JPH0560760A

JPH0560760A - 癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素標準液

Info

Publication number: JPH0560760A
Application number: JP22625591A
Authority: JP
Inventors: Takashi Sakaguchi; 孝阪口
Original assignee: Konica Minolta Inc
Current assignee: Konica Minolta Inc
Priority date: 1991-09-05
Filing date: 1991-09-05
Publication date: 1993-03-12

Abstract

(57)【要約】【目的】感染性の問題が少なく、安全で、コストが
低く、安定に調製でき、ＧＡＴの精度良い正確な測定を
可能とする標準液を提供することである。【構成】免疫測定法により癌関連ヒト由来ガラクト
ース転移酵素を測定するに際して使用される標準液であ
り、癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素標準物質をウ
マ血清で希釈することによって製造されてなる標準液。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫測定法により癌関
連ヒト由来ガラクトース転移酵素を測定するに際して用
いられる標準液に関するものである。

【０００２】

【発明の背景】生物学的流体試料中に極微量含有される
物質を検出する方法として、各種の分析法が開発されて
来ている。この分析法の一つとして、免疫反応をその原
理とするものがある。そして、この原理を用いた測定法
として種々のものが開発され、精度の高いものとして知
られている。

【０００３】すなわち、１９５８年にＢｅｒｓｏｎとＹ
ａｌｌｏｗが、放射性同位元素Ｉで標識した牛インシュ
リンと糖尿病患者血清中の抗インシュリン抗体を用い
て、血清中のインシュリンを測定することに成功して以
来、ラジオアイソトープを用いた免疫測定法が広く用い
られて来た。そして、これ以後、標識物質として放射性
同位元素以外のものも種々開発されて来た。例えば、酵
素、酵素基質、補酵素、酵素阻害物質、バクテリオファ
ージ、循環反応体、金属及び有機金属の錯体、有機補欠
分子族、化学発光性反応体及び螢光性分子等が挙げられ
る。

【０００４】ところで、癌関連ヒト由来ガラクトース転
移酵素（以下、ＧＡＴと称す）は、特願平１−４４７６
号及び特願平２−５４５６７号に記載の酵素であり、癌
マーカーとしてその有用性が示唆されている。このＧＡ
Ｔは、代表的には、酵素標識サンドウィッチアッセイで
測定される。検体測定には、ＧＡＴ標準物質を測定し、
その結果から検量線を作成し、検体中のＧＡＴ値はこれ
を基にして算定される。

【０００５】ＧＡＴ標準液は、ＧＡＴ標準物質を希釈液
により適当な濃度に希釈されて調製される。ＧＡＴを正
確に測定するには、標準液の挙動が検体と異ならないこ
と、標準液の値が検体にあわせたＧＡＴ値をカバーでき
ることが重要である。又、標準液はできるだけロット間
差の無い安定な調製・供給が望まれ、その為にはできる
だけＧＡＴの値が高く、入手しやすい標準物資の使用が
必要である。

【０００６】このＧＡＴ標準液としては、ＧＡＴ標準物
質として人癌患者血清又は人癌患者腹水が用いられ、こ
れを人血清で希釈したものが調製・使用されていた。こ
の場合、標準液の挙動は検体と同じであるが、希釈液と
して用いる人血清には、感染性の問題や、大量に集める
ための手間、コストの問題があり、又、人血清中には正
常人においてもＧＡＴが全く含まれないわけでは無い
為、ＧＡＴを含まない０の標準液を調製することが困難
である等の問題もあった。又、希釈液としてリン酸緩衝
生理食塩水（以下、ＰＢＳと称す）や１％ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓを用いた場合は、感染性やコストの問題は無いもの
の、挙動が検体と合わなくなり、ＧＡＴの正確な測定が
できなくなるという問題があった。

【０００７】又、標準物質として用いる患者血清、腹水
についても、ＧＡＴ高値のものは少なく、これを大量に
集めることは困難で、品質の安定した標準液の供給には
問題があった。又、感染性の問題もあった。

【０００８】

【発明の開示】本発明者は、鋭意検討の結果、希釈液と
して馬血清を用いることにより、検体と挙動が同じ標準
液を調製可能なこと、又、ヒト初乳が極めて高いＧＡＴ
値を示すことを見出し、これに基づいて本発明が達成さ
れた。この本発明の第１の目的は、感染性の問題の少な
い安全な標準液を提供することである。

【０００９】本発明の第２の目的は、コストが低く、安
定に調製できる標準液を提供することである。本発明の
第３の目的は、ＧＡＴの精度が良い正確な測定を可能と
する為、検体と同じ挙動を示し、かつ、低値から高値を
カバーできる標準液を安定に提供することである。

【００１０】上記本発明の目的は、希釈液としてウマ血
清を用いることによって達成される。又、ＧＡＴ標準物
質としてヒト初乳を用いることによって達成される。す
なわち、免疫測定法により癌関連ヒト由来ガラクトース
転移酵素を測定するに際して使用される標準液であり、
癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素標準物質をウマ血
清で希釈することによって製造されてなる標準液によっ
て達成される。

【００１１】又、免疫測定法により癌関連ヒト由来ガラ
クトース転移酵素を測定するに際して、ヒト初乳をヒト
血清又はウマ血清で希釈することによって製造されてな
る標準液によって達成される。尚、標準物質としてヒト
癌患者腹水、ヒト血清、ヒト乳汁、ヒト初乳、遺伝子工
学による産物の群から選択されたものを用いることがで
きる。

【００１２】本発明で用いられる希釈液としてはウマ血
清が挙げられる。ウマ血清を希釈液として用いたＧＡＴ
標準液は、検体（ヒト血清）と同じ挙動を示す。この挙
動は、添加回収試験を行うことによって確認できる。ウ
マ血清についてＧＡＴの測定を行ったところ、その値は
０であり、０ユニットの標準液を調製できたことから、
ヒト血清と比べて有利である。ウマ血清を希釈液として
用いた場合、ＧＡＴ標準物質として従来の癌患者血清、
癌患者腹水が使用できる。又、その他の物質、例えばヒ
ト乳汁、ヒト初乳、ＧＡＴ遺伝子産物が使用できる。ヒ
ト初乳、遺伝子産物は安全性の面から有利である。ヒト
初乳は、一般に、ＧＡＴ値が高く、特に好ましい。遺伝
子産物は特願平２−３０９９１８号に記載の方法に従っ
て得ることができる。

【００１３】本発明で用いられるＧＡＴ標準物質として
好ましい例としては、ヒト初乳である。一般に３０００
ユニット／ｍｌ以上（正常人の平均は１０ユニット／ｍ
ｌ以下）の高値を示し、標準液の調製に有利である。こ
れを用いて標準物質を調製する際、使用できる希釈液と
しては、検体と挙動を同じくするという意味から、ヒト
血清またはウマ血清が使用できる。安全性、コスト等の
面からウマ血清の方がより好ましい。

【００１４】免疫測定法に用いられる抗体が物理的及び
／又は化学的に結合される担体は多孔質なものであるこ
とが好ましく、このような担体の材料としてはケイ藻
土、二酸化チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、
微結晶セルロース、ケイ砂、ガラス、シリカゲル、架橋
デキストリン、架橋ポリアクリルアミド、アガロース、
架橋アガロース、ポリスチレン等の各種の合成樹脂が挙
げられる。そして、このような素材の多孔質担体であれ
ば、抗体が固定化される一次的な形状は粒子（ビーズ）
状、棒状あるいはプレート状のものであっても差し支え
ないが、粒子（ビーズ）状のものが好ましい。

【００１５】抗体は、これら多孔質の不溶化担体に化学
的及び／又は物理的に直接、あるいは間接的に結合させ
ることができる。結合技術については、１９７６年、講
談社発行、千畑一郎ほか２名編「実験と応用アフィニ
ティクロマトグラフィー」（第１刷）、１９７５年、講
談社発行、山崎誠ほか２名編「アフィニティクロマト
グラフィー」（第１版）を参考にできる。尚、結合反応
後、標識抗体の非特異反応を排除する目的で、測定すべ
き特異的反応に関与しない蛋白質を担持させることがで
きる。それらの代表的な例としては、哺乳動物及び鳥類
の正常血清蛋白質、アルブミン、スキムミルク、乳酸醗
酵物、コラーゲン及びそれらの分解物質等が挙げられ
る。

【００１６】免疫測定方法において用いられる標識物質
としては通常の免疫測定法で一般に使用できるものが使
用でき、例えば放射性物質、発光物質、蛍光物質などが
挙げられ、又、酵素、酵素基質、酵素及び酵素前駆体の
活性を変化させる物質（酵素阻害物質、補欠分子族、補
酵素）、酵素前駆体、アポ酵素なども使用できる。具体
的な物質としては、特開昭６２−９０５３９号公報など
に記載のものが挙げられるが、好ましくは酵素、又は螢
光物質であり、さらに好ましくはβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ、アルカリホスフォダーゼ、ペルオキシダーゼ、グ
ルコースオキシダーゼ、グルタメートデヒドロゲナー
ゼ、アミラーゼなどの酵素である。これらの酵素を標識
物質とする場合、酵素反応系、発色系は公知のものを使
用できる。具体的には、特開昭６１−２９２０６０号公
報、特開昭６２−９０５３９号公報、特開昭６３−１３
１０６２号公報、特開昭６３−４５５６２号公報、特願
昭６３−２１９８９３号明細書に記載の物質（物質群）
が挙げられるが、これらに限定されるものではない。そ
して、これら標識物質の抗体への結合は、当業者間で知
られている公知の試薬と方法で行うことができ、例えば
石川栄治、河合忠、宮井潔編「酵素免疫測定法
（第３版）、医学書院、１９８７年」や日本臨床病理学
会編「臨床病理」臨時増刊特集第５３号「臨床検査の為
のイムノアッセイ−技術と応用−、臨床病理刊行会、１
９８３年」などに記載された方法を参考にすることがで
きる。

【００１７】本発明で使用される抗体は、その由来を特
に限定されるものではなく、哺乳動物等に抗原を投与、
免疫して得られる抗血清、腹水液をそのままか、あるい
は従来公知の方法である硫酸ナトリウム沈澱法、硫酸ア
ンモニウム沈澱法、セファデックスゲルによるゲル濾過
法、イオン交換セルロースクロマトグラフィ法、電気泳
動法等（右田俊介偏「免疫化学」中山書店ｐｐ７４ない
し８８参照）で精製して用いることができる。あるい
は、抗原で感作した哺乳動物など（例えばマウス）の脾
臓細胞や骨髄腫細胞（ミエローマ）から雑種細胞（ハイ
ブリドーマ）を得てモノクローナル抗体を作成し、これ
を特定成分と特異的に結合しうる物質として使用すると
特異性が向上し、好ましい。又、これらの抗体はＩｇ
Ｇ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ各分画を用いるこ
とができ、或いはこれらの抗体を酵素処理してＦａｂ、
Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）₂といった活性抗体フラグメ
ントにして使用しても良い。さらに、これらの抗体は単
一で使用しても、複数の抗体を組み合わせて使用しても
良い。

【００１８】免疫測定方法による反応型式としては、競
合法、２抗体法、サンドイッチ法などが挙げられる。本
発明においては反応型式として免疫反応を挙げている
が、免疫反応に準ずる生物活性を示す物質の特異反応を
利用することも可能である。標識に起因した信号は、吸
光度法（比色法) 、螢光法、発光法または放射活性測定
法で検出することができ、測定法としては信号の経時的
変化を測定するレート測定法または一定時間後の信号を
測定するエンドポイント測定法で測定することができ
る。好ましくは吸光度法であり、吸光度法（比色法) で
は紫外線、可視光、近赤外光を利用することができる。

【００１９】

【実施例】以下、実施例により具体的に説明するが、本
発明は実施例によって限定されるものではない。〔実施例１〕癌患者腹水を３００Ｕ／ｍｌとし、これら
を下記の希釈液で１／３０、１／１０及び１／３に希釈
し、各々１０Ｕ／ｍｌ、３０Ｕ／ｍｌ及び１００Ｕ／ｍ
ｌの標準液を作製した。又、各々の希釈液そのものを０
Ｕ／ｍｌとした。

【００２０】そして、以下の免疫学的測定法により吸光度とＧＡＴ
濃度（Ｕ／ｍｌ）との関係を調べた。

【００２１】すなわち、特願平２−５４５６７号に記載
の方法で得られたＧＡＴに対するマウスモノクローナル
抗体を１Ｍの塩化ナトリウムを溶解した０．１Ｍ炭酸塩
緩衝液（ｐＨ９．５）に１０μｇ／ｍｌになるように溶
解し、この中に直径６．３５ｍｍのポリスチレンビーズ
（積水化学社製の＃８０）を浸漬し、４℃で一晩固定化
した。ＰＢＳで洗浄した後、３７℃の１％ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓ溶液に２４時間浸漬し、その後該溶液を良く切り、−
４０℃で該ビーズを凍結し、凍結乾燥した。

【００２２】そして、ポリスチレンビーズを検体または
標準液５０μｌと１Ｍの塩化ナトリウムを溶解した５０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）２００μｌとを混合し
た液の中に入れ、４５℃で２時間インキュベーションし
た。ＰＢＳで洗浄後、固定化抗体とは異なる部位を認識
するペルオキシダーゼ標識抗ＧＡＴモノクローナル抗体
の０．００２％ｐ−ヒドロキシ安息香酸−ｎ−ブチル含
有１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液（０．５μｇ／ｍｌ）２５０
μｌを加え、室温で１時間インキュベーションした。
尚、抗ＧＡＴモノクローナル抗体のペルオキシダーゼ標
識化は、石川栄治、河合忠、宮井潔編「酵素免疫
測定法（第３版）、医学書院、１９８７年」ｐｐ１０
８，１０９記載の方法で行った。

【００２３】ＰＢＳで洗浄後、３ｍｇ／ｍｌのｏ−フェ
ニレンジアミンを溶解したクエン酸−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ５．００．０２％過酸化水素含有）３００μｌを加
え、室温で３０分間発色させた。その後、１Ｎ硫酸１ｍ
ｌで発色反応を停止し、４９２ｎｍの吸光度を測定した
ので、その結果を表１〜表４（表１〜表４において、癌
患者血清と標準液との混合割合は１対１である）に示
す。

【００２４】表１（希釈液がウマ血清）吸光度ＯＤ濃度（Ｕ／ｍｌ）実測値理論値０Ｕ／ｍｌ０．００８１０Ｕ／ｍｌ０．２０２３０Ｕ／ｍｌ０．５９５１００Ｕ／ｍｌ１．９７２癌患者血清０．７９５４０．０癌患者血清＋０Ｕ／ｍｌ０．４０２２０．１２０．０癌患者血清＋１０Ｕ／ｍｌ０．４９５２４．８２５．０癌患者血清＋３０Ｕ／ｍｌ０．６９１３４．７３５．０癌患者血清＋１００Ｕ／ｍｌ１．３９５７０．６７０．０表２（希釈液がＰＢＳ）吸光度ＯＤ濃度（Ｕ／ｍｌ）実測値理論値０Ｕ／ｍｌ０．００５１０Ｕ／ｍｌ０．２７５３０Ｕ／ｍｌ０．７８３１００Ｕ／ｍｌ２．３１１癌患者血清０．７９５３０．５癌患者血清＋０Ｕ／ｍｌ０．４３２１６．２１５．３癌患者血清＋１０Ｕ／ｍｌ０．５８２２２．１２０．３癌患者血清＋３０Ｕ／ｍｌ０．８６５３３．８３０．３癌患者血清＋１００Ｕ／ｍｌ１．６８６７１．４６５．３表３（希釈液が５％ＢＳＡ−ＰＢＳ）吸光度ＯＤ濃度（Ｕ／ｍｌ）実測値理論値０Ｕ／ｍｌ０．０２７１０Ｕ／ｍｌ０．２３６３０Ｕ／ｍｌ０．６３７１００Ｕ／ｍｌ２．０６０癌患者血清０．７９５３７．８癌患者血清＋０Ｕ／ｍｌ０．４３８２０．１１８．９癌患者血清＋１０Ｕ／ｍｌ０．５５２２５．８２３．９癌患者血清＋３０Ｕ／ｍｌ０．７６１３６．１３３．９癌患者血清＋１００Ｕ／ｍｌ１．５２９７３．９６８．９表４（希釈液がウシ血清）吸光度ＯＤ濃度（Ｕ／ｍｌ）実測値理論値０Ｕ／ｍｌ０．０１８１０Ｕ／ｍｌ０．２４１３０Ｕ／ｍｌ０．６４８１００Ｕ／ｍｌ２．０４２癌患者血清０．７９５３７．４癌患者血清＋０Ｕ／ｍｌ０．４４８２０．２１８．７癌患者血清＋１０Ｕ／ｍｌ０．５５４２５．４２３．７癌患者血清＋３０Ｕ／ｍｌ０．７８３３６．８３３．７癌患者血清＋１００Ｕ／ｍｌ１．５１４７３．５６８．７表１より、ＧＡＴ標準物質の希釈液としてウマ血清が用
いられた場合には、実測値と理論値との差は少なく、Ｇ
ＡＴに対するヒト血清とウマ血清とは同質の特性を有し
ていることが判る。従って、ＧＡＴ標準物質の希釈液と
してウマ血清を用いても差し支えない。さらには、この
ウマ血清は、同一ロットのものを大量に集めることも容
易であり、かつ、ＧＡＴを全く含まない０の標準液を得
ることも出来、又、感染性の問題もなく、そしてコスト
の問題も少ない。

【００２５】これに対して、表２、表３及び表４より、
ＧＡＴ標準物質の希釈液としてＰＢＳ、ＢＳＡ−ＰＢＳ
及びウシ血清では、ヒト血清のような問題はないもの
の、実測値と理論値との差が大きく、これらの希釈液は
ヒト血清と差が有り過ぎ、ＧＡＴ標準物質の希釈液とし
ては有効でないことが判る。〔実施例２〕ヒト初乳を５４００Ｕ／ｍｌとし、これら
をウマ血清で１／５４０、１／１８０、１／５４に希釈
し、各々１０Ｕ／ｍｌ、３０Ｕ／ｍｌ及び１００Ｕ／ｍ
ｌの標準液を作製した。又、ウマ血清そのものを０Ｕ／
ｍｌとした。

【００２６】同様にヒト初乳をヒト正常人血清で１／５
４０、１／１８０、１／５４に希釈した標準液について
も調製した。（各々Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３とする）そして、
実施例１と同様の測定を行い、吸光度とＧＡＴ濃度（Ｕ
／ｍｌ）との関係を調べた。その結果を表５（表５にお
いて、癌患者血清と標準液との混合割合は１対１であ
る）に示す。

【００２７】表５吸光度ＯＤ濃度（Ｕ／ｍｌ）実測値理論値０Ｕ／ｍｌ０．０１２１０Ｕ／ｍｌ０．２１５３０Ｕ／ｍｌ０．６２１１００Ｕ／ｍｌ１．９９１癌患者血清０．７９５３８．８癌患者血清＋０Ｕ／ｍｌ０．４１１１９．７１９．４癌患者血清＋１０Ｕ／ｍｌ０．５１１２４．６２４．４癌患者血清＋３０Ｕ／ｍｌ０．６９７３３．９３４．４癌患者血清＋１００Ｕ／ｍｌ１．３９９６９．８６９．４ヒト正常人血清０．１４３６．５Ｃ１０．３４４１６．４Ｃ２０．７４２３６．２Ｃ３２．１２６１０６．９癌患者血清＋ヒト正常人血清０．４７６２２．９２２．７癌患者血清＋Ｃ１０．５６４２７．２２７．６癌患者血清＋Ｃ２０．７７３３７．８３７．５癌患者血清＋Ｃ３１．４７０７３．４７２．９表５より、ヒト初乳を含有するヒト血清、ウマ血清とも
に実測値と理論値の差はほとんど無く、癌患者血清と同
質の特性を有することが判る。又、ヒト初乳はＧＡＴの
値が高値であり、標準液の作成に有利である。

【００２８】

【効果】免疫測定法により癌関連ヒト由来ガラクトース
転移酵素を測定するに際して、ウマ血清を希釈液として
用いた標準液は、ヒト血清の代替物として優れたもので
あり、又、ヒト血清の場合の欠点、すなわちコストの問
題や感染の問題も解決されたものである等の特長を有す
る。

【００２９】又、ヒト初乳は、癌患者血清や癌患者腹水
と比較してもＧＡＴの値が高値であり、そして入手が比
較的容易であり、ＧＡＴ標準物質として非常に優れたも
のである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】免疫測定法により癌関連ヒト由来ガラク
トース転移酵素を測定するに際して使用される標準液で
あり、癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素標準物質を
ウマ血清で希釈することによって製造されてなる標準
液。
【請求項２】標準物質としてヒト癌患者腹水、ヒト血
清、ヒト乳汁、ヒト初乳、遺伝子工学による産物の群か
ら選択されることを特徴とする請求項１の標準液。
【請求項３】標準物質としてヒト初乳を用いることを
特徴とする請求項１の標準液。
【請求項４】免疫測定法により癌関連ヒト由来ガラク
トース転移酵素を測定するに際して、ヒト初乳をヒト血
清又はウマ血清で希釈することによって製造されてなる
標準液。