WO1997001759A1 - Dispositif de test immunologique perfectionne - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un dispositif de test immunologique pour la détection de la présence ou non d'un ligand dans un échantillon de fluide biologique comprenant: une membrane supérieure de complexation, poreuse, sensiblement non absorbante vis-à-vis de l'échantillon, destinée à recevoir l'échantillon et portant un réactif marqué par une enzyme capable de former un complexe immun marqué avec ledit ligand, une membrane intermédiaire de sélection, poreuse, sensiblement non absorbante vis-à-vis de l'échantillon, portant un réactif laissant sélectivement passer ledit complexe immun marqué, mais non le réactif marqué non complexé; et une membrane de révélation, poreuse et absorbante, comportant au moins un réactif capable de développer une coloration lorsque le complexe immun marqué diffuse dans cette membrane de révélation, caractérisé en ce que ladite membrane inférieure de révélation est constituée par une bande dont une partie est recouverte par la membrane intermédiaire de sélection et dont l'autre partie est non recouverte par la membrane supérieure et intermédiaire, la partie non recouverte constituant la zone de révélation et la partie recouverte étant exempte de réactif participant à la révélation.

Description

Dispositif de test immunoloαiσue perfectionné

L'invention concerne un dispositif de test immunologique perfectionné permettant la détection très rapide, qualitative, semi-quantitative ou quantitative, d'un ligand dans un fluide biologique. On connaît des dispositifs de test immunologique comprenant plusieurs membranes ou couches poreuses distinctes superposées, par exemple une membrane supérieure recevant l'échantillon et où peut se produire une formation de complexe immun marqué entre un antigène et un anticorps dont l'un est marqué par une enzyme, une membrane intermédiaire laissant sélectivement passer le complexe immun marqué et piégeant l'anticorps ou l'antigène marqué n'ayant pas formé de complexe, et une membrane inférieure dite de révélation où se lit le résultat du test, par exemple par apparition ou non d'une coloration comme résultat d'une réaction entre l'enzyme de marquage et un substrat. Des exemples de tels dispositifs sont décrits dans FR-A-2 514 511 et FR-A-2 667 943, entre autres.

Il est apparu que des interactions dues à la trop grande proximité (moins de 100 μm dans tous les dispositifs étudiés) de la membrane inférieure contenant le substrat et de la membrane sélective piégeant les anticorps marqués non liés à un antigène, provoquaient des colorations parasites plus ou moins intenses et qui apparaissaient, de toute façon, après quelques minutes, même si le substrat était parfaitement incolore tout de suite après le test. Ce qui aboutit donc à de faux positifs. Il est par ailleurs difficile de demander à l'utilisateur de lire immédiatement le résultat sans tenir compte de colorations tardives, car cet utilisateur désire souvent garder le test pour le montrer plus tard à son médecin par exemple. Le problème soulevé par lesdites interactions est particulièrement aigu lorsque la membrane inférieure met en oeuvre une association de réactifs visant normalement à amplifier le signal initial provoquant la coloration, afin qu'une infime quantité de complexe immun marqué atteignant la membrane inférieure suffise à provoquer une coloration nette.

Il serait donc avantageux de disposer d'un dispositif de test exempt de ce défaut.

La présente invention a pour objet de fournir un dispositif de test perfectionné qui est exempt du défaut signalé ci-dessus.

La présente invention a également pour objet d'apporter divers autres perfectionnements aux dispositifs de test immunologique. Plus particulièrement, l'invention concerne un dispositif de test immunologique pour la détection de la présence ou non d'un ligand dans un échantillon de fluide biologique comprenant : une membrane supérieure de complexation, poreuse, sensiblement non absorbante vis-à-vis de l'échantillon, destinée à recevoir l'échantillon et portant un réactif marqué par une enzyme capable de former un complexe immun marqué avec ledit ligand ; une membrane intermédiaire de sélection, poreuse, sensiblement non absorbante vis-à-vis de l'échantillon, portant un réactif laissant sélectivement passer ledit complexe immun marqué, mais non le réactif marqué non complexé ; et une membrane de révélation, poreuse et absorbante, comportant au moins un réactif capable de développer une coloration lorsque du complexe immun marqué diffuse dans cette membrane de révélation, caractérisé en ce que ladite membrane inférieure de révélation est constituée par une bande dont une partie est recouverte par la membrane intermédiaire de sélection et dont l'autre partie est non recouverte par les membranes supérieure et intermédiaire, la partie non recouverte constituant la zone de révélation et la partie recouverte étant exempte de réactif participant à la révélation. Selon un mode de réalisation particulier, la zone de révélation comporte successivement en s'éloignant de la partie recouverte une zone comportant au moins un réactif d'amplification, une zone de lecture du résultat du test, et, facultativement mais préférentiellement, une zone de lecture d'un signal de fin de test.

De préférence, une zone exempte de tout réactif participant à la révélation est interposée entre la partie recouverte et la zone à réactif d'amplification. Selon un mode de réalisation préféré, les membranes et bande constitutives du présent dispositif sont disposées dans une enveloppe comportant, sur sa face supérieure, des fenêtres convenablement disposées et permettant la dépose de l'échantillon de fluide biologique à tester sur la membrane supérieure, la lecture du résultat du test, et, le cas échéant, la lecture du signal de fin de test.

Ce mode de réalisation présente sur les dispositifs de test antérieurs l'avantage de ne pas devoir être retourné pour la lecture du résultat du test, toutes les opérations se passant sur la face supérieure du dispositif.

Aux fins de l'invention, le terme "ligand" désigne un antigène (y compris un haptène) , un anticorps, un ion ou une molécule chimique.

La présente invention est indépendante de l'enzyme de marquage utilisée, du type de réactif porté par la membrane de sélection, et du système de révélation employé. Les exemples donnés ci-après n'ont donc qu'une valeur purement indicative et non limitative.

Il est à noter qu'un dispositif de test selon l'invention peut inclure un seul test immunologique, plusieurs tests immunoiogiques à effectuer concurremment ou à intervalle, un ou plusieurs tests immunoiogiques associés à d'autres tests non immunoiogiques, par exemple chimiques. La description qui va suivre faite en se référant aux dessins annexés fera bien comprendre l'invention. Sur les dessins : Les figures 1 et 2 sont des vues schématiques en coupe longitudinale et en plan d'un dispositif de test selon l'invention ;

Les figures 3 à 8 illustrent, vus en plan, divers dispositifs de test selon l'invention. Les dispositif de test représenté sur les figures 1 et 2 comporte une membrane supérieure 1 de complexation, poreuse, sensiblement non absorbante, destinée à recevoir l'échantillon et portant un réactif marqué par une enzyme capable de former un complexe immun marqué avec ledit ligand; une membrane intermédiaire 2 de sélection, poreuse, sensiblement non absorbante, portant un réactif laissant sélectivement passer ledit complexe immun marqué, mais non le réactif marqué non complexé ; et une membrane de révélation 3, poreuse et absorbante, comportant au moins un réactif capable de développer une coloration lorsque du complexe immun marqué diffuse dans cette membrane de révélation.

La membrane inférieure 3 de révélation est constituée par une bande dont une partie 3a est recouverte par la membrane intermédiaire 2 de sélection et dont l'autre partie 3b est non recouverte par les membranes supérieure 1 et intermédiaire 2, la partie non recouverte constituant la zone de révélation et la partie recouverte étant exempte de réactif participant à la révélation. Les réactifs d'amplification et les réactifs chromogènes étant ainsi éloignés de la membrane 2, on évite toutes les interactions pouvant provoquer des colorations parasites.

L'ensemble des membranes 1-3 est disposé dans une enveloppe 4 pourvue de fenêtres 5, 6 et 7.

La membrane de révélation 3 comporte plusieurs zones sur la partie non recouverte 3b. Une zone neutre 8, optionnelle mais préférée, contiguë à la partie recouverte 3a, exempte de tout réactif ; une zone d'amplification 9 sur laquelle est déposé au moins un réactif d'amplification tel que RI, R2; une zone 10 portant un substrat chromogène Set servant à afficher le résultat du test (coloration ou pas) ; et une zone 11 portant un réactif chromogène C et servant à afficher un signal de fin de test. Les fenêtres 5, 6 et 7 de l'enveloppe 4 sont disposées de façon à se trouver en regard de la membrane 1, de la zone 10 et de la zone 11, respectivement.

On va maintenant décrire plus en détail l'invention dans le cas où le ligand est un antigène et le réactif porté par la membrane supérieure est un anticorps. Le réactif porté par la membrane de sélection peut être notamment des immunoglobulines comme décrit dans FR-A-2 667 943 ou FR-A- 2 703 788.

Selon la présente invention les réactifs supportés par les zones 9, 10 et 11 de la membrane 3 de tout l'étage inférieur (en dessous de la membrane sélective 2) sont déposés de façon séquentielle horizontalement d'arrière en avant sur une bande de support poreux chimiquement et immunologiquement neutre (appelée bande de révélation) , aboutissant loin vers l'avant à une succession de gouttes de réactifs d'amplification puis à une goutte de substrat chromogène.

Tout l'étage supérieur est conservé en superposition verticale : une première membrane 1 supportant un réactif marqué tel que des anticorps non fixés marqués lyophilisés, une seconde membrane 2 destinée à piéger ce réactif marqué quand il n'est pas complexé avec le ligand (cas où celui-ci est absent dans l'échantillon) . Ces deux premières membranes 1 et 2 sont donc disposées au-dessus de l'extrémité arrière de la bande 3.

Le fonctionnement de ce dispositif de test est le suivant :

Lorsque l'échantillon ne contenant pas de ligand recherché est déposé sur la première membrane 1, les anticorps marqués qui y ont été préalablement déposés et lyophilisés, sont mis immédiatement en solution et migrent verticalement vers le bas vers la membrane sélective 2 spécialement traitée pour piéger ces anticorps marqués non liés au ligand recherché. Poursuivant sa migration verticale vers le bas, l'échantillon avec tous ses composants (ne contenant pas les anticorps marqués) traverse cette membrane sélective pour arriver sur l'extrémité arrière de la bande de révélation 3. Les propriétés de "buvard" de cette bande font que la migration du liquide passe de la verticale à l'horizontale vers l'avant de la bande. Le liquide progressant par migration lente le long de la bande, arrive dans la zone d'amplification où il réagit avec, par exemple, un réactif RI. Le produit de cette réaction de l'échantillon avec RI migre ensuite lentement vers un second réactif R2 (dans le cas de deux réactifs d'amplification) pour arriver, après quelques centimètres de migration, au niveau de la goutte (S) de substrat chromogène. La série de réactions avec les différents réactifs a pour but d'amplifier chimiquement la coloration éventuelle du substrat. Si aucun anticorps marqué n'a traversé la membrane sélective (test négatif), aucun signal n'apparaîtra dans la zone 10 de la bande de révélation, malgré toutes les amplifications chimiques. Par contre si les complexes marqués (anticorps marqué + ligand recherché) traversent la membrane sélective (test positif), même en quantité infinitésimales de l'ordre du picogramme, la réaction avec les réactifs d'amplification RI et R2 aboutit à la formation dans la zone 10 de la bande de révélation à un signal coloré parfaitement visible dans la fenêtre 6.

Comme l'échantillon liquide est souvent incolore quand il arrive à l'extrémité avant de la bande de révélation, il est difficile de savoir si sa migration est terminée ou non. En cas de test colorimétrique positif cela est facile puisqu'une tache colorée apparaît en 6 (annonçant la fin de la migration) . Mais en cas de test négatif (aucune coloration) , il est difficile de faire la différence entre la bande mouillée à son extrémité et la bande encore sèche (migration insuffisante par exemple) . Pour parer à ce problème il est avantageux de déposer encore plus loin vers l'avant de la bande, dans la zone 11, une goutte (C) d'une substance qui se colore dans tous les cas (négatif ou positif) au contact de l'échantillon liquide quand il a réellement terminé sa migration vers l'extrémité avant de la bande de révélation, à condition toutefois que tous les réactifs utilisés pour ce test aient été bien conservés. Si l'un des réactifs n'était plus opérationnel, cette goutte (C) ne se colorerait pas.

De cette façon, l'apparition d'une coloration dans la fenêtre 7 annonce :

1°/ la fin du test ; 2°/ invite l'utilisateur à lire le résultat ;

3°/ garantit le bien-fondé du résultat observé :

- que la non-coloration de S est bien due à l'absence d'anticorps marqués qui ont été piégés loin vers l'arrière, par la membrane sélective 2 et non pas à une défaillance quelconque du système de coloration ou de son amplification ;

- que la coloration de S est bien le témoin de passage d'anticorps marqués à travers la membrane sélective, liés au ligand recherché. Une fois le test terminé, la coloration de C est stable tandis que la non-coloration de S en cas de test négatif est réellement définitive à l'abri d'interférences avec les enzymes des anticorps piégés plusieurs centimètres loin derrière sur la membrane 2. Une autre amélioration fournie par le dispositif de l'invention consiste à réaliser au moins une des fenêtres, sous forme d'un ou plusieurs signes (lettres, chiffres par exemple) transparents. Par exemple, on peut imprimer en négatif sur un adhésif, les lettres correspondant au diagnostic recherché. Par exemple, on imprime en blanc la totalité d'un carré adhésif initialement transparent sauf à l'emplacement de lettres "PSA" par exemple, l'adhésif restant transparent au niveau de ces lettres. En cas de test négatif, la non-coloration de la bande de révélation (blanche au départ) ne révélera aucune différence entre le blanc de l'adhésif et le blanc de la bande de révélation que l'on voit par transparence à travers les lettres PSA. En cas de test positif, le substrat chromogène de la goutte S de la bande de révélation se colore, par exemple en bleu. L'adhésif imprimé en blanc opaque sauf sur les lettres PSA, cachera le bleu, sauf au niveau des lettres PSA qui se verront, vues de dessus, colorées en bleu puisque l'adhésif est resté transparent au niveau des lettres (qui n'ont pas été imprimées en blanc opaque) . Le résultat du test sera donc, teintées en bleu, les lettres "PSA", ce qui ne laisse aucun doute sur le diagnostic. (Voir les figures 3 à 5) . Cette particularité, rendue abordable par les techniques informatiques de PAO et CAO (publication et conception assistée par ordinateur), permet donc d'obtenir tous les sigles possibles comme par exemple "PSA" pour l'antigène prostatique spécifique couplé, sur la même carte, à un second test" "> 4 ng" pour le dosage semi-quantitatif de PSA annonçant ainsi :

1 - qu'il existe du PSA donc adénome probable ;

2 - qu'il est en excès, donc éventuelle cancérisation de l'adénome prostatique. Le dispositif de test (figures 3 à 5) peut se présenter en fait sous la forme d'une mince carte de type carte de crédit formée de deux feuillets emprisonnant les deux membranes et la bande de révélation :

- le feuillet inférieur est plan sans aucun orifice et supporte sur sa face supérieure, les membranes et la bande de révélation,

- le feuillet supérieur vient recouvrir le tout et est perforé aux endroits des fenêtres.

1 - à l'arrière et juste au-dessus de la membrane 1, une fenêtre 5 peut déposer l'échantillon de telle sorte qu'il entre en contact avec les anticorps marqués

2 - quelques centimètres vers l'avant, une seconde fenêtre 6 juste au niveau de la goutte S de substrat pour lire la coloration éventuelle 3 - et quelques millimètres vers l'avant de 6, une troisième fenêtre juste-au-dessus de la goutte C pour y lire la coloration de C annonçant la fin du test. Un système d'adhésifs double face vient mettre solidement en contact les deux feuillets emprisonnant ainsi les membranes 1, 2 et 3. Le dispositif apparaît alors comme une carte rigide de type carte de crédit d'environ 0,45 mm d'épaisseur présentant à sa face supérieure ces fenêtres.

On peut imprimer diverses explications sur le feuillet supérieur, si désiré.

A la face inférieure du volet inférieur peuvent aussi être imprimées diverses notes, mode d'emploi, précautions, etc....

Le dispositif peut comprendre, en outre, une pipette stérile à usage unique pour prélever le volume adéquat d'échantillon et le déposer en 5.

En ce qui concerne les tests sur sang total, il est nécessaire de procéder à une dilution de l'échantillon car le sang total est trop visqueux et ne migrerait pas de façon satisfaisante dans le dispositif : dans ce cas, la pipette à usage unique contiendra un tampon adéquat évitant la moindre hémolyse qui libérerait de l'hémoglobine, facteur de faux positifs en cas de test colorimétrique. Si l'échantillon est un prélèvement de cellules (et non plus d'antigène en solution comme dans la grossesse par exemple) sur des lésions de muqueuses comme par exemple dans les maladies sexuellement transmissibles, la pipette contiendra un détergent doux de type CHAPS par exemple, capable de libérer instantanément les antigènes recherchés (comme par exemple l'antigène LPS dans les chlamydiae) .

L'ensemble du dispositif de test est :

- mis à l'abri de l'action oxydante de l'oxygène de l'air, par exemple emballé sous vide puis rempli de gaz neutre (par exemple argon) pour que la pression du vide ne déforme pas la carte ;

- mis à l'abri de l'action oxydante de la lumière : (sur le substrat qui est très sensible) , par exemple emballé dans un emballage opaque.

Avantageusement, il sera, en outre :

- accompagné d'explications détaillées sur la maladie en question pour laquelle on fait ce test, avec description complète du dispositif, des précautions d'emploi, du mode de prélèvement avec le volume exact à déposer, et de l'interprétation la plus claire du résultat obtenu ; - entièrement réemballé après usage dans un sac étanche et solide prévu à cet effet pour subir plus tard une biodégradation totale non contaminante et non polluante. CONSIDERATIONS GENERALES

Un "test" est une unité composée de la bande de révélation, de la membrane sélective, de la membrane aux anticorps lyophilisés marqués. Chaque test sert à la détection d'un ligand. Il peut y avoir un seul test enserré entre deux feuillets de la carte, comme par exemple pour le test de grossesse. Mais il peut y avoir plusieurs tests différents enserrés dans la même carte, chacun destiné à détecter un ligand différent. Par exemple une carte est décrite plus loin dans laquelle sont disposés trois tests pour la détection précoce de p24, de GP40 et de GP120 ; chacun des tests utilisant 50 μl du même échantillon (qui devra donc être de 150 μl : 15 μl de sang total et 135 μl de tampon) . Ce sont donc 3 tests de détection d'antigènes. Mais il peut y avoir un test antigène et un test anticorps comme dans l'exemple HIV et l'exemple hépatite décrits plus loin. II peut y avoir un test semi-quantitatif unique dans le dispositif comme pour le D-Dimère dont l'intérêt est simplement de savoir s'il est en excès.

Il peut y avoir plusieurs test semi-quantitatifs différents dans la même carte comme pour les marqueurs tumoraux : l'on sait qu'un marqueur seul est peu significatif mais que l'augmentation de plusieurs marqueurs en même temps est hautement pathologique (99% des cas où le CA, le CA 19-9 et le CA 15-5 sont augmentés en même temps tous les trois, sont des cancers digestifs que l'on peut espérer détecter tôt et suivre leur évolution grâce à cette technologie extrêmement sensible) .

Il peut y avoir un test qualitatif et un test semi- quantitatif comme pour le PSA : la simple présence témoigne d'une affection bénigne, l'excès d'une affection maligne.

Il peut y avoir toute une série de tests identiques dans la même carte comme pour la détection du pic urinaire de LH : un test par jour du 8ème au 17ème jour : la carte étant alors en fait une dizaine de mini-cartes attachées les unes aux autres.

Les tests immunoiogiques peuvent être accompagnés par des tests chimiques de la plus haute utilité. Exemples : - Dosages des transaminases avec un test Hbs antigène et un test Hbc anticorps. L'étude des résultats est riche d'enseignements. (Voir les figures 6, 7 et 8) .

* Antigène Hbs positif sans élévation des anticorps Hbc : phase infectieuse aiguë au tout début car la technique est très sensible.

** Antigène et transaminases élevés : infection en cours et grave.

*** HBc anticorps positif seul : trace d'hépatite ancienne. **** HBc anticorps positif et transaminases élevés: hépatite récente mais en phase post-infectieuse avec phénomènes de cytolyse hépatique persistante.

- Dosage chimique des phosphatases acides accompagnant le test du PSA. Enseignements : * PSA élevé sans élévation de phosphatases acides: pas de métastases osseuses à partir du cancer de la prostate.

** PSA et phosphatases acides élevées : mauvais pronostic. - Immunodosage de l'insuline et dosage chimique de la glycémie (extrêmement utile : la résistance à l'insuline va en augmentant avec l'âge et la sédentarité ; elle se traduit par de l'hyperinsulinisme, de l'obésité et du diabète avec son cortège de conséquences graves) . Ceci permet : * de dire de quel type de diabète il s'agit ;

** d'orienter le traitement vers les récepteurs cellulaires de l'insuline ; *** d'orienter enfin l'évolution sous régime et sous traitement ;

**** mais surtout éviter les traitements intempestifs par insuline qui aboutissaient à des désastres (accélération des dégénérescences artérielles) .

Ce devrait être le test glycémique de l'avenir. - Enfin il n'y a pas que la détection d'excès de ligand. La présente invention peut inverser le signal et détecter ainsi une baisse d'une substance vitale comme les facteurs de coagulation, de l'insuline, etc..

Chacun des exemples suivants illustre une possibilité. EXEMPLE 1 : Détection précoce d'antigène Hbs d'hépatite -

1. On prépare une membrane supérieure porteuse d'anticorps monoclonaux lyophilisés anti-HBs antigène, marqués à la peroxydase, par des techniques usuelles, la membrane étant constituée d'un rond en papier Whatman ayant été imprégné d'un mélange d'agent tensioactif (TWEEN) et de lait écrémé à 5%, rincé et séché.

2. On prépare ensuite une membrane sélective en traitant un rond de nylon Immunodyne^® de la Société Pall, d'une épaisseur de 0,1 mm et d'une porosité de 0,65 μm, par le procédé décrit dans FR-A-2 667 943, c'est-à-dire en le revêtant avec des immunoglobulines anti-enzyme.

3. On prépare une bande de révélation en déposant sur une bande à base de fibres de verre, vendue par la Société

Whatman, de 5 mm de large sur 5 cm de long, les réactifs suivants sous forme de gouttes de 1 μl espacées de 7 mm d'arrière en avant :

RI : glucose oxydase à 0, 1 mg/ml R2 : D-glucose en solution dans acide acétique à 1% dans l'eau

S : 3,3' ,5,5' -tétraméthyl benzidine (TMB) à 1 mg/ml C : Rouge de phénol à 1% : incolore à sec. Se colore en rose à l'arrivée de tous les réactifs en bout de bande de migration horizontale indiquant la bonne fin du test.

4. On prépare une carte inférieure formant support rigide ; 5. On prépare une carte supérieure. Par exemple une carte de polystyrène de mêmes dimensions qu'une carte de crédit (84 mm de long et 56 mm de large) .

A 15 mm du bord gauche et à 15 mm du bord supérieur, on pratique un orifice 5 de 6 mm de diamètre. Il servira à déposer l'échantillon.

A 35 mm du bord gauche mais à la même hauteur que l'orifice précédent (à 15 mm du bord supérieur) on pratique un second orifice 6 de même diamètre et destiné à lire la coloration éventuelle de la goutte S de TMB.

A 45 mm du bord gauche et toujours sur la même ligne (à 15 mm du bord supérieur) on pratique un troisième orifice 7 destiné à lire la coloration en rose de la goutte C du réactif de contrôle. Cette carte supérieure aura été préalablement imprimée de diverses explications ou images facilitant l'emploi : le dessin d'une pipette juste au-dessus du trou dans lequel l'échantillon doit être versé, le dessin d'un rond incolore et un rond bleu en expliquant que l'un est un résultat négatif et l'autre un résultat positif, enfin un dessin de rond rose expliquant que c'est la coloration nécessaire du troisième trou à attendre pour lire le résultat.

6. On y adjoint une pipette en plastique à usage unique contenant un tampon de type PBS. MONTAGE

1. On colle la bande de révélation 3 par l'intermédiaire d'un adhésif double face, sur une zone bien repérée auparavant pour qu'elle soit exactement sous les divers orifices de la plaque supérieure. 2. On colle sur l'extrémité gauche de la bande le rond de nylon constituant la membrane sélective 2.

3. On colle ensuite sur cette membrane sélective la membrane 1 supportant les anticorps marqués lyophilisés.

4. On colle sur la zone (incolore) où se trouve la TMB un carré de plastique adhésif transparent au départ puis imprimé en blanc, portant le sigle "Hbs +" resté transparent incolore car non imprimé en blanc. Si la TMB se colore (test positif) seul le sigle "Hbs +" va apparaître vu de dessus, coloré en bleu. Le reste de la goutte bleue de la bande de révélation ne se verra pas vu du dessus, car occulté par l'impression en blanc de l'adhésif. 5. On colle la carte supérieure sur tout cet ensemble et sur la carte inférieure.

6. On y adjoint la pipette à usage unique contenant 45 μl de tampon PBS non hémolysant.

7. On emballe le tout sous vide poussé, puis on injecte de l'argon dans une enveloppe opaque et solide (type aluminium souple) .

8. On peut insérer le tout dans une boîte de carton contenant : un petit livret dans lequel figure une documentation complète sur l'hépatite et ses composantes immunoiogiques, un mode d'emploi détaillé avec des schémas clairs et une projection de tous les résultats possibles expliquant dans quel cas le test n'est pas valable, sa fiabilité, sa sensibilité ainsi que la combinaison de tous les résultats possibles : fenêtre 6 colorée ou non, fenêtre 7 colorée ou non et le résultat qui en découle.

- un gant stérile à usage unique

- un stylet emballé stérile pour piquer l'extrémité d'un doigt - un sac en plastique solide destiné à contenir l'ensemble de tous les composants de ce dispositif après usage, avec un bon système de fermeture étanche ; le tout étant, de préférence, biodégradable et non polluant. MODE OPERATIONNEL 1. On déballe le carton, on ouvre le livret et on suit scrupuleusement le mode d'emploi.

2. On sort la carte de son enveloppe opaque et on la pose bien à plat.

3. On pique le doigt du patient avec le stylet stérile et on aspire 5 μl de sang total avec la pipette de PBS, ce qui aboutit immédiatement à une dilution rosée du sang total à 1/10 (1 volume de sang pour 9 volumes de PBS) . 4. On dépose les 50 μl de sang dilué dans l'orifice 5 marqué du sigle pipette. La goutte d'échantillon commence à être absorbée doucement au bout de 5 secondes, temps voulu pour que l'échantillon dissolve et s'associe bien aux anticorps marqués lyophilisés de la première membrane 1 qu'il rencontre. L'absorption est terminée après 5 secondes et la goutte a disparu.

15 secondes après la dépose de l'échantillon, le sigle

"Hbs +" commence à se colorer en bleu par la gauche puis entièrement après quelques secondes, en cas de test positif.

20 secondes après la dépose, soit 5 secondes après la coloration totale du sigle "Hbs +" une coloration rose commence à colorer le bord gauche de la fenêtre 7 qui sera complètement colorée en 5 autres secondes. 30 secondes après la dépose, le test est terminé.

Ce même patient a subi un contrôle parallèle par un laboratoire d'analyses à qui a été -demandée une quantification de l'antigène Hbs. Le résultat est de 2 nanogrammes par ml de plasma (2 Unités Internationales) par la Technique immunoenzymatique ELISA.

COMPARAISON DE LA SENSIBILITE DU DISPOSITIF PAR RAPPORT A LA

TECHNIQUE ELISA Le plasma de ce patient est dilué 2 fois puis 20 fois puis 100 fois puis 200 fois puis 500 fois puis 1000 fois puis 2000 fois. Les doses d'antigènes Hbs sont, donc, en UI: 1 0,1 0,02 0,01 0,002 0,001 0,0005

Résultats donnés par la technique ELISA : 1 0,1 douteux 0 0 0 0

Intensité du Signal transmis par la carte de test de l'invention :

+++ +++ ++ ++ + + +/- Temps mis par la TMB à se colorer, en secondes

1 2 5 10 20 30 2 min.

La sensibilité de la carte est donc de 1 mUI/ml si l'on veut attendre 30 secondes après la fin du test. Elle n'est "que" de 0,01 Ul/ml après 10 secondes.

De nombreuses variétés de cartes sont possibles :

- test anticorps Hbc et transaminases (pour le suivi post-hépatite) ou gamma-GT (suivi de cirrhose du foie)

- test antigènes Hbs et HCV (détection hépatite B ou C) avec ou sans leur anticorps correspondants.

EXEMPLE 2 - Dosaσe simultané de P24-GP40-GP120 du HIV -

1 - Sur une carte inférieure on dispose à 5 mm l'une de l'autre 3 bandes de révélation préparées auparavant.

2 - Sur l'extrémité arrière de chaque bande on colle une membrane sélective du même type que dans l'exemple précédent.

3 - Au-dessus de chaque membrane sélective on colle une membrane supportant des anticorps marqués lyophilisés : des anticorps marqués anti-p24 pour la première, des anticorps marqués anti-GP40 pour la seconde et des anticorps marqués anti-GP120 pour la troisième.

4 - On colle la carte supérieure sur l'ensemble. Elle est perforée de 9 trous : un pour chaque dépose = 3 trous, un pour chaque résultat = 3 trous et un pour chaque contrôle = 3 trous.

5. La pipette ne contient plus 45 μl mais 135 μl de tampon PBS non hémolysant. Elle est graduée pour aspirer 15 μl de sang total qui va se mélanger aussitôt à ces 135 μl de tampon et donner un échantillon de sang dilué au 1/10. On dépose 50 μl d'échantillon dans chacun des trous de gauche.

Si tous les trois trous de résultats se colorent, c'est que l'échantillon contient ces 3 antigènes et donc assurément du virus HIV. Ceci est extrêmement utile car bien avant la séropositivité en anticorps, apparaissent ces antigènes viraux mais en quantité infinitésimales indosables par les méthodes classiques : seulement 50 picogrammes de p24/ml circulent en début d'infection chez des sujets susceptibles d'être des donneurs de sang (car séronégatifs en anticorps) alors qu'ils sont contaminés. La carte de test de la présente invention peut facilement et rapidement (20 secondes) détecter 10 picogrammes de p24/ml. Si seul le trou du p24 se colore, on ne peut en déduire qu'il s'agit de virus HIV car cet antigène p24 est commun à d'autres virus bénins. EXEMPLE 3 - Carte associant quatre dosages différents trois tests antigènes : p24 - GP40 - GP120 et un test anticorps sériques anti-HIV -

1 - Sur une carte inférieure on dispose non plus les trois bandes comme pour le dosage d'antigènes de l'exemple 2 mais quatre bandes.

2 - Pour cette carte on utilise des membranes sélectives comme celles décrites dans FR-A-2 703 788, utilisant la technologie des anti-idiotypes et capables de détecter indifféremment antigènes ou anticorps. On en place une sur chaque bande de révélation.

3 - Au-dessus de chaque goutte de TMB on colle un adhésif portant l'impression correspondant à chaque test : "p24" pour la première ligne, "GP40" pour la seconde, "GP120" pour la troisième et "HIV/Ab" pour la quatrième (dosage d'anticorps) .

4 - Les membranes d'anticorps marqués lyophilisés sont les mêmes que dans l'exemple 2. Pour le test anticorps on utilise, par contre, une membrane qui ne contient plus un anticorps marqué mais un mélange de trois anticorps marqués: un anti-p24, un anti-GP40, un anti-GP120. En cas de présence d'anticorps sériques, la membrane sélective est vite saturée par les anticorps sériques et laisse passer les anticorps marqués, alors qu'en cas d'absence d'anticorps sériques, les anticorps marqués sont tous piégés par cette membrane sélective.

De même en cas de présence d'antigènes, les anticorps marqués forment avec eux des complexes qui traversent la membrane sélective ; alors qu'en cas d'absence d'antigènes les anticorps marqués sont piégés par la membrane sélective. Le mode opérationnel est le même qu'à l'exemple 2 sauf que la pipette contient 180 μl de tampon non hémolysant et permet d'aspirer 20 μl de sang total qui sera ainsi dilué au 1/10 .

50 μl sont déposés sur chaque orifice marqué "pipette".

L'apparition en bleu des sigles p24, GP40, GP120 et

HIV/Ab signe la présence certaine de HIV dans l'échantillon avec une sensibilité extrême : le sigle "HIV/Ab" apparaît en

1 minute avec un sérum séropositif dilué à 1/100.000, et en 5 secondes avec un sérum dilué à 1/1000.

EXEMPLE 4 : Dosage semi-cruantitatif de D-dimère plasmatiσue- La membrane supérieure supporte des anticorps monoclonaux anti-D-dimère marqués à la peroxydase.

La membrane sélective est celle décrite dans FR-A-

2 702 841 utilisant la technologie des peptides anti- peptides. Elle est conçue pour ne laisser passer les anticorps marqués anti-D-dimère que si le D-dimère dépasse la concentration de 0,4 microgramme/ml (seuil considéré comme physiologique) .

Le sigle imprimé sur adhésif est "D-DIM >". On peut associer à ce test un dosage d'un ou des facteurs de la coagulation (l'augmentation du D-dimère étant due à une fibrinolyse) .

EXEMPLE 5 - Dosage semi-quantitatif de PSA (antigène prostatique spécifique) -

Absent chez le sujet normal, le PSA s'élève à un maximum de 4 ng/ml dans l'adénome prostatique bénin et dépasse largement ce taux en cas de cancerisation de cet adénome (30% des adénomes) .

Il faut deux tests dans la même carte :

- un pour le dosage qualitatif : PSA oui ou non

- un pour le dosage semi-quantitatif si excès de PSA. Le sigle imprimé pour le premier test est "PSA" qui s'affiche en cas de présence de PSA.

Le sigle pour le second test sera "> 4 ng" . De telle sorte que si le PSA est inférieur à 0,4 ng/ml la fin du test montre simplement "PSA" . Par contre, s'il y a excès de PSA, le résultat sera : ιι p_SA π

" > 0,4 ng" Voir les figures 3 à 5.

On peut associer à ce test un dosage chimique colorimétrique des phosphatases acides dont l'excès indique l'atteinte des os par le processus malin' venant de la prostate.

EXEMPLE 6 - Dosage semi-quantitatif de LH urinaire Détection du pic de LH (ovulation)

La carte comprend dix tests contigus : un par jour du

7ème au 16ème jour du cycle. On prépare et on assemble en parallèle dans un même boîtier: dix bandes supérieures supportant des anticorps monoclonaux anti-LH urine marqués à la phosphatase alcaline;

- dix membranes sélectives utilisant la méthode des anti-f(ab' ) 12 décrite dans FR-A-2 667 943, qui permettent de faire un dosage semi-quantitatif ; et

- dix bandes de révélation comportant une goutte de tampon carbonate 0,1 M comme réactif d'amplification et une goutte de substrat chromogène spécifique à la phosphatase alcaline comme réactif d'affichage du résultat du test, de façon à former dix tests indépendants.

Dix pipettes sont fournies pour prélever 50 μl d'urine pour chaque jour du test.

Le signal sera tout simplement un rond bleu accompagné de l'habituel rond rose de fin de test. Chez une femme normale la carte va montrer à la fin des dix jours de tests, une première succession de ronds incolores (les 3 ou 4 premières) suivis de 3 ou 4 ronds bleus (signal d'excès de LH) , suivis à leur tout d'une succession de ronds incolores (les 3 ou 4 dernières) . II est très intéressant de noter que l'élévation de LH se fait en réalité dès le lOème jour dans les urines mais que l'ovulation ne se fait que le 13ème jour. Or les spermatozoïdes survivent chez la femme 2 à 3 jours après les rapports. Le fait que le signal apparaît ^'3 jours avant l'ovulation, permet donc de préconiser l'abstinence assez tôt. Mais comme l'ovule ne survit que peu de temps après l'ovulation en l'absence de spermatozoïdes, la persistance du signal bleu les 14ème et 15ème jours ne permet pas la reprise des rapports sans risque de rencontre de spermatozoïdes avec un ovule encore fonctionnel. EXEMPLE 7 - Combinaisons de marqueurs tumoraux et cytokines- De très nombreuses combinaisons peuvent être insérées dans la même carte surtout avec l'arrivée de nouveaux marqueurs beaucoup plus spécifiques. Un exemple de combinaisons :

CEA (Antigène carcino-embryonnaire) - AFP (alpha foeto protéine) - CA 19-9 (en théorie spécifique du pancréas mais apparaît dans d'autres cancers) - CA 15-5 (en théorie spécifique du sein) - CA 153 (ovaires) .

On peut associer le dosage de cytokines : certaines interleukines peuvent harmonieusement compléter une carte de marqueurs tumoraux.

On peut y associer un dosage chimique du fer (effondré dans les processus malins) .

Une carte de détection de la Maladie de Hodgkin est possible en y associant la détection d' interleukines impliquées dans les hemopathies malignes, avec certains marqueurs et surtout avec les dosages chimiques de cuivre

(très augmenté) et du fer (effondré) .

Une carte de suivi des chimiothérapies d'une grande utilité peut être obtenue en associant le dosage des G-CSF (Growth colonies stimulating factors) , qui appartiennent au groupe des cytokines qui ont rendu possible l'usage de quantités plus importantes de chimiothérapie en stimulant fortement le renouvellement et la croissance de nouveaux leucocytes et éviter l'aplasie médullaire post- chimiothérapique. Ces nouvelles thérapeutiques sont de maniement extrêmement délicat (l'interféron par exemple est responsable de désordres graves et d'intolérances sévères) . Le suivi par une carte de dosage de ces substances éviterait les accidents de surdosage.

Claims

REVENDICATIONS

1. Dispositif de test immunologique pour la détection de la présence ou non d'un ligand dans un échantillon de fluide biologique comprenant : une membrane supérieure de complexation, poreuse, sensiblement non absorbante vis-à-vis de l'échantillon, destinée à recevoir l'échantillon et portant un réactif marqué par une enzyme capable de former un complexe immun marqué avec ledit ligand ; une membrane intermédiaire de sélection, poreuse, sensiblement non absorbante vis-à-vis de l'échantillon, portant un réactif laissant sélectivement passer ledit complexe immun marqué, mais non le réactif marqué non complexé ; et une membrane de révélation, poreuse et absorbante, comportant au moins un réactif capable de développer une coloration lorsque du complexe immun marqué diffuse dans cette membrane de révélation, caractérisé en ce que ladite membrane inférieure de révélation est constituée par une bande dont une partie est recouverte par la membrane intermédiaire de sélection et dont l'autre partie est non recouverte par les membranes supérieure et intermédiaire, la partie non recouverte constituant la zone de révélation et la partie recouverte étant exempte de réactif participant à la révélation.

2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que la zone de révélation comporte successivement en s'éloignant de la partie recouverte une zone comportant au moins un réactif d'amplification, une zone de lecture du résultat du test, et, facultativement, une zone de lecture d'un signal de fin de test.

3. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'une zone exempte de tout réactif participant à la révélation est interposée entre la partie recouverte et la zone à réactif d'amplification.

4. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que les membranes et bande constitutives du présent dispositif sont disposées dans une enveloppe comportant, sur sa face supérieure, des fenêtres convenablement disposées et permettant la dépose de l'échantillon de fluide biologique à tester sur la membrane supérieure, la lecture du résultat du test, et, le cas échéant, la lecture du signal de fin de test.

5. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'au moins une des fenêtres est sous la forme de signes transparents.