JPH04337461A

JPH04337461A - 固定化担体の製造方法

Info

Publication number: JPH04337461A
Application number: JP10753791A
Authority: JP
Inventors: Morito Uemura; 植村　盛人
Original assignee: Konica Minolta Inc
Current assignee: Konica Minolta Inc
Priority date: 1991-05-13
Filing date: 1991-05-13
Publication date: 1992-11-25

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、流体試料中の微量成分
、特に生物学的流体試料中の特定微量成分を測定するに
際して用いられる固定化担体の製造方法に関するもので
ある。

【０００２】

【発明の背景】生物学的流体試料中に極微量含有される
物質を検出する方法として、各種の分析法が開発されて
来ている。この分析法の一つとして、免疫反応をその原
理とするものがある。そして、この原理を用いた測定法
として種々のものが開発され、精度の高いものとして知
られている。

【０００３】すなわち、１９５８年にＢｅｒｓｏｎとＹ
ａｌｌｏｗが、放射性同位元素Ｉで標識した牛インシュ
リンと糖尿病患者血清中の抗インシュリン抗体を用いて
、血清中のインシュリンを測定することに成功して以来
、ラジオアイソトープを用いた免疫測定法が広く用いら
れて来た。そして、これ以後、標識物質として放射性同
位元素以外のものも種々開発されて来た。例えば、酵素
、酵素基質、補酵素、酵素阻害物質、バクテリオファー
ジ、循環反応体、金属及び有機金属の錯体、有機補欠分
子族、化学発光性反応体及び螢光性分子等が挙げられる
。

【０００４】ところで、免疫測定が行われるに際しては
、抗体（又は抗原）が固定化された担体が用いられる。この固定化担体は、抗体（又は抗原）溶液中に担体を入
れ、攪拌し、担体に抗体（又は抗原）を吸着させ、その
後凍結乾燥することにより製造されている。しかしなが
ら、このようにして得られた固定化担体を用いての免疫
測定では、その測定値に変動が大きく、再現性が低い問
題点の有ることが判って来た。

【０００５】

【発明の開示】本発明の目的は、流体試料中の特定成分
を正確に、精度及び再現性良く定量できる技術を提供す
ることである。この本発明の目的は、免疫学的反応物質
を担体に固定化する固定化担体を製造する方法であって
、緩衝液と担体とが存在する中に免疫学的反応物質を徐
々に添加することを特徴とする固定化担体の製造方法に
よって達成される。

【０００６】尚、免疫学的反応物質を約１時間以上かけ
て、望ましくは約２時間以上かけて徐々に添加すること
が好ましい。又、緩衝液のｐＨは約５〜１２の範囲内の
ものであることが好ましく、又、緩衝液の温度は約２〜
１０℃に調整されてなることが好ましい。抗体（又は抗
原）等の免疫学的反応物質が物理的及び／又は化学的に
結合される担体は多孔質なものであることが好ましく、
このような担体の材料としてはケイ藻土、二酸化チタン
、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、微結晶セルロース
、ケイ砂、ガラス、シリカゲル、架橋デキストリン、架
橋ポリアクリルアミド、アガロース、架橋アガロース、
ポリスチレン等の各種の合成樹脂が挙げられる。そして
、このような素材の多孔質担体であれば、抗体（又は抗
原）が固定化される一次的な形状は粒子（ビーズ）状、
棒状あるいはプレート状のものであっても差し支えない
が、粒子（ビーズ）状のものが好ましい。

【０００７】抗体又は抗原等の免疫学的反応物質は、こ
れら多孔質の不溶化担体に、化学的及び／又は物理的に
直接、あるいは間接的に結合させることができる。結合
方法としては、例えばｐＨ５〜１２に調整された緩衝液
が入れられた容器内に、ポリスチレンビーズ等の担体が
入れられたメッシュ状（バスケット状）の容器を入れ、
ポリスチレンビーズ等の担体を前記緩衝液に浸し、又、
容器の底部にマグネチック攪拌子を置いておき、そして
この状態においてマグネチック攪拌子を回転させ、ポリ
スチレンビーズ等の担体に回転力を付与しない静止状態
で緩衝液を流動させると共に、免疫学的反応物質を緩衝
液に対して徐々に添加することにより、ポリスチレンビ
ーズ等の担体に均一に抗体（又は抗原）を結合させる手
段が好ましい。尚、抗体（又は抗原）溶液の流動は攪拌
子による攪拌手段のみではなく、例えば噴流力を印加す
るようにしても良く、あるいは対流手段等の外、どのよ
うな手段が用いられても良い。そして、ポリスチレンビ
ーズ等の担体を静置状態にし、かつ、緩衝液に流動力を
印加すると共に、濃度が１〜１００μｇ／ｍｌ程度の免
疫学的反応物質の溶液を緩衝液に対して徐々に添加する
ことで抗体又は抗原などの免疫学的反応物質を担体に結
合させた後、この固定化担体が凍結乾燥されるのである
が、この固定化担体が入れられている前記メッシュ状の
容器を取り出し、そして取り出したメッシュ状の容器を
そのまま液体窒素などの不活性極低温冷媒中に浸け、固
定化担体を瞬間凍結し、減圧下で乾燥することにより一
層好ましい固定化担体が得られる。

【０００８】その他の点に関する結合技術については、
１９７６年、講談社発行、千畑一郎ほか２名編「実験と
応用　　アフィニティクロマトグラフィー」（第１刷）
、１９７５年、講談社発行、山崎　　誠ほか２名編「ア
フィニティクロマトグラフィー」（第１版）を参考にで
きる。尚、結合反応後、標識抗体（又は抗原）の非特異
反応を排除する目的で、測定すべき特異的反応に関与し
ない蛋白質を担持させることができる。それらの代表的
な例としては、哺乳動物及び鳥類の正常血清蛋白質、ア
ルブミン、スキムミルク、乳酸醗酵物、コラーゲン及び
それらの分解物質等が挙げられる。

【０００９】そして、上記のようにして得られた抗体（
又は抗原）が物理的及び／又は化学的に結合した不溶化
微粒子抗体（又は不溶化微粒子抗原）と酵素などで標識
された抗体（又は抗原）及び試料とを接触、免疫反応さ
せ、Ｂ／Ｆ分離した後、不溶化微粒子抗体（又は不溶化
微粒子抗原）に結合しないで遊離の状態で存在する酵素
標識体の酵素活性を例えば乾式分析素子で測定すること
で、試料中の抗原（又は抗体）が簡便な操作で、感度、
正確度、精度及び再現性良く、正確な測定が行われるの
である。

【００１０】免疫測定においては、試料としてあらゆる
形態の溶液、コロイド溶液などが使用しうるが、好まし
くは生物由来の流体試料、例えば血液、血漿、血清、脳
脊髄液、唾液、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられる
。測定しうる流体試料中での特定成分は、その特定成分
に特異的に結合する物質が存在しうる物質（物質群）で
ある。すなわち、ポリペプチド、蛋白質、複合蛋白質、
多糖類、脂質、複合脂質、核酸、ホルモン類、ビタミン
類、薬剤、抗生物質、農薬等が挙げられる。具体的には
、特開昭６２−９０５３９号公報や特開昭６３−１３１
０６２号公報に記載の物質（物質群）を挙げることがで
きるが、これらに限定されるものではない。

【００１１】免疫測定において用いられる標識物質とし
ては、例えば酵素、酵素基質、酵素及び酵素前駆体の活
性を変化させる物質（酵素阻害物質、補欠分子族、補酵
素）、酵素前駆体、アポ酵素、螢光物質などが挙げられ
る。具体的な物質としては、特開昭６２−９０５３９号
公報などに記載のものが挙げられるが、好ましくは酵素
、又は螢光物質であり、さらに好ましくはβ−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ、アルカリホスフォダーゼ、ペルオキシダ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタメートデヒドロ
ゲナーゼ、アミラーゼなどの酵素である。これらの酵素
を標識物質とする場合、酵素反応系、発色系は公知のも
のを使用できる。具体的には、特開昭６１−２９２０６
０号公報、特開昭６２−９０５３９号公報、特開昭６３
−１３１０６２号公報、特開昭６３−４５５６２号公報
、特願昭６３−２１９８９３号明細書に記載の物質（物
質群）が挙げられるが、これらに限定されるものではな
い。そして、これら標識物質の抗体（抗原）への結合は
、当業者間で知られている公知の試薬と方法で行うこと
ができ、例えば石川　　栄治、河合　　忠、宮井潔　　
編「酵素免疫測定法（第２版）、医学書院、１９７８年
」や日本臨床病理学会編「臨床病理」臨時増刊特集第５
３号「臨床検査の為のイムノアッセイ−技術と応用−、
臨床病理刊行会、１９８３年」などに記載された方法を
参考にすることができる。

【００１２】本発明で使用される抗体は、その由来を特
に限定されるものではなく、哺乳動物等に抗原を投与、
免疫して得られる抗血清、腹水液をそのままか、あるい
は従来公知の方法である硫酸ナトリウム沈澱法、硫酸ア
ンモニウム沈澱法、セファデックスゲルによるゲル濾過
法、イオン交換セルロースクロマトグラフィ法、電気泳
動法等（右田俊介偏「免疫化学」中山書店ｐｐ７４ない
し８８参照）で精製して用いることができる。あるいは
、抗原で感染した哺乳動物など（例えばマウス）の脾臓
細胞や骨髄腫細胞（ミエローマ）から雑種細胞（ハイブ
リドーマ）を得てモノクローナル抗体を作成し、これを
特定成分と特異的に結合しうる物質として使用すると特
異性が向上し、好ましい。又、これらの抗体はＩｇＧ、
ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ各分画を用いることが
でき、或いはこれらの抗体を酵素処理してＦａｂ、Ｆａ
ｂ’又はＦ（ａｂ’）２　といった活性抗体フラグメン
トにして使用しても良い。さらに、これらの抗体は単一
で使用しても、複数の抗体を組み合わせて使用しても良
い。

【００１３】本発明で使用する抗原は特異抗体と反応す
るものであり、ハプテン及びその誘導体を含有する。免
疫測定方法による反応型式としては、競合法、２抗体法
、サンドイッチ法などが挙げられるが、特に限定はされ
ない。又、他の生物活性物質（例えば、ビオチン、アビ
ジン）を利用した免疫測定方法も適用できる。本明細書
においては、流体試料中の特定成分を測定するのに反応
型式として免疫反応を挙げているが、免疫反応に準ずる
生物活性を示す物質の特異反応（本明細書では、この特
異反応も免疫反応に包含）を利用することも可能である
。

【００１４】標識に起因した信号は、吸光度法（比色法
）　、螢光法または発光法で検出することができ、測定
法としては信号の経時的変化を測定するレート測定法ま
たは一定時間後の信号を測定するエンドポイント測定法
で測定することができる。好ましくは吸光度法であり、
吸光度法（比色法）　では紫外線、可視光、近赤外光を
利用することができ、例えば流体試料として血清及び血
漿を用いる場合には、血清及び血漿による吸光の影響を
小さくするために緑色光、赤色光または近赤外光を利用
するのが好ましい。

【００１５】

【実施例】以下、実施例により具体的に説明するが、本
発明は実施例によって限定されるものではない。〔実施例１〕ヒツジ由来の抗ＡＦＰ抗体を１００μｇ／
ｍｌの濃度で緩衝液（１００ｍＭの炭酸ソーダ、１５０
ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ１１．０）１０ｍｌに溶解し、抗
ＡＦＰ抗体を含有する緩衝液を用意する。

【００１６】この抗ＡＦＰ抗体含有緩衝液を、２００個
のポリスチレンビーズ（積水化学＃８０）が入れられて
いる上記と同じ緩衝液９０ｍｌに２時間かけて滴下する
。尚、この滴下の間攪拌操作が行われている。この後、
４℃の条件下で同様な攪拌が１８時間行われる。そして
、ＰＢＳで２回洗浄し、その後１％ＢＳＡ−ＰＢＳ中に
おいて３７℃の条件下で１時間ブロッキングが行われる
。

【００１７】〔比較例１〕ヒツジ由来の抗ＡＦＰ抗体を
１０μｇ／ｍｌの濃度で緩衝液（１００ｍＭの炭酸ソー
ダ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ１１．０）１００ｍｌ
に溶解し、この中に２００個のポリスチレンビーズを入
れ、４℃の条件下で攪拌を２０時間行う。〔免疫測定〕上記各例で得たポリスチレンビーズ１個、
５０μｇ／ｍｌの濃度のＡＦＰ標準液５０μｌ及び１％
ＢＳＡ−ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの濃度のヒツジ由来の抗
ＡＦＰ抗体ペルオキシダーゼ標識体２００μｌを試験官
中に添加し、３７℃の条件下で１時間インキュベートす
る。そして、ＰＢＳで３回ポリスチレンビーズを洗浄後
、０．０３％のＨ２　Ｏ２　と３ｍｇ／ｍｌのｏ−フェ
ニレンジアミンを含む１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ
６．０）０．３ｍｌを加え、室温で３０分間発色させた
。その後、１Ｎの硫酸１ｍｌで発色反応を停止し、４９
２ｎｍの吸光度を測定した。

【００１８】各々のものについてｎ＝１００で測定し、
変動係数ＣＶを求めたので、その結果を下記の表に示す
。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　表　　　　　　　　　　　　　　　　　　平均吸
光度　　　　　　標準偏差　　　　　　　　変動係数　
　　　実施例１　　　　　　０．２３８　　　　　　０
．００８１　　　　３．４％　　　　　　比較例１　　
　　　　０．１８５　　　　　　０．００９８　　　　
５．３％　　これによれば、本発明により得られる抗体
（又は抗原）が固定化された担体を用いての免疫測定法
は、変動係数が格段に小さく、流体試料中の特定成分を
正確に、感度がより高く定量できることが判る。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　免疫学的反応物質を担体に固定化する
固定化担体を製造する方法であって、緩衝液と担体とが
存在する中に免疫学的反応物質を徐々に添加することを
特徴とする固定化担体の製造方法。
【請求項２】　　免疫学的反応物質を約１時間以上かけ
て徐々に添加することを特徴とする請求項１の固定化担
体の製造方法。