JPH0526877A - IgM抗体固定化担体 - Google Patents

IgM抗体固定化担体

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JPH0526877A
JPH0526877A JP18003391A JP18003391A JPH0526877A JP H0526877 A JPH0526877 A JP H0526877A JP 18003391 A JP18003391 A JP 18003391A JP 18003391 A JP18003391 A JP 18003391A JP H0526877 A JPH0526877 A JP H0526877A
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JP
Japan
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antibody
carrier
immobilized
immobilizing
igm antibody
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JP18003391A
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Takashi Sakaguchi
孝 阪口
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Konica Minolta Inc
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Konica Minolta Inc
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 IgM抗体が用いられた場合における測定感
度が高い技術を提供することである。 【構成】 不溶性担体に抗IgM抗体を介してIgM抗
体が固定化されてなるIgM抗体固定化担体。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、免疫測定に用いられる
IgM抗体固定化担体に関するものである。
【0002】
【発明の背景】生物学的流体試料中に極微量含有される
物質を検出する方法として、各種の分析法が開発されて
来ている。この分析法の一つとして、免疫反応をその原
理とするものがある。そして、この原理を用いた測定法
として種々のものが開発され、精度の高いものとして知
られている。すなわち、BersonとYallowが
放射性同位元素Iで標識したウシインシュリンと糖尿病
患者血清中の抗インシュリン抗体を用いて血清中のイン
シュリンを測定することに成功して以来、ラジオアイソ
トープを用いた免疫測定法が広く用いられて来た。そし
て、これ以後、標識物質として放射性同位元素以外のも
のも種々開発されて来た。例えば、酵素、酵素基質、補
酵素、酵素阻害物質、バクテリオファージ、循環反応
体、金属及び有機金属の錯体、有機補欠分子族、化学発
光性反応体及び螢光性分子等が挙げられる。
【0003】ところで、免疫測定に際しては抗体固定化
担体が用いられている訳であるが、この抗体固定化担体
の構造によって免疫測定は大きく左右されている。特
に、抗体として5量体であるIgM抗体が用いられた場
合には、測定感度の問題が指摘されている。
【0004】
【発明の開示】本発明の目的は、IgM抗体が用いられ
た場合における測定感度が高い技術を提供することであ
る。この本発明の目的は、不溶性担体に抗IgM抗体を
介してIgM抗体が固定化されてなることを特徴とする
抗体固定化担体によって達成される。
【0005】尚、例えばグルタルアルデヒド等の架橋剤
を用いて架橋させておくこともできる。免疫測定におい
ては、試料としてあらゆる形態の溶液、コロイド溶液な
どが使用しうるが、好ましくは生物由来の流体試料、例
えば血液、血漿、血清、脳脊髄液、唾液、羊水、乳、
尿、汗、肉汁等が挙げられる。
【0006】免疫測定において用いられる抗体の標識物
質としては通常の免疫測定法で一般に使用できるものが
使用でき、例えば放射性物質、発光物質、蛍光物質など
がその例として挙げられ、又、酵素、酵素基質、酵素及
び酵素前駆体の活性を変化させる物質(酵素阻害物質、
補欠分子族、補酵素)、酵素前駆体、アポ酵素なども使
用できる。具体的な物質としては、特開昭62−905
39号公報などに記載のものが挙げられるが、好ましく
は酵素、又は螢光物質であり、さらに好ましくはβ−D
−ガラクトシダーゼ、アルカリホスフォダーゼ、ペルオ
キシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタメートデ
ヒドロゲナーゼ、アミラーゼなどの酵素である。これら
の酵素を標識物質とする場合、酵素反応系、発色系は公
知のものを使用できる。具体的には、特開昭61−29
2060号公報、特開昭62−90539号公報、特開
昭63−131062号公報、特開昭63−45562
号公報、特願昭63−219893号明細書に記載の物
質(物質群)が挙げられるが、これらに限定されるもの
ではない。そして、これら標識物質の抗体への結合は、
当業者間で知られている公知の試薬と方法で行うことが
でき、例えば石川栄治、河合 忠、宮井潔 編「酵素免
疫測定法(第3版)、医学書院、1987年」や日本臨
床病理学会編「臨床病理」臨時増刊特集第53号「臨床
検査の為のイムノアッセイ−技術と応用−、臨床病理刊
行会、1983年」などに記載された方法を参考にする
ことができる。
【0007】本発明で使用されるIgM抗体は、その由
来を特に限定されるものではなく、哺乳動物等に抗原を
投与、免疫して得られる抗血清、腹水液をそのままか、
あるいは従来公知の方法である硫酸ナトリウム沈澱法、
硫酸アンモニウム沈澱法、セファデックスゲルによるゲ
ル濾過法、イオン交換セルロースクロマトグラフィ法、
電気泳動法等(右田俊介偏「免疫化学」中山書店pp7
4〜88参照)で精製して用いることができる。あるい
は、抗原で感染した哺乳動物など(例えばマウス)の脾
臓細胞や骨髄腫細胞(ミエローマ)から雑種細胞(ハイ
ブリドーマ)を得てモノクローナル抗体を作成し、これ
を使用すると特異性が向上し、好ましい。
【0008】IgM抗体が間接的に結合される不溶性の
担体は通常用いることが出来るものであれば制限はない
が、多孔質なものであることが好ましく、このような担
体の材料としてはケイ藻土、二酸化チタン、硫酸バリウ
ム、酸化亜鉛、酸化鉛、微結晶セルロース、ケイ砂、ガ
ラス、シリカゲル、架橋デキストリン、架橋ポリアクリ
ルアミド、アガロース、架橋アガロース、ポリスチレン
等の各種の合成樹脂が挙げられる。そして、このような
素材の担体であれば、IgM抗体が固定化される一次的
な形状は粒子(ビーズ)状、棒状あるいはプレート状の
ものであっても差し支えないが、粒子(ビーズ)状のも
のが好ましい。
【0009】本発明においては、IgM抗体は抗IgM
抗体を介して不溶性の担体に間接的に結合される訳であ
るが、この抗IgM抗体の担体への固定は化学的及び/
又は物理的に直接、あるいは間接的に結合させれば良
い。その他の点に関する結合技術については、1976
年、講談社発行、千畑一郎ほか2名編「実験と応用 ア
フィニティクロマトグラフィー」(第1刷)、1975
年、講談社発行、山崎誠ほか2名編「アフィニティクロ
マトグラフィー」(第1版)を参考にできる。
【0010】そして、このようにして得られた抗IgM
抗体固定化担体をIgM抗体溶液中に浸漬することによ
り、IgM抗体と抗IgM抗体固定化担体の抗IgM抗
体とが反応して結合し、IgM抗体が抗IgM抗体を介
して担体に固定化され、本発明になるIgM抗体固定化
担体が得られる。尚、結合反応後、標識抗体(又は抗
原)の非特異反応を排除する目的で、測定すべき特異的
反応に関与しない蛋白質を担持させることができる。そ
れらの代表的な例としては、哺乳動物及び鳥類の正常血
清蛋白質、アルブミン、スキムミルク、乳酸醗酵物、コ
ラーゲン及びそれらの分解物質等が挙げられる。
【0011】本発明のIgM抗体固定化担体が用いられ
る免疫測定の感度が高い理由としては、IgM抗体を担
体に直接固定化すると、5量体であるIgM抗体の抗原
認識部位が構造的に隠され、この為活性度が低下するの
に対して、抗IgM抗体を介して間接的に固定化する
と、5量体であるIgM抗体の抗原認識部位は隠され
ず、従って活性度の低下はなく、感度が高いものと考え
られる。
【0012】免疫測定方法による反応型式としては、競
合法、2抗体法、サンドイッチ法などが挙げられるが、
特に限定はされない。標識酵素に起因した信号は、吸光
度法(比色法) 、螢光法、発光法または放射活性測定法
で検出することができ、測定法としては信号の経時的変
化を測定するレート測定法または一定時間後の信号を測
定するエンドポイント測定法で測定することができる。
好ましくは吸光度法であり、吸光度法(比色法) では紫
外線、可視光、近赤外光を利用することができる。
【0013】
【実施例】以下、本発明を実施例によって更に具体的に
説明するが、本発明は実施例によって限定されるもので
はない。 〔抗IgM抗体を介して間接的に固定化されたIgM抗
体固定化担体〕市販の抗マウスIgM抗体(ヤギ)(カ
ルタグ社製)を0.1M炭酸塩緩衝液(pH9.5)に
20μg/mlになるように溶解し、この中にポリスチ
レンビーズ(積水化学社製#80)を浸漬して4℃で一
晩かけて固定化した。
【0014】そして、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)
で洗浄した後、1%BSA−PBS溶液に37℃で24
時間浸漬した。続いて、癌関連ヒトガラクトシルトラン
スフェラーゼ(GAT)に対するマウスモノクローナル
抗体(IgM)をPBSに10μg/mlになるように
溶解した溶液中に上記抗マウスIgM抗体固定化ポリス
チレンビーズを加えて、37℃で2時間反応させ、本発
明になるIgM抗体−抗マウスIgM抗体−ポリスチレ
ンビーズを得た。
【0015】〔IgM抗体が直接固定化されたIgM抗
体固定化担体〕癌関連ヒトガラクトシルトランスフェラ
ーゼ(GAT)に対するマウスモノクローナル抗体(I
gM)を1Mの塩化ナトリウムを溶解した0.1M炭酸
塩緩衝液(pH9.5)に10μg/mlになるように
溶解し、この中にポリスチレンビーズ(積水化学社製#
80)を浸漬して4℃で一晩かけて固定化した。
【0016】そして、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)
で洗浄した後、1%BSA−PBS溶液に37℃で24
時間浸漬し、比較例になるIgM抗体−ポリスチレンビ
ーズを得た。 〔GAT標準液の調整〕濃度が300U/mlであるヒ
ト癌患者腹水を馬血清で1/30,1/10に希釈し、
各々10U/ml,30U/mlとした。又、馬血清を
0U/mlとし、GAT標準液を調整した。
【0017】〔免疫測定〕上記各例で作製したIgM抗
体固定化ビーズをGAT標準液(0,10,30U/m
l)50μlと1Mの塩化ナトリウムを溶解した50m
Mリン酸緩衝液(pH6.5)200μlとを混合した
液の中に入れ、37℃で2時間インキュベーションし
た。
【0018】PBSで洗浄後、固定化抗体とは違う部位
を認識する抗GATマウスモノクローナル抗体(Ig
G)を酵素免疫測定法(第3版)第108ページ(石川
栄治、河合 忠、宮井潔 編 医学書院 1987
年)の方法でペルオキシダーゼを標識したペルオキシダ
ーゼ標識抗GATモノクローナル抗体の1%BSA−P
BS溶液(0.5μg/ml)を250μl加え、室温
で1時間インキュベーションした。
【0019】PBSで洗浄後0.02%H2 2 を含有
するo−フェニレンジアミン溶液(3mg/ml)0.
3mlを加え、室温で30分間発色させた。この後、1
Nの硫酸1mlで発色反応を停止し、492nmの吸光
度を測定したので、その結果を表1に示す。 表 1(吸光度) GAT標準液 0U/ml 10U/ml 30U/ml 本発明のIgM抗体固定化ビーズ 0.021 0.423 1.239 比較例のIgM抗体固定化ビーズ 0.012 0.194 0.560 すなわち、抗IgM抗体を介してIgM抗体が固定化さ
れてなるIgM抗体固定化担体が用いられる免疫測定
は、直接IgM抗体が固定化されてなるIgM抗体固定
化担体が用いられる免疫測定に比べて、大幅な感度向上
が認められる。
【0020】
【効果】本発明によれば、感度が高く、正確な免疫測定
が行われる。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 【請求項1】 不溶性担体に抗IgM抗体を介してIg
    M抗体が固定化されてなることを特徴とするIgM抗体
    固定化担体。
JP18003391A 1991-07-20 1991-07-20 IgM抗体固定化担体 Pending JPH0526877A (ja)

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