JPH01140066A - 指示流診断装置および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は液体試料中の分析質（ａｎａｌｙｔｅ　）検定
のための装置および方法に関する。より詳しくは、本発
明は生物検体から得た液体試料中の分析質に対する固定
化特異結合性レセプターを用いるＷ！および方法に関す
る。

発明の背景 生物検体から得た試料中の特定物質の存在または量を測
定できる検定システムの開発に長い間関心があった。過
去２０年にわたって特定標的物質を指向する天然存在レ
セプターを用いる検定が、臨床的に重要な物質の検出に
有用な診断具を与えた。従来技術に多くの免疫検定があ
り、免疫対の１成分例えば抗原または抗体が、検出可能
シグナルを与える標識で標識した相補パートナ−の使用
により検出または測定される。

競合結合法として知られる１検定法においては、検出さ
れる物質が限定数のレセプタ一部位に対し同一物質の標
識試薬と競合する。例えば、液体試料中の未知量の選択
抗原の検出のために、既知量の抗原を試料に添加し、次
いで抗原に特異性のレセプター抗体と接触させる。抗体
に結合する標識抗原の量は試料中の未知抗原の量に反比
例する。

サンドインチ検定として知られる他の検定においては、
レセプター抗体を固体表面に結合させ、試料中の選択抗
原をその抗体に結合させる。次いで結合した抗原に結合
できる第２標識抗体を抗原と反応させて固定化された反
応生成物を形成させる。反応生成物中の標識が試料中の
抗原の存在の指標として検出される。

サンドインチ法を用いる抗原の検出または測定のために
、抗血清が標識抗体および表面上のレセプター抗４の両
方に対して長年にわたり使用された。より最近には単ク
ローン性抗体がそのような検定における抗血清の代りに
使用された。ワダ（Ｗａｄａ　）ほか、クリニカル・ケ
ミストリー（Ｃｌ１ｎ。

Ｃｈｅｎ＋、）、２８　　（９）：１９８６〜１９６６
（１９８２）に記載された１つのそのような系において
、レセプター抗体が特定抗原、ｈＣＧ、のｌサブユニッ
トに向けられ、酵素標識単クローン性抗体が他のサブユ
ニットに向けられた。この検定において、レセプター抗
体が試験管の内面に固定化され、それに試料が添加され
た。

固体表面上の反応は、固定化試薬と試料中の分析質との
間の接触が限定されるので、比較的遅いことができる。

検定時間は、多孔性膜内にレセプター抗体を固定化し、
三次元マトリック大中で抗体分子を暴露することにより
短縮された。多くのそのような系において、標的抗原を
含む液体試料が膜を通して下層吸収性物質中へ吸込まれ
る。競合結合検定における使用に開示されたそのような
系の１つは米国特許第３．８８８，６２９号である。競
合またはサンドインチ検定における使用に対して開示さ
れた他の系には米国特許第４，２４６，３３９号、第４
．３６６．２４１号、第４，６３２，９０１号が含まれ
る。

しかし、そのような検定系の多くはフィルターの表面上
に微粒物質の析出を許し、従って、例えば発色団標識を
用いるときに結果が不鮮明になる。

さらに、これらのシステムは試料中の液体の流量を制御
する手段を備えていない。米国特許第４．６２３．４６
１号の系は、吸収性物質をフィルターの周辺領域とのみ
結合させることにより液体試料を強制的にフィルターの
周囲へ横切って流すことによるこれらの問題の処理を試
みてい墨。この系はフィルター表面上の微粒物質の析出
を低下させ分析質の改良された分離を生ずるといわれる
。

残念ながら、膜の横断面の前面表面積が全く小さいので
、液体は吸収剤中へ完全に通過するのに必然的に長時間
を要する。さらに、異なる膜に変えることなく流通特性
を変えることができない。

従って、膜結合レセプター検定の感度および分離を改善
し、同時に検定系の流体流れ特性を制御することが望ま
しい。

反応物を固定化する膜の厚さおよび細孔大きさ以外の方
法により系の流体流れ特性を制御することもまた望まし
い。

発明の開示 本発明は液体試料殊に生物検体から得られる試料中の分
析質を検出する検定装置および方法を提供する。本発明
の装置は標的物質に直接または間接に結合できる固定化
レセプターを有する多孔性反応膜を含む。装置はまた多
孔性反応膜の近隣に配置され、液体試料を吸収できる吸
収性物質の体を含む、これらの成分の間に、典型的には
１つまたはそれ以上の選択された通口を有するシートの
形態で、多孔性膜を吸収性物質体から実質的に分離でき
、同時に液体試料の流れを多孔性膜から吸収性物質体へ
向かわせることができる隔膜が配置される。

液体試料は膜上の検出可能反応生成物の形成に対して検
出される。好ましい検定態様において、液体試料は生物
学的に得られ（例えば尿または血清）、膜上に固定化さ
れたレセプターにより結合されることができる標的物質
、典型的には抗原、抗体またはハプテンを含むと思われ
る。

サンドインチ検定における選択抗原の検出において、レ
セプター抗体試薬（それに抗原が結合する）が膜上に固
定化される。流体試料中の標的抗原がレセプター抗体に
結合される。次いで第２試薬、標的抗原に結合できる可
溶性標識抗体、を結合抗原と反応させて検出可能反応生
成物を膜上に形成させる。これらの反応は同時または連
続的であることができる。

好ましい態様において、装置は多孔性膜を吸収性物質体
から実質的に分離する液体不透過性メンプラン隔膜また
はシートを含む。この隔膜は液体流を優先的に多孔性膜
の中心の方へ、またはそれから離れて向かわせるように
配置された溝または通口を設けられる。

他の好ましい態様において、隔膜は不透過性メンプラン
隔膜の少くとも１つの溝中に多孔性物質の体を含む。こ
の体は接触地点でのみ多孔性膜と吸収性物質体との間の
液体流を高める溝または導管を与える。

他の好ましい態様において、レセプター試薬が膜上の少
くとも１つの規定された領域、例えばドツト、中に集中
され、検出可能反応生成物がドツトに形成される。例え
ば、選択抗原に対するサンドイッチ検定について説明す
ると、レセプター抗体が膜上のドツトに固定され、抗原
を結合させる。

次いで結合抗原を引続いて結合抗原に結合できる標識抗
体と反応させる。種々の抗原（または抗体）と特異反応
性の抗体（または抗原）を用いる多ドツトを用いて試料
中の種々の抗原を同時に検定することもまたできる。

なお他の好ましい態様において、レセプター試薬が、紙
または他の物質例えばポリニスデルまたはガラス繊維で
裏打されたニトロセルロースを含む多孔性膜上に固定化
される。

好ましい態様の説明 本発明は流体試料、殊に生物検体から得られる試料、中
の標的物質の分析質を検出する新規かつ改良された検定
装置および方法を提供する。本発明の装置は標的物質に
直接または間接に結合できる固定化レセプターを有する
多孔性反応膜を含む。

装置はまた多孔性膜近隣に配置され、液体試料を吸収で
きる吸収性物質の体を含む。これらの成分の間に、多孔
性膜を吸収性物質体から実質的に分離でき、同時に隔膜
を貫通する通口または溝により多孔性物質に対する液体
試料の流れを吸着性物質体へ実質的に向かわせることが
できる隔膜またはシートの形態の分離装置が配置される
。

次に第１図について説明すると、第１図は本発明による
代表的な検定装置１０を示す。装置は方形形状で与えら
れているけれども、他の適当な形状を用いることができ
゛、便宜には壁により拘束される倒立フラストコニカル
　ウェルの形状であることができる液体を受け、−時的
に貯蔵する開口部装置を備えることができる。

本発明の装置は、第１図の装置の縦断面を示す第２図に
一層詳細に開示される。それに示されるように、装置は
中空受容空間または室２６を規定する容器装置の形態で
例示される。この空間の境界は、こ−に便宜上ベースお
よびカバーとしてそれぞれ示す２成分１４および１２に
より与えられる。これらの成分は使い捨てプラスチック
材料例えばポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロ
ピレン、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニル、あるいは
望むならば装置１０の再使用を可能にする耐久性材料例
えば金属（例えばアルミニウム）で適当に形成される。

受容空間２６が隔膜２０により多孔性反応膜装置１８か
ら分離された吸収性物質の体２４を含むことが示され、
その機能は後により詳細に説明される。示されるように
、カバー１２は、液体試料を受け、その膜１８との接触
を促進するように便宜に造形された液体保持リングまた
は壁により拘束されたウェル１６を含む。ウェル１６の
大きさを受容客間２６および吸収性物質体２４と選択的
に合わせることにより本発明の操作を簡単にでき、例え
ば、全液体試料または場合による洗浄液体を１段階の操
作としてウェル１６中に置くことができる。

示されるように、膜装置１８は外部から見える上面を有
する多孔性反応膜を含む。反応膜は試薬と試料成分との
反応生成物を反応に不利に影響させないで固定化できる
任意の型のものであることができ、液体試料の残部また
は洗浄溶液を通過させる。適当な膜は本発明の実施に使
用されるレセブター試薬を固定化できる任意の材料、例
えばナイロン、ガラス繊維あるいは選択レセプターに直
接または間接に結合できる他の天然または合成材料で形
成することができる。膜の多孔度は好ましくは約０．２
〜約１２ミクロンである。

しかし、現在好ましい態様として、膜装置１８には紙裏
打ニトロセルロース、または類似の特性を有する他の型
のニトロセルロース膜が含まれる。

この態様には濾紙に類似する多孔性紙で裏打されたニト
ロセルロース膜が含まれる。代表的な例はシュライチャ
ー・アンド・シューエル（Ｓｃｈ　Ｉｅ　１ｃｈｅｒａ
ｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）により商品名ＢＡＣ−Ｔ−ＫＯ
ＴＥで市販されている。この好ましい膜はニトロセルロ
ース単独よりも実質的に耐久性であり、他の支持成分な
く用いることができる。またそれは反応に対する高い感
度を与える。また、例えばミクロン自セパレーション社
（Ｍｉｃｒｏｎ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ、　　Ｉｎ、）
によりニトロプラス（ＮＩＴＲＯＰＬＵＳ）名で供給さ
れるポリエステル支持ニトロセルロースを使用すること
ができる。

後記のように、典型的な系において、初めに結合性試薬
を膜上に固定化する。試薬は検定される液体試料の予定
標的物質と反応してそれを捕捉する。そのような試薬、
典型的には免疫タンパク質例えば抗体または抗原、をそ
のような膜例えばニトロセルロース上に直接または間接
に吸着または共有結合により固定化することができる。

膜の深さまたは厚さは結合性試薬の通出な量を固定化し
て試料成分を捕捉できるように選ばれる。

しかし、厚さは膜を通る液体試料の通過が不当な遅延を
生ずるほど大きくすべきではない。

本装置の吸着性物質体２４は、例えば毛細管作用により
多孔性膜を通して液体を吸込む働きをする公知の普通に
使用される吸着性物質を用いることができる。有用な公
知物質には酢酸セルロース繊維、ポリエステル、ポリオ
レフィンまたは他のそのような物質が含まれる。また市
販濾紙またはトイレットペーパーの層の使用もまた便利
であると認められ、それは本発明の検定の間に使用され
る液体の吸収に十分な容積を与えるように選ぶことがで
きる。

第２図に示されるように、膜装置１８の吸収性物質体２
４からの実質的な分離は隔膜２０の形態の分離装置であ
る。隔膜２０は本発明の装置に使用される容器に適する
外側寸法を有する。例えば第３Ａ図に示されるように、
第２図中のベース１４にカバー１２を対置することによ
り適所に保持され、密閉される十分な大きさの膜を含む
隔膜２０を与えることができる。この方法でシールが形
成され、それが反応膜１８の周囲の液体流を防ぎ、隔膜
２０中の開口部または通口（ｐｏｒｔ　）２２を通る流
れを生ずる。適当な隔膜メンプランは液体に実質的に不
透過性であり、望ましくは本発明の実施に使用される試
薬と反応性でなくまたはそれにより損傷されない任意の
材料、例えばプラスチック材料例えばポリエチレン、ポ
リプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルなどの膜
で形成されることができる。

さらに第３Ａ図について説明すると、隔膜不透過性メン
プラン２０はその上に帯域２１が配置され、その境界は
フラスコニカルウエル１６の下部寸法に近似する想像線
である。これは液体が多孔性膜１８の下面から吸着性物
質体２４へ流れる傾向がある帯域である。第３Ａ図の隔
膜態様中の帯域２１の中心内またはその方へ通路または
通口２２ａが配置され、それは液体が流通できる吸収性
の透過性物質で満たされる開口部である。本発明の特定
態様において、第３Ａ図および第３Ｃ図に例示されるよ
うに、これらの通路２２ａおよび２２ｃはそれぞれ固定
化レセプターの中心から、または典型的には帯域２１の
中心部中に半径方向に間隔を置かれ、流体の流れを固定
化レセプターの中心から離れ、周辺の方へ向かわせる。

代替として、第３Ｂ図において装置は固定化レセプター
の中心に近い通路２２ｂが与えられ、それは液体流を帯
域２１の中心の方へ向かわせる傾向がある。

この現象は以下に一層詳細に記載される。

第４図および第５Ａ〜５０図は、吸収性物質体２４と同
様かまたは異なる物質であることができる吸収性物質の
環状リング２３の種々の組合せを用いる他の隔膜装置２
０を例示する。第４図のこの環状リング２３は膜１８と
体２４との間に単なる分離を与え、吸収性物質体の対面
する表面の限定部分間の選択流体流接触を可能にする。

リングは膜１８と体１２との間の圧力により適所に保持
される。実際に隔膜または分離装置は空隔膜を貫通する
通口として働くリング２３の周囲および内の空領域であ
る。

第５Ａ図は第４図の装置に使用される形態におけるリン
グ２３ａの平面図の例示である。環状リング２３ａの外
側寸法は帯域２１の境界寸法に一般に近似するかまたは
それ未満である。この態様において、多孔性膜１８を通
る液体流は帯域２１の中心から離れ、リング２３ａの体
により与えられる通路を通って向かわされる傾向がある
。

第５Ｂ図を参照すると、他の態様として、隔膜２０は、
前記隔膜２０のシートと同様であることができる実質的
に液体不透過性物質の内側部分またはディスク２５ｂを
含むリング２３ｂの形態である。ディスク２５ｂは膜装
置１８および吸収性物質体２４の中心部間の不注意な接
触を防ぎ、従って、その結果指示されない液体流を防ぐ
ことにより環状リング２３ｂの流れ指向能力を高める傾
向がある。これに関し、分離装置はリング２３ｂの外側
の空領域とディスク２５ｂとの組合せである。

さらに他の態様として、隔膜２０が第５Ｃ図に、第３Ａ
図の態様に与えたと同様の液体不透過性物質の膜として
示される。これに関し、吸収性物質が不透過性隔膜シー
ト２０中へ挿入され、不透過性ディスク２５ｃを保持す
る。この完全隔膜は本発明の装置中の液体流に一層の制
御を与える。

第６図について説明すると、他の態様の装置が液体を送
り込む比較的幅広いリムを規定する装置あるいは装置ハ
ウジングまたは境界１４を含む。

また膜１８および吸収性物質体２４は開口空間の全内側
を横切ってのび第４図の態様のような環状開口部を残さ
ない。隔膜２０は第５Ｃ図に示されるものと同様の型を
有する。これに関し、矢印により示されるように液体は
反応膜１８を通り、典　　　′盟約には液体にさらされ
る膜１８の上面の中心に配置される固定化レセプターの
中心から優先的に離れて流れる。これは不透過性隔膜２
０に包囲され、中心に不透過性ディスク２０ｃを保持す
る吸収性物質２０ｂのリングにより起こされる。従って
、膜１８の上面上の液体は単に通口２０ｂを通って流れ
ることができ、固定化レセプターの中心から離れた流れ
を生ずる。

第７図の装置は第６図の装置に類似するが、しかしその
隔膜については第４図のものに類似する。

これに関し、隔膜はリングの中心および外側に対して全
く空の領域を有するリング２３ａを含む。

膜１８と吸収性物質２４との間の有効な流体接触はリン
グ２３ａによりなされ、それを通して液体は第６図の装
置のパターンのように流れる。第４図のように、これは
液体が流れに対する抵抗が一層少ない吸収性物質通口を
通る経路を有すれば開空間が実際に分離装置を構成でき
ることを示す。

第８図について説明すると、装置は第６図のものに類似
するが、しかし一定の重要な差異を有する。膜１８は第
７図における膜１８よりも小さい直径のデイイスクの形
態である。最も重要な差異はその隔膜２０が、離れるよ
りはむしろ固定化レセプターの中心（または膜１８の中
心）の方へ流体を流れさせるように設計されることであ
る。これは通口２０ａを固定化レセプター中心の直下の
領域に形成することにより達成される。例示態様におい
て通口２０ａは膜１８の露出上面の周辺より実質的に小
さい直径を有する円形ディスクである。これに関し、通
口２０ａは開口であるが、しかし他の態様のように、吸
収性物質を開口部中に配置して通口として働かせること
ができる。

本発明の他の態様が第９図に例示される。他の装置と同
様に、これに関して吸収性物質２４の体が柔軟である。

装置はさらに、吸収性物質中へ上方に固定化レセプター
の中心の方へ突出するプラットホーム装置を、適当には
台またはプラグ３０の形態で含む。示されるようにプラ
グ３０は、好ましくは吸収性物質体２４．に対して圧縮
したときにたわみ性不透過性シート２０を多少中高形状
にたわませ、相応して非たわみ形状の通口装置を中心の
方へ変形させる十分な上向きの圧力が吸収性物質に対し
て加えられる十分な高さである。さらに、吸収性物質が
繊維３２例えば濾紙または紙タオルの多層を含む場合に
、プラグ３０上の層がチョウの翅のようにゆるく低下す
る傾向がある。この方法で空間が濾紙間に溝の形態で生
じ、堅く圧縮された吸収性紙に比べて改良された流れを
与える。

本発明の重要な特徴は、隔膜を通る通口の配置および型
の選択により試験試料の流れを固定化レセプターの中心
から離れてまたはその方へ向かわせることにより反応の
速度論を最適化する能力である。流れの速度は使用者の
便宜のために速いが、しかし、標的物質が捕捉されるよ
うに十分遅いように調整される。また一定高粘度試料例
えば血清に対しては中心から離れて流れることが望まし
く、そうでないとそれが反応膜を詰らせる傾向がある。

逆に、詰まりが問題でなく、また低濃度の標的物質が存
在するであろう低粘度試料例えば尿に対しては液体を反
応膜の中心へ向って流すことが望ましい。

操作において、この系の検定装置は液体試料中の分析質
の存在の測定に広く使用され、少くとも１種の試薬を用
いて膜１８上に検出可能生成物を、分析質が試料中に存
在する指標として形成させる。

液体試料はウェル１６中の開口部を通して導入すること
により膜装置１８の１側面上で接触させる。

膜１８を透過した後液体は吸収性物質体２４によりその
中へ吸込まれる。しかし、この装置の隔膜１００作用に
よりこの液体の流れの速度および方向は、膜１８の下面
と吸収性物質体２４の表面との間の液体流が通路２２ま
たは吸収性物質−員２３により与えられる導管を通るよ
うに強制され向かわされるので、制御することができる
。水元、明による検定の操作はさらに次に詳細に記載さ
れる。

第２〜７図および第９図の特定装置に対し、流れは固定
化レセプターの中心から離れるように向かわされる。好
ましい態様においてレセプターは膜１８の全有効上面の
小領域（例えばドツト）中に配置される。これに関し、
試料が主にこの小領域の外側境界に近いパターンで流れ
ることが好ましい。この方法で、大部分（好ましくは実
質的にすべて）の液体試料が、隔膜を貫通する通口が開
中心であるときのような領域の中心に集中するよりはむ
しろ試料周辺に接触する。後者の形態の通口は粘性流体
例えば血清に対して中心の詰まりを生ずることができる
。これに反し、隔膜が全く使用されないときのような領
域の周辺周囲を大部分がバイパスするよりはむしろ実質
的にすべての試料がレセプター領域に接触するように通
口（類）が形成される。この目的に対する隔膜通口の好
ましい形態は連続または不連続リング、あるいはこの環
状流を生ずるそれらの等個物である。流れパターンのこ
の調整により低濃度試料（例えば血清中のＨＩＶ抗体）
に対する系の感度が膜の詰まりなく高められる。

第８図の装置に対する流れは開中心隔膜の使用により、
例えばドツトの形態の固定化レセプターの中心の方へ向
かわされる。好ましくは、開中心はドツトの外周に相当
する寸法の外周を有する。

この態様は低粘度の、標的物質を低濃度で有する試料に
対する速度論および感度高めるのに殊に有用である。

系は試料成分が抗原、抗体またはハブテンを含む免疫対
の１成分である免疫検定に殊に適用できる。免疫対には
互いに免疫的に結合する２成分が含まれる。特定免疫対
には抗原とそれらの抗体（単クローン性抗体または多ク
ローン性抗体）、生物学機能性のハプテンとそれらの抗
体、酵素とそれらの基質、ホルモンとそれらのレセプタ
ー、ビタミンとそれらのレセプター、ビオチンとアビジ
またはビオチンに対する抗体、並びにレクチンとその特
異結合単糖、三糖または三糖が含まれる。

記載を簡単にするため、系は抗原−抗体免疫対を用いる
免疫検定に関して記載される。液体試料は生物由来（例
えば尿または血清）であり、ｌ試薬は標識された抗原ま
たは抗体を含む。

初めに抗原の検定に対するサンドインチ検定について説
明すると、ｌ試薬は試料中の予定抗原に特異性の標識抗
体である。この系は、装置に対する液体試料の添加前に
膜ディスク２４ａ上に固定化された第２試薬、また予定
抗原に特異性の捕捉抗体、を用いる。タンパク質例えば
単クローン性または多クローン性抗体を固体表面例えば
膜ディスク２４ａに失活なく固定化する方法はよく知ら
れている。例えばシュールズ（５ｃｈｕｕｒｓ　）　、
米国特許第３，５５１．５５５号およびヘントリ（Ｆｌ
ｅｎｄｒｙ　）ほか、ジャーナル・オブ・イムノロジカ
ル・メソーズ（Ｊ、　Ｉｍｍｕ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　）
、３５．１９８０，２８５参照。プラスチック材料例え
ばナイロンに対しそのようなタンパク質を例えば米国特
許第３，７２０．７６０号に記載されたように共有結合
により固定化できる。ナイロンの単位領域当りに固定化
されるタンパク質の量はニトロルロースに対する量より
大きい。

サンドイッチ検定に関して記載された標識された抗体ま
たは抗原は抗体に結合される放射性、酵素または金属錯
体標識を含む任意の普通の型のものであることができる
。そのような免疫物質と標識との間の結合の形成はよく
知られ、例えば放射性標識−米国特許第３．６４６．３
４６号、ハンター（Ｈｕｎｔｅｒ　）ほか、ネイチ−ｐ
　−（Ｎａｔｕｒｅ　）、１４２（１９６２）　、９４
５　、（ｂ）酵素標識−米国特許第３，６５４，０９０
号、第３，７９１，９３１号および第３．８１７，８３
８号、ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ　）ほか、「免疫けい
光および関連染色法（Ｉｍ＋＋ｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃ
ｅｎｃｅａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｓｔｉｎｎｉｎｇ　
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　）　ｊ　、クナップ（Ｋｎａｐ
ｐ、、　１．）ほか編、エル・セピア−ノース・ホラン
ド（Ｌ、　５ｅｖｉｅｒ−Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ
　）　、バイオ・メディカル・プレス（Ｂｉｏ−Ｍｅｄ
ｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮｅｗＹｏｒｋ−Ａｍｓｔｅ
ｒｄａｍ　）、１９７８、ｐｐ２１５〜２２４；（Ｃ）
けい光消化剤標識−米国特許第３．９９６．３４５号：
　（ｄ）放射性標識−米国特許第４，０６２，７３３号
；（ｅ）けい光または酵素標識−米国特許第４．０６７
．９５９号；　（ｆ）化学発光標識−米国特許第４、１
０４．０２９号；　（ｇ）非酵素触媒標識−米国特許第
４，１６０．６４５号；　（ｈ）酵素対標識−米国特許
第４．２３３，４０２号、化学誘発けい光標識−第４，
７２０，４５０号；並びに（ｉ）酵素非イオン電荷標識
−米国特許第４．２８７．３００号参照。さらに、米国
特許第４．３６６．２４１号に開示された標識もまた使
用できる。

またコロイド金標識は以下に詳細に論議される。

プローブとして有用なコロイド金結合体例えば細胞化学
標識は顕微鏡検査によ（知られている。

例えばスキャンニング・エレクトロン・マイクロスコピ
ー（Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏ
ｓｃｏｐｙ　）、１９８１、■、Ｉ）＋１．　９〜３１
、「イムノサイトケミストリー（Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　Ｊ　、ボラク（Ｐｏ１ａｋ、
　　Ｊ、　Ｎ、　）ほか編、ブリストル（Ｂｒ１ｓｔａ
ｌ。

Ｌｏｎｄｏｎ、Ｈｏ５ｔｏｎ　）、（１９８０）　ｐｐ
−８２〜１１２およびジャーナル・オブ・ニューロサイ
エンス・メソーズ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ）、７　（１９８３）
　、ｐｐ、１〜１８参照。コロイド金粒子標識は他の普
通の標識に比べて使用が簡単である。例えば、それらは
他の標識例えば放射性同位体の検出に必要な装置を必要
としない。さらに、酵素と異なり、それらは基質を加え
る追加段階を必要としない。しかし、それらは、おそら
く反応物の混合に対して普通の方法を用いる可視化のそ
れらの低水準のために市販免疫検定キットに広範には使
用されなかった。例えば、以前の膜系におけるコロイド
金結合体を用いる検定の感度は所望水準の感度を与える
には十分でないと思われた。

膜を通る液体試料および試薬の流れを指向させることに
より感度が改善され、コロイド金粒子結合体が高価な顕
微の使用を必要としない免疫検定キットに有用な試薬で
あることが認められた。

この系の増大でも金−免疫試薬結合体の感度が不十分で
あれば、ホルゲート（Ｈｏｌｇａｔｅ、　Ｃ，Ｓ、　）
ほか、ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・アンド
・サイトケミストリー（Ｊ、　Ｉｌｉｓｔｏｃｈｅｍ。

Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、）、３１：９３８　（１９８３）お
よびダンク＋−（Ｄａｎｃｈｅｒ、　Ｇ、　）ほか、ジ
ャーナル・オプ・ヒストケミストリー・アンド・サイト
ケミストリー（Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏ
ｃｈｅｍ、　）　、３１　：１３９４　（１９８３）に
開示されたような金措体の感度を高める方法を用いるこ
とができる。この方式はコロイド金に吸収された免疫試
薬、免疫グロブリン、を用いる「間接」法である。金粒
子は銀沈殿反応により示される。本質的に、銀増強は恨
イオンを銀金属に転化する写真の物理的現像剤プロセス
を触媒する金の触媒効果を利用する。適当なコロイド金
または金ゾル粒径は３〜１５０ｎｍである。この免疫金
−銀染色法は銀染色のない金粒子の使用に比べて２００
倍までの高い感度を有することができる。

指向流の効果は、免疫試薬が下記のように特定領域例え
ば膜上のドツトに集中されたときに殊に明らかである。

その場合に、固定化抗体は単にその１つのドツトに付着
される。普通の方法においてはドツト上の想像カラム中
の試料中の抗原のみが抗体に接触する。試料中の残余抗
原はそのような接触なく膜を通過する。対照的に、抗原
を含む液体試料の流れを指向させると膜上の固定化抗体
に対する有意に多くの抗原の暴露を生じ前記有利な結果
を有する。この高い効率の原理がこの系を使用できる任
意の普通の免疫検定に適用される。

また高い効率または相互作用が反応物の局部濃度を高め
、それが反応速度論を高める。

本発明はまた競合結合法に適用できる。液体試料中の抗
原の検出に対するそのような系において、免疫対の相応
−員、すなわち抗体、が膜表面に固定化される。試料中
の検出される抗原分析質と同様の免疫特性の前記のよう
に標識した抗原を膜上の固定化抗体と接触させる。固定
化抗体は限定量にあり、従って競合が試料中の抗原と標
識抗原との間に生ずる。従って、標識から出るシグナル
が試料中の抗原の量に反比例する。サンドインチ検定と
同様に、競合結合検定は抗原および抗体の役割を逆にす
ることより行なうことができる。この場合に免疫対の固
定化具は標識抗体と競合する試料中の抗体を検出する抗
原である。

記載された免疫検定はサンドインチ検定および競合結合
検定である。系が、例えば米国特許筒４．３６６．３４
１号に記載されたような他の免疫検定にもまた有用であ
ることを理解すべきである。

分析される物質には種々の生物由来物質、例えばタンパ
ク質、が含まれる。下記はこれらの物質の若干のリスト
である。（列挙した物質はまた免疫的に反応性の抗体お
よび物質のフラクションを含む）。

免炎久ニブ斐ｌ ■ｇＥ ｇＡ ｇＭ ｇＤ 好気性芽胞形成菌 バシラス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｎｔｈ
ｒａｃｉｓ　）バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　５ｕｄｔｉｌｌｉｓ　）バシラス・セレウス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　）嫌気性芽胞形成菌 （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ　
）プルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａｅ　） プルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ　ｍｅｌｉ
ｔｅｎｓｉｓ　）プルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌ
ｌａ　ａｂｏｒｔｕｓ　）プルセラ・スイス（Ｂｒｕｃ
ｅｌｌａ　５ｕｉｓ　）クラミジア（分類不能寄生体バ
クテリア／ウィルス）クラミジア物質（名称未定） コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ　）
エシェリキア・コリ（Ｉ！５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｉ　）真菌 カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃ
ａｎｓ　）ムコール・コリムビフエル（Ｍｕｃｏｒ　ｃ
ｏｒｙｍｂｉｆｅｒ）Ｈ，デクレイイ（Ｈ，ｄｕｃｒｅ
ｙｉ　）Ｈ，ヘモフィルス（Ｈ，ｈｅｍｏｐｈｉｌｌｕ
ｓ　）Ｈ，ニジブチウス（Ｈ，ａｅｇｙｐｔｉｃｕｓ　
）Ｈ，バラインフルエンゼ（Ｈ，ｐａｒａｉｎｆｌｕｅ
ｎｚａｅ　）マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉａ　）（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃ
ｕｌｏｓｉｓ　ｈｏｍｉｎｉｓ　）マイコプラズマ（Ｍ
ｙｃｏｐｌａｍａｓ　）マイコプラズマ・ニューモニエ （Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　）ナ
イセリア（Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　） ナイセリア・ゴル工（Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒ
ｒｈｅａｅ）他の病原体 パスツレラエ（Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌｌａｅ　）パスツレ
ラ・ペスチス（Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌｌａ　ｐｅｓｔｉｓ
）パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａ５ｔｃｕｒｅｌｌａ　
ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃ
ｉ　）リケッチア・モーセリ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ　
ｍｏｏｓｅｒｉ　）リケッチア・コノリ（Ｒｉｃｋｅｔ
ｔｓｉａ　ｃｏｎｏｒｉ　）リケッチア・ブルネチイ（
Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ　ｂｕｒｎｅｔｉｉ）サルモネラ
・チフオサ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｏｓａ　
）シゲラ・ボイディイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｂｏｙｄｉ
ｉ　）シゲラ・ディセンテリエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｄ
ｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）シゲラ・フレクスネリ（Ｓｈｉ
ｇｅｌｌａ　ｆｌｘｎｅｒｉ　）シゲラ・シュミツイー
（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｓｃｈｍｉｔｚｉｉ　）シゲラ・
ソンネイ（５ｈｉｅｌｌａ　５ｏｎｎｅｔ　）スタヒロ
コツカス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ　）ストレプト
コッカス（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ　）群Ｂ、　Ｃ，
Ｄ、　Ｆ、　Ｇ。

スピロヘーテス（５ｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ　）トレポネ
ーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｐａｌｌｉｄｕ
ｍ）ボレリア・レカレンチス（Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｒｅ
ｃｕｒｒｅｎｔｉｓ）イヌレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓ
ｐｉｒａ　ｃａｎｉｃｏｌａ　）トキソプラズマ・ボン
ブイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ　ｇｏｎｄｉｉ　）濾胞刺
激ホルモン 黄体形成ホルモン（間細胞刺激ホルモン）副甲状腺ホル
モン プロラクチン 絨毛性ゴナドトロピン インスリン グルカゴン レラキシン ソマトロピン トリョードチロニン チロカルシトニン チロキシン ■罐主止天ｌ アンギオテンシンＩおよび■ ブラジキニン ガストリン ヒト胎盤性ラクトゲン セクレチン ペプチドホルモン オキシトシン バソプレッシン ウィルス アデノウィルス アルボウィルス 東部ウマ脳炎ウィルス 西部ウマ脳炎ウィルス シンドビスウイルス セムリキ森林ウィルス セントルイス脳炎ウィルス カリフォルニア脳炎ウィルス コロラドダニ熱ウィルス 黄熱ウィルス デング熱ウィルス 肝炎 肝炎Ａウィルス 肝炎Ｂウイルス ヘルペウスウイルス 単純庖疹、■および■型 水痘（チキン・ボックス） サイトメガロウィルス ミクソウィルス インフルエンザ（Ａ、ＢおよびＣ） パラインフルエンザ（１〜４） ムンプスウィルス ニューカッスル病ウィルス 麻疹ウィルス イヌジステンパーウィルス ＲＳウィルス 風疹ウィルス ピコルナウィルス ポリオウィルス コックスサラキーウィルス エコーウィルス ライノウィルス ボックスウイルス ワクシニア 伝染性軟ゆう 系はまた、免疫検定として類別されない他の検定系例え
ば未知ＤＮＡ配列の検出に適用できる。

例えば、未知ＤＮＡ配列を含む液体試料を膜に通し、膜
上に予め固定化されたＤＮＡとの接触により膜上に固定
化させる。次いで標識ＤＮＡプローブを液体中で膜に通
す。ハイブリッド形成が生ずれば、標識ＤＮＡプローブ
が膜表面上に検出可能形態に保持される。この系はポル
スキー・シンキン（Ｐｏ１ｓｋｙ−Ｃｙｎｋｉｎ、　Ｒ
，）、クリニカル・ケミストリー（Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅ
ｗ、　）　、３１　／　９．１４３８（１９８５）に記
載されている。

前記のように、殊に有効な検定において、免疫試薬は膜
上の少くとも１つの規定領域に集中され、それはドツト
として見えるが、しかし実際にはドツトには！′等しい
直径のカラム中に膜を通ってのびる。サンドインチまた
は競合結合法について説明すると、これは固定化させる
試薬を膜厚さを通して流すことによりそのような領域中
にのみ捕捉免疫試薬例えば抗原または抗体を固定化させ
ることにより達成される。試料成分との、および標識試
薬との反応はその領域中にのみ生ずる。

ドツト法は一定の利点例えば下記のように単一装置で多
重同時検定の性能を有する。またそれが単一領域に集中
されるので一層明瞭な最終生成物シグナルを与える。

ドツト法の他の利点は、それが試料中の多成分の同時検
出を可能にすることである。例えば単一検定装置で、予
定した異なる抗体を股上の別のスポット上に固定化でき
る。次いでいずれか１つの抗原を含むと思われる試料を
膜および２つの異なる一員に特異性の標識抗体と接触さ
せる。１つまたは他のドツトにおいて標識により生じた
シグナルが１つまたは両方の抗原の存在または存在しな
いことを示す。ドツトはそれらの位置により、またはそ
れぞれの固定化抗体ドツト付近の同定により相互に識別
できる。従って、例えば色が第１ドツトに表われるがし
かし第２ドツトに表われなければ第１抗原が存在するが
第２抗原が存在しない。

両ドツトが表われれば両抗原が存在し、ドツトが何ら表
われなければいずれの抗原も存在しない。

あるいは、標識を選択してそれぞれのドツトに異なる色
を生成させることができる。

この方式を拡大して膜上の相応数の固定化免疫試薬によ
り液体試料の２つ以上の成分の同時検出を包含させるこ
とができる。若干の場合に、第１抗体が多（の異なる抗
体の特定サブユニットと反応性である。第２抗体が１つ
の抗原のサブユニットにのみ特異性であれば、そのよう
な第２抗体を固定化抗体として用いることができ、単一
標識第１抗体を問題の抗原に対する普遍標識抗体として
使用できる。

普通の免疫検定の標準プロトコルを本発明に用いること
ができる。例えば、サンドインチ検定において、試料お
よび標識試薬の、添加の順序は同時または連続的である
ことができる。

単クローン性抗体が多クローン性抗体に比べて利点およ
び純度が知られているけれども、どの型の免疫試薬も本
発明により使用できる。

前記系はイエス−ノウ定量試験に関して記載されたけれ
ども、それはまた分析される成分の種々の既知濃度で生
じた適当なシグナル例えば色を用いると判定量試験とし
て適当であることを理解すべきである。従って、例えば
サンドインチ法による抗原の分析に対して系を段階希釈
で行ない、個々の希釈に対して予期される近似の色を得
ることができる。未知濃度の抗原をこれらの色と比較す
ると試料中に存在する抗原の近似の濃度が得られる。

さらに本発明の性質の開示が次の特定実施例により与え
られる。開示された実施例が本発明の範囲を限定するも
のでないことを理解すべきである。

実施例１ この実施例において第８図に示した型の装置が使用され
、試料は固定化レセプターの中心に向って優先的に流れ
る。サンドイッチ免疫検定は既知量のｈＣＧを含む尿試
料中の抗原ヒト絨毛性ゴナトロピン（ｈＣＧ）について
示される。単クローン性および多クローン性抗体を固定
化試薬および標識試薬のそれぞれに用いた。標識結合体
はフォルク（Ｆａｕｌｋ、　Ｗ、　Ｐ、　）ほか、イム
ノケミストリー（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、　）　、８　
：　１０８１　（１９８１）の操作に従って調製した金
ゾルを含む。簡単に記載すると、０．０１％クロロ金酸
溶液を含む蒸留水１００ｍｊ！を１％クエン酸三ナトリ
ウム４ＩＩｌｌと混合し、１５分間煮沸する。溶液は約
１の５２０ｎｍにおける光学濃度で黄色から赤色に変る
。

結合免疫試薬はメデイックス（Ｍｅｄｉｘ　）により供
給された抗αサブユニットｈＣＧ単りローン性抗体であ
る。祇裏打ニトロセルロースを含む膜１８　〔シュライ
チャー・アンド・シューエル（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　
ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ　）により供給された〕を用い
る。抗αｈＣＧ抗体は、予め濡らしたディスクに１〜２
ＩＩ１ｇ／ｌ１１１の濃度で５μの量を３回、直径約９
鶴の限定領域に適用する。乾燥後、接種ディスクを次に
ニトロセルロースとの非特異的結合を低下させるために
５％ＢＳＡおよび０．０１％Ｎａアジドをリン酸塩緩衝
食塩水中に含むブロッキング溶液とともにインキュベー
トし、前記装置中へ置く。

単りローン性抗βサブユニットｈＣＧ抗体〔メデイソク
ス（Ｍｅｄｉｘ　）により供給された〕をロス（Ｒｏｔ
ｈ　）、前掲、の操作に従ってこの金ゾルと結合させ、
−４５，６℃（−５０’Ｆ）の温度の浴中で凍結する。

次いでそれを凍結乾燥する。

１４０μｌの尿試料をウェル１６中に膜１８の上面上に
置く。そのとき試料溶液は膜１８を通り通路２２を通る
かまたは環状リング２３の導管を経て吸収性物質体２４
により吸込まれる。

１例として、膜１８の通過中に液体流は膜２８の下面に
対し隔膜装置２０中に設けた通路２２を通るように向け
られる。この方法で、検定の感度は、膜を横並びに縦に
通る流れを液体に起こさせることにより高められる。さ
らに液体の流量が通路の大きさにより制御され、検定反
応に対する最適インキュベーション時間の発生を可能に
する。

これは通常可能でない抗原濃度でコロイド金粒子を用い
て膜上の赤色ドツトの視覚読みを可能にする。

この実施例において１０２１ｍ床尿検体（５１＋および
５１−）を試験し、検体源の臨床所見と１００％相関し
た。感度水準は２５ｍ１ＵｈＣＧ／ｍｅであると決定さ
れた。

実施例２ この実施例において、試料が固定化レセプターの中心か
ら離れて優先的に流れる第９図に示した型の装置を用い
た。抗原を膜上に固定化し、血清試料の抗体分析質を分
析するサンドインチ検定を行ない、標識抗体は前記のよ
うに形成したコロイド金で標識した試料抗体に対する抗
抗体の結合体である。この実施例において用いた抗抗体
は普遍的抗抗体としての働きをするスタヒロコッカス・
アウレウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅ
ｕｓ　）　Ａプロティンであった。

抗原、ＨＩＶ溶解物〔デュポン社（Ｅ、Ｉ。

ＤｕＰｏｎｔ　　ｄｅ　　Ｎｅｍｏｕｒｓ＋　　Ｇｌｉ
ｌｍｉｎｇｔｏｎ、　　ｏ、　　Ｅ、　　））　　を、
洗剤およびエチレングリコールを含むデュポン緩衝液中
２ｍｇ／ｍＡで、実施例１に記載したニトロセルロース
膜ディスク上に付着させた。ブロック反応はデュポン専
売緩衝液または５％ＢＳＡ、０．０５％ツイーン２０．
０．１％Ｎａアジドおよび１０％ヤギ血清をＰＢＳ中に
含む等価緩衝液１００μｌで行なった。

抗原に対する抗体を含むと思われる血清の試料をデュポ
ン緩衝液による１：４希釈により調製し、５０μをウェ
ル１６中に置き、前記のように膜１８を通して流れさせ
た。次いで膜１８をＰＢＳのデュポン緩衝液５０μｌで
洗浄する。その後ＯＤ、！。３．５の標識プロティンＡ
（第２抗体）５０μｌを同様に膜に通し、次いでさらに
５０μｌ洗浄をする。陽性反応は膜上の明瞭な赤色ドツ
トにより示される。

この実施例において２００試料（３１＋および１６９−
）を試験し、デュポンＥＬ　Ｉ　ＳＡにより測定した検
体源の報告所見と１００％相関した。

陽性試料はウェスタンプロット分析により確認された。

明らかに、この開示′の考察後に本発明の多くの改変お
よび変更が可能である。従って、特許請求の範囲内で本
発明を特定記載以外の方法で実施できることを理解すべ
きである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による検定装置の斜視図、第２図は本発
明による検定装置の部分切欠断面図、第３Ａ、３Ｂおよ
び３０図は第２図の装置の隔膜の他の態様の平面図、第
４図は本発明による他の検定装置の部分切欠断面図、第
５Ａ、５Ｂおよび５０図は隔膜の他の態様、第６．７．
８および９図は本発明による検定装置の部分切欠断面図
である。 １０・・・・・・検定装置、１２・・・・・・カバー、
１４・・・・・・ベース、１６・・・・・・ウェル、１
８・・・・・・反応膜装置、２０・・・・・・隔膜、２
４・・・・・・吸収性物質体。 手続補正書（方式） 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 ３、補正をする者 事件との関係　　出願人 ４、代理人

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. （１）結合可能標的物質を含むと思われる液体試料中の
   結合可能標的物質を検出および（または）測定するため
   の検定に使用する貯蔵および反応装置であって、 （ａ）上面および下面を有し、少くとも前記上面がその
   上に、結合可能標的物質に直接または間接に結合できる
   レセプターを固定化した液体透過性の多孔性反応膜、 （ｂ）液体を吸収できる吸収性物質の体であって、多孔
   性反応膜の下面近隣に配置された表面を有する体、 （ｃ）多孔性反応膜の下面から吸収性物質体の上面への
   液体流を実質的に分離する分離装置、および （ｄ）前記多孔性反応膜の下面から前記分離装置を通る
   液体の流れを実質的に指示する前記分離装置を貫通する
   通口装置、 を含み、それにより前記多孔性反応膜の上面に適用され
   た液体試料が選択流れパターンでその下面へ透過し、前
   記第２員の表面の少くとも１選定部へ実質的に向かわさ
   れる装置。
2. （２）膜の上面上の結合物質の量が、相応する可視標識
   物質と結合して結合されたときに標的物質の直接視覚検
   出または測定を可能にするのに十分である、請求項（１
   ）記載の貯蔵および反応装置。
3. （３）多孔性膜がニトロセルロースを含む、請求項（１
   ）記載の貯蔵および反応装置。
4. （４）ニトロセルロース膜がさらにそれに密接触に結合
   した少くとも１つの液体透過性支持物質を含む、請求項
   （３）記載の貯蔵および反応装置。
5. （５）支持物質が紙、ガラス繊維またはポリエステルで
   ある、請求項（４）記載の貯蔵および反応装置。
6. （６）通口装置が、多孔性膜を通る液体流を固定化レセ
   プターの中心から半径方向に離れて向かわせる働きをす
   る、請求項（１）記載の貯蔵および反応装置。
7. （７）通口装置が、多孔性膜を通る液体流を固定化レセ
   プターの中心の方へ向かわせる働きをする、請求項（１
   ）記載の貯蔵および反応装置。
8. （８）分離装置が液体透過性シートを含む、請求項（１
   ）記載の貯蔵および反応装置。
9. （９）通口装置が不透過性シートを貫通する少くとも１
   つの開口部を含む、請求項（８）記載の貯蔵および反応
   装置。
10. （１０）通口装置が不透過性シート中の液体透過性物質
    を含む少くとも１つの通口を含む、請求項（８）記載の
    貯蔵および反応装置。
11. （１１）固定化レセプターが反応膜の上面の限定領域内
    に集中される、請求項（１）記載の貯蔵および反応装置
    。
12. （１２）通口装置が固定化レセプターの中心から半径方
    向に間隔を置かれ、液体流を固定化レセプターの中心か
    ら半径方向に離れて向かわせる働きをする、請求項（９
    ）記載の貯蔵および反応装置。
13. （１３）通口装置が固定化レセプターの中心から半径方
    向に間隔を置かれたリングまたはその部分を含む、請求
    項（１２）記載の貯蔵および反応装置。
14. （１４）固定化レセプターが反応膜の上面の限定領域中
    に集中され、通口装置が前記限定領域の周囲に近い、請
    求項（１３）記載の貯蔵および反応装置。
15. （１５）通口装置が、固定化レセプターの中心に近く配
    置され分離装置により囲まれた少くとも１つの通口を含
    み、液体流を前記固定化レセプターの中心の方へ向かわ
    せる働きをする、請求項（１）または（１１）記載の貯
    蔵および反応装置。
16. （１６）通口装置が開路であるか、または液体透過性物
    質を含む、請求項（１５）記載の貯蔵および反応装置。
17. （１７）多孔性膜の上面に含み実質的にすべての液体を
    密閉装置により半径方向に拘束された領域中の膜を通し
    て流れさせる働きをする密閉装置を含む、請求項（１）
    記載の貯蔵および反応装置。
18. （１８）吸収性物質が柔軟であり、装置がさらに前記吸
    収性物質を規定しかつ底壁を含む装置、および固定化レ
    セプターの中心の方へ前記吸着性物質中へ上向に突出す
    る前記底壁上に配置されたプラットホーム装置を含む、
    請求項（１）記載の貯蔵および反応装置。
19. （１９）プラットホーム装置が吸収性物質に対して不透
    過性シートをたわませ、通孔装置の非たわみ形状を変形
    させる十分な上向圧力を加える、請求項（１８）記載の
    貯蔵および反応装置。
20. （２０）通口装置が固定化レセプターの中心から半径方
    向に間隔を置かれる、請求項（１９）記載の貯蔵および
    反応装置。
21. （２１）吸収性物質体の内部が、プラットホーム装置に
    より発生された圧力下に離れて広げられて溝を生じ、そ
    れにより液体が前記溝を通って固定化レセプターの中心
    から外方へ流れることができる、請求項（２０）記載の
    貯蔵および反応装置。
22. （２２）検定装置として、 （ａ）上面および下面を有し、少くとも前記上面がその
    上に、結合可能標的物質に直接または間接に結合できる
    レセプターを固定化した液体透過性の多孔性反応膜、 （ｂ）液体を吸収できる吸収性物質の体であって、多孔
    性反応膜の下面近隣に配置された表面を有する体、 （ｃ）多孔性反応膜の下面から吸収性物質体の上面への
    液体流を実質的に分離する分離装置、および （ｄ）前記多孔性反応膜の下面から前記分離装置を通る
    液体の流れを実質的に指示する前記分離装置を貫通する
    通口装置、 を含む装置を用い、結合可能標的物質を含むと思われる
    液体試料中の結合可能標的物質を検出および（または）
    測定する検定法であって、試料、可能標的物質および追
    加試薬を前記透過性反応膜の上面に適用し、それにより
    適用された液体を前記通口装置により膜下面へ透過させ
    、前記吸収性物質体の近隣表面の少くとも１つの選択部
    へ実質的に向かわせ、その後前記上面に結合した前記標
    識物質を、前記上面上の前記結合性物質に結合した標的
    物質の存在または不在の指標として検出することを含む
    方法。
23. （２３）多孔性反応膜の上面上の結合性物質の量が、標
    識物質の直接視覚検出または測定を可能にするのに十分
    である、請求項（２２）記載の方法。
24. （２４）結合可能および結合性物質の少くとも１つが免
    疫化学品である、請求項（２２）記載の方法。
25. （２５）装置の多孔性膜がニトロセルロースを含む、請
    求項（２２）記載の方法。
26. （２６）ニトロセルロース多孔性膜が、さらに密接触に
    結合された少くとも１つの支持物質を含む、請求項（２
    ２）記載の方法。
27. （２７）支持物質が紙である、請求項（２２）記載の方
    法。
28. （２８）標的物質がコロイド金粒子を含む標識で標識さ
    れた物質の使用により検出される、請求項（２２）記載
    の方法。
29. （２９）標的物質が、キレート金粒子を含む標識で標識
    された物質の使用により検出される、請求項（２２）記
    載の方法。
30. （３０）分離装置が液体不透過性シートを含む、請求項
    （２２）記載の方法。
31. （３１）固定化レセプターが反応膜の上面の限定領域中
    に集中され、通口装置が、前記固定化レセプターの中心
    から半径方向に間隔を置きその周囲に近い分離装置を貫
    通する少くとも１つの通口を含み、液体が前記中心から
    半径方向に離れて流れるがしかし、分離装置および通口
    装置のない液体流パターンに比べて透過性膜を通過する
    ときに前記レセプター周囲に接触する、請求項（２２）
    または（３０）記載の方法。
32. （３２）固定化レセプターが反応膜の上面の限定領域中
    に集中され、通口装置が、分離装置の包囲により固定化
    レセプターの中心に近く配置されその周囲の方へ広がる
    少くとも１つの通口を含み、液体が、分離装置および通
    口装置のない流れパターンに比べて透過性膜を通過する
    ときに中心の方へ流れる、請求項（２２）または（３０
    ）記載の方法。