JPS5845560A - 癌胚杭原の固相サンドウイツチ法による定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 癌胚抗原（ｃｍＡ）の酵素免疫定量法は０Ｌｉｎ。

Ｏｈ＠ｍ、　２６　／　１２．１７１８〜１７２２　（
１９８０）に記載されている。この方法では、前処置し
た血清または真東サンプルを第一工程で１モルモット抗
ｏ１ムで過敏化したｆ−ズと４５℃において２時間イン
キュベートする。洗浄工狽後、Ｃ−ズをヤイ抗０１とワ
サビパーオキシダーゼの抱合体とともに４５℃において
２時間インキュベートする・過剰の抱ｉ体を洗浄により
除去したのち、固相にりいて酵素活性な全知方法により
測定する。同様の操作で得られた標準−線と上に得られ
た値を比較して、サンプル中の０１１ム量を決定する。

本発明は、上述の方法が時間を浪費し両側な、第一およ
び第二の免疫反応の間の洗浄工程を省略し得、しかも感
度の低下もなく同じタイムスパンで実施で舎ることを発
見し完成されたものである。

この簡略化は、試験すべきサンプルを、水不溶性担体と
結合している第１の０１ム抗体およびパーオキシダーゼ
が結合している第二の抗体と、りン酸イオン０．４〜１
．□　ｍｏｔ／　Ａ　、硫酸イオン０．２〜０．４ｍａ
ｔ　／　ｔまたは酒石酸イオン０．２〜０．４　ｍｏＬ
　／　Ｌの存在下にインキュベートすることにより可能
になる。

しかも、上述のイオンを用いることにより、上述のＯ’
ｌｉｎ、　Ｏｈｅｍ、記載の２工程方法の時間も短縮で
きる。すなわち、第二のインキュベーションは感゛度の
低下をみることなく半分の時間で（１時間）で行うこと
ができることも明らかＫなった。

抗原の定量、この場合の０１ムの定量における上述の酵
素免疫法は一般に固相すてドウイツチ鰺として知られて
いる。この方法での酵素、すなわちパーオキシダーゼは
、抗体と直接またはビオチン／アビジン橋を介して結合
できる。

したがって、本発明は、試験すべきサンプルを、水不溶
性担体に結合しているかｔたは結合する第一の癌胚抗厘
（ｏ’ｉ！！ム）抗体諺よびパーオキシダーゼが直接ま
たはＶオチン／ア♂ジン橋を介して結合している第二の
０１１！Ａ抗体とインキュベートし、同相と液相を分離
し、ついで固相または液相いずれかのバーオキシダーぜ
活性を存在するｃｍＡ−ｔとして測定する癌胚抗原（ｃ
ｍＡ）の固相サンドウィッチ法による迅速定量方法であ
って、インキュベーションをリン酸イオン０−４〜１　
＃　ＯＩｎ０Ｌ　／　Ｌ　ｓ硫酸イオン０．２〜ｏｍａ
ｍｏｔ７ｔまたは酒石酸イオン０−２　＝　０．４　ｍ
ｏｔ　／　Ｌ　ノ存在下に行５ことを、４１１１する癌
胚抗原の定量方法である。

すでに述べたように、本発明の同相サンｒウィッチ法に
よれば、試験すべきサンプルを水不溶性担体に結合して
いるＯＸム抗体の一方とインキュベートシ、洗浄工程後
にパーオキシダーゼで標識された第二のａｒｔム抗体と
インキュベートすることもできる。りン酸イオン０．４
〜１＊ａ　ｍｏｔ／ｌｓ　硫ｍイオン０．２〜ｏ、ａｍ
ｏｔ／ｌまたは酒石酸イオン０．２〜Ｏ＊４　ｍｏｚ　
／　ｔの活性化効果は第二のインキュベーションに対し
て効果があるので、この第二のインキュベーションは上
述のイオンの存在下に実施される。

Ｔでに述べたようＫ、水不溶性の担体と結合している第
一の０１１！Ａ抗体としては１モルモッ）　０１１ｔＡ
抗体を使用できる。パーオキシダーゼが結合している第
二の抗体としてはヤイ抗Ｏ１ｅムが使用できる。

第一および第二のＯＸム抗体としては、また２種の異な
るモノクローンマウス０１！ｌム抗体も使用できる。こ
の場合、両者とも０］ｃＡＶｃ対し指向性を示すが、０
１！ｉムの別個の工ｆトーゾに対して指向性を示すもの
でなければならない。

さらに、第一の抗体としてモノクローンマウス０１ム抗
体、第二の抗体として、ある動物（たとえばヤヤ）の抗
血清からのぼりクローン抗体を用いることもできる。

バーオキシダーぜはそれ自体公知の方法により。

たとえばＷｉｌｌＯｎおよびＮａｋａｎｅの方法（Ｉｍ
ｍｕｎｏ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｌ　Ｒｅ１
ａｔｅｌ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｔｅｏｈｎｉｑｕｅ＊。

１９７８．２１５頁）Ｋよって抗体に結合させることが
できる。モノクローンマウス０１！！ム抗体の場合は、
これらの公知方法では、これらの抗体の免疫学的性質が
ある種の条件で損われることが明らかＫされている。こ
のよ５な場合にはモノクローンマウス０ＩＣＪＬ抗体を
Ｖオチニル化し、ついテコノ生成物をアＶジン−バーオ
キシダーぜ複合体と反応させるのが有利である。アビジ
ンーパーオキシメーゼ複合体の製造は、上述のＷｉｌｓ
ｏｎと１ｉａｋａｎｅの方法と同様にして行５．１１Ｊ
クロ一ン抗体（すなわち動物造清からの抗体）の場合は
、パーオキシダ一ぜを抗体に直接結合させるのが好まし
い。

第一の抗体に対する水不溶性担体としては、有機または
無機−リマー〔アミラーゼ、デキストラン、中性もしく
は改曳セルロース、ｆｓリアクリルアイド、アガロース
、マグネタイト、多孔性ガラス粉末％ｆすＣニリデンフ
ルオライド（Ｋｙｎａｒ　）およびラテックス〕、試験
容器（ガラスｔたは合成材料の試験官、滴定板またはキ
ュベツト）の内壁、ならびに固体物体（ガラスまたは合
成材料のロツＰ、ｃ−ズまたは他の物体）を使用で会る
。

本発−の方法において、とくに適尚な担体は、ガラスま
たは合成材料のビーズである。

抗体は水不溶性担体と、反応中または反応後に、物履的
Ｋ（ａ着）もしくは化学的に、ｔたはさらＫＩＩ体Ｋｆ
ｉ１１合する反応パートナ−を用いて、結合させること
ができる。

免疫学的反応は０°〜５５℃の温度で行うことが好まし
い。免疫学的反応の速度は通常、Ｓ度が高いほど増大し
、他の条件が同じ場＊にはより急速に平衡に達するよう
になる。

本発明の新規な方法は感度が著しく高く、反応時間の短
いことが特徴である。

本発明の方法のための試験用キットは、とくにパーオキ
シダーゼが結合するａｍム抗体を、リン酸イオン０．４
〜１．０　Ｎｏｔ／　ｔ、硫酸イオン０．２〜０．４　
ｍｏｔ／　Ｌまたは酒石酸イオン０．２〜［１，４ｍｏ
ｔ／　Ａを含むｐＨ４〜９の水溶液中に含有する容器か
らなるものである。

次に本発明を以下の実施例によって説明する。

必要数の試験管（１０Ｘ７５ｍ）Ｋ、それぞれ、試験液
（’　ＮａＨｆｆｉＰｏ、　／　Ｎａ、ＨＰＯ４、ＰＩ
（６，５、０，８ｎｏ、４／ｌｔｔｃ２ｇ／Ｌのウシ崩
清アルデミン、２０Ｉｓ正常ヤイ愈清、０．２１／１４
−アミノアンチＶ！ＩＪンおよび０．２μＩ／−のヤヤ
抗ａＸムーパーオ牛シダーゼ抱会体を含む）０．２ｍｇ
、定量すべき患者愈清またはｏｘム標準液（０１ムＯｎ
ｌ　／　ｄ　、　０１２！Ａ　２．５　ｍｙ／ｄ。

ａ１ム１０！１１／−および０ＩｌｆＡ　２０　ｎｌ　
／ｓｇ含有液）およびｏｎ五対照血清（Ｃ１ム１０．２
ｎｌ／ｄ±１．０ｎ＃／ｓｇ）０．０５０ｍｇをピペッ
トでとり、混合し、それぞれにモノクローンマウス抗０
］！！ムで感作したポリスチレンＣ−ズ（φ冑６．５■
）を加え、この混會物を４５℃でインキュベートする。

次Ｋｆｌ？リスチレンｆ−ズな各回２〜５ｍｇの蒸留水
で３回洗浄し、それぞれ０．５−の基質緩衝１Ｋ　（０
，１ｍｏｔ　／　１のクエン酸カリウム緩１Ｆ１１１ｐ
Ｈ５，０中、ｉ！、０２６　ｍｍｏＬ　／　Ｌ　＊よび
ｂ−フェニレンジアミン４　Ｑ　ｍｍｏＡ　／　Ｌを含
１）ＫＩＩＬ、ｒ、Ｎ−ｔ４−シＪｊ−ゼの活性を定量
するため室温（２２℃）で３゜分間インキュベートＴる
。パーオキシダーゼの活性を停止させ、色を強めるため
、１　ｍｏｚ　／　ｔ　ＩＩａｔ２、ローを拠金し、３
０分以内に波長４９２　ｎｍ　Ｋおける吸収を比色欄定
する。第１表に以上の定量法で得られた値を示し、また
Ｒｏｃｈｅの放射免疫法で測定した値（参照値）、およ
び０）ｉｎ、　Ｏｈ・ｍ。

２６／１２，１７１８〜１７２２（１９８０）の方法の
改良法（トリス緩衝液の代わりＫ　Ｏ，２Ｍ　ＩＪン酸
緩衝液中ヤイ抗ａｍムーバ−オキシダーゼ抱会体を使用
）で得られた値と比較した。

な詔、モノクローンマウス抗ＯＮムの製造はｙｏｕｒｎ
ａｌｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、ＯｇｉｏａＩＭ＠ｔｈｏａ
ｓ、　５２（１９８０）２９７〜５０４に記載の方法と
同様にしてＩＪ！施し、この場合、融合のための出発セ
ルラインとしては１９７９年５男２５日Ｋ　Ｎｏ、　Ｏ
ＲＬ　ｆ３　Ｑ　０６としてＡＴＯＯＫ寄託され、１９
８１年１１月２４日に無条件に公開された骨髄腫ライン
８ｐ２１０１−ムＧを用いる。融合はＯＢムで免疫処１
１されたマウスの牌細胞を用いる。マウスの免疫処置は
上述の文献の第１表の方法に準じ、最初の２つの免疫処
置はそれぞれ５０μ９のＯＥムを用いて行い、免疫処置
３詔よび４は省略した。免疫処置５はＯＢム５０１１１
１で夾施し、免疫処置６〜８はそれぞれ０］！ｌム２０
０＃＃を用いて行った。

ｎｌ／１以上は病的ｉｕａである。第１表から明らかな
ように１本発明の方法によって得られた値は０１１ｍ、
　Ｏｈ＠ｍ、の改良方法（上述）によって得られた値あ
るいは１ｉｏｅｈ＠ＲＸム試験法で得られた値とよ（相
関する。

例２ 上昇 必要数の試験管（１０ｘ７５■）Ｋ、それぞれ。

試験液（０，２ｍｏｊ　／　Ｌりン酸ナトリウム緩衝液
または０．８　ｍｏＡ　／　Ｌりン酸ナトリウム緩衝１
１１ＰＨ６，５中２１１／Ｌウシ崩清アルデミン、２０
１Ｇヤヤ崩清、０．２１１／１４−アミノアンチピリン
および０．２μｇ／−ヤヤ抗０ＥＡ−パーオキシダーゼ
抱合体）　０．５　ａｔ、０ＩＩＩＡ標準液（０ＩＩＩ
Ａ　ＯＩｌｌ／ｗｌ、２．５　ｎｌ　／　ｓｇ、ｏｘム
１０ｎ＃／−および０ＩＩＩＡ　２０ｎ＃／−含有液）
および０ＩＩＩＡ対照崩清（１０，２ｎＪｌｌ　／ｓｇ
±１　、Ｏｎｊｌ　／　ｓｇ　０１１１ム）　０．０５
０−を−ペットでとり、混合し、それぞれモノクローン
マウスＯＭム抗体で感作したポリスチレンＣ−ズ（φ−
６．５ｍ）を加え、混合物を４５℃で４時間インキュベ
ートする。ついで４リステレンビーズを各回２〜５−の
蒸留水で６回洗浄し、それぞれバーオキシダーぜ活性を
測定するための基質緩衝液（０，１ｍｏｔ／ｌのクエン
酸カリウム緩衝液−５，０中ｓ　Ｈ１’１４　ｍｍｏＡ
　／　Ｌ　＊よびｉ−フェニレンシア叱ン４０鵬ｏＬ　
／　Ｌを含有）Ｋ移して、室１ｍ（２２℃）で３０分間
インキュベートする。パーオキシダーゼのｍｓを停止さ
せ１発色を強めるため、１　ｙｍｏｔ／１ｍａｔ　２，
０−を混合し、３０分以内に波長４９２　ｔ１ｍＫ＄け
る吸収を比色測定する。第２表にはＩＪ　ン酸ナトリウ
ム緩衝液０．２　ｍｏｔ　／　ｔと０．８　ｍ０ｔ／　
ｔの場合の値を示す。

第２表から明らかなように、０．８１ａＯＬ　／　Ｌの
リン酸イオンを用いると０．２　ｍｏｔ　／ｌの場合に
比べて感度は顕著に上昇する。

氾 」Ｌ 必要数の試験管（１０Ｘ７５■）のそれぞれに試験液（
硫酸イオンを含まないまたはＱ、４　ｍ０４／Ｌの硫酸
イオン（ｌｉａ、８０．　）を含む０．２　ｍｏＡ　／
　Ｌリン酸ナトリウム緩衝１１１ｐＨ６，５中、２１／
ｌ−のウシ皇清アルデミン、２０憾ヤｊＩ＃血清、ｏ、
２ｉ／１４″′″ア（ノアンチぜりンおよび肌２μｇ／
−ヤイ抗０１ムーパーオ牛シ〆−ゼ抱合体を含有）　０
．５ｄ。

ｏｙ＋ム標準１ｌｌ（０１ムＱ　ｎｊ　／　Ｍｌ、２．
５　ｍｌ　／ｓｇ。

５．０ｎｊｌ／ｓｇ、１ｏ、ｏ　ｎｙ／ｓｇ畠よび２０
．Ｏｎｌ／ｗｔ）０．０５０−および０］ＣＡ対照愈清
（０ＩＩＩＡ　Ｉｏ、２　ｎｔｉ　／ｓｇ±１．Ｑ！ｌ
ＩＩ／−をぜペットでとって混合し、それツレ、モノク
ローンマウスａｍム抗体で感作したポリスチレン♂−ズ
（φ−６．５ｍ）を加え、混合物を４５℃で４時間イン
キュベートする。ついでポリスチレン「−ズを各回２〜
５ｍｇの蒸留水で３回洗浄し、バーオキシダーぜ活性を
測定するためにそれぞれ０．５　ｍｇの基質緩衝液（Ｑ
、　１ｍｏ４　／　ｔのりエン酸カリウム緩衝液ｐｉ（
５，０に６ｍｍｏｊ　／　ＬのＨ，Ｏ，および４　Ｑ　
ｍｍｏＡ　／　Ｌの０−フェニレンシアギンを含有）Ｋ
移し、室ＩＩ（２２℃）で３０分間インキュベートする
。パーオキシダーゼの活性を停止させ、発色を強めるた
めに１ｍｏｚ／ｚのＨａｔ２．０−を混合し、３０分以
内に波長４９２　ｉｎの吸収を比色測定する。第３表に
は０．２　ｍｏｂ　／　ｔのＩＪ　ン酸緩衝液中硫酸イ
オンを含まない場合と硫酸イオン０．４ｍｏｔ／ｌを含
む場合に得られた値を示す。

第３表から、硫酸イオンの存在により感度が着しく上昇
することが明らかである。

ＬＬ 必ｌＩ数の試験管（１０ｘ７５ｍ）Ｋ、試験液（０，２
ｍｏｔ　／　ｔまたは０．８　Ｒ１ｏｔ／Ｌ　ＩＪ　／
ｌｌ＋　）　ＩＪウム緩衝液−６，５中、２１／Ｌウシ
血清アルデミン、２０１１ヤヤ崩清％０．１１／１４−
アミノアンチぜリンおよび４８０　ｎｌ　／−モノクロ
ーンマウス抗０１Ａ　−（０−５）　＋＋　ｒオチｙ　
７７に’ジンーパーオキシダーゼ含有）８．２−をそれ
ぞれ−ペットでとる。この試験１１１ＫＯＫ’ム標準液
（ＯＩＡ　Ｑ　ｎ１７’ｗｌｓ２．５ｎ、９／ｓｇ、５
．Ｏｎｌ　／−、１０ｎｌ　／ｓｇｇヨＩＪ’２０ｎ＃
／ｓｇ）を加え、またモノクローンマウス抗０′ＩＡム
一（０−１９）で感作したｌ、リスチレンビ−ｒ（ｆ−
６，５ｍ）を加えて混合物を３７℃で１６時間インキュ
ベートする。ついで、ぼりエチレンＶ″−ズを各回２〜
５−の蒸留水で３回洗浄し、それぞれ基質緩衝液（０，
１ｍｏｔ　／　Ａクエン酸カリウムｐＨ５，０中、６　
ｍｍｏＡ　／　Ｌ　Ｈ糾およヒ４Ｑｍｍｏ４／Ａｏ−フ
ェニレンジアミン含有）０．５ｓｄＫ移し、免疫学的に
ビーズに結合したバーオキシダーぜ活性を測定するため
に１８〜２６℃で５０分間インキュベートする。バーオ
キシダーぜの活性を停止させ、発色を強めるためＫ　１
ｍ　ＭＯＬ　２．０−を混合し。

５０分以内に波長４９２　ｎｍの吸光度を比色橢定する
。第４表に０１１１五標準液に対する値を示す。

第　　　４　　　表 第４表から明らかなよ５に、　　りン酸塩Ｉｌ変の上昇
により感度は著明に増大する。

本例に用いたモノクローンマウス抗ＯＲム抗体はＪｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｔ　ｘｍｍｕｎｏｘｏｇｔｃａＩＭ＠ｔｈ
ｏｄｓ　、　５２（１９８０）２９７〜５０４に記載の
方法とほぼ同様にして得たが、融合のための出発セルラ
インとしては前述の骨髄腫ライン０２１０１−ムＧを用
いる。融合はｏｎムで免疫処置したマウスの膵細胞を用
いる。

免疫処置は上述の文献の第１表の方法に準じ、最初の２
つの免疫処置はそれぞれ５０μ９の０１！ｌムを用いて
行い、免疫処置６および４は省略する。免疫処置５はＯ
Ｉム５０ｐ＃を用いて行い、免疫処置６〜８はそれぞれ
ａＸム２００μｇを用いて実施する。　ａｍム抗原の別
異の工ｆトーゾに指向性を有する２種銭別異の、適当゛
なモノクローン抗体、すなわち抗ａｍムＣ０−５）およ
び抗０１Ａ　（０−１９）を用いる。

抗０１１！Ａ　（０−５）抗体ｔｙ）ｘｇＧ分画は２〜
８℃で、０．１ｍ０ｔ／ｊ重炭酸？）　ｌＪつＡＩＩｔ
（ｐＨ８，２〜８．５）Ｋ対ｔ、て−夜透析し、タンパ
ク質ｌｆ度１＊／−に調整する。このタンパク質溶液１
ｍｔｌｊして１２０μの開会で、全く新たに調製された
ビオチンコハク酸イミｒエステル溶液（１ａｐ／ｇｄジ
メチルスルホキシド）を加え、この混合物を４時間室温
でインキュベートする。次にビオチン−抗体抱合体をリ
ン酸緩衝生理食塩水溶１！　（０，６ｆｌＩＩＩｙｔＭ
ｅｒｆ＠ｎ含有）に対して、２〜８℃で透析する。

タンパク質安定剤として、ウシ血清アルブミン１０ダ／
−を加える。

バーオキシダーぜをアｄｙｙＫ結合させるためには、ア
ビジン５ダをｒ３．１ｍｏｔ７を重炭酸ナトリウム（ｐ
ｉ（９，５）Ｋ溶解し、同じ溶液に対して２〜８℃で一
夜透析する。ワサビから得たパーオキシダーゼ１０Ｗ９
を蒸留水５．０ｙｄＫ溶かし、室１１に１時間放置し、
ついで新たに調製した０、　１　ｍｏｔ　／　を過ヨウ
素酸ナトリウム水溶液を加え、室温で正確に２０分間イ
ンキュベートする。限外−過によって過剰の過ヨウ素酸
ナトリウムをパーオキシダーゼから除き、最初の濃度に
議縮する。限外−過後。

パーオキシダーゼ溶液をアビジン５ダと混合し。

混合物を室温で２時間インキュベートする。シッフの塩
基を還元し、同時に共有結合を安定化するため、新たに
調製した［１，１ｍｏｔ／Ａ水索化ホウ素ナトリウム溶
液０．５　ｓｄをアＣジンーパーオキシダーゼ溶液に加
え、この混合物を２〜８℃で少なくとも２時間インキュ
ベートする。アビジンーパーオキシメーゼ抱合体を次に
りン酸緩衝生理食塩水溶液（０，６６Ｉｆ／　Ｌ　Ｍ＠
ｒｆ＠ｎ含有）に対して透析し、ウシ崩清アルデンン１
０ダ／−で安定化する。

複合体の形成には、抗Ｏｘム（０−５）抗体−Ｃオチン
抱合体５５μｔをアＣジンーパーオキシダーゼ抱合体４
８μｔと混合し、混合物を室温で１５分間インキュベー
トする。

本発ＷＲＫ使用する場合、複合体は０，２０１１０４／
Ｌまたは０．Ｂ　ｇ　ｍｏｔ７ｔリン酸ナトリウム緩衝
液Ｐ）１６．５．２１／ｌウシ血清アルデイン、２０憾
ヤイ皇清、０，１ｊ／Ｌ４−アイノアンチビリン含有溶
液て希釈する。

代理人　浅　村　　　皓 手続補正書（自発） 昭和５７年（０月７日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和５７年特許願第　１４４５８５　　号２、発明の名
称 癌胚抗原の固相サンドウィッチ法による定量方法３、補
正をする者 事件との関係　特許出願人 住　　所 ４、代理人 昭和　　　　年　　　　月　　　　日 ６、補正により増加する発明の数 ８、補正の内容　　別紙のとおり 明細書の浄書　（内２容に変更なし） ＝３３１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）試験すべきサンプルを、水不溶性担体に結合して
   いるかまたは結合する第一の癌胚抗原（ｃＲＡ）抗体お
   よびパーオキシダーゼが直接またはビオチン／アビジン
   橋を介して結合している第二〇〇Ｎｋ抗体とインキエペ
   ートシ、固相と液相を分離し。 ついで固相を九は液相いずれかのパーオキシダーゼ活性
   を存在するＣＲＡ量として測定する癌胚抗原（ｃｍ）の
   固相サンｒウィッチ法による迅速定量方法であって、イ
   ンキュベーションをリン酸イオ：１０．４〜１．０　ｍ
   ｏｔ／１．硫酸イオン０．２〜０．４ｍａＪ／　ｌ　ｔ
   たは酒石酸塩イオン０．２〜Ｑ、４　ｍｏｌ／ｊの存在
   下に行うことを特徴とする癌胚抗原の定量方法 （２）サンプルをまず、水不溶性担体に結合してｉるか
   または結合する第一のＣＲＡ抗体とインキュベートシ、
   ついで洗浄工程ののちにバーオキシダーぜが直接または
   ビオチン／アビジン橋を介して結合している第二のａｍ
   ム抗体とインキュベートする方法において、第二のイン
   キュベーションをリン酸塩イオン０．４〜１．Ｑ　ｍｏ
   Ａ　／　Ｌ、硫酸イオン０．２〜Ｑ、４　ｍｏＡ　／　
   ｔまたは酒石酸イオン０．２〜０．４１１１０Ｌ／Ｌの
   存在下に行５４１許請求の範囲第１項記載の癌胚抗原の
   定量方法 （３）　　一方の抗体にパーオキシダーゼは直接結合し
   ている特許請求の範囲第１項または第２項のいずれかに
   記載の癌胚抗原の定量方法 （４）２種のｏｎム抗体は別の動物種の抗血清から得ら
   れたものであり、その一方の抗体にパーオキシダーゼは
   直接結合している特許請求の範囲第３項記載の癌胚抗原
   の定量方法 （！５）ヤイ詔よびモルモットからの６ｉ抗体を使用し
   、ヤザ抗体にパーオキシダーゼは直談結合している特許
   請求の範囲第４項記載の癌胚抗原の定量方法 （６）２種の異なるモノクローンマウスａｍム抗体ヲ使
   用し、一方のモノクローンマウスＯＥム抗体にパーオキ
   シダーゼがビオチン／アビジン橋を介して結合している
   特許請求の範囲第１項または第２）Ｊのいずれかに記載
   の癌胚抗原の定量方法（７）ある動物の抗血清から得ら
   れる０１！ｉム抗体ならびにモノクローンマウスＯＸム
   抗体を用い、抗血清から得られる抗体にパーオキシダー
   ゼは直接結合している特許請求の範囲第３項に記載の癌
   胚抗原の定量方法 （ｇ）　　０ＦＩＡ抗体としてヤＪｉ＃　ＯＩＡ抗体詔
   よびモノクローンマウス０１１１ム抗体を用い、ヤイｃ
   ｌム抗体にパーオキシダーゼは直接結合している特許請
   求の範囲第７項記載の癌胚抗厘の定量方法 （９）　　りン酸イオン肌４〜１．０ｍ０１／ｌ、硫酸
   イオン０．２〜０＊４　ｍｏｚ　／　ｔまたは酒石酸イ
   ｔ￥０．２〜０．４　ｍｏｔ／　Ｌを含有するｐＨ４〜
   ９の水溶液中で、パーオキシダーゼが直接またはビオチ
   ン／アビジン橋を介して結合している一ム抗体 ａ１　　パーオキシダーゼは直接抗体に結合している特
   許請求の範囲第９項記載の０ＩＩｉム抗体