JPH0283448A - 免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 血液や尿などの体液に含まれる薬物や代謝物質の分析は
、病態の診断や治療経過の判定に非常に有用であり、臨
床検査の大きな分野を占めている。

本発明はこれら物質を測定する方法に関するものである
。

（従来の技術） 従来、生体由来の物質を検出するためには多くの方法が
知られている。方法論的にひとつの大きな群をなすのは
免疫測定法（イムノアッセイ）であり標識物質の種類か
ら放射免疫測定法（ラジオイムノアッセイ）、酵素免疫
測定法、蛍光免疫測定法などに分かれる。酵素免疫測定
法（以下、ＥＩＡと記す）は抗原抗体反応系に酵素活性
をマーカーとして用いることにより抗原又は抗体を定量
する方法である。その方法は２つに大別される。すなわ
ち、抗原抗体反応生成物（バウンド型、Ｂ型）と非反応
物（フリー型、Ｆ型）の分離が必要かどうかで、均一系
イムノアッセー（分離の必要なし）と非均−系イムノア
ツセ−（分離の必要あり）に分けられる。これらについ
ては石川栄治編ｒ酵素免疫測定法ｊ　第２版　医学書院
、１９８２年（以下、文献（１）とする）に詳しく記さ
れている。

非均−系イムノアッセーにおいてはＢ型とＦ型の分離（
Ｂ／Ｆ分離）が必要であり、反応生成物の別容器への移
し替え、試薬の調製、基質や反応停止液の添加、溶液吸
光度の測定等、繁雑でかつ時間を要する操作が必要であ
り、非常に効率の悪いものであった。

（解決しようとする技術的課Ｂ） 本発明はこれらの欠点を解決すべく、非均−系酵素標識
免疫分析における、反応生成物の別容器への移し替えや
、試薬の調製、基質や反応停止液の添加、溶液の吸光度
測定などの繁雑でかつ時間を要する操作を不要にした、
体液中の薬物や代謝物など各種抗原性物質の定量可能な
免疫測定方法を提供するものである。

（技術的課題の解決手段） 本発明は非均−系ＥＩＡ　（酵素標識免疫分析）におい
て、抗原抗体反応後にＦ型標識物を含む液の一定量を取
り出し、その酵素活性を酵素活性の測定に必要なすべて
の試薬を含有させた乾式化学分析フィルムを用いて測定
することにより、各種抗原性物質を簡便な操作で定量で
きることを特徴とする免疫測定法である。

すなわち抗体または抗原をまず、相分離法により作られ
たセルロースアセテート多孔質膜のような適当な多孔質
膜に物理的または化学的に結合させ、多孔質膜は不溶化
された抗体または抗原を得、この上で抗原抗体反応を行
わせた後、液相（フリー標識物を含む）の一定量を取り
出し、その酵素活性を乾式化学分析フィルムを用いて測
定゛する。

ここで言う抗原は、生体試料中に含まれる特異抗体と反
応するものであり、ハプテンおよびその誘導体を包含す
る。

多孔質膜は、免疫分析の分野で公知のものを用いること
ができる０例えば、硝酸セルロース、セルロースアセテ
ート（酢酸セルロース）、ポリアミド（例えばナイロン
）、ポリテトラフルオロエチレン等から成る多孔質膜、
アガロース膜、セルロースろ紙、ガラス繊維ろ紙等であ
る。相分離法（ｐｈａｓｅ−ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ　ｐｒ
ｏｃｅｓｓ　：例えばＲｏｂｅｒｔ　Ｅ。

にｅｓｔｉｎｇ　　著　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　　Ｐｏ１
ｙ＋＊ｅｒｉｃ　　Ｈｅ輪ｂｒａｎｅｓＭｃＧｒａｗ−
旧Ｉｆ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７１に記載）によ
り作られた、硝酸セルロース多孔質膜やセルロースアセ
テート多孔質膜は好ましい、その他特開昭５８−１８１
６７号明細書、特に公開公報３４７ペ一ジ下段より３４
８ペ一ジ上段に記載されたものを利用できる。多孔質膜
の代わりに、ガラスやプラスチック製のビーズを用いる
こともできるが、ビーズに不溶化された抗体は乾燥状態
では一般に不安定で、血清アルブミン等を含む安定化溶
液中に保存する必要がある。これに対し、多孔質膜に不
溶化された抗体は、乾燥状憩でも比教的安定に傑存し得
る。また多孔質膜は均一なものの大量生産が容易である
という利点をもつ。

酵素活性を測定するための乾式化学分析フィルムは、例
えば特公昭５３−２１６７７号、特開昭５７−１６−８
１５９号、特開昭６２−１７５１９９号、特開昭６２−
２７５６９９号等の記載を利用して作製することができ
る。乾式化学分析フィルムは１層から成っても、多層か
ら成ってもよい。

化学分析フィルムは多層から成る場合、各層が一体化さ
れていることが好ましいが、層または層群が分離でき、
それらの間に一時的に液体が流通し得るようなものでも
よい、化学分析フィルムは、酵素が関与する反応（酵素
反応）の基質および酵素反応の反応生成物を検出する試
薬を、水浸透性の層中に含有する。上記試薬の代わりに
、酵素反応の反応成分を定量することが可能な試薬を含
有してもよい、試薬による酵素反応の検出は、試薬の発
色や変色を利用して光学的に行うのが便利であるが、電
気的あるいは磁気的に行うこともてきる、基質は自己顕
色性基質であってもよく、この場合上記試薬を省略する
ことができる。基質と試薬は同じ層に含まれてもよく、
異なる層に含まれてもよい、一体化乾式多層分析フィル
ムは、試料液を展開するための展開層を有することが好
ましい、展開層は、供給された試料液の体積に比例した
面積に、試料液を展開し得ることが好ましい。

基質および試薬の少なくとも一方が、展開層に含まれて
もよい、一体化乾式多層分析フイルムはまた、光透過性
支持体を有することが好ましい、光透過性支持体は、水
透過性でもよいが、水不透過性のものが好ましい、光透
過性かつ水不透過性の支持体は上記の展開層と反対の面
に設けられる。

本発明の方法では、免疫反応終了後に液相の一定量を酵
素活性測定用乾式化学分析フィルムに点着し、予め定め
た経過時間の間で、反射光学濃度（ＯＤ　ｒ　）の変化
を反射光学濃度測定器を用いて測定する。光学濃度の変
化速度から反応速度を求め、酵素活性を算出し、酵素活
性より試料中の抗原の濃度を定量する。

漂激化に使用される酵素は特に制約なく、一般のＥＩＡ
に適用される酵素を任意に選択すればよい０代表的な例
としてはグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ペルオキ
シダーゼ（ＰＯＤ＞、フルカリホスファターゼ（ＡＬＰ
）、β−ガラクトシダーゼ（β−ＧＡＬ）などが挙げら
れる。各種の酵素標識抗原（または酵素標識抗体）は前
記文献（１）を参照することにより容易に得ることがで
きる。

本発明第一のサンドイツチ法にもとすくイムノアッセー
においては、まず抗体を適当な多孔質膜の面に物理的ま
たは／および化学的に結合させる。

抗体を多孔質膜に結合させた後、ゼラチンや血清アルブ
ミンなどの免疫的に不活性な物質の水溶液（ブロッカ−
）を一定量加えて、多孔質膜の表面の非特異的結合部位
をブロックする０次に上記の多孔質膜を、Ｔｗｅｅｎ２
０の様な界面活性剤を含む［６を液や食塩水などで洗浄
し、抗体が不溶化された多孔質膜を得る。

抗原性物質を含む試料（血清、血漿、尿等）を、上記の
抗体が不溶化された多孔質膜に加え、０ないし３７℃で
数時間ないし一昼夜、好ましくは１０ないし２５℃で２
ないし１０時間反応させた後、前述の洗浄液で洗浄する
１次に酵素標識された一定量の抗体を加える。０℃ない
し３７℃で数時間ないし一昼夜、好ましくは１０℃ない
し２５℃で２ないし１０時間反応させ、反応終了後、反
応液の一定量を酵素活性測定用乾式化学分析フィルムに
点着し、反射光学濃度（ＯＤｒ）を測定することにより
、試料中の抗原性物質を定量することが出来る。酵素標
識抗体の量は試料中の抗原性物質に対して若干過剰でな
ければならないが、過大であってはならない。

本発明第二の方法にもとすくイムノアッセーにおいては
、まず抗原を適当な多孔質膜の面に物理的または／およ
び化学的に結合させる。多孔質膜に抗原を結合させた後
、ゼラチンや血清アルブミンなどの免疫的に不活性な物
質の水溶液（ブロッカ−）を一定量加えて、多孔質膜の
表面の非特異的結合部位をブロックする０次に上記の多
孔質膜を、Ｔｗｅｅｎ　　２０の様な界面活性剤を含む
緩衝液や食塩水などで洗浄し、抗原が不溶化された多孔
質膜を得る。

抗体を含む試料（血清、血漿、尿等）を、上記の抗原が
不溶化された多孔質膜に加え、０℃ないし３７℃で数時
間ないし一昼夜、好ましくは１０℃ないし２５℃で２な
いし１０時間反応させる。前述の洗浄液で洗浄し、さら
に酵素標識された一定量の第二抗体を加え、０℃ないし
３７℃で数時間ないし１昼夜、好ましくは１０℃ないし
２５℃で２ないし１０時間反応させる０反応終了後、反
応液の一定量を酵素活性測定用乾式化学分析フィルムに
点着し、反射光学濃度（ＯＤ　ｒ　）を測定することに
より、試料中の抗体を定量することが出来る。この方法
で用いる酵素標識第２抗体は、試料中の抗体の持つ抗原
性部位に対し抗体（抗ヒトグロブリン抗体）として働く
ようなものを選ぶ。

前記酵素標識第２抗体の量は試料中の抗体に対して若干
過剰でなければならないが、過大であってはならない。

以下実施例により本発明方法を詳述するが、本発明はこ
れに限定されるものではない。

［実施例１］　（ヒト　フェリチンの測定）１”）ＣＯ
Ｄ活性測定用分析フィルムの作製表面を親水化処理した
透明ポリエチレンテレフタレートフィルム（厚さ１８０
μｌ）の上に下記組成の塗布液を１５５　ｘ１／ｘ”の
割合で、塗布、乾燥し発色層を形成した。

丸色層塗布液組成： ゼラチン　　　　　　　　　　　１６０ｇ水　　　　　
　　　　　　　　　　　１ｏｏｏ　ｇペルオキシダーゼ
　　　　　　１５万ｕｎｉｔロイコ色素（下記構造）　
　　　　　２．４９ビス〔（ビニルスルホニルメチル　
　１．６ｇカルボニル）アミノコメタン ロイコ色素： ２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）
−４−（４−（ジメチルアミノ）フェニルツー５−フェ
ネチルイミダゾール 次に、この上に下記組成の塗布液を６２．５　ｘｌ／ｗ
”の割合で塗布し、乾燥し、接着層を形成した。

接着層塗布液組成： ゼラチン　　　　　　　　　　６０　ｇ水　　　　　　
　　　　　　　　１１４０９グルコース　　　　　　　
　　４０　ｇ上記接着層を約３０　ｇ／Ｉの水で湿らせ
た後、ポリエチレンテレフタレート紡績糸（３６ゲージ
、５０デニール）からなるトリコット編物を圧着し乾燥
させて展開層とした。上記展開層に、下記の組成の塗布
液を１２０　ｚｌ／ｍ”の割合で塗布、乾燥した。

展開層塗布液 ５％（阿油） ポリビニルピロリドン水溶液　　　２００ｇグルコース
　　　　　　　　　　　　　　２０　ｌＮ−２−ヒドロ
キシエチル　　　　　　９．４ｇピペラジン−Ｎ’　−
２− エタンスルホン酸 （２Ｎ−ＮａＯＨによりｐｎ　６．５に調整）以上の方
法によりＧＯＤ活性測定用分析フィルムを作成した。

２）抗体の不溶化 常法に従いマウスを免疫することにより得た抗ヒトフェ
リチンマウス抗体（１００１０００ＡＬ！　）の溶液を
０．０２ＭＩＪンＭ）！街液（ｐＨ７，４、以下ＰＢＳ
と記す）を用いて調製し、その２．５μｌを直径４．５
ｍｍの円盤状に切ったセルロースアセテート多孔質膜（
富士写真フィルム株式会社製ミクロフィルタＦＭ３００
）に加えた。１０分間乾燥後、多孔質膜の非特異的結合
部位をブロックするため１％ヒト血清アルブミン添加Ｐ
ＢＳを２．５μｍ加えて１０分間乾燥した。　０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０（東京化成工業（株）製）を加えたＰ
ＢＳで洗浄し、抗体不溶化多孔質膜を得た。

３）検量線の作成 この抗体不溶化多孔質膜を１枚づつ試験管に入れ、１０
ないし６００　ｎｇ／ｍｌの範囲の種々の及のヒトフェ
リチンを含む標準サンプル（０，１％ヒト血清アルブミ
ンを含むＰＢＳ）を加えた。室温で２時間インキュベー
トした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０（東京化成工業
（株）製）を加えたＰＢＳで洗浄し、次にＧＯＤｔＦ識
抗ヒト　フェリチン抗体溶液（１２当たりＣＯＤ　２０
０１１１際単位）を加えてさらに２時間インキュベート
した。

各試験管中の反応液１０μｌを取り出し、液中の遊離型
（Ｆ型）のＧＯＤ活性を、ＧＯＤ活性測定用分析フィル
ムを用いて測定した。すなわち各試験管中の反応液１０
μｌをマイクロピペットを用いてＧＯＤ活性測定用分析
フィルムに点着し、１反射測光で１分から５分（＋ｉｎ
）までの間の反射光学濃度変化（八〇〇ｒ）を測定する
ことにより検量線を作成した。結果を第１図に示した。

第１図は、ＧＯＤ活性活性周定用分析フィルムいてＦ型
標識量を測定することにより、１０ないし６００　ｎｇ
／ｍｌのヒトフェリチンの定量ができることを示してい
る。この検量線を用いて、任意の血清検体のヒトフェリ
チンを定量することができた。

［実施例２］（ムンプスウィルスＩｇＧ抗体測定）１’
）ＧＯＤ活性測定用分析フィルムの作成実施例１と全く
同様にして作製した。

２）抗原の不溶化 実施例１におけるヒトフェリチン　マウス抗体の代わり
にムンプスウィルスＨＡ抗原（市販品）を用いた以外は
、実施例１と同様の操作で抗原不溶化多孔質膜を得た。

　すなわちセルロースアセテート多孔質膜に市販のＨＡ
抗原を炭酸塩緩衝液（塩濃度０．０５Ｍ、ｐＨ９，６）
で１０倍希釈した液２．５μｌを加え、その後実施例１
と同じ操作をおこなった。

３）検量線の作成 ムンプスウィルス抗体陽性血清を段階希釈したものをサ
ンプルとして、実施例１の検量線作成と同じ操作により
、血清希釈率に応じた分析スライドの吸光度の変化を得
ることができた。その結果を第２図に示す、この検量線
を用いて、任意の血清検体のムンプスウィルスＩｇＧ抗
体を検出することができた。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１において得られたヒト　フェリチンの
検ｉｔｌを示すグラフである。第２図は実施例２におい
て得られたムンプスウィルスＩｇＧ抗体の検１線を示す
グラフである。 出願人　　富士写真フィルム株式会社

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵素標識を利用する非均一系免疫分析において、
   一定量の抗体を多孔質膜に物理的または／および化学的
   に結合させて不溶化抗体を得、前記不溶化抗体に試料中
   の抗原を接触させた後、さらに一定量の酵素標識された
   抗体を接触させることにより抗原抗体反応を行わせ、抗
   原抗体反応の後液相の一定量を取り出し、液相の酵素活
   性を乾式化学分析フィルムを用いて測定することを特徴
   とする、試料中の抗原を定量するための免疫測定方法。
2. （２）酵素標識を利用する非均一系免疫分析において、
   一定量の抗原を多孔質膜に物理的または／および化学的
   に結合させて不溶化抗原を得、前記不溶化抗原に試料中
   の抗体を接触させた後、さらに一定量の酵素標識された
   抗体を接触させることにより抗原抗体反応を行わせ、抗
   原抗体反応の後液相の一定量を取り出し、液相の酵素活
   性を乾式化学分析フィルムを用いて測定することを特徴
   とする、試料中の抗体を定量するための免疫測定方法。