JP2816767B2

JP2816767B2 - 固定化抗体の製造方法

Info

Publication number: JP2816767B2
Application number: JP40066590A
Authority: JP
Inventors: 孝阪口
Original assignee: Konica Minolta Inc
Current assignee: Konica Minolta Inc
Priority date: 1990-12-06
Filing date: 1990-12-06
Publication date: 1998-10-27
Anticipated expiration: 2013-10-27
Also published as: JPH04213060A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、固定化抗体の製造方法
に関するものである。

【０００２】

【発明の背景】生物学的流体試料中に極微量含有される
物質を検出する方法として、各種の分析法が開発されて
来ている。この分析法の一つとして、免疫反応をその原
理とするものがある。そして、この原理を用いた測定法
として種々のものが開発され、精度の高いものとして知
られている。

【０００３】すなわち、１９５８年にベルソン（Ｂｅｒ
ｓｏｎ）とイアロウ（Ｙａｌｌｏｗ）が、放射性同位元
素Ｉで標識した牛インシュリンと糖尿病患者血清中の抗
インシュリン抗体を用いて、血清中のインシュリンを測
定することに成功して以来、ラジオアイソトープを用い
た免疫測定法が広く用いられて来た。尚、これ以後、標
識物質として放射性同位元素以外のものも種々開発され
て来た。例えば、酵素、酵素基質、補酵素、酵素阻害物
質、バクテリオファージ、循環反応体、金属及び有機金
属の錯体、有機補欠分子族、化学発光性反応体及び螢光
性分子等が挙げられる。

【０００４】一般に、免疫測定法には不溶性担体に固定
化された抗体が用いられている。この固定化抗体の製造
方法としては、不溶性担体のアミノ基やカルボキシル基
などと架橋剤を介して不溶性担体と抗体とを共有結合さ
せる方法、不溶性担体のマトリックス中に固定する方
法、あるいは不溶性担体に物理吸着させる方法などが有
る。尚、共有結合させる方法では、抗体が不溶性担体に
強固に結合するという利点が有るが、反応時に抗体に悪
影響を与えやすいこと、操作が面倒なこと等から、簡単
な操作で固定化抗体の得られる物理吸着方法が主に用い
られている。

【０００５】この物理吸着方法の一般的な操作方法とし
ては、例えば抗体溶液中に不溶性担体を浸漬して、例え
ば４℃で一晩、あるいは２５℃で数時間反応させる方法
が用いられている。ところで、この固定化抗体の具備す
べき条件として、特異性が高く、抗体固定量が大で高活
性であり、さらには不溶性担体への抗体固定量が一定で
あることが望まれる。

【０００６】抗体固定量を大とすべく方法として、抗体
の表面を粗くして表面積を増加させる手段（特開昭５８
−７０１６４号公報）、放射線を照射して表面の性質を
改善することで吸着量を増加させる手段（特開昭６０−
２６０８５７号公報）が提案されており、又、抗体を固
定化する際、抗体を部分変性させる為ｐＨ２．５で短時
間処理したり、グアニジンやチオシアン酸イオン、尿素
などの変性剤で前処理してから固定することにより測定
感度を向上させる方法が提案されている。

【０００７】しかしながら、不溶性担体への抗体固定量
を一定とすべく技術は提案されていない。そして、不溶
性担体への抗体固定量にバラツキがある為、同一のサン
プルを測定しても測定値にバラツキが認められ、再現性
に問題が有る。

【０００８】

【発明の開示】本発明の目的は、不溶性担体への抗体固
定量のバラツキを少なくし、もって試料中の特定成分を
再現性良く定量できる技術を提供することである。この
本発明の目的は、抗体溶液中に不溶性担体を浸漬して該
抗体を該不溶性担体に固定化する固定化抗体の製造方法
であって、該抗体溶液中に１乃至１．５Ｍの濃度の塩化
ナトリウムが含有されることを特徴とする固定化抗体の
製造方法によって達成される。

【０００９】本発明の固定化抗体で測定される試料とし
ては、あらゆる形態の溶液やコロイド溶液などが使用し
うるが、好ましくは生物由来の流体試料、例えば血液、
血漿、血清、脳脊髄液、唾液、羊水、乳、尿、汗、肉汁
等が挙げられる。流体試料中の測定成分としては、ポリ
ペプチド、酵素（エラスターゼ、アミラーゼ、プロテア
ーゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、アルカリフォスフ
ォダーゼ等）、蛋白質、血清蛋白質（ＩｇＧ、ＩｇＡ、
ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、糖蛋白質、β₂−マイクログ
ロブリン、ＴＧＤ等）、多糖類、脂質、複合脂質、核
酸、ホルモン類（インシュリン、ＨＣＧ−β、成長ホル
モン、ＴＳＨ、ＬＨ、ＦＳＨ、プロラクチン、サイロキ
シン、トリヨードサイロニン、ガストリン、グルカゴ
ン、ソマトスタチン等）、腫瘍関連抗原（ＣＥＡ、α−
フェトプロテイン、フェリチン、ＰＯＡ、ＣＡ１９−
９、ＣＡ１２５、癌関連ヒトガラクトシルトランスフェ
ラーゼ（ＧＡＴ）等）、ＤＮＡ結合性蛋白質因子、サイ
トカイン（インターフェロン、インターロイキン−１、
インターロイキン−２等）、種々の細菌、ウィルス、原
虫（真菌、連鎖球菌、肝炎ウィルス、ヘルペスウィル
ス、エイズウィルス、トキソプラズマ原虫、マラリア原
虫、赤痢アメーバー等）、ビタミン類、薬剤、抗生物
質、農薬等が挙げられる。具体的には、特開昭６２−９
０５３９号公報や特開昭６３−１３１０６２号公報に記
載の物質（物質群）を挙げることができるが、これらに
限定されるものではない。

【００１０】本発明で作製された固定化抗体による免疫
測定方法の反応型式としては、競合法、２抗体法、サン
ドイッチ法などが挙げられるが、特に限定はされない。
本発明で使用される抗体は、その由来を特に限定される
ものではなく、哺乳動物等に抗原を投与、免疫して得ら
れる抗血清、腹水液をそのままか、あるいは従来公知の
方法である硫酸ナトリウム沈澱法、硫酸アンモニウム沈
澱法、セファデックスゲルによるゲル濾過法、イオン交
換セルロースクロマトグラフィ法、電気泳動法等（右田
俊介編「免疫化学」中山書店ｐｐ７４ないし８８参照）
で精製して用いることができる。

【００１１】あるいは、抗原で感染した哺乳動物など
（例えばマウス）の脾臓細胞や骨髄腫細胞（ミエロー
マ）から雑種細胞（ハイブリドーマ）を得てモノクロー
ナル抗体を作成し、これを特定成分と特異的に結合しう
る物質として使用すると特異性が向上し、好ましい。
又、これらの抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、
ＩｇＥ各分画を用いることができ、或いはこれらの抗体
を酵素処理してＦａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）₂と
いった活性抗体フラグメントにして使用しても良い。さ
らに、これらの抗体は単一で使用しても、複数の抗体を
組み合わせて使用しても良い。尚、本発明においては、
これらの抗体フラグメントも抗体と言う文言に含めて述
べる。

【００１２】又、抗体はポリクローナル抗体でもモノク
ローナル抗体いずれのものでも用いられるが、モノクロ
ーナル抗体であることが好ましい。抗体を結合させる不
溶性担体としては、ビーズ（粒状体）、マイクロスフィ
アー、スティック、試験管、フィルム、マイクロプレー
トあるいはメンブレン等があるが、粒状体の形態である
ものが好ましい。

【００１３】不溶性担体の材料としては、アガロース、
セルロース、架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、
セルロース、微結晶セルロース、架橋アガロース、架橋
ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリエステル、ポ
リエチレン、ポリプロピレン、ＡＢＳ樹脂、ポリフッ化
ビニル、ポリアミンメチルビニルエーテル−マレイン酸
共重合体、６−ナイロン、６，６−ナイロン等の合成あ
るいは天然の有機樹脂、ガラス、シリカゲル、ケイ藻
土、二酸化チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、
ケイ砂などの各種の無機質材料、そのほか多孔質の素
材、さらには磁性微粒子が利用できる。

【００１４】好ましくはアガロース、架橋アガロース、
架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、架橋ポリアク
リルアミド、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、セル
ロース、微結晶セルロース等であり、更に好ましくはポ
リアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ポリスチ
レン、微結晶セルロース等である。上記不溶化担体は数
種を混合して用いても良い。

【００１５】抗体は、これら不溶化担体に、化学的及び
／又は物理的に直接、あるいは間接的に結合させること
ができる。結合法については１９７６年、講談社発行、
千畑一郎ほか２名編「実験と応用アフィニティクロマト
グラフィー」（第１刷）、１９７５年、講談社発行、山
崎誠ほか２名編「アフィニティクロマトグラフィー」
（第１版）を参考にできる。

【００１６】そして、抗体溶液中に不溶性担体を浸漬し
て抗体を不溶性担体に固定化するに際して、この抗体溶
液中に１乃至１．５Ｍの濃度の塩化ナトリウムが含有さ
れていることが大事である。すなわち、抗体を不溶性担
体に固定化するに際して、抗体溶液中に１乃至１．５Ｍ
の濃度の塩化ナトリウムが添加されていると、抗体の不
溶性担体への固定量が均一になり、測定値のバラツキが
少なくなり、例えば変動係数（ＣＶ）が６％以内に抑え
られ、正確な測定が行えるようになったのである。

【００１７】尚、この抗体溶液のｐＨは８．５乃至１
０．０であることが好ましい。このような範囲のｐＨと
する為には緩衝液が用いられる。例えば、リン酸緩衝
液、フタル酸水素緩衝液、リン酸二水素カリウム−硼砂
緩衝液、リン酸二ナトリウム−クエン酸緩衝液、ベロナ
ール緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、炭酸塩緩衝液、ホウ
酸緩衝液、Ｇｏｏｄの緩衝液などが有る。

【００１８】上記のようにして得られた固定化抗体に対
しては、さらに溶液中で加熱処理を行っても良い。尚、
この加熱処理は、固定化抗体を抗体溶液から取り出して
から直接に、又は、固定化抗体を抗体溶液から取り出し
てから洗浄後１％程度のＢＳＡ−ＰＢＳ溶液に浸漬し、
洗浄した後に行っても良い。加熱処理の程度は、３０℃
乃至８０℃の間で行うことが好ましく、時間は１時間乃
至数日間、中でも２乃至２４時間程度である。又、この
加熱処理はｐＨ６乃至８の緩衝液が用いられた溶液中で
行われることが好ましい。

【００１９】免疫反応に用いられる標識体としては、例
えば、酵素、酵素基質、酵素及び酵素前駆体の活性を変
化させる物質（酵素阻害物質、補欠分子族、補酵素）、
酵素前駆体、アポ酵素、螢光物質、放射性同位元素など
が用いられる。具体的な物質としては、特開昭６２−９
０５３９号公報などに記載のものが挙げられるが、好ま
しくは酵素、又は螢光物質（フルオレセインイソチオシ
アネートやローダミン等）であり、さらに好ましくはβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスフォダーゼ、ペ
ルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタメー
トデヒドロゲナーゼ、アミラーゼなどの酵素である。

【００２０】これらの酵素を標識物質とする場合、酵素
反応系、発色系は公知のものを使用できる。具体的に
は、特開昭６１−２９２０６０号公報、特開昭６２−９
０５３９号公報、特開昭６３−１３１０６２号公報、特
開昭６３−４５５６２号公報、特願昭６３−２１９８９
３号明細書に記載の物質（物質群）が挙げられるが、こ
れらに限定されるものではない。

【００２１】そして、これら標識物質の抗体（抗原）へ
の結合は、当業者間で知られている公知の試薬と方法で
行うことができ、例えば石川栄治、河合忠、宮井
潔編「酵素免疫測定法（第２版）、医学書院、１９７８
年」や日本臨床病理学会編「臨床病理」臨時増刊特集第
５３号「臨床検査の為のイムノアッセイ−技術と応用
−、臨床病理刊行会、１９８３年」などに記載された方
法を参考にすることができる。

【００２２】標識抗体又は抗原の非特異的反応を排除す
る目的で、測定すべき特異的反応に関与しない蛋白質を
担持することが可能である。それらの代表的な例として
は、哺乳動物の正常血清蛋白質、アルブミン、スキムミ
ルク、乳酸醗酵物、コラーゲン、ゼラチン及びそれらの
分解物等が挙げられる。

【００２３】

【実施例】以下、本発明を実施例によって更に具体的に
説明するが、本発明はこれら実施例によって限定される
ものではない。癌関連ヒトガラクトシルトランスフェラ
ーゼ（ＧＡＴ）に対するマウスモノクロナール抗体（Ｉ
ｇＭ）を、１Ｍの塩化ナトリウムを溶解した０．１Ｍ炭
酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）に１０μｇ／ｍｌになるよう
溶解し、そしてこの中にポリスチレンビーズ（積水化学
社製の＃８０）を浸漬し、４℃で一晩かけることにより
固定化し、固定化抗体１（本発明）を得た。

【００２４】尚、マウス抗ＧＡＴ抗体は、特願平２−５
４５６７号明細書記載の方法（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅ
ａｒｃｈ４８巻５３２５頁１９８８年に記載の方
法）に従い癌患者の腹水から精製したＧＡＴを抗原とし
てマウスを免疫して得られた脾臓細胞を用い、常法に従
って細胞融合により抗ＧＡＴモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマを得たものである。

【００２５】又、１．５Ｍの塩化ナトリウムを溶解した
ものを用いて上記と同様に行い、固定化抗体２（本発
明）を得た。又、上記において、塩化ナトリウムを全く
添加していないものを用いて同様に行い、固定化抗体３
（比較例）を得た。又、０．５Ｍの塩化ナトリウムを溶
解したものを用いて上記と同様に行い、固定化抗体４
（比較例）を得た。

【００２６】そして、上記固定化抗体１乃至固定化抗体
４各々をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した
後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液に３７℃で２４時間浸漬
し、その後４℃で保存した。これらの固定化抗体１乃至
固定化抗体４を、１０Ｕ／ｍｌ、３０Ｕ／ｍｌ、９０Ｕ
／ｍｌのＧＡＴ標準液０．０５ｍｌと１Ｍ塩化ナトリウ
ムを溶解した５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）０．
２ｍｌを混合した液の中に入れ、３７℃で２時間インキ
ュベートした。

【００２７】次に、ＰＢＳで洗浄後、固定化抗体とは違
う部位を認識するペルオキシダーゼ標識抗ＧＡＴモノク
ローナル抗体の１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液（０．５μｇ／
ｍｌ）を０．２５ｍｌ加え、室温で１時間インキュベー
トした。この後、ＰＢＳで洗浄し、０．０２％Ｈ₂Ｏ₂
及び３ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミン溶液０．３
ｍｌを加え、室温で３０分間かけて発色させ、その後１
Ｎの硫酸１ｍｌを添加して発色反応を停止し、４９２ｎ
ｍの吸光度を測定した。

【００２８】各々の濃度の標準液について、ｎ＝２５で
測定し、変動係数（ＣＶ）を求めた。１０Ｕ／ｍｌのＧ
ＡＴ標準液が用いられた場合において、固定化抗体１の
場合の変動係数は５．５％、固定化抗体２の場合の変動
係数は５．０％であるのに対して、固定化抗体３の場合
の変動係数は７．８％、固定化抗体４の場合の変動係数
は６．３％であり、抗体溶液中に不溶性担体を浸漬して
抗体を不溶性担体に固定化するに際し、抗体溶液中に１
乃至１．５Ｍの濃度の塩化ナトリウムが含有される本発
明になるものは、測定のバラツキが少なく、再現性に優
れていることが窺える。

【００２９】又、３０Ｕ／ｍｌのＧＡＴ標準液が用いら
れた場合において、固定化抗体１の場合の変動係数は
４．４％、固定化抗体２の場合の変動係数は５．２％で
あるのに対して、固定化抗体３の場合の変動係数は６．
１％、固定化抗体４の場合の変動係数は６．０％であ
り、抗体溶液中に不溶性担体を浸漬して抗体を不溶性担
体に固定化するに際し、抗体溶液中に１乃至１．５Ｍの
濃度の塩化ナトリウムが含有される本発明になるもの
は、測定のバラツキが少なく、再現性に優れていること
が窺える。

【００３０】又、９０Ｕ／ｍｌのＧＡＴ標準液が用いら
れた場合において、固定化抗体１の場合の変動係数は
３．７％、固定化抗体２の場合の変動係数は４．５％で
あり、抗体溶液中に不溶性担体を浸漬して抗体を不溶性
担体に固定化するに際し、抗体溶液中に１乃至１．５Ｍ
の濃度の塩化ナトリウムが含有される本発明になるもの
は、測定のバラツキが少なく、再現性に優れていること
が窺える。

【００３１】

【効果】本発明によれば、不溶性担体への抗体固定量の
バラツキが少なくなり、もって試料中の特定成分を再現
性良く定量できる。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】抗体溶液中に不溶性担体を浸漬して該抗
体を該不溶性担体に固定化する固定化抗体の製造方法で
あって、該抗体溶液中に１乃至１．５Ｍの濃度の塩化ナ
トリウムが含有されることを特徴とする固定化抗体の製
造方法。
【請求項２】特許請求の範囲第１項記載の固定化抗体
の製造方法において、抗体溶液のｐＨが８．５乃至１
０．０であるもの。