１０７
個とを混合し、７００ｒｌ）ｍで１５分間遠心してペレ
ットをつくった。次にポリエチレングリ、コール６００
０をＲＰ　ｔＩ　−１６４０に４５％に溶解した液０．
４　ｎＬｔを加えて、更にＲＰＭＩ−１６４０’　１５
ｍｌを徐々に加えて希釈したのち、７００　ｒｐｍで１
５分間遠心分離し、細胞を２０％牛脂児血清を含むＲＰ
ＭＩ−１６４０培地１００　ａｔに分散させた。次に２
４ウエルの培養プレート〔フロー社製（米国）〕に上記
細胞分散液２．　Ｏａｔずつ注入し、更に２日月、５日
目、および８日目に培養上清の半量をＨＡＴ培地におき
えた。１４日後における培養上清について抗体価を測定
したところ、計７２ウェル中９ウェルに陽性を認めた。

次に、これら陽性ハイブリドーマのクローニングを牛胎
児血清２０％およびＢＡＬＢ／Ｃマウス胸腺細胞をフィ
ーダー（ｆｅｅｄｅｒ　）として加えたＲＰＭＩ−１６
４０培地で希釈し、限界希釈（１１−ｍｉｎｉｎｇ　ｄ
ｉｌｕもｉｏｎ　）法を繰り返して行ない最終的にはモ
ノクローナル抗ＣＥＡ抗体を産生ずる５種類のハイブリ
ドーマが得られた。これらを鉱油で処理されたＢＡＬＢ
／Ｃマウスの腹腔内に注入し、２〜３週間後に腹水を採
取することにより、モノクローナル抗ＣＥＡ抗体を得た
。これらのモノクローナル抗体を硫酸アンモニウム法で
塩析し、それぞれグロブリン画分を得た（ＭＱ−’ｒｌ
〜ＭＱ−Ｔ６）。

（３）ポリクローナル抗ＣＥＡ抗体の作製前項（１）で
得た精製抗原２叩を生理食塩水１　ｍｌに溶解し、これ
にフロイントの完全アジュバント１＋＋ＬＬを加えてよ
く混和して乳剤を作り、これをウサギの両大關部筋肉内
および背部皮下数箇所に注射した。以上の操作を３週毎
に５回行ない最終免疫後１週間で採血して抗血清を得た
。硫酸アンモニウム法で塩析してグロブリノ画分を調製
したのち、ＣＥＡ結合セファロース４Ｂのカラムを用い
るアフィニティ・クロマトグラフィーに供した。カラム
に保持された抗体画分を０．１７Ｍグリシン−塩酸緩衝
液（ｐＨ２，８）で溶出することにより、　ＣＥＡに強
い親和性を有するポリクローナル抗体を得ｔこ。

（４）モノクローナル抗体の反応性の比較前項（２）お
よび参考例１で得られた各種モノクローナル抗体のＣＥ
Ａおよび関連抗原に対する反応性を調べた。

試薬： ■　前項（２）および参考例１で得られたモノクローナ
ル抗ＣＥＡ抗体感作マイクロプレート■　西洋わさびベ
ルオキシダーセ　（以下ＨＲＰと略称する）標識抗ＣＥ
Ａ抗体複合体（ＤＡＫＯＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（
テンマーク）製〕■　ＣＥＡおよびＣＥＡ関連抗原 ■　緩衝液Ｂ（１ｏ％子牛血清、０．１５Ｍ　ＮａＣ１
を含むｐＨ７，０の０．０２Ｍリン酸緩衝液）、緩衝Ａ
　（０，１５ＭＮａＣｌを含むｐＨ７，０ｃ７）　０．
ｏ　２Ｍ　リン酸緩衝液） ■　ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬０．０２％
過酸化水素と０．１５％０−フェニレノジアミンを含む
ｐ　Ｈ４，８の０．１Ｍクエン酸−リン酸二ナトリウム
緩衝液および反応停止液（２Ｎ−硫酸）。

抗体感作マイクロプレートの調製： ＥＩＡ用イムノプレートＩ〔ヌンク社（テンマーク）製
〕の各ウェルに０．１　Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９６）で希
釈して調製した前項（２）あるいは参考例１のモノクロ
ーナル抗ＣＥＡ抗体溶液（５ｏｔＬｇ／＋＋ＬＬ　）を
１００μ４ずっ注入して４℃で一夜放置して感作させた
。Ｏ１％ＢＳＡを含む０．ＯＩＭ’Ｊノ酸緩衝液（ｌｌ
Ｈ７，ｏ）で洗浄したのち、用時まで冷所保存した。

測定： 緩衝液Ｂに溶解させたＣＥＡ標準溶液１ｏｏＩＬｌを各
ウェルに注入し、８７℃で８ＮＭ反応させた。

各ウェルを緩衝液Ａで洗浄後、ＨＲＰ標識抗ＣＥＡ複合
体溶液（ＨＲＰとして８０ｎｇ／ウェル）１００μ（Ｊ
を加えて２５℃で３５時間さらに反応させた。緩衝液Ａ
で洗浄し、これに０．０２％過酸化水素と０．１５％θ
−フェニレンジアミンヲ含ム０、１　Ｍクエン酸−リン
酸二ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，８）１００μ４を加え
て３ｏ°ｃて８ｏ分間反応させ、２Ｎ−硫酸１ｏｏ７７
、ｌずっ加えて反応を停止させてから、マイクロプレー
ト用自動比色計〔タイターチック・マルチスキャン；フ
ロー社（米国）製〕を用い、ブランクを対照にして４９
０　ｎｍにおける吸光度を測定した。

結果を第１表に示したが、前記（２）で得られたモノク
ローナル抗ＣＥＡ抗体は、６抗体中４抗体でＣＥＡ関連
抗原であるＮ　ＣＡ　（ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃｒ
ｏｓｓ−ｒｅａｃＬｉｎｇ　ａｒ＋Ｌｉｇｅｎ　）やＮ
　ＣＡ　−２（ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃｃｒｏｓｓｒｅ
ａｃｔｉｎｇ　ａｎｔｉｇｅｎ−２）　と反応せず、し
たがって高い確率でＣＥＡに特異的なモノクローナル抗
ＣＥＡ抗体の得られることが分った。一方、参考例Ｉで
得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体は１２抗体中１抗
体（ＭＯ−に６）だけがＮＣＡならびにＮＣＡ−２とは
反応せず残りの１１抗体はこれらのＣＥＡ関連抗原と反
応した。

（以下余白） 第１表 ＭＯ−Ｋｌ　−→−十 Ｋ　２　−＋　＋ に８＋→−→− Ｋ　４　−　−　４− に５　−＋　＋ に６　−　−−　−’ に７　＋、　＋　＋ ＫＢ　十　＋　＋ Ｋ　ｇ　＋　＋　＋ ＫＩＱ　−、−＋ Ｋｌｌ　−＋　＋ に１２−＋＋ ＭＱ−Ｔ１＋＋＋ Ｔ２　−　−− Ｔ８　−　−　− Ｔ４’　−−−− Ｔ、ｊ　＋　＋　＋ Ｔ６　−　−−　＝ ＋：反応性あり　−：反応性なし く５）ポリクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’）−ＨＲ
Ｐ複合体の製造 （ａ）　マレイミド基の導入 ６　ｍｇの西洋わさびベルかキシダーゼ〔ベーリンガー
マンハイム社（西ドイツ）製〕を１耐の０１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、５０μｌのＮ、Ｎ−ジメ
チルホルムアミドにとかした結合試薬ＭＭＣ（一般式〔
■〕において、ｎ−１，Ｒ−シクロヘキシレンである化
合物）　４．８　ｍｇを加えて３０°Ｇで６０分間攪拌
しながら反応させた。

生成した沈殿を遠心分離して除去し、上清をセファデッ
クスＧ−２５のカラム（１，ＯＸ　４５国）に通し、０
．１　Ｍ　リン酸緩衝液で溶出させた。タンパクを含む
両分を分取し、コロジオン膜を用いて濃縮した。このよ
うにして調製したマレイミド化ペルオキシダーゼにおい
てベルオキシラーゼ１分子あたり導入されたマレイミド
基の数は１．０〜１２個であった（ペルオキシダーセの
分子量を４０．０００、Ｅ２８０ｎｍ−２２，７５とし
て計算）。

１％ （ｂ）　÷レイミド化ペルオキシダーゼと抗ＣＥＡ抗体
（Ｆａｂ’フラグメント）との複合体の製造前項（３）
で得られたポリクローナル抗ＣＥＡ抗体５ｍｇに０．１
　ｍｇのペプシンを加え３０°Ｃで一夜反応後、セファ
デックスＧ−１５０カラム（直径２５０、長さ５５引）
で精製した。得られた抗体Ｆ（ａｂ’）２　両分を２−
メルカプトエチルアミンで還元し、セファデックスＧ−
２５のカラムによるゲルクロマトグラフィーで精製して
ウサギ抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’フラグメント）を得た。

上記（−）で調製したマレイミド化ベルオキシダーセ１
．５　ｍｇを０．　Ｉ　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，Ｏ）
　０．１５ｍＬに溶解し、先に得た抗ＣＥＡ抗体（Ｆａ
ｂ’　フラグメント）　１．８　ｍｇをとかした５ｍＭ
エチレンジアミノ四酢酸ナトリウム塩を含む０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６，０）　０．１５　ｍｌを加えて４
°Ｃで２０時間反応させた。反応後、ウルトロゲルＡｃ
Ａ　４４を充てんしたカラム（１，５Ｘ４５Ｃ＋＋＋）
を用いるゲルクロマトグラフィーにかけ、０．１　Ｍ　
ＩＪン酸緩衝液（ＰＨ６，５）で溶出させた。溶出液の
２８０１ｍの吸光度ならびに酵素活性を測定した。ペル
オキシダーセとウサギ抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’　フラグ
メント）との複合体が生成していることを、以下の方法
で確認した。

まず、酵素活性の測定はギルバルトらの方法〔アナリテ
ィカル・ケミストリー（ＡｎａｌｙＬｉｃａｌ　Ｃｈｅ
−ｍｉｓもｒｙ）、第４０巻（１９６８年）、１２５６
頁〕で行なった。即ち、溶出液の各フラクションを０．
１％ウシ血清アルブミンを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７，０）で１８００倍に希釈した。この１０μｌに
０１％ウシ血清アルブミンを含む０．０５Ｍ酢酸すＩ−
ＩＪウム緩衝液（ｐＨ５，０）に溶解した０゜５％Ｐ−
ハイドロキシフェニル酢酸０．２５　ｍｌを加えて混合
し３０°Ｃで５分間インキュベートした。

次に０．０１％過酸化水素０．０５　ａｔを加えて３０
°Ｃで２０分反応させた。０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐ
Ｈ１０，８’）　２．５ｒｎＬを加えて酵素反応を停止
させ、１ｕ　ｙ　／ａｔのキニンの蛍光強度を１００と
し励起光３２０　ｎｍにおける４　０５　ｎ　ｍの蛍光
強度を測定した。

結果を第１図に示す。第１図において、−←は２８０　
ｎｍにおける吸光度を、−一はペルオキシターセ活性（
蛍光強度として）をそれぞれ示す。

フラクション３８付近においてペルオキシダーゼと抗Ｃ
ＥＡ抗体（Ｆ　ａ　ｂ’　フラグ・メント）との複合体
の生成が極めて良好であることが分かった。

（６）　モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆ　ａ　ｂ’　
）　−ＨＲＰ複合体の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体γ−
グロブリンフラクション（ＭＯ−Ｔ８）５ｍｇを０．１
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，２）　１　ｍｌに溶解し０２５
■のペプシンを加え３７℃で一夜反応させる。

中和後セファテックスＧ−１５０カラム（直径２゜５Ｇ
、長さ５５α）で精製した。得られたＦ　（ａ　ｂ’）
２画分を２−メルカプトエチルアミンで還元し、セファ
デックスＧ−２５のカラムによるゲルクロマトグラフィ
ーで精製してモノクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’フ
ラグメント）を得た。

次に前項（５）　−（ａ）で調製したマレイミド化ペル
オキシダーゼ１．５　ｍｇを０．１　Ｍリン酸緩衝液（
Ｐ）１６．０）０、１５　ｔｎＬに溶解し、先に得たモ
ノクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’フラグメント）　
１．８　ｍｇをとかした５ｍＭエチレンジアミン四酢酸
ナトリウム塩を含む０，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，Ｏ
）　０．１５耐を加えて４℃で一夜反応させた。反応後
、ウルトロゲルＡｃＡ　４４を充てんしたカラム（１，
５Ｘ４５ｃｍ）を用いるゲルクロマトグラフィーにかけ
、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）で溶出させた
。前項（５）と同様に溶出液の２８０　ｎｍの吸光度な
らびに酵素活性を測定して目的フラクションを分取した
。得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆ　ａ　ｂ’
　）−ＨＲＰ複合体はＢＳＡとして０．１％、マーチオ
レートとして０．００５％になるように調整して４°Ｃ
で保存しｔこ。

（７）　モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）−ＨＲ
Ｐ複合体の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体カッ
マグロプリンフラクション（ＭＯ−’Ｔ２）５ｍｇを０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）　ｌ　ｍｌに溶解し
４０μｅのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドにとかした結
合試薬ＭＭＣ（一般式〔Ｉ〕において、ｎ−１、Ｒニジ
クロヘキシレンである化合物）０．２２ｍｇを加えて２
５℃で４５分間攪拌しながら反応させた。生成した沈殿
を遠心分離して除去し、上清をセファテックスＧ−２５
のカラム（１，０Ｘ４５Ｇ）に通し、０．１　Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ６，８）で溶出させた。タンパクを含む両
分を分取し、コロジオン膜を用いて濃縮した。このよう
にして調製したマレイミド化１ｇＧにおいてＩｇＧ　１
分子あたり導入されたマレイミド基の数は５．９個であ
った。

別に、１０ｍｇのＨＲＰを１．４　ｍｌの０．１　Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６，５＞に溶解し、１００μｌのエタ
ノールにとかした結合試薬Ｓ　ＰＤＰ　［Ｎ−サクシニ
ミジル−８−（２−ピリジルジチオ）−フロピオネ−ト
　ｉ　Ｎ　−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐ
ｙｒｉｄｙｌｄｉＬｈｉｏ　）−ｐｒＯｐｉｏｎａＬｅ
ｌ　１．２５　ｍｙを加えて２５°Ｃで３０分間攪拌し
ながら反応させた。反応液はセファデックスＧ−２５の
カラム（１，Ｏｘ４５ｃｍ）に通し０．１Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ５，０）で溶出させて５ＰＤＰを除去した。次に
ジチオスレイトール（ｄｉＬｂｉｏＬｈｒｅ−ｉｔｏｌ
）　１７　ｍｙを加えて還元し、再びセファデックスＧ
−２５のカラム（１，Ｏｃｍ　Ｘ　４５　ｃｍ　）を用
いるケルクロマトグラフィーで精製してチオール化ＨＲ
Ｐを得た。

次に先に調製しＱ、　２　ｍｌ　＋Ｃ濃縮したマレイミ
ド化ＩｇＧ　８　ｍ、と、０．２　ｍｌに濃縮したチオ
ール化ＨＲＰ６　ｍｇとを４°Ｃで１６時間反応させた
。反応後、ウルトロゲルＡｃＡ４４［ＬＫＢ社製（フラ
ンス）］を充てんしたカラム（１，５ｃｍＸ　４５ｃｍ
　）を用いるゲルクロマトグラフィーにかけ、０．１　
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）で溶出させた。前項（５
）と同様に溶出液の２８０　ｎｍの吸光度ならびに酵素
活性を測定して目的フラクションを分取した。得られた
モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）−ＨＲＰ複合体
はＢＳＡとして０．１％、マーチオレートとして０．０
０５％になるように調整して４°Ｃで保存した。

（８）　モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）−ＨＲ
Ｐ複合体の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体ガン
マグロブ、ソンフラクショノ（ＭＯ−Ｔ２）５ｍｇを０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）　ｌ　ｍｌに溶解し
、０、６　ｍｇのＳ−アセチルメルカブトサクシニノク
アンハイドライド（Ｓ　−ａｃｅｔｙｌｍｅｒｃａｐｔ
ｏ　５ｕｃｃｉｎｉｃ　ａｎｈｙ−ｄｒｉｄｅ）を４０
μｌのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解して加え３
０分間２５℃で反応させた。

０．１　Ｍ　ｌ−リス緩衝液（ｐＨ７，０）０．２耐お
よび１Ｍヒドロキシルアミン０．２　ｍｌを加えて、さ
らに５分間３０°Ｃで反応させたのち、セファテックス
Ｇ−２５のカラム（１，０Ｘ４５Ｃ＋＋＋）を用いるゲ
ルクロマトグラフィーで精製してチオール化モノクロー
ナル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ　）を得た。

次に前項（５）　−（ａ）で調製したマレイミド化ベル
オキシターセ１．５　ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，０＞０、２　ｒｎＬに溶解し、先に得たチオール
化モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）８■と５ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩とを含む０．１　
Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６，０）　０．２ｍｌを加えて４
℃で一夜反応させた。反応後、ウルトロゲルＡｃＡ　８
４を充てんしたカラム（１，５ｘ４５ｃｍ）を用いるゲ
ルクロマトグラフィーにかけ、Ｑ、　Ｉ　Ｍ　ＩＪン酸
緩衝液（ＰＨ６，５）で溶出させた。前項（５）と同様
に溶出液の２８０　ｎｍの吸光度ならびに酵素活性を測
定して目的フラクションを分取した。得られたモノクロ
ーナル抗ＣＥ　Ａ　（Ｉ　ｇＧ　）−ＨＲＰ複合体はＢ
ｓＡとして０．１％、マーチオレートとして０．００５
％になるように調整して４℃で保存した。

実施例２ （ａ）　各種ＨＲＰ複合体の比較（感度、非特異的吸着
） 実施例１で得られた各種ＨＲＰ複合体の性能について調
べるためＥＩＡを行なった。ＥＩＡ用の試薬として、次
のものを用いｊこ。

試薬： ■　抗ＣＥＡ抗体感作マイクロプレート■　実施例１、
参考例２で得られたＨＲＰ複合体、あるいはＤＡＫＯイ
ムノグロフリン社製（テンマーク）抗ＣＥＡ抗体ＨＲＰ
複合体■　標準ＣＥＡ ■　緩衝液Ｂ（１０％子牛血清、０．１５　Ｍ　Ｎ　ａ
Ｃｌを含むｐＨ７，０の０．０２Ｍリン酸緩衝ｉ）。

緩衝液Ａ　（Ｑ、　ｌ　５　Ｍ　ＮｎＣＩを含むｐＨ７
，０（７）　０゜０２Ｍリン酸緩衝液） ■　ベルオキシターセ活性測定に必要な試薬０．０２％
過酸化水素と０．１５％０−フェニレンジアミンを含む
ｐＨ４，８の０．１　Ｍクエン酸−リン酸二ナトリウム
緩衝液および反応停止液（２Ｎ−硫酸） 抗体感作マイクロプレートの調製： ＥＩＡ用イムノプレートＩ［ヌンク社（テンマーク）製
〕の各ウェルにポリクローナル抗ＣＥＡ抗体〔タコ・イ
ムノグロフリン社（テンマーク）製〕を０．１Ｍ炭酸緩
衝液（ｐＨ９，６）で希釈して調製した抗体溶液（５０
μｇ／　ｒｎＬ　）を１００μｅずつ注入して４℃で一
夜放置して感作させた。０１％ＢＳＡを含む００１Ｍリ
ン酸緩衝液（Ｐ７．０）で洗浄したのち、用時まで冷所
保存した。

測定： 緩衝液Ｂに溶解させたＣＥＡ標準溶液１００μｌを各ウ
ェルに注入し、３７°Ｃで３時間反応させた。

各ウェルを緩衝液Ａで洗浄後、実施例１で得られたＨＲ
Ｐ複合体あるいはタコ・イムノグロ″プリン（Ｄ　Ａ　
Ｋ　ＯＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ　）社製ポリク
ローナル抗ＣＥＡ抗体−ＨＲＰ複合体溶液（それぞれ酵
素活性一定；ＨＲＰとして８０ｎｇ／ウェル）１００μ
ｌ　を加えて２５°Ｃで３．５時間さらに反応させた緩
衝液Ａで洗浄し、これに００２％過酸化水素と０．１５
％Ｏ−フェニレンジアミンを含ｂ０．ＩＭクエン酸−リ
ン酸二ナトリウム緩衝液（Ｐ）４４．８）１００μｌ　
を加えて３０°Ｃで３０分間反応させ、２Ｎ−硫＠１０
０Ｊずつ加えて反応を停止させてから、マイクロプレー
ト用自動比色計〔タイターチック・マルチスキャン・フ
ロー社（米国）製〕を用い、ブランクを対照にして４９
０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を第２表に示し
たが、参考例２で得られた）（ＲＰ複合体およびタコ・
イムノグロブリノ社製ＨＲＰ複合体〔２ステノフクルタ
ルアルテヒド法；イムノケミストリー（Ｉｍｍｕｎｏ−
ｃｈｅｍｉ　ｓもｒｙ）、第８巻（１９７１年）、第１
１７５頁〕と比べて実施例１で得られた本発明のＨＲＰ
複合体はそれぞれウェルへの非特異的吸着は極めて小さ
く、また高感度を与えた。

第２表 （ｂ）ＣＥＡの免疫化学的測定キットおよびＣＥＡの測
定 下記のＣＥＡ免疫化学的測定キットを用い、下記の操作
法に従って正常人および担癌患者血清中のｈＣＧ濃度を
測定した。

ＣＥＡの免疫化学的測定キット： （１）実施例１．　（２）で得られたモノクローナル抗
ＣＥＡ抗体ガンマグロブリンフラクション（ＭＱ−Ｔ４
）の１５ｔｈｙ／　＋ＩＬＬ　０．　ＯＩ　Ｍ　ＮａＣ
１−０，０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨｓ、ｏ　）　１００
　ｍｌ中にポリスチレン球（直径４．８ｍ、Ｐｒｅｃｉ
ｓｉｏｎ　ＰｌａｓＬｉｃｓ　Ｂａ１ｌ　Ｃｏ、、　Ｃ
ｈｉｃａｇｏ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、）　１５００個を浸し、５°Ｃで１夜イン
キユベートし、更に０．１％ＢＳＡを含む００５Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄してなる抗体感作ポリス
チレン球 （２）実施例１．（７）で得られるベルオキシターセ標
識抗ＣＥＡ抗体複合体 （３）　０−２００　ｎｇの標準ＣＥＡ（４）上記（３
）の試薬および被検試料の希釈上用いる緩衝液Ｂおよび
緩衝液Ａ（前項（ａ）参照）（５）ｏ−フェニレンジア
ミン （６）上記（２）の試薬の希釈に用いる緩衝液ｃ；ｏ、
ｉ％ウシ血清アルブミン、９．００２％メルチオレート
を含むｐＨ７，５の０．１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（７）
上記（５）の溶解に用いる緩衝液Ｊ０．０２％過酸化水
素０．００２％メルチオレートを含むｐｉ（４，８の０
．１　Ｍクエン酸緩衝液 （８）停止液ｉ２Ｎ硫酸 操作方法 標準ＣＥＡ溶液あるいは被検試料５０μｌに試薬（４）
緩衝液Ｂ２５０μｅおよび試薬（１）１個を添加し、室
温で１日間反応させた。ポリスチレン球を緩衝液Ａで水
洗後、試薬（６）で希釈した試薬（２）　８００μｌ（
複合体として約ｓ　ｏ　ｎｇ）を添加し、４℃で１日間
反応させた。ポリスチレン球を緩衝液Ａで水洗し、試薬
（７）で溶解した０、１５％の試薬（５）　５００μｌ
を加えて室温で４０分間反応させたのち、２Ｎ硫酸１．
５　ｍｌを添加して反応を停止させ、４９２　ｎｍの吸
光度を測定した。

上記の方法により、正常人および担癌患者血清中のＣＥ
Ａ１１度を測定した。結果は第３表に示される。

第３表 被検試料　ＣＥＡ濃度（ｎｇ／ｍＬ） 正常人血清　１０５ 正常人血清　２１０ 正常人血清　３０７ 正常人血清　４１６ 正常人血＠　５　１．２ 胆のう癌患者 血　清　１　８７ 血　＠　２　１０．８ 肝　癌　患　者 血　清　１６．４ 血　清　２　２０．８ 胃癌患者 血　清　１　１．４ 血　清　２　９６ 血　清　３　５０ 結腸癌患者 血　清　１　５６５ 血　清　２　３８５ 血　清　３　１１３ 牌臓癌患者 血　清　１　５７ 測定の結果、正常人血清のＣＥＡ値は０５〜１゜２１ｇ
／＋＋ｌｌ（平均１０　ｎｙ／、ｒｎｌ　）であったが
各種癌患者血清のＣＥＡ値は高値を与え最大５６５　ｎ
ｇ／　ｍｌとなった。

発明の効果 本発明の試薬を用いると、高感度かつ正確にＣＥＡが測
定され、大腸癌などの消化器癌や他の癌などの診断、予
後管理などに対して極めて有用である。すなオつち、本
発明におけるチオール基を導入したベルオキシダーセで
標識された抗体を用いた場合は、固相に対する非特異的
な吸着が小さいのでＣＥＡの測定の盲検値が小さくした
がって測定の信頼性が増大する。また、本発明で得られ
たモノクローナル抗体はＣＥＡに対して親和性が強く、
他のＣＥＡ関連抗原に対する交差反応性がはるかに小さ
いので被検液に同時に存在するＣＥＡ関連抗原からの影
響を受け難い。更に、モノクローナル抗体を試薬の構成
成分としているので製品の供給が容易であり、測定の再
現性が高い。

また、本発明の方法で得られたＣＥＡを免疫原として作
製されたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体は、ＣＩＡに対す
る反応性が高くしかもＣＥＡ関連抗原ＮＣＡ、ＮＣＡ−
２との交差反応を有しないモノクローナル抗ＣＥＡ抗体
である頻度が高く、従ってモノクローナル抗ＣＥＡ抗体
作製方法として有用である。

これらの選択されたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体は免疫
化学的診断剤を構成する成分として利用することができ
る。例えばサンドイツチ法による酵素免疫試験法におい
ては担体上に保持された抗体および（もしくは）酵素で
標識された抗体におけるモノクローナル抗ＣＥＡ抗体と
して用いることができる。これらの診断剤は大腸癌など
の消化器癌や他の癌の診断、予後管理などに利用できる
。

更にこれらの抗体は治療目的にも利用することができる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１−（５）で得られたベルオキシダー
セとポリクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’　フラグメ
ント）との反応生成物のゲルクロマトグラフィーにおけ
る溶出パターンを表わす。 竿　１　図 ７ヲクシヨン数、

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）担体上に保持された抗体、抗原および標識剤を結
   合させた抗体を用いるヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測
   定法において、担体上に保持される抗体と標識剤を結合
   させる抗体とが互いに抗原決定部位を重複しない２種の
   抗体であり、該２種の抗体のうち少なくとも一方が七ツ
   クローナル抗体であり、標識剤としてペルオキシダーゼ
   を用い、これと抗体とを一般式 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合捷たは
   ２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わ
   される化合物で結合させたものを用いることを特徴とす
   るヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法。
2. （２）七ツクローナル抗体が、ヒト癌胎児性抗原を含有
   する癌化組織から、非イオン性界面活性剤を含む中性塩
   溶液で抽出し、精製されたヒト癌胎児性抗原で免疫され
   た哺乳動物のリンパ球とミエローマ細胞との融合細胞か
   ら得られたヒト癌胎児性抗原反応性上ツクローナル抗体
   である特許請求の範囲第１項記載のヒト癌胎児性抗原の
   免疫化学的測定法。
3. （３）ペルオキシダーゼと抗体との結合に際し、ペルオ
   キシダーゼにあらかじめチオール基を導入したものを用
   いる特許請求の範囲第１項記載のヒト癌胎児性抗原の免
   疫化学的測定法。
4. （４）■ペルオキシダーゼと抗体とを一般式〔式中、ｎ
   は０ないし５の整数を、Ｒは化学結合捷たは２価の６員
   環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わされる化合
   物で結合させたもの、および■ペルオキシダーゼに結合
   させる抗体と互いに抗原決定部位を重複せずヒト癌胎児
   性抗原に反応する抗体を担体上に保持したものであって
   、該２種の杭６体のうち少なくとも一方が七ツクローナ
   ル抗体であるものを含有するヒト癌胎児性抗原の免疫化
   学的測定用試薬。
5. （５）　七ツクローナル抗体が、ヒト癌胎児性抗原を含
   有する癌化組織から、非イオン性界面活性剤を含む中性
   塩溶液で抽出し、精製されたヒト癌胎児性抗原で免疫さ
   れた哺乳動物のリンパ球とミエローマ細胞との融合細胞
   から得られたヒト癌胎児性抗原反応性モノクローナル抗
   体である特許請求の範囲第４項記載のヒト癌胎児性抗原
   の免疫化学的測定用試薬。
6. （６）ペルオキシダーゼと抗体との結合に際し、ペルオ
   キシダーゼにあらかじめチオール基を導入したものを用
   いる特許請求の範囲第４項記載のヒト癌胎児性抗原の免
   疫化学的測定用試薬。