JPS6283665A - ヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法および試薬 - Google Patents
ヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法および試薬Info
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- JPS6283665A JPS6283665A JP22529385A JP22529385A JPS6283665A JP S6283665 A JPS6283665 A JP S6283665A JP 22529385 A JP22529385 A JP 22529385A JP 22529385 A JP22529385 A JP 22529385A JP S6283665 A JPS6283665 A JP S6283665A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
産業上の利用分野
本発明は、ヒト癌胎児性抗原（以下、ＣＥＡと略称する
こともある。）のサンドインチ法による免疫化学的測定
法およびその試薬に関する。 従来の技術 ＣＥＡＩ−ｉｌ Ｑ ６５年Ｇ ｏ Ｉ ｄらによって
、（ニド大腸癌組織の過塩素酸抽出物中に見い出され、
しかも胎児期の消化管上皮にも存在ｊることから癌胎児
性抗ｐ （ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔ
ｉｇｅｎ ）と名付けられた。ＣＥＡは分子量約１８万
、約５０％の糖？含む蛋白である。ＣＥＡは胃癌、大腸
癌、膵癌、肺癌などの種々の癌患者で、癌組織や体液中
に比較的高レベルで検出される場合が多く、癌の診断な
らびに予後管理用として繁用されている。 従来より、ＣＥＡの酵素免疫測定法（以下、ＥＩＡと略
称することもある。）については、サンドインチ法が繁
用されてきた。ブ゛ンドイソチ法は一般に次のように行
なわれる。未知量のＣＥＡを含む被検液に担体−ｈＫ保
持された週刊量の抗体を加、−（で反応させ（第１反応
）、次Ｑて酵素で標識した過剰量の抗体の一定量を加え
て反応させる（第２反応）。担体上に保持された酵素も
Ｌ＜は担体上に保持されなかった酵素の活性を測定する
。第１反応、第２反応は同時に行なってもよいし時間音
ずらして行な−）てもよい。 第１反応および第２反応で用いられている抗体は同一の
免疫動物で得られた抗血清、あるいは異なる免疫動物か
ら得られた抗血清、さらにこれらの抗体の１種類と細胞
融合法で得られた１種類のモノクローナル抗体、あるい
は２種類のモノクローナル抗体などが用いられている。 発明が解決しようとする問題点 ＣＥＡは一般にＫｒｕｐｅｙらの方法〔イムノケ三スト
リ−（Ｉ ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）、第９巻
（１９７２年）、第６１７頁〕に準じてヒト大腸癌組織
の過塩素酸抽出物を、ゲルタロマドグラフィー、アフィ
ニティクロマトグラフィーもしくは電気泳動法の各手法
全組み合せて精製されていた。しかし、これらの方法で
得られたＣＥＡは、操作中に強い酸性溶媒にさらさバて
いるため、変性している恐へがあるという欠点を有する
。このために緩和な条件でＣＥＡ金抽出精製する方法が
報告すｊｔているか〔キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃ
ｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ） 、＠ ３５巻（１９７５年）
、第２９２８頁〕、繁雑であり、またその有用性も明ら
かでない。更に抽出のために用いられるヒト癌化組織と
しては通常、大腸癌の転移肝癌が用いられるが原発部組
織と完全に一致する性質を有するものかどうかについて
は解明されているとは言えない。更にＣＥＡと共通の抗
原決定基を有するＣＥＡ関連抗原が正常組織や新生児胎
便中から発見されており、ＮＣＡ ＣＮｏｎ５ｐｅｃｉ
ｆｉｃ ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅ
ｎ ； Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａ
ｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅｓ
ｏｆ ｔｈｅ Ｕ、Ｓ、Ａ、第６９巻（１９７２年）
。 第２４９２頁〕やＮＣＡ−２ＣＮｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇａｎｔｉｇｅｎ−２；
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１
０）１巻（１９７３年）、第１９２６頁〕などと名付ら
れている。これらのＣＥＡ関連抗原と交差反応する抗Ｃ
ＥＡ抗体を利用すると、その交差反応性のためにＣＥＡ
測定値に影響を与え、正確な測定値が得られない。 また、ＥＩＡで用いられる標識用酵素としては、安定で
高感度測定が可能であり、標識化反応時に損傷を受けな
いことが望ましい。これまでにペルオキシダーゼ、β−
Ｄ−ガラクトシダーセ°、アルカリフオスファターセ゛
、クルコースオキシダーゼなどが用いられているが、上
記の酵素ノうち、ペルオキシダーゼは分子量約４万の極
めて安定な酵素で、酵素活性も高いため最、も繁用され
ている。 ペルオキシダーゼをＥＩＡに利用するにあたって、ペル
オキシダーゼと免疫化学的活性物質とを予め結合させる
必要があるが、通常行なわれている方法では、それぞれ
欠点を有し、改善が切望されていた。 問題点を解決するための手段 本発明者らは、上記の事情に鑑み更に検討を重ねたとこ
ろ、サンドイツチ法によるＥＩＡにおいて２種の抗ＣＥ
Ａ抗体を用い、該２種の抗体のうち少なくとも一方がモ
ノクローナル抗体を用い、該サンドインチ法におけるＥ
ＩＡにおいて標識剤としてペルオキシダーゼを用いこれ
と抗体とを一般式 〔式中、ｎけＯないし５の整数全、Ｒは化学結合または
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わ
される化合物で結合させたもの金柑いると、ＣＥＡを高
感度、高精度でしかも微量のＣＥＡを測定できることを
見い出し、また、ＣＥＡｉ含有する癌化組織から非イオ
ン性界面活性剤を含む中性塩溶液で抽出することにより
ＣＥＡ’ｉ変性させることなく精製でき、またこのよう
にして精製されたＣＥＡを用いて製造されたＣＥＡ反応
性モノクローナル抗体を上記ヅンドイノチ法によるＥＩ
Ａに用いると、さらに高精度でＣＥＡを測定することが
できることを見い出し、さらに研究した結果、本発明を
完成した。 本発明は、（１）担体上に保持された抗体、抗原および
標識剤全結合させた抗体を用いるヒト癌胎児性抗原の免
疫化学的測定法において、担体上に保持される抗体と標
識剤を結合させる抗体とが互いに抗原決定部位を重複し
ない２種の抗体であり、該２種の抗体のうち少なくとも
一方がモノクローナル抗体であり、標識剤としてペルオ
キシダーゼを用いこれと抗体とを一般式〔式中、ｎは０
ないし５の整数を、Ｒは化学結合または２価の６員環状
炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わされる化合物で
結合させたものを用いることを特徴とするヒト癌胎児性
抗原の免疫化学的測定法、および （２）、■ペルオキシダーゼと抗体とを一般式〔式中、
ｎは０ないし５の整数全、Ｒは化学結合または２価の６
員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わされる化
合物で結合させたもの、および■ペルオキシダーゼに結
合させる抗体と互いに抗原決定部位を重複せずヒト癌胎
児性抗原に反応する抗体を担体上に保持したものであっ
て、該２種の抗体のうち少なくとも一方がモノクローナ
ル抗体であるもの全含有するヒト癌胎児性抗原の免疫化
学的測定用試薬である。 本発明におけるモノクローナル抗体は、ヒト癌胎児性抗
原を含有する癌化組織から、非イオン性界面活性剤を含
む中性塩溶液で抽出し、精製されたヒト癌胎児性抗原で
免疫された哺乳動物のリンパ球とミエローマ細胞との融
合細胞から得られたヒト癌胎児性抗原反応性モノクロー
ナル抗体であることがさらに好ましい。 また、本発明におけるベルオキシグーゼト抗体との結合
に際し、ベルオキシグーゼにあらかじめチオール基を導
入したものを用いることがさらに好ましい。 本発明において用いられる担体上に保持された抗体にお
ける担体としては、たとえば、ゲル粒子（例、アガロー
スゲル［［ｌＪ、セファロース４Ｂ。 セファロース６Ｂ（ファルマシア・ファインケミカル社
（スエーデン）製〕、デキストランゲル〔例、セファデ
ックスＧ−７５，セファデックスＧ−１００，セファデ
ックスＧ−２００（ファルマシア・ファインケミカル社
製）〕、ポリアクリルアミドゲル〔例、バイオゲルｐ−
３ｏ、バイオゲルＰ−６０，バイオゲルＰ−１００（バ
イオラッド・ラボラトリーズ社（米国））〕、セルロー
ス粒子〔例、アビセル（脂化成製）、イオン交換セルロ
ース（例、ジエチルアミンエチルセルロース、カルボキ
シメチルセルロース）〕、物理的吸着剤〔例、ガラス（
例、ガラス球、ガラスロッド。 アミノアルキルガラス球、アミノアルキルガラスロンド
）、シリコン片、スチレン系樹脂（例、ポリスチレン球
、ポリスチレン粒子）、イムノアッセイ用プレート（例
、ヌンク社（デンマーク）製）〕、イオン交換樹脂（例
、弱酸性陽イオン交換樹脂〔例、アンバーライトＩＲＣ
−５０（ローム・アンド・ハース社（米国〉製）、ゼオ
カーブ２２Ｇ（パームチット社（西ドイツ）製）〕９９
弱塩基性陰イオン交換樹脂例、アンバーライトＩＲ−４
Ｂ。 ダウエックス３（ダウケミカル社（米国）製）〕）など
が挙げられる。 担体に抗体を保持させるには、公知の常套手段を応用し
得るが、たとえば“代謝、第８＠（１９７１年）、第６
９６頁に記載されているブロムシアン法、グルタルアル
デヒド法などが挙げられる。また、より簡易な方法とし
て物理的に担体表面に吸着させてもよい。 本発明で用いられる抗体としてはモノクローナル抗ＣＥ
Ａ抗体もしくはポリクローナル抗ＣＥＡ抗体が用いられ
る。抗体の製造における免疫に用いる抗原としては、自
体公知の方法〔Ｋｒｕｐｅｙら。 イムノケミストリー（Ｉｍｍｕｎｏｅｈｅｍｉｓｔｒｙ
） 、第９巻（１９７２年）、第６１７頁〕で精製し
たＣＥＡ、更に望ましくは、ヒト癌組織から非イオン性
界面活性剤を含む中性塩溶液により抽出、精製されたＣ
ＥＡ画分が用いられる。 ヒト癌化組織としてはＣＥＡを含有するヒト癌化組織な
らいずれでも用いることができるが、特にヒト大腸癌組
織が望ましい。ヒト大腸癌組織としては、あらゆる段階
の大腸癌組織を用いることができるが、テユークス（Ｄ
ｕｋｅｓ ）ＣもしくはＤの段階のものが望ましい。 非イオン性界面活性剤としては、細胞成分を可溶化でき
るものならばいずれでも良いが、とりわけエチレンオキ
シド系非イオン界面活性剤〔例、Ｔｗｅｅｎ ２０．
ＴｗＣｅｎ ４０．’ Ｔ〜νｎｏｎ ３Ｑ、 Ｔｒｉ
ｔｏｎ Ｎ −１，０１、ＴｒｉｔｏｎＸ −１００、
Ｌｏｂｒｏｌ ＷＸ、 Ｂｒ１ｊｉ９６など、シグマ社
（米国）製〕が用いられる。 中性塩としてはたとえば塩化ナトリウム、塩化カリウム
、硫酸すトリウムなどが良好に用いられる。ヒト癌化組
織あたり、約１ないし１０倍量の約０．１ないし４％エ
チレンオキシド系非イオン界面活性剤を含む約０．０５
Ｍないし３Ｍ塩化すｌ−’）ラムもしくは塩化カリウム
を抽出用溶媒とＩ７て用いることが好ましい。 更にＣＥＡの抽出に際しては、抽出効率を向上させるた
め、攪拌、振盪、超音波処理などを行なってもよい。 上記の方法で得られたＣＥＡ抽出液は自体公知の精製手
段（例、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティ・クロ
マトグラフィー、ゲル電気法１）こコ史に精製すること
ができるＣ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｃ＋ｎ１ｓＬｒｙ、第９
巻（１９７２年）、ｆＪＮ６１７頁。ＣａｎｃＣｒＲｅ
５ｅａｒｃｈ 、第３５巻（１９７５年）、第２９２８
頁参照〕。 これらの精製手段によりＣＥＡの純度を蛋白量あγこり
約数バーセン１−から数１０パーセントまでに濃縮する
ことができる。 モノクローナル抗ＣＥＡ抗体はＭｉｌｓＬｃｉｎらの方
法〔ネイチュア（Ｎａｔｕｒｅ ） 、第２５６巻（１
９７５年）、第４９５頁〕と同様の方法で作製すること
ができる。例えば、上記精製ＣＥＡを抗原として免疫し
て得られたマウス牌細胞とマウスのミエローマ細胞とを
融合させることにより、モノクローナル抗ＣＥＡ抗体を
分泌する融合細胞（）蔦イブリドーマ）を作製すること
ができる。 すなわち、ハイブリドーマは精製ＣＥＡであらかじめ免
疫しておいたマウス（たとえばＢ Ａ Ｌ Ｂ／Ｃ系）
から得られた牌細胞と、同系マウスのミエローマ細胞（
たとえばＭ Ｓ −１、Ｐ Ｓ −Ｕ ｉなど）とを細
胞融合剤（たとえばポリエチレングリコール、センダイ
ウィルスなど）の存在下で混合し、融合、培養すること
によって得られる。牌細胞とミエローマ細胞との混合比
は１：１ないし１０：１種度が有利に用いられる。 このようにして得られたノ・イブリドーマとしては、後
述の実施例１−（２）で得られた・・イブリドーマＭＯ
２７１−１０）（モノクロナール抗体 Ｍｏ −−Ｔ２
）が挙げられ、該／・イブリドーマは、財団法人発酵研
究所に昭和６０年（１９８５年）３月４日に受託番号Ｉ
Ｆ０５００３３として寄託されている。 ハイブリドーマはヒポキサンチン−アミノブチリン−チ
ミジン培地（ＨＡＴ培地：ネイチュアー。 第２５６巻（１９７５年）、第４９５頁〕等を用いて選
択的に増殖させることができる。 細胞培養液中に目的とする抗体が含まれているかどうか
については自体公知の酵素免疫測定法を用いて検定する
ことができる。ＣＥＡに特異性の高い抗体を産生するハ
イブリドーマはさらに通常の限界希釈法によりモノクロ
ーン化される。得られた目的とするハイブリドーマは通
常の液体培地または哺乳動物の腹腔内で増殖させること
ができる。ハイブリドーマが産生ずるモノクローナル抗
体は公知の方法（たとえば硫酸アンモニウムによル塩析
、ＤＥＡＥセルロースカラムクロマトグラフィーなど）
により濃縮精製される。 モノクローナル抗体はＣＥＡに対して反応性が高く、正
常組織や非担癌患者由来の試料に対Ｉ２ては反応性がは
るかに小さい性質を有する抗体が選ばれる。サンドイツ
チ法によるＥＩＡ用として２種類のモノクローナル抗体
が用いられる場合、それぞれの抗体の抗原決定部位が異
な−）でいるものが選ばれる。 ポリクローナル抗ＣＥＡ抗体は通常の方法で調製するこ
とができる。即ち、精製ＣＥＡがヒト以外の温血動物に
接種される。ヒト以外の温血動物としては、たζえば哺
乳温血動物（例、ウサギ、ヒツジ、ラット、マウス、モ
ルモッｌ−、ウシ、ウマ、ブタ）、鳥類（例、ニラ１−
リ、ハト、アヒル。 ガチョウ、ウズラ）などが挙げられる。該抗原をヒト以
夕）の温血動物に接種する方法と
こともある。）のサンドインチ法による免疫化学的測定
法およびその試薬に関する。 従来の技術 ＣＥＡＩ−ｉｌ Ｑ ６５年Ｇ ｏ Ｉ ｄらによって
、（ニド大腸癌組織の過塩素酸抽出物中に見い出され、
しかも胎児期の消化管上皮にも存在ｊることから癌胎児
性抗ｐ （ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔ
ｉｇｅｎ ）と名付けられた。ＣＥＡは分子量約１８万
、約５０％の糖？含む蛋白である。ＣＥＡは胃癌、大腸
癌、膵癌、肺癌などの種々の癌患者で、癌組織や体液中
に比較的高レベルで検出される場合が多く、癌の診断な
らびに予後管理用として繁用されている。 従来より、ＣＥＡの酵素免疫測定法（以下、ＥＩＡと略
称することもある。）については、サンドインチ法が繁
用されてきた。ブ゛ンドイソチ法は一般に次のように行
なわれる。未知量のＣＥＡを含む被検液に担体−ｈＫ保
持された週刊量の抗体を加、−（で反応させ（第１反応
）、次Ｑて酵素で標識した過剰量の抗体の一定量を加え
て反応させる（第２反応）。担体上に保持された酵素も
Ｌ＜は担体上に保持されなかった酵素の活性を測定する
。第１反応、第２反応は同時に行なってもよいし時間音
ずらして行な−）てもよい。 第１反応および第２反応で用いられている抗体は同一の
免疫動物で得られた抗血清、あるいは異なる免疫動物か
ら得られた抗血清、さらにこれらの抗体の１種類と細胞
融合法で得られた１種類のモノクローナル抗体、あるい
は２種類のモノクローナル抗体などが用いられている。 発明が解決しようとする問題点 ＣＥＡは一般にＫｒｕｐｅｙらの方法〔イムノケ三スト
リ−（Ｉ ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）、第９巻
（１９７２年）、第６１７頁〕に準じてヒト大腸癌組織
の過塩素酸抽出物を、ゲルタロマドグラフィー、アフィ
ニティクロマトグラフィーもしくは電気泳動法の各手法
全組み合せて精製されていた。しかし、これらの方法で
得られたＣＥＡは、操作中に強い酸性溶媒にさらさバて
いるため、変性している恐へがあるという欠点を有する
。このために緩和な条件でＣＥＡ金抽出精製する方法が
報告すｊｔているか〔キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃ
ｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ） 、＠ ３５巻（１９７５年）
、第２９２８頁〕、繁雑であり、またその有用性も明ら
かでない。更に抽出のために用いられるヒト癌化組織と
しては通常、大腸癌の転移肝癌が用いられるが原発部組
織と完全に一致する性質を有するものかどうかについて
は解明されているとは言えない。更にＣＥＡと共通の抗
原決定基を有するＣＥＡ関連抗原が正常組織や新生児胎
便中から発見されており、ＮＣＡ ＣＮｏｎ５ｐｅｃｉ
ｆｉｃ ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅ
ｎ ； Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａ
ｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅｓ
ｏｆ ｔｈｅ Ｕ、Ｓ、Ａ、第６９巻（１９７２年）
。 第２４９２頁〕やＮＣＡ−２ＣＮｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇａｎｔｉｇｅｎ−２；
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１
０）１巻（１９７３年）、第１９２６頁〕などと名付ら
れている。これらのＣＥＡ関連抗原と交差反応する抗Ｃ
ＥＡ抗体を利用すると、その交差反応性のためにＣＥＡ
測定値に影響を与え、正確な測定値が得られない。 また、ＥＩＡで用いられる標識用酵素としては、安定で
高感度測定が可能であり、標識化反応時に損傷を受けな
いことが望ましい。これまでにペルオキシダーゼ、β−
Ｄ−ガラクトシダーセ°、アルカリフオスファターセ゛
、クルコースオキシダーゼなどが用いられているが、上
記の酵素ノうち、ペルオキシダーゼは分子量約４万の極
めて安定な酵素で、酵素活性も高いため最、も繁用され
ている。 ペルオキシダーゼをＥＩＡに利用するにあたって、ペル
オキシダーゼと免疫化学的活性物質とを予め結合させる
必要があるが、通常行なわれている方法では、それぞれ
欠点を有し、改善が切望されていた。 問題点を解決するための手段 本発明者らは、上記の事情に鑑み更に検討を重ねたとこ
ろ、サンドイツチ法によるＥＩＡにおいて２種の抗ＣＥ
Ａ抗体を用い、該２種の抗体のうち少なくとも一方がモ
ノクローナル抗体を用い、該サンドインチ法におけるＥ
ＩＡにおいて標識剤としてペルオキシダーゼを用いこれ
と抗体とを一般式 〔式中、ｎけＯないし５の整数全、Ｒは化学結合または
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わ
される化合物で結合させたもの金柑いると、ＣＥＡを高
感度、高精度でしかも微量のＣＥＡを測定できることを
見い出し、また、ＣＥＡｉ含有する癌化組織から非イオ
ン性界面活性剤を含む中性塩溶液で抽出することにより
ＣＥＡ’ｉ変性させることなく精製でき、またこのよう
にして精製されたＣＥＡを用いて製造されたＣＥＡ反応
性モノクローナル抗体を上記ヅンドイノチ法によるＥＩ
Ａに用いると、さらに高精度でＣＥＡを測定することが
できることを見い出し、さらに研究した結果、本発明を
完成した。 本発明は、（１）担体上に保持された抗体、抗原および
標識剤全結合させた抗体を用いるヒト癌胎児性抗原の免
疫化学的測定法において、担体上に保持される抗体と標
識剤を結合させる抗体とが互いに抗原決定部位を重複し
ない２種の抗体であり、該２種の抗体のうち少なくとも
一方がモノクローナル抗体であり、標識剤としてペルオ
キシダーゼを用いこれと抗体とを一般式〔式中、ｎは０
ないし５の整数を、Ｒは化学結合または２価の６員環状
炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わされる化合物で
結合させたものを用いることを特徴とするヒト癌胎児性
抗原の免疫化学的測定法、および （２）、■ペルオキシダーゼと抗体とを一般式〔式中、
ｎは０ないし５の整数全、Ｒは化学結合または２価の６
員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わされる化
合物で結合させたもの、および■ペルオキシダーゼに結
合させる抗体と互いに抗原決定部位を重複せずヒト癌胎
児性抗原に反応する抗体を担体上に保持したものであっ
て、該２種の抗体のうち少なくとも一方がモノクローナ
ル抗体であるもの全含有するヒト癌胎児性抗原の免疫化
学的測定用試薬である。 本発明におけるモノクローナル抗体は、ヒト癌胎児性抗
原を含有する癌化組織から、非イオン性界面活性剤を含
む中性塩溶液で抽出し、精製されたヒト癌胎児性抗原で
免疫された哺乳動物のリンパ球とミエローマ細胞との融
合細胞から得られたヒト癌胎児性抗原反応性モノクロー
ナル抗体であることがさらに好ましい。 また、本発明におけるベルオキシグーゼト抗体との結合
に際し、ベルオキシグーゼにあらかじめチオール基を導
入したものを用いることがさらに好ましい。 本発明において用いられる担体上に保持された抗体にお
ける担体としては、たとえば、ゲル粒子（例、アガロー
スゲル［［ｌＪ、セファロース４Ｂ。 セファロース６Ｂ（ファルマシア・ファインケミカル社
（スエーデン）製〕、デキストランゲル〔例、セファデ
ックスＧ−７５，セファデックスＧ−１００，セファデ
ックスＧ−２００（ファルマシア・ファインケミカル社
製）〕、ポリアクリルアミドゲル〔例、バイオゲルｐ−
３ｏ、バイオゲルＰ−６０，バイオゲルＰ−１００（バ
イオラッド・ラボラトリーズ社（米国））〕、セルロー
ス粒子〔例、アビセル（脂化成製）、イオン交換セルロ
ース（例、ジエチルアミンエチルセルロース、カルボキ
シメチルセルロース）〕、物理的吸着剤〔例、ガラス（
例、ガラス球、ガラスロッド。 アミノアルキルガラス球、アミノアルキルガラスロンド
）、シリコン片、スチレン系樹脂（例、ポリスチレン球
、ポリスチレン粒子）、イムノアッセイ用プレート（例
、ヌンク社（デンマーク）製）〕、イオン交換樹脂（例
、弱酸性陽イオン交換樹脂〔例、アンバーライトＩＲＣ
−５０（ローム・アンド・ハース社（米国〉製）、ゼオ
カーブ２２Ｇ（パームチット社（西ドイツ）製）〕９９
弱塩基性陰イオン交換樹脂例、アンバーライトＩＲ−４
Ｂ。 ダウエックス３（ダウケミカル社（米国）製）〕）など
が挙げられる。 担体に抗体を保持させるには、公知の常套手段を応用し
得るが、たとえば“代謝、第８＠（１９７１年）、第６
９６頁に記載されているブロムシアン法、グルタルアル
デヒド法などが挙げられる。また、より簡易な方法とし
て物理的に担体表面に吸着させてもよい。 本発明で用いられる抗体としてはモノクローナル抗ＣＥ
Ａ抗体もしくはポリクローナル抗ＣＥＡ抗体が用いられ
る。抗体の製造における免疫に用いる抗原としては、自
体公知の方法〔Ｋｒｕｐｅｙら。 イムノケミストリー（Ｉｍｍｕｎｏｅｈｅｍｉｓｔｒｙ
） 、第９巻（１９７２年）、第６１７頁〕で精製し
たＣＥＡ、更に望ましくは、ヒト癌組織から非イオン性
界面活性剤を含む中性塩溶液により抽出、精製されたＣ
ＥＡ画分が用いられる。 ヒト癌化組織としてはＣＥＡを含有するヒト癌化組織な
らいずれでも用いることができるが、特にヒト大腸癌組
織が望ましい。ヒト大腸癌組織としては、あらゆる段階
の大腸癌組織を用いることができるが、テユークス（Ｄ
ｕｋｅｓ ）ＣもしくはＤの段階のものが望ましい。 非イオン性界面活性剤としては、細胞成分を可溶化でき
るものならばいずれでも良いが、とりわけエチレンオキ
シド系非イオン界面活性剤〔例、Ｔｗｅｅｎ ２０．
ＴｗＣｅｎ ４０．’ Ｔ〜νｎｏｎ ３Ｑ、 Ｔｒｉ
ｔｏｎ Ｎ −１，０１、ＴｒｉｔｏｎＸ −１００、
Ｌｏｂｒｏｌ ＷＸ、 Ｂｒ１ｊｉ９６など、シグマ社
（米国）製〕が用いられる。 中性塩としてはたとえば塩化ナトリウム、塩化カリウム
、硫酸すトリウムなどが良好に用いられる。ヒト癌化組
織あたり、約１ないし１０倍量の約０．１ないし４％エ
チレンオキシド系非イオン界面活性剤を含む約０．０５
Ｍないし３Ｍ塩化すｌ−’）ラムもしくは塩化カリウム
を抽出用溶媒とＩ７て用いることが好ましい。 更にＣＥＡの抽出に際しては、抽出効率を向上させるた
め、攪拌、振盪、超音波処理などを行なってもよい。 上記の方法で得られたＣＥＡ抽出液は自体公知の精製手
段（例、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティ・クロ
マトグラフィー、ゲル電気法１）こコ史に精製すること
ができるＣ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｃ＋ｎ１ｓＬｒｙ、第９
巻（１９７２年）、ｆＪＮ６１７頁。ＣａｎｃＣｒＲｅ
５ｅａｒｃｈ 、第３５巻（１９７５年）、第２９２８
頁参照〕。 これらの精製手段によりＣＥＡの純度を蛋白量あγこり
約数バーセン１−から数１０パーセントまでに濃縮する
ことができる。 モノクローナル抗ＣＥＡ抗体はＭｉｌｓＬｃｉｎらの方
法〔ネイチュア（Ｎａｔｕｒｅ ） 、第２５６巻（１
９７５年）、第４９５頁〕と同様の方法で作製すること
ができる。例えば、上記精製ＣＥＡを抗原として免疫し
て得られたマウス牌細胞とマウスのミエローマ細胞とを
融合させることにより、モノクローナル抗ＣＥＡ抗体を
分泌する融合細胞（）蔦イブリドーマ）を作製すること
ができる。 すなわち、ハイブリドーマは精製ＣＥＡであらかじめ免
疫しておいたマウス（たとえばＢ Ａ Ｌ Ｂ／Ｃ系）
から得られた牌細胞と、同系マウスのミエローマ細胞（
たとえばＭ Ｓ −１、Ｐ Ｓ −Ｕ ｉなど）とを細
胞融合剤（たとえばポリエチレングリコール、センダイ
ウィルスなど）の存在下で混合し、融合、培養すること
によって得られる。牌細胞とミエローマ細胞との混合比
は１：１ないし１０：１種度が有利に用いられる。 このようにして得られたノ・イブリドーマとしては、後
述の実施例１−（２）で得られた・・イブリドーマＭＯ
２７１−１０）（モノクロナール抗体 Ｍｏ −−Ｔ２
）が挙げられ、該／・イブリドーマは、財団法人発酵研
究所に昭和６０年（１９８５年）３月４日に受託番号Ｉ
Ｆ０５００３３として寄託されている。 ハイブリドーマはヒポキサンチン−アミノブチリン−チ
ミジン培地（ＨＡＴ培地：ネイチュアー。 第２５６巻（１９７５年）、第４９５頁〕等を用いて選
択的に増殖させることができる。 細胞培養液中に目的とする抗体が含まれているかどうか
については自体公知の酵素免疫測定法を用いて検定する
ことができる。ＣＥＡに特異性の高い抗体を産生するハ
イブリドーマはさらに通常の限界希釈法によりモノクロ
ーン化される。得られた目的とするハイブリドーマは通
常の液体培地または哺乳動物の腹腔内で増殖させること
ができる。ハイブリドーマが産生ずるモノクローナル抗
体は公知の方法（たとえば硫酸アンモニウムによル塩析
、ＤＥＡＥセルロースカラムクロマトグラフィーなど）
により濃縮精製される。 モノクローナル抗体はＣＥＡに対して反応性が高く、正
常組織や非担癌患者由来の試料に対Ｉ２ては反応性がは
るかに小さい性質を有する抗体が選ばれる。サンドイツ
チ法によるＥＩＡ用として２種類のモノクローナル抗体
が用いられる場合、それぞれの抗体の抗原決定部位が異
な−）でいるものが選ばれる。 ポリクローナル抗ＣＥＡ抗体は通常の方法で調製するこ
とができる。即ち、精製ＣＥＡがヒト以外の温血動物に
接種される。ヒト以外の温血動物としては、たζえば哺
乳温血動物（例、ウサギ、ヒツジ、ラット、マウス、モ
ルモッｌ−、ウシ、ウマ、ブタ）、鳥類（例、ニラ１−
リ、ハト、アヒル。 ガチョウ、ウズラ）などが挙げられる。該抗原をヒト以
夕）の温血動物に接種する方法と
【７ては、動物に接種
する抗原は抗体を産生するに有効な汲でよく、たとえば
ウサギに１回約０．１〜１０ｍｇを等容量（１ｔＩＬＬ
＞の生理食塩水およびフロイントの完全アジュバント
で乳化して、背部ならびに後肢掌皮下に４週問おきに５
回接種すると抗体を産生させ得ろ場合が多い。 このようにして、温血動物中に形成された抗体を採取す
る方法としては、たとえばウサギでは、通常最終接種後
７日から１２日の間に耳静脈から採血し、遠心分離して
血清として得られる。得られた抗血清は、公知の方法に
従って塩析し、通常、ＣＥＡを保持させた担体を用いる
アフィニティクロマトグラフィーで吸着した両分を回収
することによりポリクローナル抗ＣＥＡ抗体を精製する
ことができる。 本発明で用いられる２種の抗体は、モノクローナル抗Ｃ
ＥＡ抗体でもポリクローナル抗ＣＥＡ抗体であってもよ
いが、少なくとも一万がモノクローナル抗体であるのが
好ましい。また、抗体分子ばＩｇ（到でもよく、または
そのフラクション（例、１；’（ａｂ’）２． Ｆａｂ
’もしくはＦａｂ ｌであってもよい。 なかでも、４Ｆ！体にに保持された抗体における抗体が
、モノクローナル抗ＣＥＡ抗体のＦ（ａｂ’ ） ２ま
たけＦａｂ’であることが好ましい。 このようにして得られた抗ＣＥＡモノクローナル抗体は
、ＣＥＡのサンドイツチ法によるＥＩＡにおける試薬と
して用いることができる。 標識剤であるペルオキシダーゼとしては、種々の起源の
ものを用いることができるが、その例としてはたとえば
西洋わさび、パイナツプル、イチジク、せ諸、ソラマメ
、トウモロコシなどから得られるペルオキシダーゼが挙
げられ、特に西洋わさびから抽出されたホースラディツ
シュ ペルオキシダーゼ゛（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ
ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（ＨＲＰ）が好ましい。 ペルオキシダーゼと抗体とを化合物ＣＩ）で結合するに
あたり、あらかじめペルオキシダーゼにチオール基を導
入したものを用いると好都合である。 チオール基をペルオキシダーゼに導入する方法としては
、ペルオキシダーゼのアミノ基を介してチオール基を導
入することができる。たとえば、Ｓ−アセチルメルカプ
トサクシニックアンハイドライト（ＡＭＳＡと略称する
こともある１Ｓ−ａｃｃＬｙｌ ＋ｎｅｒｃａＩルｏｓ
ｕｃｃｉｎｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ） 、 Ｎ−サク
シニミジル：３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネー
ト（ＳＰＤＰと略称することもある； Ｎ −ｓｕｃｃ
ｉｎｉｍｉｄｙｌ ３−（２−ｐｙｒｉｔｌｙｌｄｉＬ
ｈｉｏ ） ｐｒｏｐｉｏｎａＬｅ ：）など通常のチ
オール基導入試薬が有利に用いられる。 したがって、チオール基をペルオキシダーゼとの間に一
定の基が入っていることとなってもよい。 ＡＭＳＡを用いる場合、ペルオキシダーゼ約０．１ない
し１０ｍｇを中性の緩衝液（たとえば０．１Ｍ ＋）ン
酸緩衝液）約０．２ないし２ ｍＬに溶解し、約０．１
ないし４ ｍｇのＡＭＳＡを約０．０１ないし０．１ｔ
ｎＬかＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解して加え、
約１０〜１２０分間、約４〜３５℃で反応させる。次に
約０．２〜２Ｍヒドロキシルアミンを加えて約４〜３５
℃で約１〜６０分間反応させ、ゲルクロマトグラフィー
で精製してチオール化ペルオキシダーゼを得ることがで
きる。 ５ＰＤＰを用いろ場合、ペルオキシダーゼ約０゜１ない
し１０ａｇを中性の緩衝液（たとえば０．１ Ｍリン酸
緩衝液）約０．１〜１耐に溶解し、約０．１〜８ ｍｇ
の５ＰＤＰのエタノール溶液を加えて約４〜３５°Ｃで
約１０〜１２０分間反応させる。ゲルクロマトグラフィ
ーで過剰の試薬を除去したのち、ジチオスレイトール（
ｄｉＬｂｉｏむｈｒｓｉｔｏｌ ） などの還元用試
薬を加えて還元し、更にゲルクロマトグラフィーで精製
してチオール化ペルオキシダーゼを得ることができる。 ペルオキシダーゼと抗体とを結合させる化合物として、
一般式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
される化合物を用いるが、上記式中、Ｒで表わされる２
価の６員環状炭化水素残基としては、飽和のもの、不飽
和のもののいずれでもよい。飽和の２価の６員環状炭化
水素の例としては、たとえば１．２−．１．８−．１．
４−シクロヘキシレンが挙げられ、不飽和の２価の６＠
環状炭化水素残基の例としては、たとえば１．２−．１
．３−．１．４−フェニレンなどが挙げられる。 該化合物〔Ｉ〕において、ｎとしては１ないし５の整数
が好ましく、特に１が好ましい。Ｒとしては２価の６＠
環状炭化水素残基が好ましく、特に１．４−シクロヘキ
シレンカ好マシい。 本発明の方法において用いられる化合物ＣＩ）は、たと
えばザ・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｔｈ
ｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
） 第７９巻２３３頁（１９７６年）、ヨーロピアン
・ジャーナル拳オブーバイオヶミス１へり−（Ｅｕｒｏ
ｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ ｏｒＢｉｏｃ＋＋ｅｍｉｓも
ｒｙ ）第１０１巻３９５頁（１９７９年）、特開昭５
２−８５１６８号公報、特開昭５２−８５１６４号公報
等に記載の方法あるいはこれらの方法に準じて製造する
ことができる。たとえば、一般式 〔式中、Ｘは水酸基またはハロゲン原子を示す。 １０）およびＲは前記と同意義を有する。〕で表わされ
るマレイミド化合物（ＩＩＩと一般式〔式中、Ｙは水素
原子またはアルカリ金属原子を示す。〕で表わされるサ
クシンイミド化合物〔■〕とを脱水剤あるいは脱酸剤の
存在下で反応させることにより製造することができる。 上記一般式において、ハロゲン原子としては塩素、臭素
などが挙げられ、アルカリ金属原子としてはたとえばす
Ｉ・リウム、カリウムなどが挙げられる。また反応に用
いられる脱水剤としてはたとえば、硫酸。 ジシクロへキシルカルボジイミドなどが、１悦酸剤とし
てはたとえばピリジン、トリエチルアＦンなどが挙げら
れる。 前記化合物〔ＩＩ）は、たとえば特開昭５２−８５１６
４号公報に記載の方法あるいはこれに慴して製造するこ
とができる。たとえば一般式％式％ 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義へ・打する。〕で表
わされる化合物〔Ｉ■〕を脱水閉環せしめることにより
得られる。該脱水閉環させるには、脱水剤たとえば無水
酢酸又は無水酢酸と酢酸ナトリウム（無水物）を用い、
温和に加熱することにより反応させることができる。 さらに別法として、ヘルベティ力・キミカ・アクタ（Ｈ
ｅ１ｖｅＬｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ ＡｃＬａ ）第５
８巻（１９７５年）５３１頁に記載されている方法ある
いはこれに準じて製造することができる。たとえば、一
般式 〔式中、２はアルキル基を示す〕で表わされるＮ−アル
コキシカルボニルマレイミド〔ｖ〕と、一般式 ％式％ 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
されるアミノ酸ＣＶＩ）とを反応させて、一般式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
されるマレイミド化合物〔■〕を得る。次に一般式ＣＩ
［［］で表わされるサクシレイ２ド化合物ＣＩＩＩ〕を
加え先に述べたと同様の脱水剤もしくは脱酸剤の存在下
で反応させることにより製造することができる。 上記一般式〔■〕で表わされる化合物においてＺで表わ
されるアルキルとしては、たとえばメチル、エチルが挙
げられる。 ベルオキシダーセに化合物〔■〕を反応させるには、両
者をｐＨ約６ないし８の緩衝液中で約１０ないし５０′
Ｃの温度で約１０分ないし２４時間反応させることによ
って行なわれる。該緩衝液としては、たとえばｐＨ７，
０の０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液。 ｐＨ６，３の０．０５Ｍ！Ｊン酸緩衝液などが挙げられ
る。 このようにして得られたマレイミド化ベルオキシグーゼ
の精製は、たとえばゲルクロマ１−グラフィーなどによ
り行なうことができる。該ゲルクロマトグラフィーを行
なう際に用いられる担体としてはたとえばセファデック
スＧ−２５［ファルマシア・ファインケミカル社（スエ
ーデン）Ｍｌ、。 バイオゲルｐ−２Ｃバイオ・ラッド・ラボラトリーズ社
（米国）製〕などが挙げられる。 マレイミド化ベルオキシグーゼを抗ＣＥＡ抗体と反応さ
せる場合、抗ＣＥＡ抗体ＩｇＧあるいはペプンン分解し
て得られたＦ（ａｂ’）２画分を、メルカプトエチルア
ミン類の存在下で還元し、ゲルクロマトグラフィーによ
って精製された抗ＣＥＡ抗体ＩｇＧもしくはＦａｂ’
とマレイミド化ベルオキシダーセとを反応させる。 該反応は、両者を緩＠液中で約Ｏ０ｃないし４゜０Ｃの
温度で、約１ないし４８時間反応させることにより行な
うことができる。該緩＠液としては、たとえばｐ Ｈ６
，０の５ ｍ Ｍエチレンジアミン四酢ｒ１勺ナトリウ
ム塩を含む０． Ｉ Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる
。 このようにし、で得られたベルオキンクーセ標識抗体は
、たとヌばケルクロマ１−グラフィーなどに。Ｌり精製
することができる。該ゲルクロマトグラフィーに用いら
４する担体としては、たとえばウルトロケルＡｅＡ ４
４ ［ＬＫＢ社（フランス）製〕、セファクリルＳ−２
００［：ファルマシア・ファインケミカル（スエーデン
）製コなどが挙ケラれる。 本発明の測定方法を以下に具体的に説明する。 まず、■：担体に保持された抗体に、測定すべきＣＥＡ
含有の分析対象物を加えて抗原抗体反応を行った後これ
に前記で得られたペルオキシダーゼと抗ＣＥＡ抗体との
結合物を加えて反応させる。 本発明の酵素免疫測定法において測定対象となるＣＥＡ
を含む被検試料としては、尿、血清、血景、髄液あるい
は各種臓器抽出物等が挙げられ、とｔ）わけ尿、血清お
よび面素が繁用される。 ■：■で得られた反応生成物にペルオキシダーゼの基質
を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定す
ることにより上記の反応生成物の酵素活性ｉ知る。 ■二上記■−■の操作を既知喰のＣＥＡの標ｑ溶液に対
し予め行ない、ＣＥＡと吸光度も１７＜は蛍光強度との
関係を標準曲線として作成しておく。 ■：未知量のＣＥ Ａを含む分析対象物について得られ
た吸光度もしくは蛍光強度を標準曲線にあてはめ、分析
対象物中のＣＥＡ含量を測定する。 本発明のサンドインチ法によるＣＥＡの免疫化学的測定
法に用いられる定量用キットとじては、［Ａ）主として
、 （１）担体上に保持された抗ＣＥＡ抗体（２）本発明方
法により得られたペルオキシダーゼで標識化された抗Ｃ
ＥＡ抗体（化合物ＣＩ）を用いて結合されている。） 上記（１）および（２）の２種の抗体のうち少なくとも
一方はモノクローナル抗体である。 さらに、１０）１体上に（ｙ持される抗体は、Ｆ（ａｂ
’）２ｉだはｌｉ”ａｂ’が好寸しい。 （３）標準ＣＥＡ （４）１−記（２）〜（３）の試薬および被検試料の希
釈に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた
約１０％牛血清および約１％牛血清アルブミン（以下、
Ｂ Ｓ Ａと略称することもある。）を含むｐ Ｈ約６
ないし９のリン酸緩衝液またはグリノン緩衝液が挙げら
れる。）。 （５）ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬。その−
例とし′Ｃ蛍光法の場合、酵素基質どしてｐ−ハイドロ
キシフェニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、（）−
フェニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用
いる緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応
停止液。 が挙げられる。 〔Ｂ〕主として、 （１）担体上に保持された抗ＣＥＡ抗体。 （２）本発明方法により得られたペルオキシダーゼで標
識化された抗ＣＥＡ抗体（チオール化されたペルオキシ
ダーゼと抗ＣＥＡ抗体とが化合物ＣＩ）を用いて結合さ
れている。）。 （３）標準ＣＥＡ。 （４） 上記（２）〜（３）の試薬および被検試料の
希釈に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめ
た約１０％ピノシ血清および、約１％牛血清アルブミン
（以下、ＢＳＡと略称するｒ、ともある。）を含むｐＨ
約６ないし９のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙
げられる。）。 （５）ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬。その−
例として蛍光法の場合、酵素基質としてＩ）−ハイドロ
キノフェニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、０−フ
ェニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用い
る緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停
止液。 が挙げられる。 さらに〔り主として、 （１） 担体−ヒに保持された抗ＣＥＡ抗体。 （２）本発明方法により得られたペルオキシダーゼで標
識化された抗ＣＥＡ抗体（チオール化されたベルオキン
々−セと抗ＣＥＡ抗体とが化合物〔■〕を用いて結合さ
れている。） −１二記（１）および（２）の２種の抗体のうち少なく
とも一方はモノクローナル抗体である。 さらに、担体に保持さｔしる抗体は、Ｆ （ａｂ’ ）
２ま、ｉはＦａｂ’であることが好ましい。 （３）標慴ＣＥＡ。 （４）上記（２）〜（３）の試薬および被検試料の希釈
に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた約
１０％ヒツジ血清および約１％牛血清アルブミン（以下
、ＢＳＡと略称することもある。）を含むｐＨ約６ない
し９のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げらねる
。） （５）ベルオキシターセ活性測定に必要な試薬。その−
例として蛍光法の場合、酵素基質として１）−ハイドロ
キシフェニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、０−フ
ェニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用い
る緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停
ＦＦ液。 が挙げられる。 一ヒ記のキットは例えば下記の方法により使用すること
ができる。 標準ＣＥＡもしくは被検収約ｘｏｔｃいし２００ＬＬｅ
に試薬（４）を加えて希釈し、一定量の試薬（１）を加
えて約Ｏないし４０°Ｃで約１ないし・１８時間反応さ
せる。担体を水洗後、試薬（２）の約１０ないし３００
μｅを加えたのち、約０ない（７４０°Ｃで反応させる
。約１ないし４８時間反応後、担体を洗浄し担体、トに
結合しているベルオキシダーセ活性を測定する。即ちベ
ルオキシグーセの基質収約１０〜１０００μｅを加え−
Ｃ約２０〜４０６Ｃで約０２〜２４時間反応させたのち
、酵素反応を停止させ、反応液中の吸光度もしくは蛍光
強度を測定する。 本発明の免疫化学的分析法用試薬を用いれば、通常の臨
床検査室において簡単な操作でＣＥＡの高感度測定が可
能となる。 実施例 参考例１ 過塩素酸抽出法による精製およびモノクロー
ナル抗体の作製 （１）抗原の精製 Ｋｒｕｐｅｙらの方法〔イムノケミストリー（Ｉｍｍｕ
ｎｏ−Ｃｈｅｍｉ ５Ｌｒｙ ） 、第９巻（１９７２
年）、第６１７頁」ζ・−べ（じてＣＥＡを精製した。 才なわち大腸癌組ｖ＆１００ ｙを細断し、これに４０
０１の蒸留水を加えてホモジナイザーで水冷下１時間破
砕して懸濁液を３１０）■製した。次に、等容量の２Ｍ
過塩素酸を加えて室温で３０分間攪拌して抽出しｊ二。 次に遠心分離し、その上清について蒸留水に対して透析
したのち凍結乾燥した。次に０．１５ Ｍ ＮａＣ１を
含ｆＪＯ，０５Ｍリン酸緩衝液を用いてセファロース４
Ｂ［ファルマシア製（スエーデン）〕のカラム（２，３
ｃｍＸ １００ａｉ ）にかけてゲルクロマトグラフ、
イー１行な−）ｔこ。ＣＥＡを含むフラクションを透析
し、凍結乾燥後、更にセファテックスＧ−２００のカラ
ム（２，３ｃｍＸ ｔ ＯＯｏｎ ）でケルクロマトク
ラフィーを行ない、ＣＥＡ溶出画分を透析、凍結乾ｒＳ
Ｌ −ｃ ｅ Ｅ Ａ ノｆ、ｌ；製抗Ｊ１５−ｉ
ｆ、、得ｆ、：（３：ｌｑ）。 （２） モノクローナル抗ＣＥＡ抗体の作製１）１０
）項（１）で得た精製抗ｇ７０μｇ覆生理食塩水１５０
〃ｒに溶解し、これに７０インドの完全アジ。 バントＣＦｒｃｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄ
ｊｕｖ＋１ｎＬ 、 ”免疫の生化学“、橘ら著、第２
６頁、共立出版株式会社（１９６７年）：［５Ｏμｌを
加えてよく昆（イ）し−Ｃ乳削を作り、こ才］をＢＡＬ
Ｂ／Ｃマウス皮下に投月した。更に、２週毎に２回、フ
ロイノ１−の不完全アジュバン！・を用いて免疫し、最
終免疫４旨シて精製抗原１３０μｇを生理食塩水に溶解
して得た４ ００ ｔｔｅを静脈投与し、３日後肺臓を
取り出した。次に、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｒ
ｉｅｄ Ｍ ＦＪＭ 培地でよく洗浄したのち、当該
肺細胞１×１０８個とマウスミエローマ細胞（ＰａＵ＋
） ２ Ｘ ｔ ｏ７個とを混合し、７００ ｒＩ曲
で１５分間遠心してペレットをつくった。次にポリエチ
レングリコール６ｏｏｏをＲＰＭＩ−１６４０に４５％
に溶解した液０．４ ａｔを加、ｔｒ、更ニＲＰＭＩ−
１６４０，１５ｍｌを徐々に加えて希釈したのち、７０
０ ｒｐｍで１５分間遠心分離し、細胞を２０％牛脂児
血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地１００ ｒｎｌに分
散さぜた。次に２４ウエルの培養ブツート〔フロー社製
（米国）〕に上記細胞分散液２． Ｏｍｌずつ注入し、
更に２日日。 ５日日、および８［コ目に培養上清の半量をＨＡ Ｔ培
地におきかえた。１４日後における培養上清に−）いて
抗体価をｆｌｉ１０）定したところ、計１２０ウェル中
１２ウェルに陽性を認めた。 次に、これら陽性ハイブリドーマのクローニングを牛脂
児面清２０％およびＢＡＬＢ／Ｃマウス胸腺細胞をフィ
ーター（ｆｅｅｄｅｒ ）として加えた。 ＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈し、限界希釈（ｌｉｍ−
ｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ）法を繰り返して行な
い最終的にはモノクローナル抗ＣＥＡ抗体を産生ずる１
２種類のハイブリドーマが得られた。これらを鉱油で処
理されたＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に注入し、２〜３
週間後に腹水を採取することにより、モノクローナル抗
ＣＥＡ抗体を得た。これらのモノクローナル抗体を硫酸
アンモニウム法で塩析し、それぞれグロブリン画分を得
た（ＭＯ−Ｋｌ〜ＭＯ−に１２）。 参考例２ 過ヨウ素酸架橋法 伸根らの方法〔ザ・ジャーナル・オブ・ヒストケミスト
リー・アンド・サイトケミストリー（Ｔｌｉｅ Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｒ ＨｉｓＬｏｃｌ＋ｅｍｉｓｔｒ
ｙ ａｎｄ Ｃｙも６ｃｈｅ−ｍｉｓＬｒｙ ）第
２２巻（１９７４年）第１０８４頁〕に従って行なった
。７ＩＩＩｇの西洋わさびベルオキノターセを１ ｍｌ
の０．：９Ｍ重炭酸ナトリウム溶液（ＰＨｓ、ｌ）にと
かし、０．１ ｍｌの１％ｌ−フルオロ−２，４−ジニ
トロベンセンを加えて室温で１時間反応させた。次にＱ
、Ｑ ６ＭＮａＩＯ４１ｍｌヲ加エテ室温で３０分間攪
拌したのち、０．１６Ｍエチレングリコール水溶液１
ｍｌを加えて室温で１時間放置した。０，０１Ｍ炭酸ナ
トリウム緩衝液（ＰＨ９，５）に対；ッて１夜透析した
。 後述の実施例１−（２）で得られたモノクローナル抗Ｃ
ＥＡ抗体ガンマ・グロブリンフラクション（Ｍ ｏ −
Ｔ３） ５１０）１ｇを０．０１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ９，５） １ ｍｌにとかし、先に調製したア
ルデヒドペルオキシダーゼと混合して室温で３時間反応
させてから、５■の水素化硼素ナトリウムに加えて４℃
で１夜反応させた。０．１５ Ｍ ＮａＣ５を含む０．
０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，１）に対して４８Ｃで１
夜透析した後、ウルトロゲルＡｃＡ４４を充てんしたカ
ラム（１，５ｃｍＸ ４５６１０）） ｋ用いるゲルク
ロマトクリフィーにかけ、０．１Ｍリン酸緩衝液 （＋
）Ｈ６，５）で溶出させた。後述の実施例１−（５）と
同様に溶出液の２８０および４０３ｎｍの吸光度ならび
に酵素活性を測定して目的フラクションを分取した。得
られたモノクローナル抗ＣＥ ｈ抗体−ＨＲＰ複合体ハ
ＢｓＡト１．テ０．１％、マーチオレートとして０．０
０５％になるようにして４６Ｃで保存した。 実施例 １ （１）抗原の精製 大鯖癌組織２００．を細断し、これに６００ ｙｔＬの
１％Ｔｗｅｅｎ ２０ Ｃシグマ社（米国）製〕を含む
０、１５ Ｍ ＮａＣ４溶液を加えてホモジナイザーで
水冷下１０分間破砕して懸濁液を調製した。さらに超音
波発生機で水冷下１時間処理したのち、１２゜０００
ｒｐｍ ２０分間遠心分離した。上清を蒸留水に対して
透析したのち凍結乾燥した。次に０．２Ｍクエン酸緩衝
液（Ｐｌ（６，５）に溶解し、同じ緩衝液を用いて調製
したコンカナバリンＡ結合セファロース４Ｂ〔ファルマ
シア製（スエーデン）〕のカラム（２，２ｃ７ＩＩ Ｘ
２６ ｃｍ ）にかけた。カラムに保持された物質を
α−メチル−Ｄ−マンノサイドを含む緩衝液を用いて溶
出した。蒸留水に対して透析したのち凍結乾燥した。次
に０．２ Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６，５）を用いてウ
ルトロゲルＡｃＡ−３４（ＬＫＢ社製（フランス）〕の
カラム（２，３Ｃ３ｌＸＩＱＱＣＩＩ）にかけてゲルク
ロマトグラフィーを行ない、２８０〜３５０ ｍｌの両
分を蒸留水に対して透析し、凍結乾燥してＣＥＡの精製
抗原を得た（５■）。 （２）モノクローナル抗ＣＥＡ抗体の作製前項（１）で
得た精製抗京ＴＯ７ｔｇを生理食塩水１５０μｅに溶解
し、これにフロイントの完全アジュバントＣＦｒｃｕｎ
＋ｌ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎＬ
、 ’免疫の生化学“、橘ら著、第２６頁、共立出版株
式会社（１９６７年）〕２５０μｅを加えてよく混和し
て乳剤を作り、これをＢＡＬＢ／Ｃマウス皮下に投与し
た。更に、２週毎に２回、フロイントの不完全アジュバ
ントを用いて免疫し、最終免疫として精製抗原１３０１
ｔｇ を生理食塩水に溶解して得た４００バに静脈投与
し、３日後牌臓を取り出した。 次に、ＤｕＬｂｅｃｅｏ’８ｍｏｃｌｉｒｉｅｄ Ｍ
Ｅ Ｍ培地でよく洗浄したのち、当該牌細胞ｌＸ１０個
とマウスミエローマ細胞（Ｐ３ＵＩ） ２ Ｘ １０７
個とを混合し、７００ｒｌｌｍで１５分間遠心してベレ
ットをつくった。次にポリエチレングリコール６０００
ヲＲＰ Ｍ Ｉ −１６４０に４５％に溶解した液０
．４ｍｌを加えて、更にＲＰ Ｍ Ｉ −１６４０１５
ｍｌを徐々に加えて希釈したのち、７００ ｒｐｍで１
５分間遠心分離し、細胞を２０％牛脂児血清を含むＲＰ
ＭＩ−１６４０培地１００ ｍｌに分散させた。次に２
４ウエルの培養プレート〔フロー社製（米国）〕にＦ記
細胞分散液２． Ｏｍｌずつ注入し、更に２「１目、５
［１目、および８日日に培養ト清の！１′！：ｉ′ｉ（
′をＨＡ Ｔ培地におきかえた。１４日後における培養
上清について抗体価を測定したところ、計７２ウェル中
９ウェルに陽性を認めだ。 次に、これら陽性ハイブリドーマのクローニングを牛胎
児血清２０％およびＢＡＬＢ／Ｃマウス胸腺細胞をフィ
ーター（ｆｃＣｄｃｒ ）として加えたＲＰＭＩ−１６
４０培地で希釈し、限界希釈（Ｉｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉ
ｆｕｓｉｏｎ ）法を繰り返し−Ｃ行ない最終的に（
ｋロックローナル抗ＣＥＡ抗体を産生−１ｒろ５種類の
ハイブリドーマが得られた。これら４鉱油で処理９され
たＢＡＩ、Ｂ／Ｃマウスの腹腔内に注入し、２〜３週間
後に腹水を採取することにより、モノクローナル抗ＣＥ
Ａ抗体を得た。これらのモノクローナル抗体を硫酸ア
ンモニウム法で塩析し、それぞわグロブリン画分を得た
（ＭＯ−Ｔ＋〜ＭＱ−Ｔ６）。 （３）ポリクローナル抗ＣＥＡ抗体の作製前項（１）で
得た精製抗原２ ｙａｇを生理食塩水１耐に溶解し、こ
れにフロイントの完全アジュバント１ｍｌを加えてよく
混和して乳剤を作り、これをウサギの両大腿部筋肉内お
よび背部皮下数箇所に注射した。以上の操作を３週毎に
５回行ない最終免疫後１週間で採血して抗血清を得た。 硫酸アンモニウム法で塩析してグロブリン画分を調製し
ｔこのち、Ｃ）ＥＡ結合セファ０−ス４Ｂのカラムを用
いるアフィニティ・クロマトグラフィーに供した。カラ
ムに保持された抗体画分を０．１７Ｍグリシン−塩１”
″ツ衝Ｉｆ（ｐＨ２，８）で溶出することにより、 Ｃ
ＫＡに強い親和性を有するポリクローナル抗体を得た。 （４）モノクローナル抗体の反応性の比較前項（２）お
、よび参考例１で得られた各種七ツク１】−ナル抗体の
ＣＥＡおよび関連抗原に対する反応性を調べた。 試薬： ■ 前項（２）および参考例１で得られたモノクローナ
ル抗ＣＥＡ抗体感作マイクロプレート■ 西洋わさびペ
ルオキシダーゼ （以下ＨＲＰと略称する）標識抗ＣＥ
Ａ抗体複合体［ＤＡＫＯＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（
テンマーク）製〕■ ＣＥＡおよびＣＥＡ関連抗原 ■ 緩衝８１Ｂ （１０％子牛血清、０．１５ＭＮａＣ
ｌを含むｐＨ７，０の０．０２Ｍリン酸緩衝液）、緩衝
Ａ （０，１５ＭＮａＣ１を含むｐＨ７，０の０．０２
Ｍ リン酸緩衝液） ■ ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬０．０２％
過酸化ｙＪ＜素ト０．１５％０−フェニレンジ７Ｅンを
含むｐ Ｈ４，８の０．１Ｍクエン酸−リン酸二すｌ−
ＩＪウム緩衝液および反応停止液（２Ｎ−硫酸）。 抗体感作マイクロプレートの、ｌｉＪ、′、Ｉ製：ＥＩ
ＡＪＩＩイノ、ノブレート１しヌンク社（テンマーク）
１４更〕の各ウェルに０．１ Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９６
）で希釈ｊ−て調製した前項（２）あるいは参考例１の
モノクローナル抗ＣＥＡ抗体溶液（５ｏ／ｌ／ｍ１３
）を１００７ｔｅずつ注入して４°Ｃで一夜放置して感
作させた。０１％ＢＳＡを含む０．０１Ｍ！Ｊン酸緩イ
！ｌｉｉ液（ｐＨ７，０）で洗浄し／このち、用時１で
冷所保存した。 σ用定 ： 緩衝液Ｂ Ｋ溶解させたＣＥＡあるいはＣＥ Ａ関連抗
原標鵡浴？（’ｉ １ ’ＯＯｐｌを各ウェルに注入し
、８７ ’Ｃで３時間反応させた。各ウェルを緩衝液Ａ
で洗浄佼、ＨＲＰ標識抗ＣＥＡ複合体溶液（Ｊ（ＲＰと
し、て３０ ｎｇ／ウェル） １．００１’ｌ！を加え
て２５”Ｃで３５時間さらに反応させた。緩ｆ！Ｉｉｔ
液Ａで洗浄し、これに００２％過酸化水素と０．１５％
〇−フエごレンジアミンを含む０．１ Ｍクエン酸−リ
ノ酸ニナトリウム緩衝液（１）Ｈ４，８）１００．ｚｉ
ｌを加えて３０”（１’３０′＋間反応させ、２Ｎ−イ
ビＣ酸１ｏｏ、ｌＬｇずつ加えて反応を停止させてから
、マイクｒｘクレー１−用自動比色計しタイターチック
・マルチスキャン；フロー社（米国）製〕を用い、ブラ
ンクを対照にして４９０ ｎｍにおける吸光度を乙用定
した。 結果を第１表に示したが、前記（２）で得ら、１０）ま
た上２ツクローナル抗ＣＥＡ抗体は、６抗体中４抗体で
ＣＥ Ａ関連抗体であるＮ ＣＡ （ｎｏｎｓｐｅｃｉ
ｆｉｃ ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅ
ｎ ）やＮ ＣＡ−２（ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃｃｒｏ
ｓｓ−ｒｅａｃｔｉｒ、ｇ ａｎｔｉｇｅｎ −２）と
反応せず、シ／コがって高い確率でＣＥＡに特異的なモ
ノクローナル抗ＣＥＡ抗体の得られることが分った。一
方、参考ｊ＋Ｑ １ ｃ得られたモノクローナル抗ＣＥ
Ａ抗体は】２抗体中１抗体（ＭＯ−に６）だけがＮＣＡ
ならびにＮＣＡ−２どは反応せず残りの１０）抗体はこ
れらのＣＥＡ関連抗体と反応した。 第１表 ＭＯ−Ｋ１．−＋＋ に２ − ＋ ＋
Ｋ ３ ＋ ↓ ＋
に４ − − ＋
に５ − ＋ ＋
に６ − − −に
７ ＋ ＋
＋に３ ＋
十 ＋に９
＋ ＋
＋ＫＩＯ−−＋ に１０） − ＋
÷に１２−よ十 ＭＯ−Ｔ１＋＋＋ Ｔｊ −−− Ｔ３ − − −Ｔ
４ − − −Ｔ５
＋ ＋
＋Ｔ６ − − −
十：反応性あり −二反応性なし く５）モノクローナル抗１本（ｐｉ （ａ ＋）’ ）
２フラグメント）の・製造 前項′２）で得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体Ｔ−
クログリンフラクション（Ｎｉ（Ｉ Ｔ４）５Ｎ１０
）をｏＩＭ酢酸緩萌面（ｐ）（３，０）１屑ｌに溶解し
、０５睨のペプシン１：６０，０００（シグマ計装、Ｕ
ＳＡ）を加え、３７ ’Ｃで１時間反応させた。中和後
＋ニア ルトｃ＋ゲルＡｃＡ ４４ （ＬＫＢＬｔ’に
、Ｘウエ−デン）カラム（直ｑ ２ ｔｙｎ 、長さ７
５ｍ）（二よるゲルクロマトで精製し、モノクローナル
抗ＣＥ Ａ抗体（Ｐ（ａｂ’）２フラゲメント）を得た
１、（６）七ノイＦローナル抗Ｃ１ＤＡ抗体（Ｆ ａ
１０）’ フラグメント）の・装造 前項（５）で１；）られた−仁ノクローナル抗ＣＥＡ抗
体（ト″’ （ａｂ’）２７ ｉグメニ／ト）を１ ｍ
Ｎｌ ｘチレンジアミン四耐酸すｌ−リウム塩を含む
０．１ Ｍ ＋’Ｔ’＋酸緩岨腋（ｐＨ５，０）で−＆
透析した後、透析Ｈ１０ｍｌに２−ｊ ｊ、 ０．１５
八・１２メルカプ１−エチルアミンｉ、 ｍｌ ヲ１ｆ
１０）え、３７ ’Ｃで２時間反応させた１０）反応後
セファデックスＱ −２５カラム（直伜１．５１ 、
ｌ、〜さ２５備）によるゲルクロマトグラフィーで精製
し、モ／ り０−ナル抗ＣＥＡ抗体（Ｐａｂ’フラグメ
ントを得た。 （７）ポリクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’） −Ｈ
ＲＰ複合体の製造 （ａ） マレイミド基の導入 ６ ｍｇの西洋わさびペルオキシダーゼ〔ベーリンガー
マンハイム社（西ドイツ） 製：） ヲｉ ａｔの０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、５０ｔｔ＃
のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドにとかした結合試薬Ｍ
ＭＣ（一般式［Ｉ）において、ｎ＝１．Ｒ＝シクロヘキ
シレンである化合物） ４．８ ｍｇ ヲ加えて３０°
Ｃで６０分間攪拌しながら反応させた。 生成した沈殿を遠心分離して除去し、上清をセファデッ
クスＧ−２５のカラム（１，ＯＸ、４５α）に通Ｉ７、
Ｑ、 Ｉ Ｍ ＩＪン酸緩衝液で溶出させた。タンパク
を含む両分を分取し、コロジオン膜を用いて淵縮した。 このようにして調製したマレイミド化ベルオキシダーセ
においてベルオキシター上１分子あたり導入されたマレ
イミド基の数は１０〜１．２個であった（ベルｔキシ々
′−セの分子ｊｉ；ｊ ｆｊ２４０．０００．Ｅ２８”
”” ＝２２．７５として、ｉＨ’Ｊ）。 １％ （１＋） マレイミド化ベルオキンターセと抗ＣＥＡ
抗体（Ｆ ：ｌ ＋１’フラグメノト）との複合体の１
トリ造前項（３）で得られたポリクローナル抗ＣＥＡ抗
体５ ｍｇに０．１ ｍｇのペプシンを加え３０℃で一
夜反応後、セファデックスＧ−１５０カラム（直径２．
５−、長さ５５α）で精製した。得られた抗体Ｆ（工ｓ
ｂ’）２ 画分を２−メルカプトエチルアミンで還元
し、セファデックスＧ−２５のカラムによるケルクロマ
トグラフィーで精製してつ廿キ抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’
フラグメノト）を得た。 上記（＋Ｌ）で調製したマレイミド化ベルオキシターセ
１．５ ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（戸６゜０）０．
１５ｍ１に溶解し、先に得た抗ＣＥＡ抗体（Ｆ ａ １
＋’ フラグメント）１．８ｍｇヲとかした５ｍＭエ
チレンンアミン四酢酸ナトリウム塩を含む０．１Ｍリン
酸緩衝液（ＰＨ６，０） ０．１５ ｍＬを加えて４′
Ｃで２０時間１又応させた。反応後、ウルトロケルＡ’
ｉ・Ａ４４を充てんしたカラム（１，５Ｘ４５ａ＋＋）
を用いるゲルクロマトグラフィーにかけ、０．ＩＭＭリ
ン酸緩衝ｎ！ｉ（ｐＨ６，５）で溶出さセた。溶出液の
２８０ ｎｍの吸光度ならびに酵素活性を測定した。ベ
ルオキンターセとパフ材・〜抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’
７ラグ７）（・）との複合体が生成していることを、
以下の１５法で確認した。 まず、酵素活性の測定はギルバルトらの方法〔アナリテ
ィカル・ケ乏ストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｂｅ
−＋ｎ１ＳＬｒｙ ）、第４０巻（１９６８年）、１２
５６頁〕で行なった。、即ち、溶出液の各フラクシヨン
を０．１％ウシ血清アルブミンを含む０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）で１８００倍に希釈した。このｌＯ
μｅに０．１％ウシ血清アルブミンを含む０．０５Ｍ酢
酸すｌ・リウム緩衝液（Ｐ１′（５０）に溶解した０゜
５％Ｐ−ハイドロキシフェニル酢酸０．、２５ ｍｌを
加えて渥合し３０°Ｃで５分間インキュベー トＬ、た
。 次に０．０１％過酸化水素０．０５ ｍｌを加えて３０
°Ｃで２０分反応させ！こ。０，１Ｍグリシ〉緩衝液（
ＰＩ（１０，３） ２．５＋ｘＬを加えて酵素反応を停
止させ、ｌｕ ｙ ／ ａｔのキニー・の蛍光強度を１
００とし励起光３２０ ｎｍにおける４ ０５ ｎ ｍ
の蛍光強度を測定した。 結果を第１図に示す。第１図において、４−は２８０旧
ｎにおける吸光度を、−一はベルオキシターセ活性（蛍
光強度として）をそれぞれ示す。 フラクション３８付近においてベルオキシダーセと抗Ｃ
ＥＡ抗体（Ｆ ａ ｌ）’ フラグメン１〜）との複
合体の生成が極めて良好であることが分かった。 （８）モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆ ａ ｂ’ ）
−ＨＲＰ複合体の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体γ−
グロプリンフラクショノ（Ｍｏ−Ｔ３）５ｍｇを０．１
Ｍ酢酸緩衝液（ｐ）４４．２ ） １ ｍｌに溶解し０
．２５ ｍｇのペプシンを加え３７°Ｃで一夜反応させ
る。 中和後セフ１テックス（、−１５０カラム（直径２゜５
ｃ＋ｎ 、長さ５５ ｃｍ ）で精製した。得られた
Ｆ （ａ ｂ’）２画分を２−メルカプトエチルアミン
で還元し、セファデックスＧ−２５のカラムによるゲル
クロマトグラフィーで精製し−Ｃモノクローナル抗ＣＥ
Ａ抗体（Ｆａｌｙ’フラグメノト）を得た。 次に前項（７）−（ａ）で調製したマレイミ］・化ペル
オキシダーゼ１．５ ｍｇＩ Ｏ，Ｉ Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ６，０）０、１５ ｍｌに溶解し、先に得たモノ
クローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’ ７ラグメント）
１．８ ｍｇをとかしｊ、二５ｍＭエチレンジアミ：／
四酢酸ナトリウム塩を含むＱ、 ｌ Ｍリン酸緩衝液（
ＰＨ６，０） ０．ｔ ５ｍｌを加：（て４°Ｃで一夜
反応させた。反応後、ウルトロゲルＡｅＡ ４４を充て
んしたカラム（１，５Ｘ４５０）を用いるゲルクロマト
グラフィーにかけ、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，
５）で溶出させた。前項（７）と同様に溶出液の２ｇＱ
＋ｉｍの吸光度ならびに酵素活性を測定して目的フラク
ションを分取した。得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗
体（Ｆ ａ ｂ’ ）−ＨＲＰ複合体はＢＳＡとして０
．１％、マーチオレートとじて０．００５％になるよう
に調ｊ整して４°Ｃて保存した。 （９）モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）−ＨＲＰ
複合体の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体カン
マグロブリンフラクション（Ｍ Ｏ−Ｔ ２ ） ５ｍ
ｇｊ２０． Ｉ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５） １
ａｔに溶解し４０μｅのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド
にとかした結合試薬ＭＭＣ（一般式〔Ｉ〕において、ｎ
−１、Ｒ−ノクロヘキンレンである化合物）０．２２ｍ
ｇを加えて２５°Ｃで４５分間攪拌しながら反応させた
。生成した沈殿を遠心分離して除去し、上清をセフアゾ
、リスＧ−２５のカラム（１，０Ｘ４５−）に通し、０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ）１６．８）で溶出させた。タ
ンパクを含む両分を分取し、コロジオン膜を用いて濃縮
した。このようにして調製したマレイミド化ＩｇＧにお
いてＩｇＧ １分子あたり導入されたマレイミド基の数
は５．９個であった。 別に、１０Ｉ＋ＩｇのＨＲＰを１．４ ｍｌの０．１Ｍ
リン酸Ｆ［［（ＰＨ６，５） ＋ｃｍＷｉ ｔ、、１０
０ｄ（１）エタノールにとかした結合試薬５ＰＤＰ（Ｎ
−サクシニｊジル−８−（２−ピリジルジチオ）−プロ
ピオネ−ト ｉ Ｎ −ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙ
ｌ−８−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉＬｈｉｏ ）−ｐ
ｒｏｐｉｏｎａｔｅ） １．２５ ｍｃｔを加えて２５
℃で３０分間攪拌しながら反応させた。反応液はセファ
デックスＧ−２５のカラム（１，Ｏｘ４５ｃｍ）に通し
０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）で溶出させて５ＰＤ
Ｐを除去した。次にジチオスレイトール（ｄｉＬｌ＋１
ｏＬｌ＋ｒｏ−ｉｔｏｌ） １７ｍｇを加えて還元し
、再びセファデックスＧ−２５のカラム（１，ＯｃｍＸ
４５ｃｍ ）を用いるゲルクロマトグラフィーで精製
してチオール化ＨＲＰを得た。 次に先に調製しＯ６２ｍｌに濃縮したマレイミド化Ｉｇ
Ｇ ３ ｍｇと、Ｑ、 ２ ｍＬに濃縮したチオール化
ＨＲＰ６ ｍｇとを４°Ｃで１６時間反応させた。反応
後、ウルトロゲルＡｃＡ ４４ （Ｌ Ｋ Ｂ社製（フ
ランス）〕を充てんしたカラム（１，５ｃｍＸ ４５０
１ ）を用いるゲルクロマトグラフィーにかけ、０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）で溶出させた。前項（７
）と同様に溶出液の２８０ ｎｍの吸光度ならびに酵素
活性を測定して目的フラクションを分取した。得られた
モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ） −ＨＲＰ複合
体はＢＳＡとして０．１％、マーチオレー１・とじて０
．００５％になるように調整して４６Ｃで保存した。 （１０）モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）−ＨＲ
Ｐ複合体の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体ガン
マグロブリンフラクション（ＭＯ−Ｔ２）５ｍｇを０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐ）１６．５ ） １ ｍｌに溶解
し、０、６ ｍｇのＳ−アセチルメルカプトサクシニッ
クアンハイドライド（Ｓ −ａｃｅｔｙｌｍａｒｃａｐ
ｔｏ ５ｕｃｃｉｎｉｃ ａｎｌ＋ｙ−＋Ｉｒ１ｄｅ）
を４０ｕｊのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解して
加え３０分間２５°Ｃで反応させた。 ０、１ Ｍ ｌ−リス緩衝液（ｐＨ７，Ｏ） ０．２
ｍｌおよびＩＭヒドロキノルアミン０．２ ｍｌを加え
て、さらに５分間３０’Ｃで反応させたのら、セファデ
ックスＧ−２５のカラム（Ｌ、ＱＸ４５ｃｍ）を用いる
ゲルクロマトグラフィーで精製してチオール化モノクロ
ーナル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）？得た。 次に前項（７） −（ａ）で調製したマレイミド化ベル
オキシグーセ１．５ ｍｇを０．１ Ｍリン酸緩衝液（
ＰＨ６，０）０、２ ｒｎｔに溶解し、先に得たチオー
ル化モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）３ｍｇと５
ｍ Ｍ エチレンジアミノ四酢酸ナトリウム塩とを含
む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，Ｏ） ０．２ ｍｌ
を加えて４°Ｃで一夜反応させた。反応後、ウルトロゲ
ルＡｃＡ ３４を充てんしたカラム（１，５Ｘ４５ｃｍ
）を用いるプルクロマトグラフィーにかけ、０，１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６，５）で溶出させた。前項（７）と
同様に溶出液の２８０ ｎｍの吸光度ならびに酵素活性
を測定して目的フラクションを分取した。得られたモノ
クローナル抗ＣＥ Ａ （Ｉ ｇＧ）−ＨＲＰ複合体は
ＢＳＡとして０．１％、マーチオレートとして０．００
５％になるように調整して４°Ｃで保存した。 （１０））モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆ（ａＬ）’
）２ ）−ＨＲＰ複合体の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体Ｔ−
グロブリンフラクション（Ｍｏ −Ｔ２ ） ２５１０
）ｆｌをｏＩＭ酢酸緩＠液（ｐＨ３，０） ５ ｍｌに
溶解し、２、５１０）４のペプシンを加え、３７℃で１
時間反応させた。中和後クルトロゲルＡｃＡ４４カラム
（直径２α、長さ７５１）によるゲルクロマトで精製し
、モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆ（ａｂ’）２フラグ
メント）を得た。 次に、モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｐ （ａｂ’）２
フラダメント）５１０）Ｉｉ／をｏ、ｔｆｖｆリン酸緩
衝液（１）Ｈ６，５）１ ｍｌに溶解し４０μｌのＮ、
Ｎジメチルホルムアミドにとかした結合試薬ＭＭＣ（一
般式［１］において、ｎ＝１．Ｒ−シクロヘギシレンで
ある化合物）０．２２＃を加えて２５℃で４５分間攪拌
しながら反応させた。生成した沈殿を遠心分離して除去
し、上清をセファデックスＧ−２５のカラム（１，０ｚ
ｘ４５備）に通し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，８
）で溶出させた。タンパクを含む両分を分取し、コロジ
オン膜を用いて濃縮しマレイミド化Ｆ（、ａｂ’）２を
得た。 別に、１０９のＨＲＰを１．４厘ｌの０．１ Ｍリン酸
Ｆｌ）ｔ＋Ｔｆ［（Ｉ）Ｈ６，５） ニ溶解シ、１００
ｔｔｅノ：ｒ−タ／ −ル（二とかした結合試薬５１）
ＤＰ［Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ヒリシルシチオ
）−フロピオネ−ト ； Ｎ −ｓｕｃｃｉｎｉｍｉ
ｄｙｌ −３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）
−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ ］ １．２５１〃りを加えて
２５”Ｃで３０分間攪拌しながら反応させた。反応液は
セファデックスＧ−２５のカラム（１，０口Ｘ ４５
ｃｙｓ ）に通し０．１Ｎ１酢酸緩衝面（ｐｌ−１５，
０）で溶出させてＳ ＰＤ Ｐを除去した。次にジチオ
スレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔ−ｈｒｃｉｔｏｌ ）
１７ Ｈ９を加えて還元し、再びセファデックス（）−
２５のカラム（１，０備×４５備）を用いるゲルタロマ
ドグラフィーで精製して千オール化ＨＲＰを得た。 次に先に調製し０．２ ｍｌ に濃縮したマレイミド化
Ｆ（ａｂ’）２３Ｗと、０．２ ｍｌに濃縮したチオー
ル化１（ＲＰ ６ ｑとを４℃で１６時間反応させた。 反応後、ウルトロゲルＡｃＡ ４４ ［ＬＫＢ社製（フ
ランス）］を充てんしたカラム（１，５ＧＩＸ４５ｆｆ
ｉ）ｆｒ用いるゲルタロマドグラフィーしかけ、０．１
Ｍリン酸緩衛液（ｐＨ６，５）で溶出させた。前項（７
）と同様に溶出液の２８０ｎｍの吸光度ならびに酵素活
性を測定して目的フラクションを分取した。 得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体Ｆ（ａｂ’）２−
ＩＩＲｆ）複合体はＢＳＡとして０１％、マーチオレ
ートとして０．００５Ｑ６ｉ二なるよう（二調整して４
′０で保存した。 実施例２ （ａ）各種ＨＲＰ複合体の比較（感度、非特異的吸着） 実施例１で得られた各種ＨＲＰ複合体の性能について調
べるｔこめＥＩＡを行なった。ＥＩＡ用の試薬として、
次のものを用いた。 試薬： ■ 抗ＣＥＡ抗体感作マ・イクロプレート■ 実施例１
、参考例２で得られたＨＲＰ複合体、あるいはＤＡＫＯ
イムノグロブリン社製（デンマーク）抗ＣＥＡ抗体Ｉ（
ＲＰ複合体■ 標準ＣＥＡ ■ 緩衝液Ｂ（１０％子牛血清、Ｑ、 ｌ ５ Ｍ Ｎ
ａＣ１を含むｐｌ（７，０の０．０２Ｍリン酸緩衝液）
。 緩衝液Ａ（０−１５Ｍ ＮａＣ１を含むｐＨ７，０の０
０２Ｍリン酸緩衝液） ■ ベルオキンクーセ活性測定に必・塩４ｃ試薬０．０
２％過酸化水素ｊ０．１５９お＋１−７７ ｘ ニレン
ジアミンを含む・ｐＨ４，３の０．１Ｍクエン酸−リン
酸二十トリ・”７ム緩衝液お、よび反応停止液（２Ｎ−
硫酸） 抗体感作マイクロづレートの調製： ＥＩＡ用イムノプレートＩ［ヌン・り社（テノマーク）
製）の各ウェルにポリクローナル抗ＣＥＡ抗体〔タコ・
イムノグロブリン社（デンマーク）製〕を０． Ｉ Ｍ
炭酸緩衝液（ｐＨ９，６）で希釈して調製した抗体溶液
（５０ａｙ／ｍｌ）を１００１Ｌｌずつ注入して４°Ｃ
で一夜放置して感作させた。０．１％ＢＳＡを含む０．
０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄しｔコのち、
用時まで冷所保存した。 測定： 緩衝液Ｂ（こ溶解させたＣＥＡ標準溶液１００ＬＬｅを
各ウェルに注入し、３７°Ｃで３時間反応させた。 各ウェルを緩ｆｆ１ｆｉ、Ａで洗浄後、実施例１で得ら
れｆ： ＨＲＰ １合体あるいはタコ・イムノグロブリ
ン（Ｄ Ａ Ｋ Ｏｂｎｎ＋ｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ
）社製ポリク。−→−ル抗ＣＥＡ抗体−ＨＲＰ複合体
溶液（それぞれ酵素活性一定、 ＨＲＰとして３０’ｎ
ｇ／ウェル）１００Ｊ を加えて２５°Ｃで３．５時
間さらに反応させた緩衝液Ａで洗浄し、これに０．０２
％１過酸化水素と０．１５％Ｏ−フェニレンシアんンを
含む０．１ Ｍクエン酸−リン酸二すトリウム緩衝１（
ｐＨ４，８）１００ｕｅ を加えて３０°Ｃで３０分
間反応させ、２Ｎ−硫酸１００ＩＬｌ！ずつ加えて反応
を停止させてから、マ、イクロブレート用自動比色計〔
タイターチック・マルチスキャン・フロー社（１）ｆｆ
ｌを用い、ブランクを対照にして４９０ｎｍにおける吸
光度を測定した。結果を第２表に示したが、参考例２で
得られたＨＲＰ複合体およびグコ・イムノグロブリン社
製ＩＩ ＲＰ複合体〔２ステ、ブ グルタルアルデヒド
法；イムノケミストリー（Ｉｍｍｕｎｏ−ｃＩＩｃｍｉ
ｓＬｒｙ ）、第８巻（１９７１年）、ｍ１０）７５頁
〕と比べて実施例１で得られた本発１０）のＨＲＰ複合
体はそれぞれウェルへの非特異的吸着は極めて小さく、
また高感度を与えた。 （以下余白） 第２表 （ｂ） 各種担体保持抗体の比較（添加回収試験）実
施例１で得られた各挿担体保持抗体の性能にについて調
べるためＥＩＡを行なった。ＥＩＡ用の試薬として、下
記のものを用い、正常人血清について添加回収試験を行
なった。 試薬： （１） 実施例１で得られた各踵抗ＣＥＡ抗体の感作
ポリスチレン球 （２）実施例１． （９）で得られたペルオキシダーゼ
標識抗ＣＥ Ａ抗体複合体 （３）標準ＣＥＡ （４）上記（２）、 （３１の試薬の希釈上用いる緩４
ｉ［Ｅ：１０９６羊血清、０．１９６牛血清アルブミン
。 ０、１ Ｍ ＮａＣ１を含むｐＨｒ、２）ｏ、ｏ ｔＭ
リン酸緩衝液 （５）ｏ−フェニレンシアミン （６）上記（５）ノ溶解に用いる緩衝液Ｉ）： ｏ、
０２９６過酸化水素、０５００２％メルチオレートを含
むｐＨ４，８の０１Ｍクエン酸緩酸液 （７）停止液：２Ｎ硫酸 各種坑ＣＥＡ抗体感作ポリスチレン球の調製：０．１〜
１炭酸緩新液（ｐｉ−１９，６）で希釈して調製した実
施例１の（２） 、 （５） 、 （６）項のモノクロ
ーナル抗ＣＥＡ抗体溶液（１００μ’ｊ／ｎｌ ）
Ｌ ＯＯＢｌ中にポリスチレン球（直径６．５ ｍｍ
、株式会社イチゴ）７００個を浸し、５℃で３日間放置
して感作させた。 更に、１％ＢＳＡを含む０．０２ＭＩＪン酸緩嘴液（ｐ
＋−ｒ ７． Ｏ’）で洗浄した後、用時まで冷却保存
した。 操作： 標準（ＩＡ溶液あるいは被検試料５０μｌ（＝試薬（１
）１個および試薬（４）で希釈した試薬（２） ２５０
μｌ（複合体として約２００ｎｇ）を添加し、３７℃で
１時間反応させた。ポリスチレン球を精製水で水洗し、
試薬（６）テ溶解Ｌり０．２％（７）試薬（５）５００
μｅを加えて、室温で３０分間反応させた後、２ＮＨ２
ＳＯ４１，５ｍｌを添加して反応？停止させ、４９２ｎ
ｍの吸光度を測定した。 上記の操作方法により、正常人血清検体にＣＥＡを１０
ｎ９７ｍｅ添加して添加回収試験を行なった。 その際、血清検体について前処理（５６℃、３０分間加
温）した場合と前処理しない場合について添加回収率を
比較検討した。結果を表３表に示す。 血ｔ１４検体を前処理した場合、いずれの担体保持抗体
も良い添加回収率を示した。しかし前処理しない場合、
モノクローナル抗ＣＥＡ抗体ｒ−グロブリンでは血清中
のインヒビターの影響のためか添加回収率は低かったが
、Ｆ（ａｂ’）−およびＦａｂ’ フラグメントでは良
い添加回収率を示した。 第３表 １）血清検体を前処理（５６℃、３０分間）した場合 ２）血清検体な前処＋１ｐ Ｌない場合（Ｃ） ＣＥＡ
の免疫化学的測定キットおよびＣＥ Ａの４）１０）定 下記のＣＥＡ免疫化学的測定キットを用い、下記の操作
法に従って正常人および担１＜＋＋患者血清中のＣＥ
Ａ濃度を測定した。 ＣＥＡの免疫化学的測定キット： （１）実施例１− （５）で得られたモノクローナル抗
ＣＥＡ抗体Ｐ （ａｂ’ ）２−ｙ ラ、グメント（Ｍ
Ｏ−Ｔ４）の１． ＯＯμＱ／ｄ ０．１ Ｍ炭酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ９，６）１００ｍ／中にポリスチレ
ン球（直径６．５ｍ。 株式会社イチコ製）７００個を浸し、５℃で３日間イン
キュベートし、更（二１９６ＢＳＡを含む０．０２ Ｍ
ＩＪン酸緩斬液（ｐｌ−１７，０）で洗浄してなる抗
体感作ポリスチレン球 （２）実施例１−（１０））で得られるベルオキンダー
ゼ標識抗ＣＥＡ抗体複合体 （３）０〜２００ｎｇの標準ＣＥＡ （４）上記（２） 、 （３）の試薬および被検試料の
希釈」−用いる緩ｔ＋ｆ［Ｊ ： １０ Ｑ６羊血清、
０．１％牛血清アルフミン、 ０．１ＭＮａＣ１を含
むＩ）１−Ｉ ７．２（７）０．０１Ｍリン酸緩衝液 （５）０−フェニレンジアミン （６）上記（５）の溶解（二用いる緩術面り：０．０２
％過酸化水素、０．００２％メルチオレートを含むｐｔ
＋４．８の０．１ Ｍクエン酸緩衝液 （７）停止ａ★：２Ｎ硫酸 操作方法 標準ＣＥＡ溶面あるいは被検試料５０μｅに試薬（１）
１個および試薬（４）で希釈した試薬（２） ２５０μ
ｅ（複合体として約２００１０）ｇ）を添加し、３７℃
で１時間反応させた。ポリスチレン球を精製水で水洗し
、試薬（６）テ溶解シタ０．２ｑ６（７）試薬（５）５
００Ｊを加えて、室温で３０分間反応させた後、２ＮＨ
２３０４１，５ｙｔを添加シテ反応を停止代セ、４９２
１０）ｍの吸光度を測定した。 上記の方法（二より、正常人および担癌患者血清中のＣ
ＥＡ濃度を測定した。 結果は第４表に示される。 （以下８シ） 第４表 正常人血清 １０．５ 正常人血ｉ ２ １．０ 正常人血清 ３２．５ 正常人血清 ４１．４ 正常人血清 ５１．９ 胃 癌 患 者 血 清 １２．１ 血 清 ２ １５．０結腸
６患者 血 清 １ １３．６血
清 ２ １３８．０血
清 ３ ２４．０乳 癌 患
者 血 清 １３．６ 血 清 ２ １０．５血
清 ３ ７００すい腺癌患者 ４１０）１定の結果、正常人血清のＣＥＡ値は０．５〜
２，５ｎＶ／ｍｌ （平均１．４ ｎＱ／ｍｌ ）であ
ったが各種癌患者血清のＣＥＡ値は高値を示し、最大１
３８ ｎ９１ｍ１となった。 （ｄ）ＣＥＡの免疫化学的測定キットおよびＣＥＡの６
１０）１定 下記のＣＥＡ免疫化学的測定キットを用い、下記の操作
法に従って正常人および担癌患者血清中のＣＢＡ購度を
測定した。 ＣｇＡの免疫化学的測定キット： （１）実施例１− （５）で得られたモノクローナル抗
ＣＥＡ抗体Ｆ（ａｂ’）２７ラグメント（ＭＯ−Ｔ４）
の１００パ／ｄ ０．１ Ｍ炭酸ナトリウム緩＠液（ｐ
Ｈ９，６）Ｌｏｏｍｔ中にポリスチレン球（直径６．５
順。 株式会社イチコ製）７００個を浸し、５℃で３日間イン
キュベートし、更に１％ＢＳＡを含む００２Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）で洗浄してなる抗（ｉζ１・８作ポ
リスチレン球 （２）実施例１− （９）で得られるペルオキシダーゼ
標識抗ＣｇＡ抗体複合体 （３） ０〜２０００ｇの標準ＣｇＡ （４）上記：２） 、 （３）の試薬および被検試料の
希釈上用いる緩衝酸Ｅ：ｔＯ％羊血清、０．１ｑ６牛血
清アルブミン、０、Ｉ Ｍ ＮａＣ１を含むｐ Ｈ７，
２（Ｄ ０． ＯＩ Ｍリン酸緩衝液 （５）Ｏ−フェニレンジアミン （６）上記（５）の溶解に用いる緩＠液り：０．０２％
過酸（ヒ水素、０．００２％メルチオレートを含むｐＨ
４８のｏＩＭクエン酸緩斬液 （７）停止液＝２Ｎ硫酸 操作方法 標ｔ＄ＣＥＡ溶腋あるいは被検試料５０μｅに試薬（１
）１個および試薬（４）で希釈した試薬（２） ２５０
μｌ（複合体として約２０ Ｏｎ９）を添加し、３７℃
で１時間反応させた。ポリスチレン球を精製水で水洗し
、試薬（６）テ溶解した０２％の試薬（５） ５００
ｌｔｅを加えて、室温で３０分間反応させた後、２ Ｎ
Ｈ２ＳＯ４１、５ｍｌを添７１０Ｌで反応を停止させ
、４９２１ｍの吸光度を４１０）１定した。 上記の方法（二より、正常人および担癌患者血清中のＣ
ＥＡ濃度を測定し、第４表と同様の結果が得られた。 （ｅ）ＣＥＡの免疫化学的測定キットおよびＣＥＡの測
定 下記のＣＥＡ免疫化学的測定キットを用い、下記の操作
法に従って正常人および担癌患者血清中のＣＥＡ濃度を
測定した。 ＣＥＡの免疫化学的測定キット： （１） 実施例１． （２）で得られたモノクローナ
ル抗ＣＥＡ抗体ガンマグロブリンフラクション（ＭＯ−
Ｔ４）の１５ μ９／ ｍＬ Ｏ，ＯＩ Ｍ ＮａＣ１
−０，０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨｓ、ｏ ） １００
ｍｌ中にポリスチレン球（直径４、８ ｍｍ、 Ｐｒｅ
ｃｉｓｉｏｎ ＰＩａｓＬｉｃｓ Ｂａ１ｌ Ｃｏ、、
ＣＩ＋ｉｃａｇｏ。 Ｕ、Ｓ、Ａ、） １５００個を浸し、５°Ｃで１夜イン
キユベートし、更に０．１％ＢＳＡを含む０．０５Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄してなる抗体感作ポリ
スチレン球 （２）実施例１． （９）で得られるベルオキシターゼ
標識抗ＣＥＡ抗体複合体 （３） ０−２００１０）．の標準ＣＥＡ（４）上記
（３）の試薬および被検試料の希釈上用いる緩衝液Ｂお
よび緩衝液Ａ（前項（ａ）参照）（５）Ｏ−フェニレン
ジアミン （６）上記（２）の試薬の希釈に用いる緩衝液Ｃｉ０．
１％ウシ血清アルフミン、０．００２％メルチオレート
を含むＰＨ７，５の０．１． Ｍ ！Ｊン酸緩衝液（７
）上記（５）の溶解に用いる緩衝液Ｄ；０．０２％過酸
化水素０．００２％メルチオレートを含むＰＩ（４，８
の０．１Ｍクエン酸緩衝液 （８）停止液ｉ２Ｎ硫酸 操作方法 標準ＣＥＡ溶液あるいは被検試着１５０μで（非働化し
たもの）（二試薬（４）緩衝液Ｂ２５０μｅおよび試薬
（１）１個を添加し、室温で１日間反応させた。ポリス
チレン球を緩衝液Ａで水洗後、試薬（６）で希釈した試
薬（２） ３００μｅ（複合体として約３０１ｇ）を添
加し、４℃で１日間反応させた。ポリスチレン球を緩＠
液Ａで水洗し、試薬（７）で溶解した０、１５％の試Ｘ
（５） ５００ ／ｌｌを加えて室温で４０分間反応さ
せたのち、２Ｎ硫酸１．５ ＊Ｉ！を添加して反応な停
止させ、４９２τｌｎｌの吸光度を４１０）１定した。 上記の方法Ｃ二より、正常人および担癌聴者血清中のＣ
ＥＡ濃度をｌ１ｌｌｌ定した。結果は第５表に示される
。 （以下余白） 第５表 被検試料 ＣＥＡｉｉ１度（ｎ ｇ ／’ｍＬ ）正
常人血清 １０．５ 正常人血清 ２１．０ 正常人血清 ３０，７ 正常人血清 ４１．６ 正常人血清 ５１．２ 胆のう癌患者 血 清 １ ８７血 清
２ １０．３肝 癌 患 者 血 清 １ ６４血 清
２ ２０．８胃癌患者 血 清 １０）．４ 血 清 ２９，６ 血 清 ３５．０ 結腸癌患者 血 清 １ ５６５血 漬
２ ３８５二 清 ３１０）３ 抑 癌患者 皿 清 】５７ ｆｌｌ１０）定の結果、正常人血清のＣ，ＥＡ値は０．
５〜１゜２ ｎｇ／ ｍｌ （平均１． Ｏｎｇ／ ａ
Ｌ ）であッｔ：が各種癌患者血清のＣＥＡ値は高値を
与え最大５６５ ｎｇ／ ｍｌとなった。 実施例３ ＣＥＡ測定用免疫化学的」り定試薬： ＣＥＡを測定するだめの試薬として、次のものが挙げら
れ、壕だ測定方法として次のものが挙げられる。 試薬： ■ 抗ＣＥＡ抗体感作マイクロプレート（≧）実施例１
−４１０）で得られた抗ＣＥＡ抗体ｆ（ＲＰ複合体 ■ 標準ＣＥＡ ■ 緩衝ＩＢ（１０％子牛血清、０． ’１５１ＶＩ
ＮａＣ１を含むｐＨ７，０の００２Ｍリン酸緩揮ｊ液）
、援ｉＪｉ液Ａ （０，１，５Ｍ ＮａＣ１を含むｐ）
（７，０の０．０２Ｍリン酸緩衝液） （の ベルオキ／ダーゼ活性１０）１０）定に必安な試
薬：０．０２％過酸化水素と０．１５％０−フェニレ／
ジアミ／を含むｐｌｔ（４，８の０．１Ｍクエン酸−リ
ン酸二ナトリウム緩衝液および反応停止液（２Ｎ−硫酸
） 抗体感作マイクロプレートの調製： ＥＩＡ用イムノプレートｌ（ヌンク社（デンマーク）製
〕の各ウェルにモノクローナル抗ＣＥＡ抗体γ−グロブ
リン・フラクション（ＭＯ−に５ ）を０．１ Ｍ炭酸
緩衝液（ｐＨ９，６）で希釈して調製した抗体溶液（５
０μｇ／ｍｅ）を１００μｅずつ注入して４“Ｃで一夜
放置して感作させる。０１％ＢＳＡを含む００１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄したのち、用時まで冷所
保存する。 測定： 緩衝液Ｂに浴ｍ：’＜せたＣＥＡ標準溶液あるいは被検
試料１００μ／’ （あらかじめ非動化した被検試料を
希釈した液）を各ウェルに注入し、３７°Ｃで３時間反
応させる。各ウェルを緩衝液Ａで洗浄後、実施例１−
（１０）で得られた抗ＣＥＡ抗体−ＨＲＰ複合体溶液１
００ ｐｌを加、ｊｔで２５°Ｃテ３，５１０）、冒１
０）ｊさらに反応させる。ウェルを緩衝液Ａで洗浄し、
これに０．０２％過酸化水素と０．１５％０−フェニレ
ンジアミンを含む０．１ Ｍクエン酸−リン酸二ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ４，８）１００μｅを加えて３０ ”
Ｃで３０分間反応させ、２Ｎ−硫酸１００μｌずつ加え
て反応を停止させてから、マイクロプレート用自動比色
計しタイターチック・マルチスキャン・フロー社（米国
）製〕を用い、４９０ｎｍにおける吸光度を測定する。 実施例４ ＣＥ Ａ １ｆｌｌｌ定用免疫化学的測定試薬およびＣ
ＥＡのｄ１０）１定： 次に挙げるＣＥＡ測定用免疫化学的測定試薬を用い、次
に述べる方法で正常人と担癌患者との血清中のＣＥＡを
測定した。 試薬： ■ 抗ＣＥＡ抗体感作マイクロプレート■ 実施例１−
（９）で得られた抗ＣＥＡ抗体ＨＲＰ複合体 ■ 標準ＣＥＡ ■ 緩衝液Ｂ（１０％子牛血清、０．１５ Ｍ ＮａＣ
１ｆ含むｐＨ７，ｏのｏ、ｏ ２ＭＩＪｙ酸緩衝ｆｆ）
、緩衝液Ａ （０，１５Ｍ ＮａＣ１を含むｐＨ７，０
の０．０２Ｍリン酸緩衝液） （Ｑ ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬＝００
２％過酸化水素と０．１５％Ｏ−フェニレンジアミンを
含むｐＨ４，８の０，１Ｍクエン酸−リン酸二ナトリウ
ム緩衝液および反応停止液（２Ｎ−硫酸） 抗体感作マイクロプレートの調製： ＥＩＡ用イムノプレート１〔ヌンク社（デンマーク）製
〕の各ウェルに参考例１−（２）で得られたモノクロー
ナル抗ＣＥＡ抗体γ−グロブリン・フラクションＩ’Ｍ
Ｏ−に５）を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，６）で希釈
して調製した抗体溶液（５０ｐＥ／／ｍｅ） を１０
０μｅずつ注入して４℃で一夜放置して感作させた。０
１％ＢＳＡを含む００１Ｍ ’Ｊン酸緩衝液（１）Ｈ７
，Ｏ）で洗浄したのち、用（１ｈ゛まで冷所保存した。 測定： 緩衝液Ｂに溶解させたＣＥＡ標準溶液あるいは被検試料
ｔ００７ｚ／（あらかじめ非動化した被検試料を希釈し
だ液）を各ウェルに注入し、３７°Ｃで３時間反応させ
た。各ウェルを緩衝液Ａで洗浄後、実施例１−（９）で
得られだ抗ＣＥＡ抗体−ＨＲＰ複合体溶液１００７ｚ＃
を加えて２５°Ｃで３．５時間さらに反応させた。ウェ
ルを緩衝液Ａで洗浄し、これに０．０２％過酸化水素と
０．１５％Ｏ−フェニレンジアミンを含む０．１ Ｍク
エン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，８）１０
０μｇを加えて３０°Ｃで３０分間反応させ、２Ｎ−硫
酸１００μｌずつ加えて反応を停止させてから、マイク
ロプレート用自動比色計〔タイターチック・マルチスキ
ャン・フロー社（米国）製〕を用い、ブランクを対照に
して４９０１ｍにおける吸光度を測定した。 結果を第６表に示した。 、７．ミ下余白） 第 ６ 表 一τ倹試料 ＣＥＡ濃度（ｎＩ／驚）正
常人 ＪＪＩＬ イ＊Ａ
１ 。６血清Ｂ１．５ 血清Ｃ１，５ 血清Ｄ １．。 犬、暢癌患者 ｊ旦 清 Ａ
１３１．０皿 清 Ｂ
１４．。 血清Ｃ１３，８ 血 （青 Ｄ ８８．０血清Ｅ
８．４ 回前Ｆ １２．ｇ 実施例５ ｃ Ｅ Ａ ６＋（ｊ定１’ｌ免疫ｆ１−学的測定１ム
（薬：ＣＥ Ａを測定−Ｊ″″るＡ−めの試薬として、
次のものが挙げら：ＩＬ、 ４だ測定方法として次のも
のが挙げられる。 試薬： （１）参考例１（２）で得られたモノクローナル抗ＣＥ
Ａ抗体ガンマグロプリンフラク／ヨン（ＭＯ−に５）の
１５ μｇ／’ｍｌ ０．０１ Ｍ ＮａＣｌ−０，Ｏ
Ｉ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨｓ、ｏ ） ｔ ｏｏｍｌ中
にポリスチレン球（直イ％ ４． ８ ｍ＋ａ 、
Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｂａ
１ｌ Ｃｏ、、 Ｃｈｉｃａｇｏ。 Ｕ、Ｓ、Ａ、 ） １５００個を侵り、、５”Ｃて１夜
イノギ。 べ−トシ２、更にＯ，１％Ｂ Ｓ Ａを含む００５Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄してなる抗体感作ポリ
スチレン球 （２）実施例１（９）で得られたベルオギ／グーゼ標識
抗ＣＥＡ抗体複合体 （３） ０〜２０ Ｏｎ、Ｓ’のけ準ＣＥＡ（４）上
記（３）の試薬および被検試料の希釈ト用いる緩衝液Ｂ
および緩衝液Ａ（実施ＩＺ１０）２ （ａ）参照）（５
）０−フェニレン／アミン （６）上記（２）の試薬の希釈に用いる緩衝液Ｃ；０１
％つ／血清アルブミン、０．００２％メルチオレートを
含むｐＨ７，５の０．１ Ｍ’）ン酸緩衝液（７）上記
（５）の溶解に用いる緩衝液Ｄ；０．０２％過酸化水素
０．００２％ノルチオレートを含むｐＨ４，８のｏ、
］ ＋ＶＩクエン酸緩衝液 （８）停止１−液；２Ｎ硫酸 操作方法 標準ＣＥＡ溶液あるいは被検試料５０／ｌｅ （非動化
Ｌ７たもの）シＣ試薬（４）緩衝液Ｂ２５０μｌおよび
試ｇ（ｔ）１個を添加し、室温で１日間反応させる。 ポリスチレン球を緩衝液Ａで水洗後、試薬（６）で希釈
した試薬（２） ３００μｌ （複合体として約３０ｎ
ｐ）を添加し２．４°Ｃで１日間反応させる。ポリスチ
レン球を緩衝液Ａで水洗し、試薬（７）で溶解した０、
１５％の試薬（５） ５００ ／１０）を加えて室温で
４０分間反応させたのち、２Ｎ硫酸１．５ ｍｌを添加
して反応を停止させ、４９２１ｍの吸光度を測定する。 発明の効果 本発明の試薬を用いると、高感度かつ正確にＣＥＡが測
定され、大腸癌などの消化器癌や他の癌などの診断、予
後管理などに対して極めて有用である。すなわら、本発
明におけるチオール基を導入したベルオキシダーセで標
識された抗体を用いた場合は、固相に対する非持異的な
吸着が小さいのでＣＥＡの測定の盲検値が小さくしたが
って測定の信頼性が増大する。また、本発明で得られた
モノクローナル抗体はＣＥＡに対して親和性が強く、他
のＣＥＡ関連抗原に対する交差反応性がはるかに小さい
ので被検液に同時に存在するＣＥＡ関連抗原からの影響
を受は難い。更に、モノクローナル抗体を試薬の構成成
分としているので製品の供給が容易であり、測定の再現
性が高い。 また、本発明の方法で得られたＣＥＡを免疫原として作
製されたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体は、ＣＥＡに対す
る反応性が高くしかもＣＥＡ関連抗原ＮＣＡ、ＮＣＡ−
２との交差反応を有しないモノクローナル抗ＣＥＡ抗体
である頻度が高く、従ってモノクローナル抗ＣＥＡ抗体
作製方法として有用である。 これらの選択されたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体は免疫
化学的診断剤を構成する成分として利用することができ
る。例えばサンドイツチ法による酵素免疫試験法におい
ては担体上に保持された抗体および（もしくは）酵素で
標識された抗体におけるモノクローナル抗ＣＥＡ抗体と
して用いることができる。これらの診断剤は大腸癌など
の消化器癌や他の癌の診断、予後管理などに利用できる
。 更にこれらの抗体は治療目的にも利用することができる
。
する抗原は抗体を産生するに有効な汲でよく、たとえば
ウサギに１回約０．１〜１０ｍｇを等容量（１ｔＩＬＬ
＞の生理食塩水およびフロイントの完全アジュバント
で乳化して、背部ならびに後肢掌皮下に４週問おきに５
回接種すると抗体を産生させ得ろ場合が多い。 このようにして、温血動物中に形成された抗体を採取す
る方法としては、たとえばウサギでは、通常最終接種後
７日から１２日の間に耳静脈から採血し、遠心分離して
血清として得られる。得られた抗血清は、公知の方法に
従って塩析し、通常、ＣＥＡを保持させた担体を用いる
アフィニティクロマトグラフィーで吸着した両分を回収
することによりポリクローナル抗ＣＥＡ抗体を精製する
ことができる。 本発明で用いられる２種の抗体は、モノクローナル抗Ｃ
ＥＡ抗体でもポリクローナル抗ＣＥＡ抗体であってもよ
いが、少なくとも一万がモノクローナル抗体であるのが
好ましい。また、抗体分子ばＩｇ（到でもよく、または
そのフラクション（例、１；’（ａｂ’）２． Ｆａｂ
’もしくはＦａｂ ｌであってもよい。 なかでも、４Ｆ！体にに保持された抗体における抗体が
、モノクローナル抗ＣＥＡ抗体のＦ（ａｂ’ ） ２ま
たけＦａｂ’であることが好ましい。 このようにして得られた抗ＣＥＡモノクローナル抗体は
、ＣＥＡのサンドイツチ法によるＥＩＡにおける試薬と
して用いることができる。 標識剤であるペルオキシダーゼとしては、種々の起源の
ものを用いることができるが、その例としてはたとえば
西洋わさび、パイナツプル、イチジク、せ諸、ソラマメ
、トウモロコシなどから得られるペルオキシダーゼが挙
げられ、特に西洋わさびから抽出されたホースラディツ
シュ ペルオキシダーゼ゛（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ
ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（ＨＲＰ）が好ましい。 ペルオキシダーゼと抗体とを化合物ＣＩ）で結合するに
あたり、あらかじめペルオキシダーゼにチオール基を導
入したものを用いると好都合である。 チオール基をペルオキシダーゼに導入する方法としては
、ペルオキシダーゼのアミノ基を介してチオール基を導
入することができる。たとえば、Ｓ−アセチルメルカプ
トサクシニックアンハイドライト（ＡＭＳＡと略称する
こともある１Ｓ−ａｃｃＬｙｌ ＋ｎｅｒｃａＩルｏｓ
ｕｃｃｉｎｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ） 、 Ｎ−サク
シニミジル：３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネー
ト（ＳＰＤＰと略称することもある； Ｎ −ｓｕｃｃ
ｉｎｉｍｉｄｙｌ ３−（２−ｐｙｒｉｔｌｙｌｄｉＬ
ｈｉｏ ） ｐｒｏｐｉｏｎａＬｅ ：）など通常のチ
オール基導入試薬が有利に用いられる。 したがって、チオール基をペルオキシダーゼとの間に一
定の基が入っていることとなってもよい。 ＡＭＳＡを用いる場合、ペルオキシダーゼ約０．１ない
し１０ｍｇを中性の緩衝液（たとえば０．１Ｍ ＋）ン
酸緩衝液）約０．２ないし２ ｍＬに溶解し、約０．１
ないし４ ｍｇのＡＭＳＡを約０．０１ないし０．１ｔ
ｎＬかＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解して加え、
約１０〜１２０分間、約４〜３５℃で反応させる。次に
約０．２〜２Ｍヒドロキシルアミンを加えて約４〜３５
℃で約１〜６０分間反応させ、ゲルクロマトグラフィー
で精製してチオール化ペルオキシダーゼを得ることがで
きる。 ５ＰＤＰを用いろ場合、ペルオキシダーゼ約０゜１ない
し１０ａｇを中性の緩衝液（たとえば０．１ Ｍリン酸
緩衝液）約０．１〜１耐に溶解し、約０．１〜８ ｍｇ
の５ＰＤＰのエタノール溶液を加えて約４〜３５°Ｃで
約１０〜１２０分間反応させる。ゲルクロマトグラフィ
ーで過剰の試薬を除去したのち、ジチオスレイトール（
ｄｉＬｂｉｏむｈｒｓｉｔｏｌ ） などの還元用試
薬を加えて還元し、更にゲルクロマトグラフィーで精製
してチオール化ペルオキシダーゼを得ることができる。 ペルオキシダーゼと抗体とを結合させる化合物として、
一般式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
される化合物を用いるが、上記式中、Ｒで表わされる２
価の６員環状炭化水素残基としては、飽和のもの、不飽
和のもののいずれでもよい。飽和の２価の６員環状炭化
水素の例としては、たとえば１．２−．１．８−．１．
４−シクロヘキシレンが挙げられ、不飽和の２価の６＠
環状炭化水素残基の例としては、たとえば１．２−．１
．３−．１．４−フェニレンなどが挙げられる。 該化合物〔Ｉ〕において、ｎとしては１ないし５の整数
が好ましく、特に１が好ましい。Ｒとしては２価の６＠
環状炭化水素残基が好ましく、特に１．４−シクロヘキ
シレンカ好マシい。 本発明の方法において用いられる化合物ＣＩ）は、たと
えばザ・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｔｈ
ｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
） 第７９巻２３３頁（１９７６年）、ヨーロピアン
・ジャーナル拳オブーバイオヶミス１へり−（Ｅｕｒｏ
ｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ ｏｒＢｉｏｃ＋＋ｅｍｉｓも
ｒｙ ）第１０１巻３９５頁（１９７９年）、特開昭５
２−８５１６８号公報、特開昭５２−８５１６４号公報
等に記載の方法あるいはこれらの方法に準じて製造する
ことができる。たとえば、一般式 〔式中、Ｘは水酸基またはハロゲン原子を示す。 １０）およびＲは前記と同意義を有する。〕で表わされ
るマレイミド化合物（ＩＩＩと一般式〔式中、Ｙは水素
原子またはアルカリ金属原子を示す。〕で表わされるサ
クシンイミド化合物〔■〕とを脱水剤あるいは脱酸剤の
存在下で反応させることにより製造することができる。 上記一般式において、ハロゲン原子としては塩素、臭素
などが挙げられ、アルカリ金属原子としてはたとえばす
Ｉ・リウム、カリウムなどが挙げられる。また反応に用
いられる脱水剤としてはたとえば、硫酸。 ジシクロへキシルカルボジイミドなどが、１悦酸剤とし
てはたとえばピリジン、トリエチルアＦンなどが挙げら
れる。 前記化合物〔ＩＩ）は、たとえば特開昭５２−８５１６
４号公報に記載の方法あるいはこれに慴して製造するこ
とができる。たとえば一般式％式％ 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義へ・打する。〕で表
わされる化合物〔Ｉ■〕を脱水閉環せしめることにより
得られる。該脱水閉環させるには、脱水剤たとえば無水
酢酸又は無水酢酸と酢酸ナトリウム（無水物）を用い、
温和に加熱することにより反応させることができる。 さらに別法として、ヘルベティ力・キミカ・アクタ（Ｈ
ｅ１ｖｅＬｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ ＡｃＬａ ）第５
８巻（１９７５年）５３１頁に記載されている方法ある
いはこれに準じて製造することができる。たとえば、一
般式 〔式中、２はアルキル基を示す〕で表わされるＮ−アル
コキシカルボニルマレイミド〔ｖ〕と、一般式 ％式％ 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
されるアミノ酸ＣＶＩ）とを反応させて、一般式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
されるマレイミド化合物〔■〕を得る。次に一般式ＣＩ
［［］で表わされるサクシレイ２ド化合物ＣＩＩＩ〕を
加え先に述べたと同様の脱水剤もしくは脱酸剤の存在下
で反応させることにより製造することができる。 上記一般式〔■〕で表わされる化合物においてＺで表わ
されるアルキルとしては、たとえばメチル、エチルが挙
げられる。 ベルオキシダーセに化合物〔■〕を反応させるには、両
者をｐＨ約６ないし８の緩衝液中で約１０ないし５０′
Ｃの温度で約１０分ないし２４時間反応させることによ
って行なわれる。該緩衝液としては、たとえばｐＨ７，
０の０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液。 ｐＨ６，３の０．０５Ｍ！Ｊン酸緩衝液などが挙げられ
る。 このようにして得られたマレイミド化ベルオキシグーゼ
の精製は、たとえばゲルクロマ１−グラフィーなどによ
り行なうことができる。該ゲルクロマトグラフィーを行
なう際に用いられる担体としてはたとえばセファデック
スＧ−２５［ファルマシア・ファインケミカル社（スエ
ーデン）Ｍｌ、。 バイオゲルｐ−２Ｃバイオ・ラッド・ラボラトリーズ社
（米国）製〕などが挙げられる。 マレイミド化ベルオキシグーゼを抗ＣＥＡ抗体と反応さ
せる場合、抗ＣＥＡ抗体ＩｇＧあるいはペプンン分解し
て得られたＦ（ａｂ’）２画分を、メルカプトエチルア
ミン類の存在下で還元し、ゲルクロマトグラフィーによ
って精製された抗ＣＥＡ抗体ＩｇＧもしくはＦａｂ’
とマレイミド化ベルオキシダーセとを反応させる。 該反応は、両者を緩＠液中で約Ｏ０ｃないし４゜０Ｃの
温度で、約１ないし４８時間反応させることにより行な
うことができる。該緩＠液としては、たとえばｐ Ｈ６
，０の５ ｍ Ｍエチレンジアミン四酢ｒ１勺ナトリウ
ム塩を含む０． Ｉ Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる
。 このようにし、で得られたベルオキンクーセ標識抗体は
、たとヌばケルクロマ１−グラフィーなどに。Ｌり精製
することができる。該ゲルクロマトグラフィーに用いら
４する担体としては、たとえばウルトロケルＡｅＡ ４
４ ［ＬＫＢ社（フランス）製〕、セファクリルＳ−２
００［：ファルマシア・ファインケミカル（スエーデン
）製コなどが挙ケラれる。 本発明の測定方法を以下に具体的に説明する。 まず、■：担体に保持された抗体に、測定すべきＣＥＡ
含有の分析対象物を加えて抗原抗体反応を行った後これ
に前記で得られたペルオキシダーゼと抗ＣＥＡ抗体との
結合物を加えて反応させる。 本発明の酵素免疫測定法において測定対象となるＣＥＡ
を含む被検試料としては、尿、血清、血景、髄液あるい
は各種臓器抽出物等が挙げられ、とｔ）わけ尿、血清お
よび面素が繁用される。 ■：■で得られた反応生成物にペルオキシダーゼの基質
を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定す
ることにより上記の反応生成物の酵素活性ｉ知る。 ■二上記■−■の操作を既知喰のＣＥＡの標ｑ溶液に対
し予め行ない、ＣＥＡと吸光度も１７＜は蛍光強度との
関係を標準曲線として作成しておく。 ■：未知量のＣＥ Ａを含む分析対象物について得られ
た吸光度もしくは蛍光強度を標準曲線にあてはめ、分析
対象物中のＣＥＡ含量を測定する。 本発明のサンドインチ法によるＣＥＡの免疫化学的測定
法に用いられる定量用キットとじては、［Ａ）主として
、 （１）担体上に保持された抗ＣＥＡ抗体（２）本発明方
法により得られたペルオキシダーゼで標識化された抗Ｃ
ＥＡ抗体（化合物ＣＩ）を用いて結合されている。） 上記（１）および（２）の２種の抗体のうち少なくとも
一方はモノクローナル抗体である。 さらに、１０）１体上に（ｙ持される抗体は、Ｆ（ａｂ
’）２ｉだはｌｉ”ａｂ’が好寸しい。 （３）標準ＣＥＡ （４）１−記（２）〜（３）の試薬および被検試料の希
釈に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた
約１０％牛血清および約１％牛血清アルブミン（以下、
Ｂ Ｓ Ａと略称することもある。）を含むｐ Ｈ約６
ないし９のリン酸緩衝液またはグリノン緩衝液が挙げら
れる。）。 （５）ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬。その−
例とし′Ｃ蛍光法の場合、酵素基質どしてｐ−ハイドロ
キシフェニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、（）−
フェニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用
いる緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応
停止液。 が挙げられる。 〔Ｂ〕主として、 （１）担体上に保持された抗ＣＥＡ抗体。 （２）本発明方法により得られたペルオキシダーゼで標
識化された抗ＣＥＡ抗体（チオール化されたペルオキシ
ダーゼと抗ＣＥＡ抗体とが化合物ＣＩ）を用いて結合さ
れている。）。 （３）標準ＣＥＡ。 （４） 上記（２）〜（３）の試薬および被検試料の
希釈に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめ
た約１０％ピノシ血清および、約１％牛血清アルブミン
（以下、ＢＳＡと略称するｒ、ともある。）を含むｐＨ
約６ないし９のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙
げられる。）。 （５）ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬。その−
例として蛍光法の場合、酵素基質としてＩ）−ハイドロ
キノフェニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、０−フ
ェニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用い
る緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停
止液。 が挙げられる。 さらに〔り主として、 （１） 担体−ヒに保持された抗ＣＥＡ抗体。 （２）本発明方法により得られたペルオキシダーゼで標
識化された抗ＣＥＡ抗体（チオール化されたベルオキン
々−セと抗ＣＥＡ抗体とが化合物〔■〕を用いて結合さ
れている。） −１二記（１）および（２）の２種の抗体のうち少なく
とも一方はモノクローナル抗体である。 さらに、担体に保持さｔしる抗体は、Ｆ （ａｂ’ ）
２ま、ｉはＦａｂ’であることが好ましい。 （３）標慴ＣＥＡ。 （４）上記（２）〜（３）の試薬および被検試料の希釈
に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた約
１０％ヒツジ血清および約１％牛血清アルブミン（以下
、ＢＳＡと略称することもある。）を含むｐＨ約６ない
し９のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げらねる
。） （５）ベルオキシターセ活性測定に必要な試薬。その−
例として蛍光法の場合、酵素基質として１）−ハイドロ
キシフェニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、０−フ
ェニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用い
る緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停
ＦＦ液。 が挙げられる。 一ヒ記のキットは例えば下記の方法により使用すること
ができる。 標準ＣＥＡもしくは被検収約ｘｏｔｃいし２００ＬＬｅ
に試薬（４）を加えて希釈し、一定量の試薬（１）を加
えて約Ｏないし４０°Ｃで約１ないし・１８時間反応さ
せる。担体を水洗後、試薬（２）の約１０ないし３００
μｅを加えたのち、約０ない（７４０°Ｃで反応させる
。約１ないし４８時間反応後、担体を洗浄し担体、トに
結合しているベルオキシダーセ活性を測定する。即ちベ
ルオキシグーセの基質収約１０〜１０００μｅを加え−
Ｃ約２０〜４０６Ｃで約０２〜２４時間反応させたのち
、酵素反応を停止させ、反応液中の吸光度もしくは蛍光
強度を測定する。 本発明の免疫化学的分析法用試薬を用いれば、通常の臨
床検査室において簡単な操作でＣＥＡの高感度測定が可
能となる。 実施例 参考例１ 過塩素酸抽出法による精製およびモノクロー
ナル抗体の作製 （１）抗原の精製 Ｋｒｕｐｅｙらの方法〔イムノケミストリー（Ｉｍｍｕ
ｎｏ−Ｃｈｅｍｉ ５Ｌｒｙ ） 、第９巻（１９７２
年）、第６１７頁」ζ・−べ（じてＣＥＡを精製した。 才なわち大腸癌組ｖ＆１００ ｙを細断し、これに４０
０１の蒸留水を加えてホモジナイザーで水冷下１時間破
砕して懸濁液を３１０）■製した。次に、等容量の２Ｍ
過塩素酸を加えて室温で３０分間攪拌して抽出しｊ二。 次に遠心分離し、その上清について蒸留水に対して透析
したのち凍結乾燥した。次に０．１５ Ｍ ＮａＣ１を
含ｆＪＯ，０５Ｍリン酸緩衝液を用いてセファロース４
Ｂ［ファルマシア製（スエーデン）〕のカラム（２，３
ｃｍＸ １００ａｉ ）にかけてゲルクロマトグラフ、
イー１行な−）ｔこ。ＣＥＡを含むフラクションを透析
し、凍結乾燥後、更にセファテックスＧ−２００のカラ
ム（２，３ｃｍＸ ｔ ＯＯｏｎ ）でケルクロマトク
ラフィーを行ない、ＣＥＡ溶出画分を透析、凍結乾ｒＳ
Ｌ −ｃ ｅ Ｅ Ａ ノｆ、ｌ；製抗Ｊ１５−ｉ
ｆ、、得ｆ、：（３：ｌｑ）。 （２） モノクローナル抗ＣＥＡ抗体の作製１）１０
）項（１）で得た精製抗ｇ７０μｇ覆生理食塩水１５０
〃ｒに溶解し、これに７０インドの完全アジ。 バントＣＦｒｃｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄ
ｊｕｖ＋１ｎＬ 、 ”免疫の生化学“、橘ら著、第２
６頁、共立出版株式会社（１９６７年）：［５Ｏμｌを
加えてよく昆（イ）し−Ｃ乳削を作り、こ才］をＢＡＬ
Ｂ／Ｃマウス皮下に投月した。更に、２週毎に２回、フ
ロイノ１−の不完全アジュバン！・を用いて免疫し、最
終免疫４旨シて精製抗原１３０μｇを生理食塩水に溶解
して得た４ ００ ｔｔｅを静脈投与し、３日後肺臓を
取り出した。次に、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｒ
ｉｅｄ Ｍ ＦＪＭ 培地でよく洗浄したのち、当該
肺細胞１×１０８個とマウスミエローマ細胞（ＰａＵ＋
） ２ Ｘ ｔ ｏ７個とを混合し、７００ ｒＩ曲
で１５分間遠心してペレットをつくった。次にポリエチ
レングリコール６ｏｏｏをＲＰＭＩ−１６４０に４５％
に溶解した液０．４ ａｔを加、ｔｒ、更ニＲＰＭＩ−
１６４０，１５ｍｌを徐々に加えて希釈したのち、７０
０ ｒｐｍで１５分間遠心分離し、細胞を２０％牛脂児
血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地１００ ｒｎｌに分
散さぜた。次に２４ウエルの培養ブツート〔フロー社製
（米国）〕に上記細胞分散液２． Ｏｍｌずつ注入し、
更に２日日。 ５日日、および８［コ目に培養上清の半量をＨＡ Ｔ培
地におきかえた。１４日後における培養上清に−）いて
抗体価をｆｌｉ１０）定したところ、計１２０ウェル中
１２ウェルに陽性を認めた。 次に、これら陽性ハイブリドーマのクローニングを牛脂
児面清２０％およびＢＡＬＢ／Ｃマウス胸腺細胞をフィ
ーター（ｆｅｅｄｅｒ ）として加えた。 ＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈し、限界希釈（ｌｉｍ−
ｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ）法を繰り返して行な
い最終的にはモノクローナル抗ＣＥＡ抗体を産生ずる１
２種類のハイブリドーマが得られた。これらを鉱油で処
理されたＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に注入し、２〜３
週間後に腹水を採取することにより、モノクローナル抗
ＣＥＡ抗体を得た。これらのモノクローナル抗体を硫酸
アンモニウム法で塩析し、それぞれグロブリン画分を得
た（ＭＯ−Ｋｌ〜ＭＯ−に１２）。 参考例２ 過ヨウ素酸架橋法 伸根らの方法〔ザ・ジャーナル・オブ・ヒストケミスト
リー・アンド・サイトケミストリー（Ｔｌｉｅ Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｒ ＨｉｓＬｏｃｌ＋ｅｍｉｓｔｒ
ｙ ａｎｄ Ｃｙも６ｃｈｅ−ｍｉｓＬｒｙ ）第
２２巻（１９７４年）第１０８４頁〕に従って行なった
。７ＩＩＩｇの西洋わさびベルオキノターセを１ ｍｌ
の０．：９Ｍ重炭酸ナトリウム溶液（ＰＨｓ、ｌ）にと
かし、０．１ ｍｌの１％ｌ−フルオロ−２，４−ジニ
トロベンセンを加えて室温で１時間反応させた。次にＱ
、Ｑ ６ＭＮａＩＯ４１ｍｌヲ加エテ室温で３０分間攪
拌したのち、０．１６Ｍエチレングリコール水溶液１
ｍｌを加えて室温で１時間放置した。０，０１Ｍ炭酸ナ
トリウム緩衝液（ＰＨ９，５）に対；ッて１夜透析した
。 後述の実施例１−（２）で得られたモノクローナル抗Ｃ
ＥＡ抗体ガンマ・グロブリンフラクション（Ｍ ｏ −
Ｔ３） ５１０）１ｇを０．０１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ９，５） １ ｍｌにとかし、先に調製したア
ルデヒドペルオキシダーゼと混合して室温で３時間反応
させてから、５■の水素化硼素ナトリウムに加えて４℃
で１夜反応させた。０．１５ Ｍ ＮａＣ５を含む０．
０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，１）に対して４８Ｃで１
夜透析した後、ウルトロゲルＡｃＡ４４を充てんしたカ
ラム（１，５ｃｍＸ ４５６１０）） ｋ用いるゲルク
ロマトクリフィーにかけ、０．１Ｍリン酸緩衝液 （＋
）Ｈ６，５）で溶出させた。後述の実施例１−（５）と
同様に溶出液の２８０および４０３ｎｍの吸光度ならび
に酵素活性を測定して目的フラクションを分取した。得
られたモノクローナル抗ＣＥ ｈ抗体−ＨＲＰ複合体ハ
ＢｓＡト１．テ０．１％、マーチオレートとして０．０
０５％になるようにして４６Ｃで保存した。 実施例 １ （１）抗原の精製 大鯖癌組織２００．を細断し、これに６００ ｙｔＬの
１％Ｔｗｅｅｎ ２０ Ｃシグマ社（米国）製〕を含む
０、１５ Ｍ ＮａＣ４溶液を加えてホモジナイザーで
水冷下１０分間破砕して懸濁液を調製した。さらに超音
波発生機で水冷下１時間処理したのち、１２゜０００
ｒｐｍ ２０分間遠心分離した。上清を蒸留水に対して
透析したのち凍結乾燥した。次に０．２Ｍクエン酸緩衝
液（Ｐｌ（６，５）に溶解し、同じ緩衝液を用いて調製
したコンカナバリンＡ結合セファロース４Ｂ〔ファルマ
シア製（スエーデン）〕のカラム（２，２ｃ７ＩＩ Ｘ
２６ ｃｍ ）にかけた。カラムに保持された物質を
α−メチル−Ｄ−マンノサイドを含む緩衝液を用いて溶
出した。蒸留水に対して透析したのち凍結乾燥した。次
に０．２ Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６，５）を用いてウ
ルトロゲルＡｃＡ−３４（ＬＫＢ社製（フランス）〕の
カラム（２，３Ｃ３ｌＸＩＱＱＣＩＩ）にかけてゲルク
ロマトグラフィーを行ない、２８０〜３５０ ｍｌの両
分を蒸留水に対して透析し、凍結乾燥してＣＥＡの精製
抗原を得た（５■）。 （２）モノクローナル抗ＣＥＡ抗体の作製前項（１）で
得た精製抗京ＴＯ７ｔｇを生理食塩水１５０μｅに溶解
し、これにフロイントの完全アジュバントＣＦｒｃｕｎ
＋ｌ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎＬ
、 ’免疫の生化学“、橘ら著、第２６頁、共立出版株
式会社（１９６７年）〕２５０μｅを加えてよく混和し
て乳剤を作り、これをＢＡＬＢ／Ｃマウス皮下に投与し
た。更に、２週毎に２回、フロイントの不完全アジュバ
ントを用いて免疫し、最終免疫として精製抗原１３０１
ｔｇ を生理食塩水に溶解して得た４００バに静脈投与
し、３日後牌臓を取り出した。 次に、ＤｕＬｂｅｃｅｏ’８ｍｏｃｌｉｒｉｅｄ Ｍ
Ｅ Ｍ培地でよく洗浄したのち、当該牌細胞ｌＸ１０個
とマウスミエローマ細胞（Ｐ３ＵＩ） ２ Ｘ １０７
個とを混合し、７００ｒｌｌｍで１５分間遠心してベレ
ットをつくった。次にポリエチレングリコール６０００
ヲＲＰ Ｍ Ｉ −１６４０に４５％に溶解した液０
．４ｍｌを加えて、更にＲＰ Ｍ Ｉ −１６４０１５
ｍｌを徐々に加えて希釈したのち、７００ ｒｐｍで１
５分間遠心分離し、細胞を２０％牛脂児血清を含むＲＰ
ＭＩ−１６４０培地１００ ｍｌに分散させた。次に２
４ウエルの培養プレート〔フロー社製（米国）〕にＦ記
細胞分散液２． Ｏｍｌずつ注入し、更に２「１目、５
［１目、および８日日に培養ト清の！１′！：ｉ′ｉ（
′をＨＡ Ｔ培地におきかえた。１４日後における培養
上清について抗体価を測定したところ、計７２ウェル中
９ウェルに陽性を認めだ。 次に、これら陽性ハイブリドーマのクローニングを牛胎
児血清２０％およびＢＡＬＢ／Ｃマウス胸腺細胞をフィ
ーター（ｆｃＣｄｃｒ ）として加えたＲＰＭＩ−１６
４０培地で希釈し、限界希釈（Ｉｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉ
ｆｕｓｉｏｎ ）法を繰り返し−Ｃ行ない最終的に（
ｋロックローナル抗ＣＥＡ抗体を産生−１ｒろ５種類の
ハイブリドーマが得られた。これら４鉱油で処理９され
たＢＡＩ、Ｂ／Ｃマウスの腹腔内に注入し、２〜３週間
後に腹水を採取することにより、モノクローナル抗ＣＥ
Ａ抗体を得た。これらのモノクローナル抗体を硫酸ア
ンモニウム法で塩析し、それぞわグロブリン画分を得た
（ＭＯ−Ｔ＋〜ＭＱ−Ｔ６）。 （３）ポリクローナル抗ＣＥＡ抗体の作製前項（１）で
得た精製抗原２ ｙａｇを生理食塩水１耐に溶解し、こ
れにフロイントの完全アジュバント１ｍｌを加えてよく
混和して乳剤を作り、これをウサギの両大腿部筋肉内お
よび背部皮下数箇所に注射した。以上の操作を３週毎に
５回行ない最終免疫後１週間で採血して抗血清を得た。 硫酸アンモニウム法で塩析してグロブリン画分を調製し
ｔこのち、Ｃ）ＥＡ結合セファ０−ス４Ｂのカラムを用
いるアフィニティ・クロマトグラフィーに供した。カラ
ムに保持された抗体画分を０．１７Ｍグリシン−塩１”
″ツ衝Ｉｆ（ｐＨ２，８）で溶出することにより、 Ｃ
ＫＡに強い親和性を有するポリクローナル抗体を得た。 （４）モノクローナル抗体の反応性の比較前項（２）お
、よび参考例１で得られた各種七ツク１】−ナル抗体の
ＣＥＡおよび関連抗原に対する反応性を調べた。 試薬： ■ 前項（２）および参考例１で得られたモノクローナ
ル抗ＣＥＡ抗体感作マイクロプレート■ 西洋わさびペ
ルオキシダーゼ （以下ＨＲＰと略称する）標識抗ＣＥ
Ａ抗体複合体［ＤＡＫＯＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（
テンマーク）製〕■ ＣＥＡおよびＣＥＡ関連抗原 ■ 緩衝８１Ｂ （１０％子牛血清、０．１５ＭＮａＣ
ｌを含むｐＨ７，０の０．０２Ｍリン酸緩衝液）、緩衝
Ａ （０，１５ＭＮａＣ１を含むｐＨ７，０の０．０２
Ｍ リン酸緩衝液） ■ ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬０．０２％
過酸化ｙＪ＜素ト０．１５％０−フェニレンジ７Ｅンを
含むｐ Ｈ４，８の０．１Ｍクエン酸−リン酸二すｌ−
ＩＪウム緩衝液および反応停止液（２Ｎ−硫酸）。 抗体感作マイクロプレートの、ｌｉＪ、′、Ｉ製：ＥＩ
ＡＪＩＩイノ、ノブレート１しヌンク社（テンマーク）
１４更〕の各ウェルに０．１ Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９６
）で希釈ｊ−て調製した前項（２）あるいは参考例１の
モノクローナル抗ＣＥＡ抗体溶液（５ｏ／ｌ／ｍ１３
）を１００７ｔｅずつ注入して４°Ｃで一夜放置して感
作させた。０１％ＢＳＡを含む０．０１Ｍ！Ｊン酸緩イ
！ｌｉｉ液（ｐＨ７，０）で洗浄し／このち、用時１で
冷所保存した。 σ用定 ： 緩衝液Ｂ Ｋ溶解させたＣＥＡあるいはＣＥ Ａ関連抗
原標鵡浴？（’ｉ １ ’ＯＯｐｌを各ウェルに注入し
、８７ ’Ｃで３時間反応させた。各ウェルを緩衝液Ａ
で洗浄佼、ＨＲＰ標識抗ＣＥＡ複合体溶液（Ｊ（ＲＰと
し、て３０ ｎｇ／ウェル） １．００１’ｌ！を加え
て２５”Ｃで３５時間さらに反応させた。緩ｆ！Ｉｉｔ
液Ａで洗浄し、これに００２％過酸化水素と０．１５％
〇−フエごレンジアミンを含む０．１ Ｍクエン酸−リ
ノ酸ニナトリウム緩衝液（１）Ｈ４，８）１００．ｚｉ
ｌを加えて３０”（１’３０′＋間反応させ、２Ｎ−イ
ビＣ酸１ｏｏ、ｌＬｇずつ加えて反応を停止させてから
、マイクｒｘクレー１−用自動比色計しタイターチック
・マルチスキャン；フロー社（米国）製〕を用い、ブラ
ンクを対照にして４９０ ｎｍにおける吸光度を乙用定
した。 結果を第１表に示したが、前記（２）で得ら、１０）ま
た上２ツクローナル抗ＣＥＡ抗体は、６抗体中４抗体で
ＣＥ Ａ関連抗体であるＮ ＣＡ （ｎｏｎｓｐｅｃｉ
ｆｉｃ ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅ
ｎ ）やＮ ＣＡ−２（ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃｃｒｏ
ｓｓ−ｒｅａｃｔｉｒ、ｇ ａｎｔｉｇｅｎ −２）と
反応せず、シ／コがって高い確率でＣＥＡに特異的なモ
ノクローナル抗ＣＥＡ抗体の得られることが分った。一
方、参考ｊ＋Ｑ １ ｃ得られたモノクローナル抗ＣＥ
Ａ抗体は】２抗体中１抗体（ＭＯ−に６）だけがＮＣＡ
ならびにＮＣＡ−２どは反応せず残りの１０）抗体はこ
れらのＣＥＡ関連抗体と反応した。 第１表 ＭＯ−Ｋ１．−＋＋ に２ − ＋ ＋
Ｋ ３ ＋ ↓ ＋
に４ − − ＋
に５ − ＋ ＋
に６ − − −に
７ ＋ ＋
＋に３ ＋
十 ＋に９
＋ ＋
＋ＫＩＯ−−＋ に１０） − ＋
÷に１２−よ十 ＭＯ−Ｔ１＋＋＋ Ｔｊ −−− Ｔ３ − − −Ｔ
４ − − −Ｔ５
＋ ＋
＋Ｔ６ − − −
十：反応性あり −二反応性なし く５）モノクローナル抗１本（ｐｉ （ａ ＋）’ ）
２フラグメント）の・製造 前項′２）で得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体Ｔ−
クログリンフラクション（Ｎｉ（Ｉ Ｔ４）５Ｎ１０
）をｏＩＭ酢酸緩萌面（ｐ）（３，０）１屑ｌに溶解し
、０５睨のペプシン１：６０，０００（シグマ計装、Ｕ
ＳＡ）を加え、３７ ’Ｃで１時間反応させた。中和後
＋ニア ルトｃ＋ゲルＡｃＡ ４４ （ＬＫＢＬｔ’に
、Ｘウエ−デン）カラム（直ｑ ２ ｔｙｎ 、長さ７
５ｍ）（二よるゲルクロマトで精製し、モノクローナル
抗ＣＥ Ａ抗体（Ｐ（ａｂ’）２フラゲメント）を得た
１、（６）七ノイＦローナル抗Ｃ１ＤＡ抗体（Ｆ ａ
１０）’ フラグメント）の・装造 前項（５）で１；）られた−仁ノクローナル抗ＣＥＡ抗
体（ト″’ （ａｂ’）２７ ｉグメニ／ト）を１ ｍ
Ｎｌ ｘチレンジアミン四耐酸すｌ−リウム塩を含む
０．１ Ｍ ＋’Ｔ’＋酸緩岨腋（ｐＨ５，０）で−＆
透析した後、透析Ｈ１０ｍｌに２−ｊ ｊ、 ０．１５
八・１２メルカプ１−エチルアミンｉ、 ｍｌ ヲ１ｆ
１０）え、３７ ’Ｃで２時間反応させた１０）反応後
セファデックスＱ −２５カラム（直伜１．５１ 、
ｌ、〜さ２５備）によるゲルクロマトグラフィーで精製
し、モ／ り０−ナル抗ＣＥＡ抗体（Ｐａｂ’フラグメ
ントを得た。 （７）ポリクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’） −Ｈ
ＲＰ複合体の製造 （ａ） マレイミド基の導入 ６ ｍｇの西洋わさびペルオキシダーゼ〔ベーリンガー
マンハイム社（西ドイツ） 製：） ヲｉ ａｔの０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、５０ｔｔ＃
のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドにとかした結合試薬Ｍ
ＭＣ（一般式［Ｉ）において、ｎ＝１．Ｒ＝シクロヘキ
シレンである化合物） ４．８ ｍｇ ヲ加えて３０°
Ｃで６０分間攪拌しながら反応させた。 生成した沈殿を遠心分離して除去し、上清をセファデッ
クスＧ−２５のカラム（１，ＯＸ、４５α）に通Ｉ７、
Ｑ、 Ｉ Ｍ ＩＪン酸緩衝液で溶出させた。タンパク
を含む両分を分取し、コロジオン膜を用いて淵縮した。 このようにして調製したマレイミド化ベルオキシダーセ
においてベルオキシター上１分子あたり導入されたマレ
イミド基の数は１０〜１．２個であった（ベルｔキシ々
′−セの分子ｊｉ；ｊ ｆｊ２４０．０００．Ｅ２８”
”” ＝２２．７５として、ｉＨ’Ｊ）。 １％ （１＋） マレイミド化ベルオキンターセと抗ＣＥＡ
抗体（Ｆ ：ｌ ＋１’フラグメノト）との複合体の１
トリ造前項（３）で得られたポリクローナル抗ＣＥＡ抗
体５ ｍｇに０．１ ｍｇのペプシンを加え３０℃で一
夜反応後、セファデックスＧ−１５０カラム（直径２．
５−、長さ５５α）で精製した。得られた抗体Ｆ（工ｓ
ｂ’）２ 画分を２−メルカプトエチルアミンで還元
し、セファデックスＧ−２５のカラムによるケルクロマ
トグラフィーで精製してつ廿キ抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’
フラグメノト）を得た。 上記（＋Ｌ）で調製したマレイミド化ベルオキシターセ
１．５ ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（戸６゜０）０．
１５ｍ１に溶解し、先に得た抗ＣＥＡ抗体（Ｆ ａ １
＋’ フラグメント）１．８ｍｇヲとかした５ｍＭエ
チレンンアミン四酢酸ナトリウム塩を含む０．１Ｍリン
酸緩衝液（ＰＨ６，０） ０．１５ ｍＬを加えて４′
Ｃで２０時間１又応させた。反応後、ウルトロケルＡ’
ｉ・Ａ４４を充てんしたカラム（１，５Ｘ４５ａ＋＋）
を用いるゲルクロマトグラフィーにかけ、０．ＩＭＭリ
ン酸緩衝ｎ！ｉ（ｐＨ６，５）で溶出さセた。溶出液の
２８０ ｎｍの吸光度ならびに酵素活性を測定した。ベ
ルオキンターセとパフ材・〜抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’
７ラグ７）（・）との複合体が生成していることを、
以下の１５法で確認した。 まず、酵素活性の測定はギルバルトらの方法〔アナリテ
ィカル・ケ乏ストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｂｅ
−＋ｎ１ＳＬｒｙ ）、第４０巻（１９６８年）、１２
５６頁〕で行なった。、即ち、溶出液の各フラクシヨン
を０．１％ウシ血清アルブミンを含む０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）で１８００倍に希釈した。このｌＯ
μｅに０．１％ウシ血清アルブミンを含む０．０５Ｍ酢
酸すｌ・リウム緩衝液（Ｐ１′（５０）に溶解した０゜
５％Ｐ−ハイドロキシフェニル酢酸０．、２５ ｍｌを
加えて渥合し３０°Ｃで５分間インキュベー トＬ、た
。 次に０．０１％過酸化水素０．０５ ｍｌを加えて３０
°Ｃで２０分反応させ！こ。０，１Ｍグリシ〉緩衝液（
ＰＩ（１０，３） ２．５＋ｘＬを加えて酵素反応を停
止させ、ｌｕ ｙ ／ ａｔのキニー・の蛍光強度を１
００とし励起光３２０ ｎｍにおける４ ０５ ｎ ｍ
の蛍光強度を測定した。 結果を第１図に示す。第１図において、４−は２８０旧
ｎにおける吸光度を、−一はベルオキシターセ活性（蛍
光強度として）をそれぞれ示す。 フラクション３８付近においてベルオキシダーセと抗Ｃ
ＥＡ抗体（Ｆ ａ ｌ）’ フラグメン１〜）との複
合体の生成が極めて良好であることが分かった。 （８）モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆ ａ ｂ’ ）
−ＨＲＰ複合体の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体γ−
グロプリンフラクショノ（Ｍｏ−Ｔ３）５ｍｇを０．１
Ｍ酢酸緩衝液（ｐ）４４．２ ） １ ｍｌに溶解し０
．２５ ｍｇのペプシンを加え３７°Ｃで一夜反応させ
る。 中和後セフ１テックス（、−１５０カラム（直径２゜５
ｃ＋ｎ 、長さ５５ ｃｍ ）で精製した。得られた
Ｆ （ａ ｂ’）２画分を２−メルカプトエチルアミン
で還元し、セファデックスＧ−２５のカラムによるゲル
クロマトグラフィーで精製し−Ｃモノクローナル抗ＣＥ
Ａ抗体（Ｆａｌｙ’フラグメノト）を得た。 次に前項（７）−（ａ）で調製したマレイミ］・化ペル
オキシダーゼ１．５ ｍｇＩ Ｏ，Ｉ Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ６，０）０、１５ ｍｌに溶解し、先に得たモノ
クローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’ ７ラグメント）
１．８ ｍｇをとかしｊ、二５ｍＭエチレンジアミ：／
四酢酸ナトリウム塩を含むＱ、 ｌ Ｍリン酸緩衝液（
ＰＨ６，０） ０．ｔ ５ｍｌを加：（て４°Ｃで一夜
反応させた。反応後、ウルトロゲルＡｅＡ ４４を充て
んしたカラム（１，５Ｘ４５０）を用いるゲルクロマト
グラフィーにかけ、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，
５）で溶出させた。前項（７）と同様に溶出液の２ｇＱ
＋ｉｍの吸光度ならびに酵素活性を測定して目的フラク
ションを分取した。得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗
体（Ｆ ａ ｂ’ ）−ＨＲＰ複合体はＢＳＡとして０
．１％、マーチオレートとじて０．００５％になるよう
に調ｊ整して４°Ｃて保存した。 （９）モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）−ＨＲＰ
複合体の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体カン
マグロブリンフラクション（Ｍ Ｏ−Ｔ ２ ） ５ｍ
ｇｊ２０． Ｉ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５） １
ａｔに溶解し４０μｅのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド
にとかした結合試薬ＭＭＣ（一般式〔Ｉ〕において、ｎ
−１、Ｒ−ノクロヘキンレンである化合物）０．２２ｍ
ｇを加えて２５°Ｃで４５分間攪拌しながら反応させた
。生成した沈殿を遠心分離して除去し、上清をセフアゾ
、リスＧ−２５のカラム（１，０Ｘ４５−）に通し、０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ）１６．８）で溶出させた。タ
ンパクを含む両分を分取し、コロジオン膜を用いて濃縮
した。このようにして調製したマレイミド化ＩｇＧにお
いてＩｇＧ １分子あたり導入されたマレイミド基の数
は５．９個であった。 別に、１０Ｉ＋ＩｇのＨＲＰを１．４ ｍｌの０．１Ｍ
リン酸Ｆ［［（ＰＨ６，５） ＋ｃｍＷｉ ｔ、、１０
０ｄ（１）エタノールにとかした結合試薬５ＰＤＰ（Ｎ
−サクシニｊジル−８−（２−ピリジルジチオ）−プロ
ピオネ−ト ｉ Ｎ −ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙ
ｌ−８−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉＬｈｉｏ ）−ｐ
ｒｏｐｉｏｎａｔｅ） １．２５ ｍｃｔを加えて２５
℃で３０分間攪拌しながら反応させた。反応液はセファ
デックスＧ−２５のカラム（１，Ｏｘ４５ｃｍ）に通し
０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）で溶出させて５ＰＤ
Ｐを除去した。次にジチオスレイトール（ｄｉＬｌ＋１
ｏＬｌ＋ｒｏ−ｉｔｏｌ） １７ｍｇを加えて還元し
、再びセファデックスＧ−２５のカラム（１，ＯｃｍＸ
４５ｃｍ ）を用いるゲルクロマトグラフィーで精製
してチオール化ＨＲＰを得た。 次に先に調製しＯ６２ｍｌに濃縮したマレイミド化Ｉｇ
Ｇ ３ ｍｇと、Ｑ、 ２ ｍＬに濃縮したチオール化
ＨＲＰ６ ｍｇとを４°Ｃで１６時間反応させた。反応
後、ウルトロゲルＡｃＡ ４４ （Ｌ Ｋ Ｂ社製（フ
ランス）〕を充てんしたカラム（１，５ｃｍＸ ４５０
１ ）を用いるゲルクロマトグラフィーにかけ、０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）で溶出させた。前項（７
）と同様に溶出液の２８０ ｎｍの吸光度ならびに酵素
活性を測定して目的フラクションを分取した。得られた
モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ） −ＨＲＰ複合
体はＢＳＡとして０．１％、マーチオレー１・とじて０
．００５％になるように調整して４６Ｃで保存した。 （１０）モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）−ＨＲ
Ｐ複合体の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体ガン
マグロブリンフラクション（ＭＯ−Ｔ２）５ｍｇを０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐ）１６．５ ） １ ｍｌに溶解
し、０、６ ｍｇのＳ−アセチルメルカプトサクシニッ
クアンハイドライド（Ｓ −ａｃｅｔｙｌｍａｒｃａｐ
ｔｏ ５ｕｃｃｉｎｉｃ ａｎｌ＋ｙ−＋Ｉｒ１ｄｅ）
を４０ｕｊのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解して
加え３０分間２５°Ｃで反応させた。 ０、１ Ｍ ｌ−リス緩衝液（ｐＨ７，Ｏ） ０．２
ｍｌおよびＩＭヒドロキノルアミン０．２ ｍｌを加え
て、さらに５分間３０’Ｃで反応させたのら、セファデ
ックスＧ−２５のカラム（Ｌ、ＱＸ４５ｃｍ）を用いる
ゲルクロマトグラフィーで精製してチオール化モノクロ
ーナル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）？得た。 次に前項（７） −（ａ）で調製したマレイミド化ベル
オキシグーセ１．５ ｍｇを０．１ Ｍリン酸緩衝液（
ＰＨ６，０）０、２ ｒｎｔに溶解し、先に得たチオー
ル化モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（ＩｇＧ）３ｍｇと５
ｍ Ｍ エチレンジアミノ四酢酸ナトリウム塩とを含
む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，Ｏ） ０．２ ｍｌ
を加えて４°Ｃで一夜反応させた。反応後、ウルトロゲ
ルＡｃＡ ３４を充てんしたカラム（１，５Ｘ４５ｃｍ
）を用いるプルクロマトグラフィーにかけ、０，１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６，５）で溶出させた。前項（７）と
同様に溶出液の２８０ ｎｍの吸光度ならびに酵素活性
を測定して目的フラクションを分取した。得られたモノ
クローナル抗ＣＥ Ａ （Ｉ ｇＧ）−ＨＲＰ複合体は
ＢＳＡとして０．１％、マーチオレートとして０．００
５％になるように調整して４°Ｃで保存した。 （１０））モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆ（ａＬ）’
）２ ）−ＨＲＰ複合体の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体Ｔ−
グロブリンフラクション（Ｍｏ −Ｔ２ ） ２５１０
）ｆｌをｏＩＭ酢酸緩＠液（ｐＨ３，０） ５ ｍｌに
溶解し、２、５１０）４のペプシンを加え、３７℃で１
時間反応させた。中和後クルトロゲルＡｃＡ４４カラム
（直径２α、長さ７５１）によるゲルクロマトで精製し
、モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆ（ａｂ’）２フラグ
メント）を得た。 次に、モノクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｐ （ａｂ’）２
フラダメント）５１０）Ｉｉ／をｏ、ｔｆｖｆリン酸緩
衝液（１）Ｈ６，５）１ ｍｌに溶解し４０μｌのＮ、
Ｎジメチルホルムアミドにとかした結合試薬ＭＭＣ（一
般式［１］において、ｎ＝１．Ｒ−シクロヘギシレンで
ある化合物）０．２２＃を加えて２５℃で４５分間攪拌
しながら反応させた。生成した沈殿を遠心分離して除去
し、上清をセファデックスＧ−２５のカラム（１，０ｚ
ｘ４５備）に通し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，８
）で溶出させた。タンパクを含む両分を分取し、コロジ
オン膜を用いて濃縮しマレイミド化Ｆ（、ａｂ’）２を
得た。 別に、１０９のＨＲＰを１．４厘ｌの０．１ Ｍリン酸
Ｆｌ）ｔ＋Ｔｆ［（Ｉ）Ｈ６，５） ニ溶解シ、１００
ｔｔｅノ：ｒ−タ／ −ル（二とかした結合試薬５１）
ＤＰ［Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ヒリシルシチオ
）−フロピオネ−ト ； Ｎ −ｓｕｃｃｉｎｉｍｉ
ｄｙｌ −３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）
−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ ］ １．２５１〃りを加えて
２５”Ｃで３０分間攪拌しながら反応させた。反応液は
セファデックスＧ−２５のカラム（１，０口Ｘ ４５
ｃｙｓ ）に通し０．１Ｎ１酢酸緩衝面（ｐｌ−１５，
０）で溶出させてＳ ＰＤ Ｐを除去した。次にジチオ
スレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔ−ｈｒｃｉｔｏｌ ）
１７ Ｈ９を加えて還元し、再びセファデックス（）−
２５のカラム（１，０備×４５備）を用いるゲルタロマ
ドグラフィーで精製して千オール化ＨＲＰを得た。 次に先に調製し０．２ ｍｌ に濃縮したマレイミド化
Ｆ（ａｂ’）２３Ｗと、０．２ ｍｌに濃縮したチオー
ル化１（ＲＰ ６ ｑとを４℃で１６時間反応させた。 反応後、ウルトロゲルＡｃＡ ４４ ［ＬＫＢ社製（フ
ランス）］を充てんしたカラム（１，５ＧＩＸ４５ｆｆ
ｉ）ｆｒ用いるゲルタロマドグラフィーしかけ、０．１
Ｍリン酸緩衛液（ｐＨ６，５）で溶出させた。前項（７
）と同様に溶出液の２８０ｎｍの吸光度ならびに酵素活
性を測定して目的フラクションを分取した。 得られたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体Ｆ（ａｂ’）２−
ＩＩＲｆ）複合体はＢＳＡとして０１％、マーチオレ
ートとして０．００５Ｑ６ｉ二なるよう（二調整して４
′０で保存した。 実施例２ （ａ）各種ＨＲＰ複合体の比較（感度、非特異的吸着） 実施例１で得られた各種ＨＲＰ複合体の性能について調
べるｔこめＥＩＡを行なった。ＥＩＡ用の試薬として、
次のものを用いた。 試薬： ■ 抗ＣＥＡ抗体感作マ・イクロプレート■ 実施例１
、参考例２で得られたＨＲＰ複合体、あるいはＤＡＫＯ
イムノグロブリン社製（デンマーク）抗ＣＥＡ抗体Ｉ（
ＲＰ複合体■ 標準ＣＥＡ ■ 緩衝液Ｂ（１０％子牛血清、Ｑ、 ｌ ５ Ｍ Ｎ
ａＣ１を含むｐｌ（７，０の０．０２Ｍリン酸緩衝液）
。 緩衝液Ａ（０−１５Ｍ ＮａＣ１を含むｐＨ７，０の０
０２Ｍリン酸緩衝液） ■ ベルオキンクーセ活性測定に必・塩４ｃ試薬０．０
２％過酸化水素ｊ０．１５９お＋１−７７ ｘ ニレン
ジアミンを含む・ｐＨ４，３の０．１Ｍクエン酸−リン
酸二十トリ・”７ム緩衝液お、よび反応停止液（２Ｎ−
硫酸） 抗体感作マイクロづレートの調製： ＥＩＡ用イムノプレートＩ［ヌン・り社（テノマーク）
製）の各ウェルにポリクローナル抗ＣＥＡ抗体〔タコ・
イムノグロブリン社（デンマーク）製〕を０． Ｉ Ｍ
炭酸緩衝液（ｐＨ９，６）で希釈して調製した抗体溶液
（５０ａｙ／ｍｌ）を１００１Ｌｌずつ注入して４°Ｃ
で一夜放置して感作させた。０．１％ＢＳＡを含む０．
０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄しｔコのち、
用時まで冷所保存した。 測定： 緩衝液Ｂ（こ溶解させたＣＥＡ標準溶液１００ＬＬｅを
各ウェルに注入し、３７°Ｃで３時間反応させた。 各ウェルを緩ｆｆ１ｆｉ、Ａで洗浄後、実施例１で得ら
れｆ： ＨＲＰ １合体あるいはタコ・イムノグロブリ
ン（Ｄ Ａ Ｋ Ｏｂｎｎ＋ｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ
）社製ポリク。−→−ル抗ＣＥＡ抗体−ＨＲＰ複合体
溶液（それぞれ酵素活性一定、 ＨＲＰとして３０’ｎ
ｇ／ウェル）１００Ｊ を加えて２５°Ｃで３．５時
間さらに反応させた緩衝液Ａで洗浄し、これに０．０２
％１過酸化水素と０．１５％Ｏ−フェニレンシアんンを
含む０．１ Ｍクエン酸−リン酸二すトリウム緩衝１（
ｐＨ４，８）１００ｕｅ を加えて３０°Ｃで３０分
間反応させ、２Ｎ−硫酸１００ＩＬｌ！ずつ加えて反応
を停止させてから、マ、イクロブレート用自動比色計〔
タイターチック・マルチスキャン・フロー社（１）ｆｆ
ｌを用い、ブランクを対照にして４９０ｎｍにおける吸
光度を測定した。結果を第２表に示したが、参考例２で
得られたＨＲＰ複合体およびグコ・イムノグロブリン社
製ＩＩ ＲＰ複合体〔２ステ、ブ グルタルアルデヒド
法；イムノケミストリー（Ｉｍｍｕｎｏ−ｃＩＩｃｍｉ
ｓＬｒｙ ）、第８巻（１９７１年）、ｍ１０）７５頁
〕と比べて実施例１で得られた本発１０）のＨＲＰ複合
体はそれぞれウェルへの非特異的吸着は極めて小さく、
また高感度を与えた。 （以下余白） 第２表 （ｂ） 各種担体保持抗体の比較（添加回収試験）実
施例１で得られた各挿担体保持抗体の性能にについて調
べるためＥＩＡを行なった。ＥＩＡ用の試薬として、下
記のものを用い、正常人血清について添加回収試験を行
なった。 試薬： （１） 実施例１で得られた各踵抗ＣＥＡ抗体の感作
ポリスチレン球 （２）実施例１． （９）で得られたペルオキシダーゼ
標識抗ＣＥ Ａ抗体複合体 （３）標準ＣＥＡ （４）上記（２）、 （３１の試薬の希釈上用いる緩４
ｉ［Ｅ：１０９６羊血清、０．１９６牛血清アルブミン
。 ０、１ Ｍ ＮａＣ１を含むｐＨｒ、２）ｏ、ｏ ｔＭ
リン酸緩衝液 （５）ｏ−フェニレンシアミン （６）上記（５）ノ溶解に用いる緩衝液Ｉ）： ｏ、
０２９６過酸化水素、０５００２％メルチオレートを含
むｐＨ４，８の０１Ｍクエン酸緩酸液 （７）停止液：２Ｎ硫酸 各種坑ＣＥＡ抗体感作ポリスチレン球の調製：０．１〜
１炭酸緩新液（ｐｉ−１９，６）で希釈して調製した実
施例１の（２） 、 （５） 、 （６）項のモノクロ
ーナル抗ＣＥＡ抗体溶液（１００μ’ｊ／ｎｌ ）
Ｌ ＯＯＢｌ中にポリスチレン球（直径６．５ ｍｍ
、株式会社イチゴ）７００個を浸し、５℃で３日間放置
して感作させた。 更に、１％ＢＳＡを含む０．０２ＭＩＪン酸緩嘴液（ｐ
＋−ｒ ７． Ｏ’）で洗浄した後、用時まで冷却保存
した。 操作： 標準（ＩＡ溶液あるいは被検試料５０μｌ（＝試薬（１
）１個および試薬（４）で希釈した試薬（２） ２５０
μｌ（複合体として約２００ｎｇ）を添加し、３７℃で
１時間反応させた。ポリスチレン球を精製水で水洗し、
試薬（６）テ溶解Ｌり０．２％（７）試薬（５）５００
μｅを加えて、室温で３０分間反応させた後、２ＮＨ２
ＳＯ４１，５ｍｌを添加して反応？停止させ、４９２ｎ
ｍの吸光度を測定した。 上記の操作方法により、正常人血清検体にＣＥＡを１０
ｎ９７ｍｅ添加して添加回収試験を行なった。 その際、血清検体について前処理（５６℃、３０分間加
温）した場合と前処理しない場合について添加回収率を
比較検討した。結果を表３表に示す。 血ｔ１４検体を前処理した場合、いずれの担体保持抗体
も良い添加回収率を示した。しかし前処理しない場合、
モノクローナル抗ＣＥＡ抗体ｒ−グロブリンでは血清中
のインヒビターの影響のためか添加回収率は低かったが
、Ｆ（ａｂ’）−およびＦａｂ’ フラグメントでは良
い添加回収率を示した。 第３表 １）血清検体を前処理（５６℃、３０分間）した場合 ２）血清検体な前処＋１ｐ Ｌない場合（Ｃ） ＣＥＡ
の免疫化学的測定キットおよびＣＥ Ａの４）１０）定 下記のＣＥＡ免疫化学的測定キットを用い、下記の操作
法に従って正常人および担１＜＋＋患者血清中のＣＥ
Ａ濃度を測定した。 ＣＥＡの免疫化学的測定キット： （１）実施例１− （５）で得られたモノクローナル抗
ＣＥＡ抗体Ｐ （ａｂ’ ）２−ｙ ラ、グメント（Ｍ
Ｏ−Ｔ４）の１． ＯＯμＱ／ｄ ０．１ Ｍ炭酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ９，６）１００ｍ／中にポリスチレ
ン球（直径６．５ｍ。 株式会社イチコ製）７００個を浸し、５℃で３日間イン
キュベートし、更（二１９６ＢＳＡを含む０．０２ Ｍ
ＩＪン酸緩斬液（ｐｌ−１７，０）で洗浄してなる抗
体感作ポリスチレン球 （２）実施例１−（１０））で得られるベルオキンダー
ゼ標識抗ＣＥＡ抗体複合体 （３）０〜２００ｎｇの標準ＣＥＡ （４）上記（２） 、 （３）の試薬および被検試料の
希釈」−用いる緩ｔ＋ｆ［Ｊ ： １０ Ｑ６羊血清、
０．１％牛血清アルフミン、 ０．１ＭＮａＣ１を含
むＩ）１−Ｉ ７．２（７）０．０１Ｍリン酸緩衝液 （５）０−フェニレンジアミン （６）上記（５）の溶解（二用いる緩術面り：０．０２
％過酸化水素、０．００２％メルチオレートを含むｐｔ
＋４．８の０．１ Ｍクエン酸緩衝液 （７）停止ａ★：２Ｎ硫酸 操作方法 標準ＣＥＡ溶面あるいは被検試料５０μｅに試薬（１）
１個および試薬（４）で希釈した試薬（２） ２５０μ
ｅ（複合体として約２００１０）ｇ）を添加し、３７℃
で１時間反応させた。ポリスチレン球を精製水で水洗し
、試薬（６）テ溶解シタ０．２ｑ６（７）試薬（５）５
００Ｊを加えて、室温で３０分間反応させた後、２ＮＨ
２３０４１，５ｙｔを添加シテ反応を停止代セ、４９２
１０）ｍの吸光度を測定した。 上記の方法（二より、正常人および担癌患者血清中のＣ
ＥＡ濃度を測定した。 結果は第４表に示される。 （以下８シ） 第４表 正常人血清 １０．５ 正常人血ｉ ２ １．０ 正常人血清 ３２．５ 正常人血清 ４１．４ 正常人血清 ５１．９ 胃 癌 患 者 血 清 １２．１ 血 清 ２ １５．０結腸
６患者 血 清 １ １３．６血
清 ２ １３８．０血
清 ３ ２４．０乳 癌 患
者 血 清 １３．６ 血 清 ２ １０．５血
清 ３ ７００すい腺癌患者 ４１０）１定の結果、正常人血清のＣＥＡ値は０．５〜
２，５ｎＶ／ｍｌ （平均１．４ ｎＱ／ｍｌ ）であ
ったが各種癌患者血清のＣＥＡ値は高値を示し、最大１
３８ ｎ９１ｍ１となった。 （ｄ）ＣＥＡの免疫化学的測定キットおよびＣＥＡの６
１０）１定 下記のＣＥＡ免疫化学的測定キットを用い、下記の操作
法に従って正常人および担癌患者血清中のＣＢＡ購度を
測定した。 ＣｇＡの免疫化学的測定キット： （１）実施例１− （５）で得られたモノクローナル抗
ＣＥＡ抗体Ｆ（ａｂ’）２７ラグメント（ＭＯ−Ｔ４）
の１００パ／ｄ ０．１ Ｍ炭酸ナトリウム緩＠液（ｐ
Ｈ９，６）Ｌｏｏｍｔ中にポリスチレン球（直径６．５
順。 株式会社イチコ製）７００個を浸し、５℃で３日間イン
キュベートし、更に１％ＢＳＡを含む００２Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）で洗浄してなる抗（ｉζ１・８作ポ
リスチレン球 （２）実施例１− （９）で得られるペルオキシダーゼ
標識抗ＣｇＡ抗体複合体 （３） ０〜２０００ｇの標準ＣｇＡ （４）上記：２） 、 （３）の試薬および被検試料の
希釈上用いる緩衝酸Ｅ：ｔＯ％羊血清、０．１ｑ６牛血
清アルブミン、０、Ｉ Ｍ ＮａＣ１を含むｐ Ｈ７，
２（Ｄ ０． ＯＩ Ｍリン酸緩衝液 （５）Ｏ−フェニレンジアミン （６）上記（５）の溶解に用いる緩＠液り：０．０２％
過酸（ヒ水素、０．００２％メルチオレートを含むｐＨ
４８のｏＩＭクエン酸緩斬液 （７）停止液＝２Ｎ硫酸 操作方法 標ｔ＄ＣＥＡ溶腋あるいは被検試料５０μｅに試薬（１
）１個および試薬（４）で希釈した試薬（２） ２５０
μｌ（複合体として約２０ Ｏｎ９）を添加し、３７℃
で１時間反応させた。ポリスチレン球を精製水で水洗し
、試薬（６）テ溶解した０２％の試薬（５） ５００
ｌｔｅを加えて、室温で３０分間反応させた後、２ Ｎ
Ｈ２ＳＯ４１、５ｍｌを添７１０Ｌで反応を停止させ
、４９２１ｍの吸光度を４１０）１定した。 上記の方法（二より、正常人および担癌患者血清中のＣ
ＥＡ濃度を測定し、第４表と同様の結果が得られた。 （ｅ）ＣＥＡの免疫化学的測定キットおよびＣＥＡの測
定 下記のＣＥＡ免疫化学的測定キットを用い、下記の操作
法に従って正常人および担癌患者血清中のＣＥＡ濃度を
測定した。 ＣＥＡの免疫化学的測定キット： （１） 実施例１． （２）で得られたモノクローナ
ル抗ＣＥＡ抗体ガンマグロブリンフラクション（ＭＯ−
Ｔ４）の１５ μ９／ ｍＬ Ｏ，ＯＩ Ｍ ＮａＣ１
−０，０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨｓ、ｏ ） １００
ｍｌ中にポリスチレン球（直径４、８ ｍｍ、 Ｐｒｅ
ｃｉｓｉｏｎ ＰＩａｓＬｉｃｓ Ｂａ１ｌ Ｃｏ、、
ＣＩ＋ｉｃａｇｏ。 Ｕ、Ｓ、Ａ、） １５００個を浸し、５°Ｃで１夜イン
キユベートし、更に０．１％ＢＳＡを含む０．０５Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄してなる抗体感作ポリ
スチレン球 （２）実施例１． （９）で得られるベルオキシターゼ
標識抗ＣＥＡ抗体複合体 （３） ０−２００１０）．の標準ＣＥＡ（４）上記
（３）の試薬および被検試料の希釈上用いる緩衝液Ｂお
よび緩衝液Ａ（前項（ａ）参照）（５）Ｏ−フェニレン
ジアミン （６）上記（２）の試薬の希釈に用いる緩衝液Ｃｉ０．
１％ウシ血清アルフミン、０．００２％メルチオレート
を含むＰＨ７，５の０．１． Ｍ ！Ｊン酸緩衝液（７
）上記（５）の溶解に用いる緩衝液Ｄ；０．０２％過酸
化水素０．００２％メルチオレートを含むＰＩ（４，８
の０．１Ｍクエン酸緩衝液 （８）停止液ｉ２Ｎ硫酸 操作方法 標準ＣＥＡ溶液あるいは被検試着１５０μで（非働化し
たもの）（二試薬（４）緩衝液Ｂ２５０μｅおよび試薬
（１）１個を添加し、室温で１日間反応させた。ポリス
チレン球を緩衝液Ａで水洗後、試薬（６）で希釈した試
薬（２） ３００μｅ（複合体として約３０１ｇ）を添
加し、４℃で１日間反応させた。ポリスチレン球を緩＠
液Ａで水洗し、試薬（７）で溶解した０、１５％の試Ｘ
（５） ５００ ／ｌｌを加えて室温で４０分間反応さ
せたのち、２Ｎ硫酸１．５ ＊Ｉ！を添加して反応な停
止させ、４９２τｌｎｌの吸光度を４１０）１定した。 上記の方法Ｃ二より、正常人および担癌聴者血清中のＣ
ＥＡ濃度をｌ１ｌｌｌ定した。結果は第５表に示される
。 （以下余白） 第５表 被検試料 ＣＥＡｉｉ１度（ｎ ｇ ／’ｍＬ ）正
常人血清 １０．５ 正常人血清 ２１．０ 正常人血清 ３０，７ 正常人血清 ４１．６ 正常人血清 ５１．２ 胆のう癌患者 血 清 １ ８７血 清
２ １０．３肝 癌 患 者 血 清 １ ６４血 清
２ ２０．８胃癌患者 血 清 １０）．４ 血 清 ２９，６ 血 清 ３５．０ 結腸癌患者 血 清 １ ５６５血 漬
２ ３８５二 清 ３１０）３ 抑 癌患者 皿 清 】５７ ｆｌｌ１０）定の結果、正常人血清のＣ，ＥＡ値は０．
５〜１゜２ ｎｇ／ ｍｌ （平均１． Ｏｎｇ／ ａ
Ｌ ）であッｔ：が各種癌患者血清のＣＥＡ値は高値を
与え最大５６５ ｎｇ／ ｍｌとなった。 実施例３ ＣＥＡ測定用免疫化学的」り定試薬： ＣＥＡを測定するだめの試薬として、次のものが挙げら
れ、壕だ測定方法として次のものが挙げられる。 試薬： ■ 抗ＣＥＡ抗体感作マイクロプレート（≧）実施例１
−４１０）で得られた抗ＣＥＡ抗体ｆ（ＲＰ複合体 ■ 標準ＣＥＡ ■ 緩衝ＩＢ（１０％子牛血清、０． ’１５１ＶＩ
ＮａＣ１を含むｐＨ７，０の００２Ｍリン酸緩揮ｊ液）
、援ｉＪｉ液Ａ （０，１，５Ｍ ＮａＣ１を含むｐ）
（７，０の０．０２Ｍリン酸緩衝液） （の ベルオキ／ダーゼ活性１０）１０）定に必安な試
薬：０．０２％過酸化水素と０．１５％０−フェニレ／
ジアミ／を含むｐｌｔ（４，８の０．１Ｍクエン酸−リ
ン酸二ナトリウム緩衝液および反応停止液（２Ｎ−硫酸
） 抗体感作マイクロプレートの調製： ＥＩＡ用イムノプレートｌ（ヌンク社（デンマーク）製
〕の各ウェルにモノクローナル抗ＣＥＡ抗体γ−グロブ
リン・フラクション（ＭＯ−に５ ）を０．１ Ｍ炭酸
緩衝液（ｐＨ９，６）で希釈して調製した抗体溶液（５
０μｇ／ｍｅ）を１００μｅずつ注入して４“Ｃで一夜
放置して感作させる。０１％ＢＳＡを含む００１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄したのち、用時まで冷所
保存する。 測定： 緩衝液Ｂに浴ｍ：’＜せたＣＥＡ標準溶液あるいは被検
試料１００μ／’ （あらかじめ非動化した被検試料を
希釈した液）を各ウェルに注入し、３７°Ｃで３時間反
応させる。各ウェルを緩衝液Ａで洗浄後、実施例１−
（１０）で得られた抗ＣＥＡ抗体−ＨＲＰ複合体溶液１
００ ｐｌを加、ｊｔで２５°Ｃテ３，５１０）、冒１
０）ｊさらに反応させる。ウェルを緩衝液Ａで洗浄し、
これに０．０２％過酸化水素と０．１５％０−フェニレ
ンジアミンを含む０．１ Ｍクエン酸−リン酸二ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ４，８）１００μｅを加えて３０ ”
Ｃで３０分間反応させ、２Ｎ−硫酸１００μｌずつ加え
て反応を停止させてから、マイクロプレート用自動比色
計しタイターチック・マルチスキャン・フロー社（米国
）製〕を用い、４９０ｎｍにおける吸光度を測定する。 実施例４ ＣＥ Ａ １ｆｌｌｌ定用免疫化学的測定試薬およびＣ
ＥＡのｄ１０）１定： 次に挙げるＣＥＡ測定用免疫化学的測定試薬を用い、次
に述べる方法で正常人と担癌患者との血清中のＣＥＡを
測定した。 試薬： ■ 抗ＣＥＡ抗体感作マイクロプレート■ 実施例１−
（９）で得られた抗ＣＥＡ抗体ＨＲＰ複合体 ■ 標準ＣＥＡ ■ 緩衝液Ｂ（１０％子牛血清、０．１５ Ｍ ＮａＣ
１ｆ含むｐＨ７，ｏのｏ、ｏ ２ＭＩＪｙ酸緩衝ｆｆ）
、緩衝液Ａ （０，１５Ｍ ＮａＣ１を含むｐＨ７，０
の０．０２Ｍリン酸緩衝液） （Ｑ ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬＝００
２％過酸化水素と０．１５％Ｏ−フェニレンジアミンを
含むｐＨ４，８の０，１Ｍクエン酸−リン酸二ナトリウ
ム緩衝液および反応停止液（２Ｎ−硫酸） 抗体感作マイクロプレートの調製： ＥＩＡ用イムノプレート１〔ヌンク社（デンマーク）製
〕の各ウェルに参考例１−（２）で得られたモノクロー
ナル抗ＣＥＡ抗体γ−グロブリン・フラクションＩ’Ｍ
Ｏ−に５）を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，６）で希釈
して調製した抗体溶液（５０ｐＥ／／ｍｅ） を１０
０μｅずつ注入して４℃で一夜放置して感作させた。０
１％ＢＳＡを含む００１Ｍ ’Ｊン酸緩衝液（１）Ｈ７
，Ｏ）で洗浄したのち、用（１ｈ゛まで冷所保存した。 測定： 緩衝液Ｂに溶解させたＣＥＡ標準溶液あるいは被検試料
ｔ００７ｚ／（あらかじめ非動化した被検試料を希釈し
だ液）を各ウェルに注入し、３７°Ｃで３時間反応させ
た。各ウェルを緩衝液Ａで洗浄後、実施例１−（９）で
得られだ抗ＣＥＡ抗体−ＨＲＰ複合体溶液１００７ｚ＃
を加えて２５°Ｃで３．５時間さらに反応させた。ウェ
ルを緩衝液Ａで洗浄し、これに０．０２％過酸化水素と
０．１５％Ｏ−フェニレンジアミンを含む０．１ Ｍク
エン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，８）１０
０μｇを加えて３０°Ｃで３０分間反応させ、２Ｎ−硫
酸１００μｌずつ加えて反応を停止させてから、マイク
ロプレート用自動比色計〔タイターチック・マルチスキ
ャン・フロー社（米国）製〕を用い、ブランクを対照に
して４９０１ｍにおける吸光度を測定した。 結果を第６表に示した。 、７．ミ下余白） 第 ６ 表 一τ倹試料 ＣＥＡ濃度（ｎＩ／驚）正
常人 ＪＪＩＬ イ＊Ａ
１ 。６血清Ｂ１．５ 血清Ｃ１，５ 血清Ｄ １．。 犬、暢癌患者 ｊ旦 清 Ａ
１３１．０皿 清 Ｂ
１４．。 血清Ｃ１３，８ 血 （青 Ｄ ８８．０血清Ｅ
８．４ 回前Ｆ １２．ｇ 実施例５ ｃ Ｅ Ａ ６＋（ｊ定１’ｌ免疫ｆ１−学的測定１ム
（薬：ＣＥ Ａを測定−Ｊ″″るＡ−めの試薬として、
次のものが挙げら：ＩＬ、 ４だ測定方法として次のも
のが挙げられる。 試薬： （１）参考例１（２）で得られたモノクローナル抗ＣＥ
Ａ抗体ガンマグロプリンフラク／ヨン（ＭＯ−に５）の
１５ μｇ／’ｍｌ ０．０１ Ｍ ＮａＣｌ−０，Ｏ
Ｉ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨｓ、ｏ ） ｔ ｏｏｍｌ中
にポリスチレン球（直イ％ ４． ８ ｍ＋ａ 、
Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｂａ
１ｌ Ｃｏ、、 Ｃｈｉｃａｇｏ。 Ｕ、Ｓ、Ａ、 ） １５００個を侵り、、５”Ｃて１夜
イノギ。 べ−トシ２、更にＯ，１％Ｂ Ｓ Ａを含む００５Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄してなる抗体感作ポリ
スチレン球 （２）実施例１（９）で得られたベルオギ／グーゼ標識
抗ＣＥＡ抗体複合体 （３） ０〜２０ Ｏｎ、Ｓ’のけ準ＣＥＡ（４）上
記（３）の試薬および被検試料の希釈ト用いる緩衝液Ｂ
および緩衝液Ａ（実施ＩＺ１０）２ （ａ）参照）（５
）０−フェニレン／アミン （６）上記（２）の試薬の希釈に用いる緩衝液Ｃ；０１
％つ／血清アルブミン、０．００２％メルチオレートを
含むｐＨ７，５の０．１ Ｍ’）ン酸緩衝液（７）上記
（５）の溶解に用いる緩衝液Ｄ；０．０２％過酸化水素
０．００２％ノルチオレートを含むｐＨ４，８のｏ、
］ ＋ＶＩクエン酸緩衝液 （８）停止１−液；２Ｎ硫酸 操作方法 標準ＣＥＡ溶液あるいは被検試料５０／ｌｅ （非動化
Ｌ７たもの）シＣ試薬（４）緩衝液Ｂ２５０μｌおよび
試ｇ（ｔ）１個を添加し、室温で１日間反応させる。 ポリスチレン球を緩衝液Ａで水洗後、試薬（６）で希釈
した試薬（２） ３００μｌ （複合体として約３０ｎ
ｐ）を添加し２．４°Ｃで１日間反応させる。ポリスチ
レン球を緩衝液Ａで水洗し、試薬（７）で溶解した０、
１５％の試薬（５） ５００ ／１０）を加えて室温で
４０分間反応させたのち、２Ｎ硫酸１．５ ｍｌを添加
して反応を停止させ、４９２１ｍの吸光度を測定する。 発明の効果 本発明の試薬を用いると、高感度かつ正確にＣＥＡが測
定され、大腸癌などの消化器癌や他の癌などの診断、予
後管理などに対して極めて有用である。すなわら、本発
明におけるチオール基を導入したベルオキシダーセで標
識された抗体を用いた場合は、固相に対する非持異的な
吸着が小さいのでＣＥＡの測定の盲検値が小さくしたが
って測定の信頼性が増大する。また、本発明で得られた
モノクローナル抗体はＣＥＡに対して親和性が強く、他
のＣＥＡ関連抗原に対する交差反応性がはるかに小さい
ので被検液に同時に存在するＣＥＡ関連抗原からの影響
を受は難い。更に、モノクローナル抗体を試薬の構成成
分としているので製品の供給が容易であり、測定の再現
性が高い。 また、本発明の方法で得られたＣＥＡを免疫原として作
製されたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体は、ＣＥＡに対す
る反応性が高くしかもＣＥＡ関連抗原ＮＣＡ、ＮＣＡ−
２との交差反応を有しないモノクローナル抗ＣＥＡ抗体
である頻度が高く、従ってモノクローナル抗ＣＥＡ抗体
作製方法として有用である。 これらの選択されたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体は免疫
化学的診断剤を構成する成分として利用することができ
る。例えばサンドイツチ法による酵素免疫試験法におい
ては担体上に保持された抗体および（もしくは）酵素で
標識された抗体におけるモノクローナル抗ＣＥＡ抗体と
して用いることができる。これらの診断剤は大腸癌など
の消化器癌や他の癌の診断、予後管理などに利用できる
。 更にこれらの抗体は治療目的にも利用することができる
。
第１図は、実施例１−（７）で得られたペルオキシダー
ゼとポリクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’ フラグメ
ント）との反応生成物のゲルクロマトグラフィーにおけ
る溶出パターンを表わす。 第１図 ブラクシタン阜
ゼとポリクローナル抗ＣＥＡ抗体（Ｆａｂ’ フラグメ
ント）との反応生成物のゲルクロマトグラフィーにおけ
る溶出パターンを表わす。 第１図 ブラクシタン阜
Claims (10)
- （１）担体上に保持された抗体、抗原および標識剤を結
合させた抗体を用いるヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測
定法において、担体上に保持される抗体と標識剤を結合
させる抗体とが互いに抗原決定部位を重複しない２種の
抗体であり、該２種の抗体のうち少なくとも一方がモノ
クローナル抗体であり、標識剤としてペルオキシダーゼ
を用い、これと抗体とを一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合または
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わ
される化合物で結合させたものを用いることを特徴とす
るヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法。 - （２）モノクローナル抗体が、ヒト癌胎児性抗原を含有
する癌化組織から、非イオン性界面活性剤を含む中性塩
溶液で抽出し、精製されたヒト癌胎児性抗原で免疫され
た哺乳動物のリンパ球とミエローマ細胞との融合細胞か
ら得られたヒト癌胎児性抗原反応性モノクローナル抗体
である特許請求の範囲第１項記載のヒト癌胎児性抗原の
免疫化学的測定法。 - （３）モノクローナル抗体の分子が、Ｆ（ａｂ′）＿２
である特許請求の範囲第１項または第２項記載のヒト癌
胎児性抗原の免疫化学的測定法。 - （４）モノクロナール抗体の分子が、Ｆａｂ′である特
許請求の範囲第１項または第２項記載のヒト癌胎児性抗
原の免疫化学的測定法。 - （５）ペルオキシダーゼと抗体との結合に際し、ペルオ
キシダーゼにあらかじめチオール基を導入したものを用
いる特許請求の範囲第１項記載のヒト癌胎児性抗原の免
疫化学的測定法。 - （６）［１］ペルオキシダーゼと抗体とを一般式▲数式
、化学式、表等があります▼ 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合または
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わ
される化合物で結合させたもの、および［２］ペルオキ
シダーゼに結合させる抗体と互いに抗原決定部位を重複
せずヒト癌胎児性抗原に反応する抗体を担体上に保持し
たものであって、該２種の抗体のうち少なくとも一方が
モノクローナル抗体であるものを含有するヒト癌胎児性
抗原の免疫化学的測定用試薬。 - （７）モノクローナル抗体が、ヒト癌胎児性抗原を含有
する癌化組織から、非イオン性界面活性剤を含む中性塩
溶液で抽出し、精製されたヒト癌胎児性抗原で免疫され
た哺乳動物のリンパ球とミエローマ細胞との融合細胞か
ら得られたヒト癌胎児性抗原反応性モノクローナル抗体
である特許請求の範囲第６項記載のヒト癌胎児性抗原の
免疫化学的測定用試薬。 - （８）モノクローナル抗体の分子が、Ｆ（ａｂ′）＿２
である特許請求の範囲第６項または第７項記載のヒト癌
胎児性抗原の免疫化学的測定用試薬。 - （９）モノクローナル抗体の分子が、Ｆａｂ′である特
許請求の範囲第６項または第７項記載のヒト癌胎児性抗
原の免疫化学的測定用試薬。 - （１０）ペルオキシダーゼと抗体との結合に際し、ペル
オキシダーゼにあらかじめチオール基を導入したものを
用いる特許請求の範囲第６項記載のヒト癌胎児性抗原の
免疫化学的測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60225293A JPH083490B2 (ja) | 1985-10-09 | 1985-10-09 | ヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法および試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60225293A JPH083490B2 (ja) | 1985-10-09 | 1985-10-09 | ヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法および試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6283665A true JPS6283665A (ja) | 1987-04-17 |
| JPH083490B2 JPH083490B2 (ja) | 1996-01-17 |
Family
ID=16827060
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60225293A Expired - Lifetime JPH083490B2 (ja) | 1985-10-09 | 1985-10-09 | ヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法および試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH083490B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0327296A (ja) * | 1989-06-23 | 1991-02-05 | Fuji Yakuhin Kogyo Kk | ヒトラミニンのモノクローナル抗体、その製法および利用 |
| US4994385A (en) * | 1987-10-30 | 1991-02-19 | Abbott Laboratories | Heterobifunctional coupling agents |
| US5002883A (en) * | 1987-10-30 | 1991-03-26 | Abbott Laboratories | Covalent attachment of antibodies and antigens to solid phases using extended length heterobifunctional coupling agents |
Citations (2)
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| JPS5845560A (ja) * | 1981-08-21 | 1983-03-16 | エフ・ホフマン−ラ・ロシユ・ウント・コンパニ−・アクチエンゲゼルシヤフト | 癌胚杭原の固相サンドウイツチ法による定量方法 |
| JPS60214259A (ja) * | 1984-04-10 | 1985-10-26 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法および試薬 |
-
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- 1985-10-09 JP JP60225293A patent/JPH083490B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| JPH0327296A (ja) * | 1989-06-23 | 1991-02-05 | Fuji Yakuhin Kogyo Kk | ヒトラミニンのモノクローナル抗体、その製法および利用 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH083490B2 (ja) | 1996-01-17 |
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