JPH04221762A - 免疫学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、流体試料中の微量成分
、特に生物学的流体試料中の特定微量成分を測定する方
法に関するものである。

【０００２】

【発明の背景】生物学的流体試料中に極微量含有される
物質を検出する方法として、各種の分析法が開発されて
来ている。この分析法の一つとして、免疫反応をその原
理とするものがある。そして、この原理を用いた測定法
として種々のものが開発され、精度の高いものとして知
られている。

【０００３】すなわち、１９５８年にベルソン（Ｂｅｒ
ｓｏｎ）とイアロウ（Ｙａｌｌｏｗ）が、放射性同位元
素Ｉで標識した牛インシュリンと糖尿病患者血清中の抗
インシュリン抗体を用いて、血清中のインシュリンを測
定することに成功して以来、ラジオアイソトープを用い
た免疫測定法が広く用いられて来た。そして、これ以後
、標識物質として放射性同位元素以外のものも種々開発
されて来た。例えば、酵素、酵素基質、補酵素、酵素阻
害物質、バクテリオファージ、循環反応体、金属及び有
機金属の錯体、有機補欠分子族、化学発光性反応体及び
螢光性分子等が挙げられる。

【０００４】ところで、免疫学的測定法において、検体
（例えば人血清）中に固定化抗体及び標識抗体の双方と
反応する物質（以下、非特異反応物質と称する）が存在
する場合、抗原陰性の検体でもあたかも陽性のような結
果を示すことになる。これは、特に、固定化抗体と標識
抗体に用いられる抗体の由来が同じ動物種である場合に
顕著である。

【０００５】従って、正確なデータを得る為には前記の
ような非特異反応物質による非特異反応を抑制すること
が必要であり、このような非特異的反応を抑制する為、
従来では、例えば免疫反応に用いる抗体が共にマウス由
来のものである場合、マウス血清や測定系に影響を与え
ないマウスモノクローナル抗体を添加していたが、得ら
れる効果は不充分であった。

【０００６】

【発明の開示】本発明の目的は、非特異反応物質による
影響を排除する技術を提供することである。この本発明
の目的は、使用する抗体に対する一価の抗体フラグメン
トで処理することを特徴とする免疫学的測定法によって
達成される。

【０００７】又、免疫反応時に一価の抗体フラグメント
を共存させることを特徴する免疫学的測定法によって達
成される。例えば、抗体を微粒子の担体に化学的及び／
又は物理的に結合させ、不溶化微粒子抗体を得、これと
例えば酵素で標識された抗体及び試料とを接触、免疫反
応させるに際して、この溶液中に非特異反応物質が結合
する部分と同じ部分を認識する一価の抗体フラグメント
ＦａｂやＦａｂ’を共存させたり、又は、あらかじめ固
定化抗体を一価の抗体フラグメントＦａｂやＦａｂ’で
処理したり、標識抗体を一価の抗体フラグメントトＦａ
ｂやＦａｂ’で処理しておくことによって、非特異反応
物質による影響が排除され、正確なデータが得られるよ
うになったのである。

【０００８】本発明において、試料としてはあらゆる形
態の溶液、コロイド溶液などが使用しうるが、好ましく
は生物由来の流体試料、例えば血液、血漿、血清、脳脊
髄液、唾液、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられる。 本発明により測定しうる流体試料中の特定成分は、その
特定成分に特異的に結合する物質が存在しうる物質（物
質群）である。すなわち、ポリペプチド、蛋白質、複合
蛋白質、多糖類、脂質、複合脂質、核酸、ホルモン類、
ビタミン類、薬剤、抗生物質、農薬等が挙げられる。具
体的には、特開昭６２−９０５３９号公報や特開昭６３
−１３１０６２号公報に記載の物質（物質群）を挙げる
ことができるが、これらに限定されるものではない。

【０００９】本発明に用いられる抗体の標識物質として
は、通常の免疫測定法で一般に使用できるものを用いる
ことができ、例えば、放射性物質、発光物質、螢光物質
、酵素などが挙げられ、又、酵素基質、酵素及び酵素前
駆体の活性を変化させる物質（酵素阻害物質、補欠分子
族、補酵素）、酵素前駆体、アポ酵素、螢光物質なども
使用できる。

【００１０】具体的な物質としては、特開昭６２−９０
５３９号公報などに記載のものが挙げられるが、好まし
くは酵素または螢光物質である。これらの酵素を標識物
質とする場合、酵素反応系、発色系は公知のものを使用
できる。具体的には、特開昭６１−２９２０６０号公報
、特開昭６２−９０５３９号公報、特開昭６３−１３１
０６２号公報、特開昭６３−４５５６２号公報、特願昭
６３−２１９８９３号明細書に記載の物質（物質群）が
挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【００１１】そして、これら標識物質の抗体への結合は
、当業者間で知られている公知の試薬と方法で行うこと
ができ、例えば石川　　栄治、河合　　忠、宮井　　潔
編「酵素免疫測定法（第２版）、医学書院、１９７８年
」や日本臨床病理学会編「臨床病理」臨時増刊特集第５
３号「臨床検査の為のイムノアッセイ−技術と応用−、
臨床病理刊行会、１９８３年」などに記載された方法を
参考にすることができる。

【００１２】本発明で使用される抗体は、その由来を特
に限定されるものではなく、マウスなどの哺乳動物等に
抗原を投与、免疫して得られる抗血清、腹水液をそのま
まか、あるいは従来公知の方法である硫酸ナトリウム沈
澱法、硫酸アンモニウム沈澱法、セファデックスゲルに
よるゲル濾過法、イオン交換セルロースクロマトグラフ
ィ法、電気泳動法等（右田俊介偏「免疫化学」中山書店
ｐｐ７４ないし８８参照）で精製して用いることができ
る。

【００１３】あるいは、抗原で感染した哺乳動物など（
例えばマウス）の脾臓細胞や骨髄腫細胞（ミエローマ）
から雑種細胞（ハイブリドーマ）を得てモノクローナル
抗体を作成し、これを特定成分と特異的に結合しうる物
質として使用すると特異性が向上し、好ましい。本発明
の免疫測定法による反応型式としては、競合法、２抗体
法、サンドイッチ法などが挙げられるが、サンドイッチ
法であることが好ましい。

【００１４】本発明で使用する抗原は特異抗体と反応す
るものであり、ハプテン及びその誘導体を含有する。抗
体を結合させる不溶化担体の材料としては、アガロース
、セルロース、架橋デキストラン、ポリアクリルアミド
、セルロース、微結晶セルロース、架橋アガロース、架
橋ポリアクリルアミド、ガラス、シリカゲル、ケイ藻土
、二酸化チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、ケ
イ砂、ポリスチレン等の各種の合成樹脂のほか、多孔質
層の素材、さらには磁性微粒子が利用できる。

【００１５】好ましくはアガロース、架橋アガロース、
架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、架橋ポリアク
リルアミド、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、セル
ロース、微結晶セルロース等であり、更に好ましくはポ
リアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ポリスチ
レン、微結晶セルロース等である。これらの不溶化担体
は数種を混合して用いても良い。

【００１６】抗体は、これら不溶化担体に、当業者で公
知の方法で化学的及び／又は物理的に直接、あるいは間
接的に結合させることができる。結合法については１９
７６年、講談社発行、千畑一郎ほか２名編「実験と応用
アフィニティクロマトグラフィー」（第１刷）、１９７
５年、講談社発行、山崎誠ほか２名編「アフィニティク
ロマトグラフィー」（第１版）を参考にできる。

【００１７】非特異反応を抑制する為に、非特異反応物
質が結合する部分と同じ部分を認識する一価の抗体フラ
グメントＦａｂやＦａｂ’で標識抗体や不溶化担体に結
合した抗体が処理される訳であるが、この処理は次のよ
うに行われることが好ましい。すなわち、所望のｐＨ値
を有する緩衝液中で標識抗体もしくは不溶化抗体と上記
一価の抗体フラグメントとを接触させる。その際のｐＨ
やバッファー種は、一般に、抗原抗体反応が行えるもの
であれば、特には限定されないが、例えばｐＨの好まし
い範囲は４．０ないし１０．０、より好ましい範囲は６
．０ないし９．０であり、そしてバッファー種としては
リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリ
シン緩衝液などが挙げられ、それらの緩衝液に測定すべ
き特異反応に関与しない蛋白質を添加することもできる
。例えば、アルブミン、スキムミルク、乳酸醗酵物、コ
ラーゲン及びそれらの分解物質などが挙げられる。 又、例えば無機塩、界面活性剤、アジ化ソーダといった
安定剤などの添加物が共存させられていても良い。

【００１８】又、非特異反応を抑制する為に、非特異反
応物質が結合する部分と同じ部分を認識する一価の抗体
フラグメントＦａｂやＦａｂ’が免疫反応溶液中に添加
される訳であるが、この添加は次のような条件で行われ
ることが好ましい。すなわち、所望のｐＨ値を有する緩
衝液中で標識抗体もしくは不溶化抗体と上記一価の抗体
フラグメントとを接触させる。その際のｐＨやバッファ
ー種は、一般に、抗原抗体反応が行えるものであれば、
特には限定されないが、例えばｐＨの好ましい範囲は４
．０ないし１０．０、より好ましい範囲は６．０ないし
９．０であり、そしてバッファー種としてはリン酸緩衝
液、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液
などが挙げられ、それらの緩衝液に測定すべき特異反応
に関与しない蛋白質を添加することもできる。例えば、
アルブミン、スキムミルク、乳酸醗酵物、コラーゲン及
びそれらの分解物質などが挙げられる。又、例えば無機
塩、界面活性剤、アジ化ソーダといった安定剤などの添
加物が共存させられていても良い。

【００１９】尚、標識抗体や不溶化担体に結合した抗体
として一価の抗体フラグメントＦａｂやＦａｂ’で処理
されたものを用いると共に、免疫反応溶液中にこの一価
の抗体フラグメントＦａｂやＦａｂ’を添加するといっ
た両方の手段を併用すれば、一層非特異吸着の抑制効果
が上がる。標識物質に起因した信号は、吸光度法（比色
法）　、螢光法、発光法または放射活性測定法で検出す
ることができ、測定法としては信号の経時的変化を測定
するレート測定法または一定時間後の信号を測定するエ
ンドポイント測定法で測定することができる。

【００２０】

【実施例】以下、本発明を実施例によって更に具体的に
説明するが、本発明はこれら実施例によって限定される
ものではない。 〔実施例１〕市販の２種の癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のマ
ウス由来モノクローナル抗体（フナコシ）のうち、一方
を、常法によって直径６．２５ｍｍのポリスチレンビー
ズ（積水化学工業社の＃８０）に固定化して固定化抗体
を得、他方を、ペルオキシダーゼで標識して標識抗体を
得た。

【００２１】抗マウス抗体のＦａｂフラグメントが０．
１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように加えた１％牛血清アル
ブミン（ＢＳＡ）及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
に、前記固定化抗体ビーズを加え、３７℃で１時間反応
させた。この抗マウス抗体のＦａｂフラグメントで処理
された固定化抗体ビーズを、検体（人血清）が５０μｌ
とＰＢＳが２００μｌ混合された液中に入れ、３７℃で
２時間反応させた。

【００２２】この後、蒸留水２ｍｌで３回洗浄し、そし
て前記標識抗体液２５０μｌを加え、３７℃で１時間反
応させた。蒸留水２ｍｌで３回洗浄後、３ｍｇ／ｍｌの
オルトフェニレンジアミンを溶解したクエン酸−りん酸
緩衝液（ｐＨ５．０、０．０１％の過酸化水素含有）を
３００μｌ添加し、室温において３０分間発色させた。

【００２３】この後、１Ｎの硫酸１ｍｌで発色反応を停
止し、４９２ｎｍの吸光度を測定した。比較の為、抗マ
ウスモノクローナル抗体の一価のフラグメントＦａｂに
よる処理を行わなかった測定系でも調べた。検体は正常
人血清で、異常高値を示した３例（検体１，２，３）と
癌患者血清２例（検体４，５）を使用した。

【００２４】この測定結果によれば、検体１の場合にあ
っては、本発明のものでは吸光度が０．０８８であるの
に対して、比較例のものでは吸光度が０．３８９、検体
２の場合にあっては、本発明のものでは吸光度が０．０
９２であるのに対して、比較例のものでは吸光度が０．
４７２、検体３の場合にあっては、本発明のものでは吸
光度が０．１０８であるのに対して、比較例のものでは
吸光度が０．３１８、癌患者である検体４の場合にあっ
ては、本発明のものでは吸光度が０．３４２で、比較例
のものでは吸光度が０．３２１、癌患者である検体５の
場合にあっては、本発明のものでは吸光度が０．６８８
で、比較例のものでは吸光度が０．６９９であり、本発
明になるものは正常人の場合における擬陽性率が低く、
正確な診断が行えることが判る。

【００２５】すなわち、正常人の検体１，２，３につい
ては、抗マウスモノクローナル抗体Ｆａｂによる固定化
抗体の処理により、非特異反応が抑制されたものと考え
られる。 〔実施例２〕実施例１のＣＥＡの測定系において、抗マ
ウス免疫グロブリン抗体Ｆａｂを検体とリン酸緩衝液の
混合液に０．１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように加えて行
った。尚、固定化抗体ビーズはＦａｂフラグメントで処
理していないものである。

【００２６】比較の為、一価のフラグメントＦａｂを添
加していない測定系でも調べた。検体は正常人血清で、
異常高値を示した３例（検体１，２，３）と癌患者血清
２例（検体４，５）を使用した。この測定結果によれば
、検体１の場合にあっては、本発明のものでは吸光度が
０．０７９であるのに対して、比較例のものでは吸光度
が０．３８９、検体２の場合にあっては、本発明のもの
では吸光度が０．０８８であるのに対して、比較例のも
のでは吸光度が０．４７２、検体３の場合にあっては、
本発明のものでは吸光度が０．１２５であるのに対して
、比較例のものでは吸光度が０．３１８、癌患者である
検体４の場合にあっては、本発明のものでは吸光度が０
．３０８で、比較例のものでは吸光度が０．３２１、癌
患者である検体５の場合にあっては、本発明のものでは
吸光度が０．６８５で、比較例のものでは吸光度が０．
６９９であり、本発明になるものは正常人の場合におけ
る擬陽性率が低く、正確な診断が行えることが判る。

【００２７】すなわち、正常人の検体１，２，３につい
ては、抗マウスグロブリン抗体Ｆａｂの添加により、非
特異反応が抑制されたものと考えられる。 〔実施例３〕実施例１のＣＥＡの測定系において、抗マ
ウス免疫グロブリン抗体Ｆａｂを標識抗体液１ないし０
．１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように加えた。尚、固定化
抗体ビーズはＦａｂフラグメントで処理していないもの
である。

【００２８】比較の為、一価のフラグメントＦａｂを添
加していない測定系でも調べた。検体は正常人血清で、
異常高値を示した３例（検体１，２，３）と癌患者血清
２例（検体４，５）を使用した。この測定結果によれば
、検体１の場合にあっては、本発明のものでは吸光度が
０．０８３であるのに対して、比較例のものでは吸光度
が０．３８９、検体２の場合にあっては、本発明のもの
では吸光度が０．０９８であるのに対して、比較例のも
のでは吸光度が０．４７２、検体３の場合にあっては、
本発明のものでは吸光度が０．１１９であるのに対して
、比較例のものでは吸光度が０．３１８、癌患者である
検体４の場合にあっては、本発明のものでは吸光度が０
．３５５で、比較例のものでは吸光度が０．３２１、癌
患者である検体５の場合にあっては、本発明のものでは
吸光度が０．６９７で、比較例のものでは吸光度が０．
６９９であり、本発明になるものは正常人の場合におけ
る擬陽性率が低く、正確な診断が行えることが判る。

【００２９】すなわち、正常人の検体１，２，３につい
ては、抗マウスグロブリン抗体Ｆａｂの添加により、非
特異反応が抑制されたものと考えられる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　使用する抗体に対する一価の抗体フラ
   グメントで処理することを特徴とする免疫学的測定法。
2. 【請求項２】　　固定化抗体を一価の抗体フラグメント
   で処理することを特徴とする請求項１の免疫学的測定法
   。
3. 【請求項３】　　標識抗体を一価の抗体フラグメントで
   処理することを特徴とする請求項１の免疫学的測定法。
4. 【請求項４】　　免疫反応時に一価の抗体フラグメント
   を共存させることを特徴する免疫学的測定法。