JPH06130058A

JPH06130058A - 免疫測定法

Info

Publication number: JPH06130058A
Application number: JP28280392A
Authority: JP
Inventors: Masayuki Numama; 雅之沼間
Original assignee: Konica Minolta Inc
Current assignee: Konica Minolta Inc
Priority date: 1992-10-21
Filing date: 1992-10-21
Publication date: 1994-05-13

Abstract

(57)【要約】流体試料中の特定成分を精度良く測定できる技術を提
供することである。【構成】サンドイッチ法による免疫測定法であって、
この免疫測定に際して用いられる一次抗体を固定化した
アフィニティカラムを通すことによって前記抗体への結
合能が除去されたポリクローナル抗体が標識二次抗体と
して用いられる免疫測定法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、特に生物学的流体試料
中の特定微量成分を検出する免疫測定法に関するもので
ある。

【０００２】

【発明の背景】生物学的流体試料中に極微量含有される
物質を検出する方法として、各種の分析法が開発されて
来ている。この分析法の一つとして、免疫反応をその原
理とするものがある。そして、この原理を用いた測定法
として種々のものが開発され、精度の高いものとして知
られている。尚、免疫反応型式として競合法、２抗体
法、サンドイッチ法などの各種のものが提案されて来て
いる。

【０００３】ところで、このサンドイッチイムノアッセ
イにおいて、標識二次抗体中には一次抗体に非特異的に
吸着し、目的検出物質の測定に妨害となるものが除去で
きてなく、免疫測定の精度が低いといった問題点が有
る。

【０００４】

【発明の開示】本発明の目的は、流体試料中の特定成分
を精度良く測定できる技術を提供することである。この
本発明の目的は、サンドイッチ法による免疫測定法であ
って、この免疫測定に際して用いられる一次抗体を固定
化したアフィニティカラムを通すことによって前記抗体
への結合能が除去されたポリクローナル抗体が標識二次
抗体として用いられるものであることを特徴とする免疫
測定法によって達成される。

【０００５】以下、本発明をさらに詳しく説明する。免
疫反応に際して用いられる流体試料中の特定成分と特異
的に結合する物質、すなわち一次抗体（モノクローナル
抗体）が固定化される不溶性の担体としては粒状体、プ
レート状といったものが有り、如何なるタイプのもので
も良い。不溶性担体の材料としては、アガロース、セル
ロース、架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、セル
ロース、微結晶セルロース、架橋アガロース、架橋ポリ
アクリルアミド、ガラス、シリカゲル、ケイ藻土、二酸
化チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、ケイ砂、
ポリスチレン等の各種の合成樹脂のほか、多孔質な素
材、さらには磁性微粒子などが利用できる。好ましくは
アガロース、架橋アガロース、架橋デキストラン、ポリ
アクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ガラス、シ
リカゲル、ポリスチレン、セルロース、微結晶セルロー
ス等であり、更に好ましくはポリアクリルアミド、架橋
ポリアクリルアミド、ポリスチレン、微結晶セルロース
等である。これらの不溶性担体は数種を混合して用いて
も良い。

【０００６】一次抗体は、これら不溶性担体に、当業者
に公知の方法で化学的及び／又は物理的に直接、あるい
は間接的に結合させることができる。結合法については
１９７６年、講談社発行、千畑一郎ほか２名編「実験と
応用アフィニティクロマトグラフィー」（第１刷）、
１９７５年、講談社発行、山崎誠ほか２名編「アフィ
ニティクロマトグラフィー」（第１版）を参考にでき
る。尚、結合反応後、非特異反応を排除する目的で、測
定すべき特異的反応に関与しない蛋白質を担持させるこ
とができる。それらの代表的な例としては、哺乳動物及
び鳥類の正常血清蛋白質、アルブミン、スキムミルク、
乳酸醗酵物、コラーゲン及びそれらの分解物質等が挙げ
られる。尚、非特異吸着抑制蛋白質は、固定化担体に担
持させるだけでなく、免疫反応時に、その一定量を免疫
反応溶液中に添加することにより、非特異吸着の抑制効
果が一層上がる。

【０００７】測定に用いられる流体試料としてはあらゆ
る形態の溶液、コロイド溶液などが使用しうるが、好ま
しくは生物由来の流体試料、例えば血液、血漿、血清、
脳脊髄液、唾液、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられ
る。測定しうる流体試料中での特定成分は、その特定成
分に特異的に結合する物質が存在しうる物質（物質群）
である。具体的には、特開昭６２−９０５３９号公報や
特開昭６３−１３１０６２号公報に記載の物質（物質
群）を挙げることができるが、これらに限定されるもの
ではない。

【０００８】そして、上記したような一次抗体が固定化
された固定化担体、試料中の抗原及び標識二次抗体との
間で免疫反応が行われ、その後標識物質を測定すること
により定量が行われる。標識二次抗体としてはポリクロ
ナール抗体が使用される。ところで、ポリクロナール抗
体の中に前記一次抗体に直接吸着するものが存在する
と、これが目的検出物質の測定に妨害となる恐れがあ
る。従って、このようなものは必ず除去されていなけれ
ば正確な測定を期待することが出来ない。そこで、この
ことについての研究を鋭意押し進めて行った結果、コロ
ンブスの卵のようであるが、一次抗体を固定化したアフ
ィニティカラムを通すことによって一次抗体への結合能
が除去されたポリクローナル抗体を得ることが出来、こ
のようなポリクローナル抗体を二次抗体として用いるよ
うにすれば、前記の問題が解決されるとの発想を得た。
それ故、本発明においては、サンドイッチアッセイにお
ける二次抗体として、免疫測定に際して用いられるモノ
クローナル抗体を固定化したアフィニティカラムを通す
ことによって前記抗体への結合能が除去されたポリクロ
ーナル抗体を用いることを特徴とする免疫測定法を提案
するものである。

【０００９】免疫反応に用いられる抗体の標識物質とし
て酵素、酵素基質、補酵素、酵素阻害物質、バクテリオ
ファージ、循環反応体、金属及び有機金属の錯体、有機
補欠分子族、化学発光性反応体及び螢光性分子等が挙げ
られるが、例えばβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシ
ダーゼ、グルタメートデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ等
の酵素が好ましい。これらの酵素を標識物質とする場
合、酵素反応系、発色系は公知のものを使用できる。具
体的には、特開昭６１−２９２０６０号公報、特開昭６
２−９０５３９号公報、特開昭６３−１３１０６２号公
報、特開昭６３−４５５６２号公報、特願昭６３−２１
９８９３号明細書に記載の物質（物質群）が挙げられる
が、これらに限定されるものではない。そして、これら
標識物質の抗体への結合は、当業者間で知られている公
知の試薬と方法で行うことができ、例えば石川栄治、
河合忠、宮井潔編「酵素免疫測定法（第２版）、医
学書院、１９７８年」や日本臨床病理学会編「臨床病
理」臨時増刊特集第５３号「臨床検査の為のイムノアッ
セイ−技術と応用−、臨床病理刊行会、１９８３年」な
どに記載された方法を参考にすることができる。

【００１０】本発明で使用される抗体は、その由来を特
に限定されるものではなく、哺乳動物等に抗原を投与、
免疫して得られる抗血清、腹水液をそのままか、あるい
は従来公知の方法である硫酸ナトリウム沈澱法、硫酸ア
ンモニウム沈澱法、セファデックスゲルによるゲル濾過
法、イオン交換セルロースクロマトグラフィ法、電気泳
動法等（右田俊介偏「免疫化学」中山書店ｐｐ７４〜８
８参照）で精製して用いることができる。又、これらの
抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ各分画
を用いることができ、或いはこれらの抗体を酵素処理し
てＦａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）₂といった活性抗
体フラグメントにして使用しても良い。

【００１１】免疫反応後の標識物質に起因した信号の測
定方法は標識の種類により異なるが、例えば標識物質が
螢光物質であれば、螢光強度を測定すれば良く、標識物
質が酵素であれば適当な基質、必要ならば酵素や発色系
を含む溶液を添加し、一定時間インキュベートした後
に、該発色系に適合した波長の光の吸光度または反射濃
度（基質の種類によっては螢光強度、発光強度）を測定
することにより信号強度を測定できる。このような目的
で用いられる基質、発色系は標識酵素の種類にしたがっ
て適宜なものを選択できる。標識酵素に起因した信号
は、吸光度法（比色法) 、螢光法または発光法で検出す
ることができ、測定法としては信号の経時的変化を測定
するレート測定法または一定時間後の信号を測定するエ
ンドポイント測定法で測定することができる。好ましく
は吸光度法であり、吸光度法（比色法) では紫外線、可
視光、近赤外光を利用することができ、例えば流体試料
として血清及び血漿を用いる場合には、血清及び血漿に
よる吸光の影響を小さくする為に緑色光、赤色光または
近赤外光を利用するのが好ましい。

【００１２】

【実施例】

〔固定化抗体〕ポリスチレンビーズ（積水化学製の＃８
０）を２０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体ＡＣ−００
５溶液（１ＭのＮａＣｌを含む、ＰＢＳ：ｐＨ７．４）
に４℃で２０時間浸漬し、固定化操作を行った。この
後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて３７℃、１．５時間の
条件でブロッキングを行った。

【００１３】又、比較用にＡＣ−００５を含まない溶液
を使用し、同様な操作を施したビーズを用意した。〔本発明になる標識二次抗体〕α₁−アンチキモトリプ
シンを常法にしたがってヒツジに免疫し、抗血清を得
た。そして、硫酸アンモニウムによる塩析でＩｇＧ画分
を沈澱させ、他のタンパクを除く為にＤＥＡＥのセルロ
ーズカラムに通し、素通り分画を採取し、ＩｇＧを得
た。

【００１４】このようにして得たＩｇＧ画分をモノクロ
ーナル抗体ＡＣ−００５（特願平４−７８３０５号明細
書参照）を固定化したアフィニティカラムに通し、素通
り分画を採取し、これに対して前述の石川栄治らの方法
により過ヨーソ酸法を用いてＨＲＰ標識を行った。〔比較例になる標識二次抗体〕α₁−アンチキモトリプ
シンを常法にしたがってヒツジに免疫し、抗血清を得
た。そして、硫酸ソーダによる塩析でＩｇＧ画分を沈澱
させ、他のタンパクを除く為にＤＥＡＥのセルローズカ
ラムに通し、素通り分画を採取し、ＩｇＧを得た。

【００１５】このようにして得たＩｇＧ画分に対して過
ヨーソ酸法を用いてＨＲＰ標識を行った。〔免疫反応〕抗体を固定化し、ブロッキングを行ったビ
ーズをプレートに移した。プール血清を１％ＢＳＡ−Ｐ
ＢＳ溶液で５０倍及び無限大に希釈し、各々２００μｌ
ずつを先のプレートに移した。続いて、３７℃で１．５
時間インキュベートし、一次反応を行った。ビーズをＰ
ＢＳで３回洗浄した後、前述のようにアフィニティカラ
ムクロマトグラフィにより精製し、ＨＲＰで標識化した
抗α₁−アンチキモトリプシンポリクローナル抗体を含
む１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液２００μｌを加え、２０℃で
１．５時間インキュベートし、二次免疫反応を行った。
ビーズをＰＢＳで４回洗浄した後、ｏ−フェニレンジア
ミンを適当量含む発色液を用い、３０分間の発色反応を
行った。そして、１Ｎ硫酸で反応を停止させた後、その
吸光度を測定したので、その結果を表１に示す。

【００１６】又、本発明になる標識二次抗体の代わりに
比較例の標識二次抗体を用いて同様に行ったので、その
結果も表１に示す。表１試料５０倍希釈試料無限大希釈固定化抗体有固定化抗体無固定化抗体有固定化抗体無０．９８０．０５０．０７０．０６本発明１．１２０．０８０．２２０．０７比較例＊固定化抗体無は、モノクローナル抗体ＡＣ−００５が
固定化されていないポリスチレンビーズ（積水化学製の
＃８０）を使用した場合のもの。これによれば、モノクローナル抗体を固定化したアフィ
ニティカラムに通し、素通り分画を採取したものを標識
抗体として用いた系では、バックグラウンドが低減し、
Ｓ／Ｎの高い測定方法であることが判る。

【００１７】

【効果】流体試料中の特定成分を精度良く測定できる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】サンドイッチ法による免疫測定法であっ
て、この免疫測定に際して用いられる一次抗体を固定化
したアフィニティカラムを通すことによって前記抗体へ
の結合能が除去されたポリクローナル抗体が標識二次抗
体として用いられるものであることを特徴とする免疫測
定法。