JPH04235350A - 免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、流体試料中の微量成分
、特に生物学的流体試料中の特定微量成分を測定する方
法に関するものである。

【０００２】

【発明の背景】生物学的流体試料中に極微量含有される
物質を検出する方法として、各種の分析法が開発されて
来ている。この分析法の一つとして、免疫反応をその原
理とするものがある。そして、この原理を用いた測定法
として種々のものが開発され、精度の高いものとして知
られている。

【０００３】免疫測定法は、均一免疫測定法と非均一免
疫測定法に大別される。すなわち、抗原抗体反応生成物
（Ｂｏｕｎｄ体）と非反応物（Ｆｒｅｅ体）の分離（Ｂ
／Ｆ分離）が必要な非均一免疫測定法と、Ｂ／Ｆ分離の
必要のない均一免疫測定法とに大別される。このうち、
測定対象物質が高分子である場合には、Ｂ／Ｆ分離が必
要な非均一免疫測定法が利用されている。

【０００４】ところで、この非均一免疫測定法の問題点
として、測定に長時間を要するといった問題などがあり
、これらの問題点に対して各種の技術が提案されている
が、未だに充分なものではない。すなわち、免疫反応時
間を短くして測定時間の短縮化を図ろうとし、免疫反応
時の酵素標識抗体量を増やすと、非特異吸着によるノイ
ズが大きくなり、測定感度（Ｓ／Ｎ）が低下する。

【０００５】又、Ｂ／Ｆ分離時に洗浄操作を入れない方
法（特願平２−２０７０号明細書、特願平２−３１８３
号明細書など）では、使用する酵素標識抗体の量が限定
され、使用する酵素標識抗体の濃度を変えて反応速度を
高めることは容易でなかった。

【０００６】

【発明の開示】本発明の目的は、流体試料中の特定成分
を短時間で、感度、精度及び再現性良く定量できる技術
を提供することである。この本発明の目的は、非均一系
免疫測定法を用いて試料中の特定成分を分析する方法で
あって、試料中の特定成分と特異的に反応する物質が結
合された不溶化担体、試料、及び試料中の特定成分と特
異的に反応する物質に標識物質が結合された標識体（但
し、この標識体における標識物質と試料中の特定成分と
特異的に反応する物質との結合モル比は１対４以上であ
る）を接触、免疫反応させることを特徴とする免疫測定
方法によって達成される。

【０００７】尚、標識体における標識物質と試料中の特
定成分と特異的に反応する物質との結合モル比は１対４
以上であるが、好ましくは１対６以上で、１対１５以下
である。本発明において、試料としてはあらゆる形態の
溶液、コロイド溶液などが使用しうるが、好ましくは生
物由来の流体試料、例えば血液、血漿、血清、脳脊髄液
、唾液、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられる。

【０００８】本発明により測定しうる流体試料中での特
定成分とは、その特定成分に特異的に結合する物質が存
在しうる物質（物質群）である。すなわち、ポリペプチ
ド、蛋白質、複合蛋白質、多糖類、脂質、複合脂質、核
酸、ホルモン類、ビタミン類、薬剤、抗生物質、農薬等
が挙げられる。具体的には、特開昭６２−９０５３９号
公報や特開昭６３−１３１０６２号公報に記載の物質（
物質群）を挙げることができるが、これらに限定される
ものではない。

【０００９】本発明に用いられる標識体における標識物
質としては、例えば、酵素、酵素基質、酵素及び酵素前
駆体の活性を変化させる物質（酵素阻害物質、補欠分子
族、補酵素）、酵素前駆体、アポ酵素、螢光物質などが
挙げられる。具体的な物質としては、特開昭６２−９０
５３９号公報などに記載のものが挙げられるが、好まし
くは酵素、又は螢光物質であり、さらに好ましくはβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスフォダーゼ、ペル
オキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタメート
デヒドロゲナーゼ、アミラーゼなどの酵素である。

【００１０】こらの酵素を標識物質とする場合、酵素反
応系、発色系は公知のものを使用できる。具体的には、
特開昭６１−２９２０６０号公報、特開昭６２−９０５
３９号公報、特開昭６３−１３１０６２号公報、特開昭
６３−４５５６２号公報、特願昭６３−２１９８９３号
明細書に記載の物質（物質群）が挙げられるが、これら
に限定されるものではない。

【００１１】そして、これら標識物質の抗体への結合方
法は、石川　　栄治、河合忠、宮井潔　　編「酵素免疫
測定法（第２版）、医学書院、１９７８年」や日本臨床
病理学会編「臨床病理」臨時増刊特集第５３号「臨床検
査の為のイムノアッセイ−技術と応用−、臨床病理刊行
会、１９８３年」などに記載された方法を参考にするこ
とができる。

【００１２】標識物質と抗体との結合モル比が１対４以
上であるように結合させる方法としては、例えばビオチ
ン、アビジン等の特異結合を利用する方法が有り、ビオ
チン（又はアビジン）を結合させた標識物質とアビジン
（又はビオチン）を結合させた抗体とを１対４以上のモ
ル比で反応させることにより可能である。但し、本発明
は、これに限定されるものではない。

【００１３】又、本発明に適用される流体試料中の特定
成分や標識体と特異的に結合する物質としては、測定対
象により抗体、抗原、レクチン、プロテインＡなどが挙
げられるが、該特定成分と該結合物質の結合反応が抗原
−抗体反応である場合が特に好ましい。本発明で使用さ
れる抗体は、その由来を特に限定されるものではなく、
哺乳動物等に抗原を投与、免疫して得られる抗血清、腹
水液をそのままか、あるいは従来公知の方法である硫酸
ナトリウム沈澱法、硫酸アンモニウム沈澱法、セファデ
ックスゲルによるゲル濾過法、イオン交換セルロースク
ロマトグラフィ法、電気泳動法等（右田俊介偏「免疫化
学」中山書店ｐｐ７４ないし８８参照）で精製して用い
ることができる。

【００１４】あるいは、抗原で感染した哺乳動物など（
例えばマウス）の脾臓細胞や骨髄腫細胞（ミエローマ）
から雑種細胞（ハイブリドーマ）を得てモノクローナル
抗体を作成し、これを特定成分と特異的に結合しうる物
質として使用すると特異性が向上し、好ましい。 又、これらの抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、
ＩｇＥ各分画を用いることができ、或いはこれらの抗体
を酵素処理してＦａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２　
といった活性抗体フラグメントにして使用しても良い。 さらに、これらの抗体は単一で使用しても、複数の抗体
を組み合わせて使用しても良い。

【００１５】本発明の免疫測定方法による反応型式とし
ては、競合法、２抗体法、サンドイッチ法などが挙げら
れるが、サンドイッチ法が好ましい。又、他の生物活性
物質（例えば、ビオチン、アビジン）を利用した免疫測
定方法も適用できる。本発明においては、流体試料中の
特定成分を測定するのに反応型式として免疫反応を挙げ
ているが、免疫反応に準ずる生物活性を示す物質の特異
反応（本明細書では、この特異反応も免疫反応に包含）
を利用することも可能である。この特異的に結合する物
質の組み合わせとしては、次のようなものが挙げられる
。

【００１６】酵素と基質（生成物） 酵素と阻害剤 酵素と補欠分子族 酵素と補酵素 酵素とアロステリックエフェクター 抗体と抗原 抗体とプロテインＡ レクチンと多糖類 レクチンと糖タンパク質 核酸と相補性の塩基配列 核酸とヒストン 核酸と核酸 核酸とポリメラーゼ ホルモンと受容体 ピオチンとアビジン（ストレプトアビジン）ビオチシン
とアビジン（ストレプトアビジン）デスチオビオチンと
アビジン（ストレプトアビジン）オキシビオチンとアビ
ジン（ストレプトアビジン）本発明で使用する抗原は特
異抗体と反応するものであり、ハプテン及びその誘導体
を含有する。

【００１７】抗体を結合させる不溶化担体は、格別なる
限定はないが、その大きさが２ｍｍ以下の粒状体を用い
ることが好ましい。不溶化担体の材料としては、アガロ
ース、セルロース、架橋デキストラン、ポリアクリルア
ミド、セルロース、微結晶セルロース、架橋アガロース
、架橋ポリアクリルアミド、ガラス、シリカゲル、ケイ
藻土、二酸化チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛
、ケイ砂、ポリスチレン等の各種の合成樹脂のほか、多
孔質層の素材、さらには磁性微粒子が利用できる。

【００１８】好ましくはアガロース、架橋アガロース、
架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、架橋ポリアク
リルアミド、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、セル
ロース、微結晶セルロース等であり、更に好ましくはポ
リアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ポリスチ
レン、微結晶セルロース等である。上記不溶化担体は数
種を混合して用いても良い。

【００１９】抗体又は抗原は、これら不溶化担体に、当
業者で公知の方法で化学的及び／又は物理的に直接、あ
るいは間接的に結合させることができる。結合法につい
ては１９７６年、講談社発行、千畑一郎ほか２名編「実
験と応用アフィニティクロマトグラフィー」（第１刷）
、１９７５年、講談社発行、山崎誠ほか２名編「アフィ
ニティクロマトグラフィー」（第１版）を参考にできる
。

【００２０】標識抗体又は抗原の非特異的反応を排除す
る目的で、測定すべき特異的反応に関与しない蛋白質を
担持することが可能である。それらの代表的な例として
は、哺乳動物の正常血清蛋白質、アルブミンン、スキム
ミルク、乳酸醗酵物、コラーゲン、ゼラチン及びそれら
の分解物等が挙げられる。標識体に起因した信号の測定
方法は標識の種類により異なるが、例えば標識物質が螢
光物質であれば、螢光強度を測定すれば良く、標識物質
が酵素であれば適当な基質、必要ならば酵素や発色系を
含む溶液を添加し、一定時間インキュベートした後に、
該発色系に適合した波長の光の吸光度または反射濃度（
基質の種類によっては螢光強度、発光強度）を測定する
ことにより信号強度を測定できる。このような目的で用
いられる基質、発色系は標識酵素の種類にしたがって適
宜なものを選択できる。標識酵素に起因した信号は、吸
光度法（比色法）　、螢光法または発光法で検出するこ
とができ、測定法としては信号の経時的変化を測定する
レート測定法または一定時間後の信号を測定するエンド
ポイント測定法で測定することができる。好ましくは吸
光度法であり、吸光度法（比色法）　では紫外線、可視
光、近赤外光を利用することができ、例えば流体試料と
して血清及び血漿を用いる場合には、血清及び血漿によ
る吸光の影響を小さくするために緑色光、赤色光または
近赤外光を利用するのが好ましい。

【００２１】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例によって限定されるもので
はない。 〔実施例１〕１−（１）ビオチン化β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼの作成 β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（東洋紡社製）の４０ｍｇを
０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）１３．２ｍｌに溶解し、これにビオチン
−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエスエテル（ベーリン
ガ社製）０．４ｍｇを含有するジメチルホルムアミド溶
液１２０μｌを加えて室温で２．５時間反応後、前記緩
衝液にて十分に透析し、ビオチン化したβ−Ｄ−ガラク
トシダ−ゼを得た。

【００２２】１−（２）アビジン化抗ＣＲＰ抗体の作成
ＣＲＰ抗体（ヒツジＩｇＧフラクション、カッペル社製
）１００ｍｇ及びアビジン（オリエンタル酵母社製）４
５．６ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０
ｍｌに溶解し、これにグルタルアルデヒド０．３４ｍｇ
含有液を１００μｌ加えて室温で５時間反応後、前記緩
衝液にて十分に透析し、アビジン化したＣＲＰ抗体を得
た。

【００２３】１−（３）本発明のβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ標識ＣＲＰ抗体の作成 前記１−（１）で合成したビオチン化β−Ｄ−ガラクト
シダーゼ１０ｍｇと１−（２）で合成したアビジン化Ｃ
ＲＰ抗体１６．１ｍｇとを混合し、４℃で２０時間反応
させ、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含有する０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したスーパーロー
ズ６プレップグレード（ファルマシア社製）カラムで分
離、精製し、本発明に用いるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
標識ＣＲＰ抗体を得た。尚、このβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ標識ＣＲＰ抗体にあっては、β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ１分子に対し、およそ４．２個のＣＲＰ抗体が結合
していることが確認された。

【００２４】１−（４）比較例のβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ標識ＣＲＰ抗体の作成 前記１−（１）で合成したビオチン化β−Ｄ−ガラクト
シダーゼ１０ｍｇと１−（２）で合成したアビジン化抗
ＣＲＰ抗体４．０ｍｇを混合し、４℃で２０時間反応さ
せ、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含有する０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したスーパーローズ
６プレップグレード（ファルマシア社製）カラムで分離
、精製し、比較例のβ−Ｄ−ガラクトシターゼ標識ＣＲ
Ｐ抗体を得た。尚、このβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識
ＣＲＰ抗体にあっては、β−Ｄ−ガラクトシターゼ１分
子に対して、およそ１．４個のＣＲＰ抗体が結合してい
ることが確認された。

【００２５】１−（５）　　ＣＲＰ抗体固定化オイパー
ギットＣの合成 オイパーギットＣ（ロームファーマ社製）３ｇを０．１
５Ｍの塩化ナトリウム含有の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）４０ｍｌ中に分散し、これにＣＲＰ抗体（ウ
サギＩｇＧフラクション、タウンズ社製）１３６ｍｇを
入れ、４℃で２０時間攪拌し反応させる。反応後、濾取
し、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）と０．１Ｍの炭
酸緩衝液（ｐＨ８．０）を交互に用い、充分洗浄した。 次いで、水洗した後、径口３８μｍのメッシュでふるい
をかけた。オイパーギットＣの非特異的結合部位をブロ
ックする為、上記のふるいをかけたオイパーギットＣを
３％スキムミルク添加の０．１５Ｍの塩化ナトリウムを
含有する０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で４
℃、２０時間攪拌した。次いで水洗し、ＣＲＰ抗体固定
化オイパーギッドＣを得た。

【００２６】１−（６）　　ＣＲＰの測定１ｍＭ塩化マ
グネシウム及び３重量ウシ血清アルブミンを含有する０
．３Ｍビストリス緩衝液１９０μｌに、前記１−（５）
で合成したＣＰＲ抗体固定化オイパーギットＣ１５ｍｇ
、前記１−（３）で合成した本発明のβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼ標識ＣＲＰ抗体（１０μｇ／ｍｌ）２５μｌ、
及びＣＲＰ溶液（０，１０，３０，１００，３００μｇ
／ｍｌ）７μｌを添加混合し、それぞれのＣＲＰ濃度に
ついて室温で所定時間（０，５，１０，２０，４０，８
０，１６０分）反応させた。

【００２７】反応後の混合液は、直ちに口径０．４５μ
ｍのセルロースアセテートメンブランフィルター（ミリ
ポア社製）により固相と液相に分離された。次いで、こ
の各液相２００μｌに、１ｍＭの塩化マグネシウム及び
ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（３
．０ｍｇ／ｍｌ）含有の０．１Ｍビストリス緩衝液５０
０μｌを添加し、３７℃でインキュベートしながら４０
５ｎｍの光学濃度を測定した。

【００２８】５ないし１５分の光学濃度差（△ＯＤ）を
用いて、各反応時間、各ＣＲＰ濃度における△ＯＤをプ
ロットし、タイムコースを測定した結果を図１に示す。 又、上記の測定において、前記１−（３）で合成した本
発明のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＣＲＰ抗体の代わ
りに、前記１−（４）で合成した比較例のβ−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ標識ＣＲＰ抗体を用いて、同様の測定を行
い、タイムコースを測定した結果を図２に示す。

【００２９】又、本発明のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ標
識ＣＲＰ抗体を用いた時、及び比較例のβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼ標識ＣＲＰ抗体を用いた時の免疫反応時間１
０分におけるＣＲＰ検量線の比較図を図３に示す。図１
と図２を比較することにより、本発明のβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼ標識ＣＲＰ抗体が用いられると、免疫反応時
間４０分において、免疫反応はほぼ平衡に達しているが
、比較例のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＣＲＰ抗体が
用いられた場合には、免疫反応時間８０分にならないと
平衡に達しないことがわかる。

【００３０】又、図３から、本発明のβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼ標識ＣＲＰ抗体が用いられると、比較例のβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＣＲＰ抗体を用いた場合に比
べ、より感度良く、ＣＲＰの測定が出来ている。

【００３１】

【効果】本発明によれば、流体試料中の特定成分を短時
間で、感度、精度及び再現性良く定量できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＣＲＰ
抗体が用いられた場合において、５ないし１５分の光学
濃度差（△ＯＤ）を用いて、各反応時間、各ＣＲＰ濃度
における△ＯＤをプロットし、タイムコースを測定した
グラフである。

【図２】比較例のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＣＲＰ
抗体が用いられた場合において、５ないし１５分の光学
濃度差（△ＯＤ）を用いて、各反応時間、各ＣＲＰ濃度
における△ＯＤをプロットし、タイムコースを測定した
グラフである。

【図３】本発明のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＣＲＰ
抗体を用いた時、及び比較例のβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ標識ＣＲＰ抗体を用いた時の免疫反応時間１０分にお
けるＣＲＰ検量線の比較のグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　非均一系免疫測定法を用いて試料中の
   特定成分を分析する方法であって、試料中の特定成分と
   特異的に反応する物質が結合された不溶化担体、試料、
   及び試料中の特定成分と特異的に反応する物質に標識物
   質が結合された標識体（但し、この標識体における標識
   物質と試料中の特定成分と特異的に反応する物質との結
   合モル比は１対４以上である）を接触、免疫反応させる
   ことを特徴とする免疫測定方法。