JPH0518974A

JPH0518974A - 免疫学的測定方法

Info

Publication number: JPH0518974A
Application number: JP5194391A
Authority: JP
Inventors: Morito Uemura; 盛人植村
Original assignee: Konica Minolta Inc
Current assignee: Konica Minolta Inc
Priority date: 1991-03-18
Filing date: 1991-03-18
Publication date: 1993-01-26

Abstract

(57)【要約】【目的】病気の治療に大きな効果を奏する免疫複合体
を測定する方法を提供することである。【構成】人体液中の免疫複合体を測定する免疫学的測
定方法であって、前記免疫複合体を構成している抗原に
対する抗体が固定化された担体、及び標識された抗ヒト
イムノグロブリン抗体又はプロテインＡが用いられて行
われる免疫学的測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、人体液中の免疫複合体
を測定する免疫学的測定方法に関するものである。

【０００２】

【発明の背景】生物学的流体試料中に極微量含有される
物質を検出する方法として、各種の分析法が開発されて
来ている。この分析法の一つとして、免疫反応をその原
理とするものがある。そして、この原理を用いた測定法
として種々のものが開発され、精度の高いものとして知
られている。

【０００３】すなわち、１９５８年にＢｅｒｓｏｎとＹ
ａｌｌｏｗが、放射性同位元素Ｉで標識した牛インシュ
リンと糖尿病患者血清中の抗インシュリン抗体を用い
て、血清中のインシュリンを測定することに成功して以
来、ラジオアイソトープを用いた免疫測定法が広く用い
られて来た。そして、これ以後、標識物質として放射性
同位元素以外のものも種々開発されて来た。例えば、酵
素、酵素基質、補酵素、酵素阻害物質、バクテリオファ
ージ、循環反応体、金属及び有機金属の錯体、有機補欠
分子族、化学発光性反応体及び螢光性分子等が挙げられ
る。

【０００４】ところで、体液中の抗原や抗体を測定する
ことは良く行われている。すなわち、病気の治療に当た
って、抗原の免疫反応による測定で発病に関する情報は
得られるものの、これは発病に関する情報であり、その
後の回復に関する情報は得られにくい。これに対して、
抗体の測定により回復に関する情報は比較的多く得られ
るものの、回復の徴候時点では抗体を測定しても観測さ
れず、充分なる情報が得られない。

【０００５】

【発明の開示】抗原や抗体の免疫学的測定のみでは病気
の治療情報は不充分なことに鑑み、さらなる研究が行わ
れた結果、免疫複合体を測定することが極めて大事なこ
とであることが判って来た。すなわち、例えばウィルス
に感染すると、この段階では抗原が形成され、そして回
復の兆し伴い免疫複合体が形成され出し、これに遅れて
抗体が形成され出すことが究明されたのである。従っ
て、抗体の形成に先立って形成される免疫複合体に関す
る情報が得られることは、病気の治療に多大な貢献がな
されるのである。特に、血清肝炎の如きのウィルス感染
症では、先ず、抗原が検出され、その後に抗体が増加し
て来るのであるが、免疫複合体の測定により診断がより
正確なものになり、治療対策に多大な貢献が予想され
る。

【０００６】ところで、従来の抗原や抗体を測定するこ
とが出来る免疫反応を応用しても、これでは免疫複合体
を測定することはできない。すなわち、抗体が固定化さ
れた担体と標識抗体とを用いたサンドイッチ法や競合法
による免疫反応により抗原が測定される訳であるが、こ
のような抗体が固定化された担体と標識抗体とでは免疫
複合体を測定出来ず、又、抗原が固定化された担体と標
識抗ヒトイムノグロブリン抗体とを用いたサンドイッチ
法による免疫反応により抗体が測定される訳であるが、
このような抗原が固定化された担体と標識抗ヒトイムノ
グロブリン抗体とでは免疫複合体を測定出来ない。

【０００７】そこで、本発明の目的は、免疫複合体を測
定出来る免疫学的測定方法を提供することである。この
本発明の目的は、人体液中の免疫複合体を測定する免疫
学的測定方法であって、前記免疫複合体を構成している
抗原に対する抗体が固定化された担体、及び標識された
抗ヒトイムノグロブリン抗体又はプロテインＡが用いら
れて行われることを特徴とする免疫学的測定方法によっ
て達成される。

【０００８】尚、免疫複合体は人体液中に存在する異物
抗原の複合体であり、この免疫複合体を構成している抗
原は、ウィルス由来の蛋白からなる抗原であったり、自
己免疫抗原の蛋白からなる抗原であったりする。本発明
で使用される免疫複合体を構成する抗原に対する抗体
は、その由来を特に限定されるものではないが、哺乳動
物等に抗原を投与、免疫して得られる抗血清、腹水液を
そのままか、あるいは従来公知の方法である硫酸ナトリ
ウム沈澱法、硫酸アンモニウム沈澱法、セファデックス
ゲルによるゲル濾過法、イオン交換セルロースクロマト
グラフィ法、電気泳動法等（右田俊介偏「免疫化学」中
山書店ｐｐ７４ないし８８参照）で精製して用いること
ができる。あるいは、抗原で感染した哺乳動物など（例
えばマウス）の脾臓細胞や骨髄腫細胞（ミエローマ）か
ら雑種細胞（ハイブリドーマ）を得てモノクローナル抗
体を作成し、これを特定成分と特異的に結合しうる物質
として使用すると特異性が向上し、好ましい。又、これ
らの抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ各
分画を用いることができ、或いはこれらの抗体を酵素処
理してＦａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）₂といった活
性抗体フラグメントにして使用しても良い。さらに、こ
れらの抗体は単一で使用しても、複数の抗体を組み合わ
せて使用しても良い。

【０００９】免疫複合体を構成している抗原に対する抗
体が固定化される担体は多孔質なものであることが好ま
しく、このような担体の材料としてはケイ藻土、二酸化
チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、微結晶セル
ロース、ケイ砂、ガラス、シリカゲル、架橋デキストリ
ン、架橋ポリアクリルアミド、アガロース、架橋アガロ
ース、ポリスチレン等の各種の合成樹脂が挙げられる。
そして、このような素材の多孔質担体であれば、抗体が
固定化される一次的な形状は粒子（ビーズ）状、棒状あ
るいはプレート状のものであっても差し支えないが、粒
子（ビーズ）状のものが好ましい。

【００１０】抗体は、これら多孔質の不溶化担体に、化
学的及び／又は物理的に直接、あるいは間接的に結合さ
せることができる。結合技術については、１９７６年、
講談社発行、千畑一郎ほか２名編「実験と応用アフィ
ニティクロマトグラフィー」（第１刷）、１９７５年、
講談社発行、山崎誠ほか２名編「アフィニティクロマ
トグラフィー」（第１版）を参考にできる。尚、結合反
応後、標識抗ヒトイムノグロブリン抗体又はプロテイン
Ａの非特異反応を排除する目的で、測定すべき特異的反
応に関与しない蛋白質を担持させることができる。それ
らの代表的な例としては、哺乳動物及び鳥類の正常血清
蛋白質、アルブミン、スキムミルク、乳酸醗酵物、コラ
ーゲン及びそれらの分解物質等が挙げられる。

【００１１】本発明において用いられる抗ヒトイムノグ
ロブリン抗体やプロテインＡは、当業者間で一般的に行
われている方法によって調整され得る。例えば、ヒト免
疫グロブリンをヤギあるいはヒツジ等に免疫し、得られ
た抗血清を前記載の抗体精製法に従って調整する。抗ヒ
トイムノグロブリン抗体はポリクロナール抗体及びモノ
クロナール抗体を用いることができる。プロテインＡ
は、市販のプロテインＡをそのまま、あるいは精製して
用いることができる。

【００１２】免疫測定方法において用いられる抗ヒトイ
ムノグロブリン抗体又はプロテインＡに対する標識物質
としては、例えば酵素、酵素基質、酵素及び酵素前駆体
の活性を変化させる物質（酵素阻害物質、補欠分子族、
補酵素）、酵素前駆体、アポ酵素、螢光物質などが挙げ
られる。具体的な物質としては、特開昭６２−９０５３
９号公報などに記載のものが挙げられるが、好ましくは
酵素、又は螢光物質であり、さらに好ましくはβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼ、アルカリホスフォダーゼ、ペルオキ
シダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタメートデヒ
ドロゲナーゼ、アミラーゼなどの酵素である。これらの
酵素を標識物質とする場合、酵素反応系、発色系は公知
のものを使用できる。具体的には、特開昭６１−２９２
０６０号公報、特開昭６２−９０５３９号公報、特開昭
６３−１３１０６２号公報、特開昭６３−４５５６２号
公報、特願昭６３−２１９８９３号明細書に記載の物質
（物質群）が挙げられるが、これらに限定されるもので
はない。そして、これら標識物質の抗ヒトイムノグロブ
リン抗体又はプロテインＡへの結合は、当業者間で知ら
れている公知の試薬と方法で行うことができ、例えば石
川栄治、河合忠、宮井潔編「酵素免疫測定法（第
２版）、医学書院、１９７８年」や日本臨床病理学会編
「臨床病理」臨時増刊特集第５３号「臨床検査の為のイ
ムノアッセイ−技術と応用−、臨床病理刊行会、１９８
３年」などに記載された方法を参考にすることができ
る。

【００１３】そして、上記のようにして得られた抗体が
物理的及び／又は化学的に結合した不溶化微粒子抗体と
酵素などで標識された抗ヒトイムノグロブリン抗体又は
プロテインＡ及び試料とを接触、免疫反応させ、Ｂ／Ｆ
分離した後、不溶化微粒子抗体に結合しないで遊離の状
態で存在する酵素標識体の酵素活性を分析素子で測定す
ることで、試料中の免疫複合体が簡便な操作で、感度、
正確度、精度及び再現性良く測定される。

【００１４】免疫測定方法による反応型式としては、競
合法、２抗体法、サンドイッチ法などが挙げられるが、
特に限定はされない。標識に起因した信号は、吸光度法
（比色法) 、螢光法または発光法で検出することがで
き、測定法としては信号の経時的変化を測定するレート
測定法または一定時間後の信号を測定するエンドポイン
ト測定法で測定することができる。好ましくは吸光度法
であり、吸光度法（比色法) では紫外線、可視光、近赤
外光を利用することができ、例えば流体試料として血清
及び血漿を用いる場合には、血清及び血漿による吸光の
影響を小さくするために緑色光、赤色光または近赤外光
を利用するのが好ましい。

【００１５】

【実施例】９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク
社）に動物（ヤギ）由来抗ＨＢｓ（Ｂ型肝炎表面抗原）
抗体（バイオメダ社）の１０μｇ／ｍｌＰＢＳ溶液を５
０μｌ加え、４℃で１晩静置した。そして、ＰＢＳで３
回洗浄した後、２００μｌの１％ＢＳＡ・ＰＢＳで３７
℃下において１時間ブロッキング操作を行った。

【００１６】次いで、正常人及び肝炎患者の血清５０μ
ｌ及びＰＢＳ１００μｌを加え、３７℃で３時間インキ
ュベートした。そして、プレートをＰＢＳで３回洗浄し
た後、ペルオキシダーゼで標識したヒツジ由来の抗ヒト
イムノグロブリン抗体（ＥＹラボラトリー社）の１％Ｒ
ＢＳＡ・ＰＢＳ２００倍希釈溶液１００μｌを加え、室
温下で１時間静置した。

【００１７】ＰＢＳで４回洗浄した後、１００μｌの基
質液（３ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミン、０．０
１％のＨ₂Ｏ₂、１００ｍＭのクエン酸、１００ｍＭの
リン酸水素ナトリウム、ｐＨ６．０）を加え、室温下で
３０分間の発色反応を行った。その後、２５μｌの９Ｎ
硫酸を加え、反応を停止させた後、４９２ｎｍの吸光度
を測定したので、その結果を以下に示す。

【００１８】吸光度吸光度正常人Ａ０．０２５肝炎患者Ａ０．３８０正常人Ｂ０．０３１肝炎患者Ｂ０．２５４正常人Ｃ０．０２８肝炎患者Ｃ１．３１２正常人Ｄ０．０３３肝炎患者Ｄ０．１２５正常人Ｅ０．０２８肝炎患者Ｅ０．２４７これによれば、肝炎の診断に対し本発明の免疫測定は特
異的であり、すなわち免疫複合体を測定することにより
肝炎患者か否かが判る。

【００１９】又、ＨＢｓ複合体の外にもＨＢｓ抗体を測
定する為に、上記の抗ＨＢｓ抗体を固定化する代わりに
ＨＢｓ抗原（ケミコン社）の１μｇ／ｍｌＰＢＳ溶液を
用い、その他は上記の場合と同様な操作を行い、免疫測
定を行ったので、その結果を下記に示す。尚、検体は、
急性肝炎患者から２週間ごとに採血した血清を用いた。

【００２０】以上の結果から、発病後の抗体の出現前に免疫複合体の
検出が可能であり、抗体の検出前において治療に対する
正しい処置が可能となる。

【００２１】

【効果】本発明によれば、免疫複合体の測定が可能とな
り、抗体の検出前において治療に対する正しい処置が可
能となる。

Claims

【特許請求の範囲】【請求項１】人体液中の免疫複合体を測定する免疫学
的測定方法であって、前記免疫複合体を構成している抗
原に対する抗体が固定化された担体、及び標識された抗
ヒトイムノグロブリン抗体又はプロテインＡが用いられ
て行われることを特徴とする免疫学的測定方法。