JPH04216467A - 免疫学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、流体試料中の微量成分
、特に生物学的流体試料中の特定微量成分を測定する方
法に関するものである。

【０００２】

【発明の背景】生物学的流体試料中に極微量含有される
物質を検出する方法として、各種の分析法が開発されて
来ている。この分析法の一つとして、免疫反応をその原
理とするものがある。そして、この原理を用いた測定法
として種々のものが開発され、精度の高いものとして知
られている。

【０００３】すなわち、１９５８年にベルソン（Ｂｅｒ
ｓｏｎ）とイアロウ（Ｙａｌｌｏｗ）が、放射性同位元
素Ｉで標識した牛インシュリンと糖尿病患者血清中の抗
インシュリン抗体を用いて、血清中のインシュリンを測
定することに成功して以来、ラジオアイソトープを用い
た免疫学的測定法が広く用いられて来た。そして、これ
以後、標識物質として放射性同位元素以外のものも種々
開発されて来た。例えば、酵素、酵素基質、補酵素、酵
素阻害物質、バクテリオファージ、循環反応体、金属及
び有機金属の錯体、有機補欠分子族、化学発光性反応体
及び螢光性分子等が挙げられる。

【０００４】ところで、固定化抗体、試料中の抗原、及
び標識された抗体を接触、免疫反応させる免疫学的測定
法において、より正確な測定を得る為には固相化抗体の
保存安定性の向上が必要であり、この固定化抗体の保存
安定性を向上させる為に、凍結乾燥する手段や保存安定
剤を併用する手段が知られている。すなわち、抗体は、
分子量約１５万（ＩｇＭは約９０万）の糖タンパクであ
り、比較的熱安定性が高いが、長期間の保存中にはその
立体構造に変化を来たし、抗原への反応活性が変化して
くることから、凍結乾燥する手段や保存安定剤を併用す
る手段が用いられて来たのであるが、かかる手段で充分
に満足されていたものではない。

【０００５】

【発明の開示】本発明の目的は、保存安定性に富んだ固
定化抗体により正確な測定を得ることができる免疫学的
測定法を提供することである。この本発明の目的は、ク
ロスリンク処理された抗体が担体に固定化された固定化
抗体を用いることを特徴とする免疫学的測定法によって
達成される。

【０００６】尚、このクロスリンク処理は、化学的共有
結合を形成する架橋剤、例えばグルタルアルデヒド、１
，５−ジクロロ−２，４−ジニトロベンゼン、ビスマレ
イミドヘキサン、ジメチルアジポイミデート、シメチル
スベルイミデート、２−イミノチオレーソ−ＨＣｌ、ジ
サクシイミジルスバレート、ｐ−アジドフェナシルブロ
マイド、サクシイミジル４−（ｐ−マレインイミドフェ
ニル）ブチレート等の多官能性基を有する架橋剤での処
理とか、あるいは抗マウスイムノグロブリン抗体などの
免疫学的クロスリンキング剤による処理が有る。そして
、このようなクロスリンク処理された抗体溶液の中から
クロスリンクしている高分子画分を分離収集し、これを
所望の担体に固定化操作すれば良い。

【０００７】例えば、抗体を粒状体の担体に化学的及び
／又は物理的に結合させ、不溶化微粒子抗体を得、これ
と酵素で標識された抗体及び試料とを接触、免疫反応さ
せることにより、試料中の抗原を定量するに際して、担
体に固定化された抗体としてクロスリンク処理されたも
のが用いられた場合には、固定化抗体が長期間にわたっ
て保存されたものであっても、正確な測定が行えたので
ある。

【０００８】本発明において、試料としてはあらゆる形
態の溶液、コロイド溶液などが使用しうるが、好ましく
は生物由来の流体試料、例えば血液、血漿、血清、脳脊
髄液、唾液、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられる。 本発明により測定しうる流体試料中での特定成分は、そ
の特定成分に特異的に結合する物質が存在しうる物質（
物質群）である。すなわち、ポリペプチド、蛋白質、複
合蛋白質、多糖類、脂質、複合脂質、核酸、ホルモン類
、ビタミン類、薬剤、抗生物質、農薬等が挙げられる。 具体的には、特開昭６２−９０５３９号公報や特開昭６
３−１３１０６２号公報に記載の物質（物質群）を挙げ
ることができるが、これらに限定されるものではない。

【０００９】本発明に用いられる標識物質としては、例
えば、酵素、酵素基質、酵素及び酵素前駆体の活性を変
化させる物質（酵素阻害物質、補欠分子族、補酵素）、
酵素前駆体、アポ酵素、螢光物質などが挙げられる。具
体的な物質としては、特開昭６２−９０５３９号公報な
どに記載のものが挙げられるが、好ましくは酵素、又は
螢光物質であり、さらに好ましくはβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ、アルカリホスフォダーゼ、ペルオキシダーゼ、
グルコースオキシダーゼ、グルタメートデヒドロゲナー
ゼ、アミラーゼなどの酵素である。

【００１０】これらの酵素を標識物質とする場合、酵素
反応系、発色系は公知のものを使用できる。具体的には
、特開昭６１−２９２０６０号公報、特開昭６２−９０
５３９号公報、特開昭６３−１３１０６２号公報、特開
昭６３−４５５６２号公報、特願昭６３−２１９８９３
号明細書に記載の物質（物質群）が挙げられるが、これ
らに限定されるものではない。

【００１１】そして、これら標識物質の抗体への結合は
、当業者間で知られている公知の試薬と方法で行うこと
ができ、例えば石川　　栄治、河合　　忠、宮井　　潔
編「酵素免疫測定法（第２版）、医学書院、１９７８年
」や日本臨床病理学会編「臨床病理」臨時増刊特集第５
３号「臨床検査の為のイムノアッセイ−技術と応用−、
臨床病理刊行会、１９８３年」などに記載された方法を
参考にすることができる。

【００１２】本発明で使用される抗体は、その由来を特
に限定されるものではなく、哺乳動物等に抗原を投与、
免疫して得られる抗血清、腹水液をそのままか、あるい
は従来公知の方法である硫酸ナトリウム沈澱法、硫酸ア
ンモニウム沈澱法、セファデックスゲルによるゲル濾過
法、イオン交換セルロースクロマトグラフィ法、電気泳
動法等（右田俊介偏「免疫化学」中山書店ｐｐ７４ない
し８８参照）で精製して用いることができる。

【００１３】あるいは、抗原で感染した哺乳動物など（
例えばマウス）の脾臓細胞や骨髄腫細胞（ミエローマ）
から雑種細胞（ハイブリドーマ）を得てモノクローナル
抗体を作成し、これを特定成分と特異的に結合しうる物
質として使用すると特異性が向上し、好ましい。 又、これらの抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、
ＩｇＥ各分画を用いることができ、或いはこれらの抗体
を酵素処理してＦａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２　
といった活性抗体フラグメントにして使用しても良い。 さらに、これらの抗体は単一で使用しても、複数の抗体
を組み合わせて使用しても良い。

【００１４】本発明の免疫測定方法による反応型式とし
ては、競合法、２抗体法、サンドイッチ法などが挙げら
れるが、特に限定はされない。本発明で使用する抗原は
特異抗体と反応するものであり、ハプテン及びその誘導
体を含有する。抗体を結合させる不溶化担体としては粒
状体が好ましい。

【００１５】不溶化担体の材料としては、アガロース、
セルロース、架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、
セルロース、微結晶セルロース、架橋アガロース、架橋
ポリアクリルアミド、ガラス、シリカゲル、ケイ藻土、
二酸化チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、ケイ
砂、ポリスチレン等の各種の合成樹脂のほか、多孔質層
の素材、さらには磁性微粒子が利用できる。

【００１６】好ましくはアガロース、架橋アガロース、
架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、架橋ポリアク
リルアミド、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、セル
ロース、微結晶セルロース等であり、更に好ましくはポ
リアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ポリスチ
レン、微結晶セルロース等である。これらの不溶化担体
は数種を混合して用いても良い。

【００１７】抗体は、これら不溶化担体に、当業者で公
知の方法で化学的及び／又は物理的に直接、あるいは間
接的に結合させることができる。結合法については１９
７６年、講談社発行、千畑一郎ほか２名編「実験と応用
アフィニティクロマトグラフィー」（第１刷）、１９７
５年、講談社発行、山崎誠ほか２名編「アフィニティク
ロマトグラフィー」（第１版）を参考にできる。

【００１８】尚、結合反応後、非特異反応を排除する目
的で、測定すべき特異的反応に関与しない蛋白質を担持
させることができる。それらの代表的な例としては、哺
乳動物及び鳥類の正常血清蛋白質、アルブミン、スキム
ミルク、乳酸醗酵物、コラーゲン及びそれらの分解物質
等が挙げられる。又、上記の非特異吸着抑制蛋白質は、
固定化担体に担持させるだけでなく、免疫反応時に、そ
の一定量を免疫反応溶液中に添加することにより、一層
非特異吸着の抑制効果が上がる。

【００１９】そして、このような固定化担体に抗体を担
持させるに先立って、抗体は前記のようなクロスリンキ
ング剤で処理されることが大事な訳であるが、このよう
な処理は次のようにして行われることが好ましい。すな
わち、抗体を所定の濃度（好ましくは０．１ないし１０
ｍｇ／ｍｌ）で、例えばリン酸バッファー、クエン酸バ
ッファー等のバッファー（好ましくはｐＨが５ないし９
）中に溶解し、クロスリンキング剤を加える。化学的ク
ロスリンキング剤は抗体１モルに対して１ないし１００
モル、好ましくは１ないし１０モルの割合で添加される
。免疫学的クロスリンキング剤は抗体１モルに対して１
ないし１０モル、好ましくは１ないし３モルの割合で添
加される。クロスリンキングの反応条件としては、温度
が室温あるいは４℃ないし３７℃で、時間が１時間ない
し１日である。そして、反応終了後、クロスリンキング
されたものと未反応物との分離を分子量の差を利用して
行う。通常、ゲルフィルトレーションクロマトグラフィ
によって溶出される高分子量の分画を集めることにより
、クロスリンキングされた抗体を精製し、固定化担体に
担持させる次の工程に進めるのである。

【００２０】標識物質に起因した信号は、吸光度法（比
色法）　、螢光法または発光法で検出することができ、
測定法としては信号の経時的変化を測定するレート測定
法または一定時間後の信号を測定するエンドポイント測
定法で測定することができる。好ましくは吸光度法であ
り、吸光度法（比色法）　では紫外線、可視光、近赤外
光を利用することができ、例えば流体試料として血清及
び血漿を用いる場合には、血清及び血漿による吸光の影
響を小さくするために緑色光、赤色光または近赤外光を
利用するのが好ましい。

【００２１】

【実施例】以下、本発明を実施例によって更に具体的に
説明するが、本発明はこれら実施例によって限定される
ものではない。〔クロスリンク処理−１〕ヒツジ由来の
抗ＣＲＰ抗体１０ｍｇを１０ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．２）に溶解し、その後５０μｌのグルタル
アルデヒド（３５％Ｗ／Ｖ）を加え、室温において１時
間攪拌した。

【００２２】この反応溶液を、２．５×８０ｃｍのゲル
濾過カラム（セファクリルＳ−２００、ファルマシア社
製）によりＰＢＳ（２０ｍＭのリン酸緩衝液、１５０ｍ
ＭのＮａＣｌ）で溶出し、分子量１００万以上の分画を
集めた。〔クロスリンク処理−２〕マウスモノクロナー
ル抗ＣＲＰ抗体（コスモバイオ社製）１ｍｇを１ｍｌの
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解した後、ヒ
ツジ由来の抗マウスイムノグロブリン抗体１ｍｇを加え
、室温において１時間攪拌した。

【００２３】そして、〔クロスリンク処理−１〕と同様
にゲル濾過カラムにより、分子量１００万以上の分画を
集めた。上記〔クロスリンク処理−１〕で得た抗体とヒ
ツジ由来の抗ＣＲＰ抗体、及び〔クロスリンク処理−２
〕で得た抗体とマウスモノクロナール抗ＣＲＰ抗体の計
４種類の抗体各々を、１０μｇ／ｍｌのＰＢＳ溶解中に
添加し、４℃で一晩静置することにより、１／４インチ
のポリスチレンビーズ（積水化学社製）の固相単体に固
定化した。

【００２４】この後、ＰＢＳで２回洗浄後、１％ＢＳＡ
（牛アルブミン）ＰＢＳ中において３７℃で１時間ブロ
ッキグ処理した。このようにして得られた４種類各々の
固定化ビーズを３７℃で１週間保存し、４℃に保存した
ものと比較試験を行った。すなわち、１２×６０ｍｍ試
験管中へ、ＣＲＰ標準液、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍ
ｌの濃度で調整したものを５０μｌ加え、さらにヒツジ
由来抗ＣＲＰ抗体ペルオキシダーゼ標識体１μｇ／ｍｌ
、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液を２００μｌ、及び前記各々
の固定化ビーズ１個を加え、３７℃で１時間インキュベ
ーションした。

【００２５】ＰＢＳで３回洗浄後、発色基質（３μｍ／
ｍｌのｏ−フェニレンジアミン、０．０３％のＨ２　Ｏ
２　、０．１Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ６．０）０．３ｍｌ
を加え、１０分間発色反応させ、１Ｎの硫酸１ｍｌを加
え、発色反応を停止させた。そして、４９２ｎｍの吸光
度を分光度計により測定したので、その結果を表１に示
す。

【００２６】この表１によれば、本発明のクロスリンク
処理した抗体が担体に固定化された固定化抗体が用いら
れた場合には、抗体の保存安定性が向上していることが
判る。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　クロスリンク処理された抗体が担体に
   固定化された固定化抗体を用いることを特徴とする免疫
   学的測定法。
2. 【請求項２】　　クロスリンク処理が化学的共有結合を
   形成する架橋剤で処理されたものであることを特徴とす
   る請求項１の免疫学的測定法。
3. 【請求項３】　　クロスリンク処理が免疫学的クロスリ
   ンキング剤によって処理されたものであることを特徴と
   する請求項１の免疫学的測定法。