JPH03118473A - 流量調整手段を含む試験装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 １、発明の分野　　本発明は分析物のアッセイに関し、
より詳細には膜流通アッセイ法およびそれに有用な装置
に関する。

２、発明の背景　　流体試料中に低濃度で存在する通常
分析物と呼ぶ物質の濃度を求めるための迅速かつ感度の
よいアッセイシステムが開発されている。免疫検定法（
イムノアッセイ）は特定の抗体との抗原またはハプテン
の結合によるものであり、該検定法は高い特異性と感度
を示すので特に有用となっている。該検定法は上記試薬
の一つを標識として使用し、該標識試薬をトレーサーと
云う。

免疫検定法では酵素を標識として使用していることが多
い。通常の酵素免疫検定法（ＥＸＡ）において、酵素は
特定結合の抗原−抗体対の一成分と共有結合で結合され
、生成した酵素結合体は基質と反応して信号を発し、そ
れを検出して測定を行う。該信号は、裸眼または分光光
度法で検知されろ変色であることができるか、または螢
光によって検出される生成物への基質の変化であること
ができる。

ＥＸＡの便利な様式は検定試薬の一つが固体支持体上に
固定されている固相免疫検定法である。

固体支持体は計量棒（ｄｉｐｓｔｉｃｋ　）、試験管ま
たはセルの内壁もしくはミクロタイター板（ｍｉｃｒｏ
−ｔｉｔａｒ　ｐＬαｔａ　　）の（ばみの形をとるこ
とができる。特に有用な固体支持体は微小孔構造膜であ
る。

膜検定法は、各工程の流体相を次工程が始まる前に逐次
膜を通過させて分析工程を実施するので流通検定法（フ
ロースルーアッセイ）と呼ぶことが多い。流体の流動を
重量制御する検定装置がＰｃＬｒｋの米国特許第４，１
１１，７５４号に開示されている。膜に接触する吸収剤
パッドによって誘起される毛管作用によって流動を促進
させる流通検定装置がＢａｇｓｈａｗの米国特許第３，
８８８．６２９号およびＶａｔｈｉｒｓ　　等の米国特
許第４，６３２，９０１号に開示されている。流通を用
いる計量棒検定装置がＴＯｍ等の米国特許第４，３６６
，２４１号に開示されている。Ｂασ８　ｈａｗ　の装
置、ＶａＬｋｉｒｓ　　等の装置およびｒｏｍ等の装置
では、膜の中の流体の流れを尋問技術者が調整すること
はできない。Ｃｏｔｓ等は米国特許第４，２４６，３３
９号で吸収剤パッドを一方に片寄せて膜に接触させたり
接触させなかったりすることによって毛管作用を調整す
る装置を開示している。真空によって流動を開始させる
装置がＧＷ（Ｌ’ＪＩの米国特許第４，２７７，５６０
号およびＭｃＬａｘｒｉｎ等の米国特許第４，８１２．
２９３号に記載されている。

前記の特許に開示されている流動を促進させるために機
械的手段を用いる装置は流通検定法を向上させたけれど
も、単に流量調整試薬を膜に通すことによって流量を調
整することのできる装置に対する要望は依然として残っ
ている。本発明が指向することはこの要望の実現を目指
すものである。

含量検定装置は底部および蓋を有する包囲体の内側にフ
ィルタースタックを含んでいる。フィルタースタックは
、好ましくは膜上に分析物用結合剤を有する多孔性親水
膜を含んで成る。親水膜は、湿潤剤によって活性化され
るまで水性液体の通過を許さない多孔性疎水膜の上に位
置している。疎水膜は吸収剤パッドの上に位置している
。蓋の開口部は親水膜に連通（αｃｃｇｓｓ　）　して
いる。

好適な装置においては、蓋は、その中にインサートを有
するくばみを形成する上方に突出するリムを有し、くぼ
みは蓋の開口部と一直線上にある開口部を有している。

もつとも好ましい装置には液体を親水膜中に逆行させな
いように疎水膜と吸収剤パッドの間にスペーサー層を含
んでいる。

本発明は、本発明の装置を包含し、分析物のアッセイを
行うのに有用な物質のキットを含む。キットは、また標
識を分析物または抗分析物に結合せしめて成るトレーサ
ーのような通常の免疫検定法の他の成分をも含むことが
できる。標識が酵素である場合には、キットは酵素の基
質を含むことができる。

このように、分析物の流通検定に有用なアッセイ装置は
、毛管作用によって膜中に検定液体の流動を生じさせる
構造及び妥当と思われるまで流動を阻止する構造を含ん
でいる。本発明の装置は、抗原−抗体結合反応が緩慢で
、結合が完了するまで流体の流動を阻止しなければなら
ない分析物の免疫検定に特に好適である。流動を阻止す
る手段は単純な疎水膜であって、その多くは市販品であ
り、かつ所望の時間に流動を開始させる手段は簡単で容
易に入手可能な化学試薬であるので、複雑な機械装置は
全く必要ない。該装置は、従ってつくるのに簡単で、経
費がかからず、使いやす（、かつ限られた訓練しかして
いない実験室職員によって医師の診療室で、あるいはま
た家庭における使用にうってつけである。

詳細な説明 本発明はいろいろの形式の態様によって満足させられる
けれども、本発明の好適な態様をここで詳細に述べよう
。ただ本開示は本発明の原理の例示とみなすべきもので
あって、本発明を図示し、記述した態様に限定するつも
りではないことを理解されたい。本発明の範囲は添付ク
レームおよびその等価物によって判断される。

まず本発明のアッセイ装置を図面を参照しながら説明す
る。第１図は底部１２および蓋部１３を有する包囲体１
１を含む装置１０を示す。蓋１３は上部壁１４および実
質的に垂直な側壁１５を含む。リム１６は上部壁１４か
も上方に突出する。

リム１６は蓋１４の開口部２４と一直線をなす開口部２
２を有する好ましくは着色インサート２０を有するくぼ
み１８を形成する。

第２図は、それぞれ開口部２２および開口部２４の下部
に位置する仮想のフィルタースタック２４を示す。

底部１２およびフィルタースタックの細部をさらに明瞭
に第３図に示す。底部１２は、底壁３０および、実質的
に水平の棚３６によって下部３２および上部３４に分け
られる実質的に水平な側壁を有している。底壁３０なら
びに側壁部３９および３６は共にフィルタースタック２
６を受は入れるチャンバー３８を形成する。

側壁上部３４はそこから上方に延びる複数の突起４０を
有している。突起４０は空隙４２によって相互に分離さ
れる。装置を第１図に示したように組立てると、蓋１３
の上部壁１４は、側壁１５の下縁４６が好ましくは水平
棚３６の僅か上部に位置しそれによって空隙４２を通っ
て外部環境からチャンバー３８に空気を導通させるよう
に突起４０の上面４４の上に載る。

フィルタースタック２６は上面５２および下面５４を有
する多孔性親水膜５０を含む。上面５２は好ましくは後
記するように結合剤５２で被覆された試験領域５６を含
む。

第３図は試験領域５６を膜５０の中の限られた領域であ
るように示すけれども、試験領域は結合剤が便宜的なら
びに経済的に結合している膜５０の一部を単に示すにす
ぎないことを理解すべきである。所望の場合には膜５０
の全体またはその任意の部分を結合剤で被覆することが
できる。一般に、試験領域は少なくとも１μ９／ｃｍ”
、　好ましくは１０μｙ／ｃＩｒＬ２、もつとも好まし
くは少な（とも４０μｙ／ｃｒｎ２の濃度の結合剤を支
持することができるような表面積を有している。

試験領域５６はインサート２０の開口部２２および蓋１
４の開口部２４の下に位置する。親水膜５０の底面５４
は、上面６２および底面６４を有する多孔性疎水膜６０
に接するように位置する。

膜６０の底面６４は、好適には多孔性物質の任意の多孔
性スペーサー層７２の上面７０に載るのが好ましい。ス
ペーサー層７２の底面７４は吸収剤物質のパッド８２の
上面に載り、その下面８４は底部１２の底壁３０に載る
。第３図は好ましくは複数の部材を含むようにパッド８
２を示すけれども、適当な厚さの単一のパッドを用いる
ことができることは明かである。その代りに、複数の部
材を縫い合わせるか、もしくは任意の他の便利な手段で
結合させることができるかあるいは部材５０．６０、お
よび７２ならびにパッド８２をすべて縫い合わせるか結
合させて単一のフィルタースタックとすることができる
。

包囲部１１のインサート２０および底部１２および蓋１
３は好適にはポリエチレン、ポリスチレンあるいはもつ
とも好ましくはポリプロピレンのような任意のプラスチ
ック材料でつくることができる。インサート２０は任意
の色、好ましくは陽性検定（ｐｏｓｉｔｉｖｅα５ｓａ
ｙ）に起因して試験領域５０に現れる色と対照をなす色
であることができる。装置は任意の形状を有することが
でき、図面に示す三角形に限定されないことを理解すべ
きである。

親水膜５０は水性検定液で容易にぬれる任意の物質、好
ましくは捕捉抗体のようなアッセイ結合試薬の結合に適
当な物質の膜であることができる。

適当な膜はたとえば、ガラス、ナイロン、好ましくはセ
ルロースである。もつとも好ましい膜は気孔径が約２な
いし１２μ、好ましくは約３ないし５μのニトロセルロ
ース膜である。適当な親水膜はＥａｓｔ　Ｈｉｌｌｓ、
Ｎｅｗ　ＹｏｒｋのＰａ１ｌ　Ｃｏｒｐ、からＩＭＭＵ
ＮＯＤＹＮＥ　　　という商品名で市販されている。

疎水膜６０はフィルタースタック２６中の親水膜５０の
直ぐ下に位置することができる。本発明によれば、疎水
膜は湿潤剤によって活性化されるまで水性検定流体の通
過を許さない。したがって、適当な疎水膜は、たとえば
多孔性のポリシロキサン、ポリエチレンおよびポリテト
ラフルオロエチレン膜である。Ｆａｌｌから入手可能な
ポリエチレンを被覆したガラス繊維膜を使用することが
できる。好ましい疎水膜はＩＨ，ＩＢ、２８．２Ｂ−ペ
ルフルオロオクチルトリエトキシシラン、ペルフルオロ
オクタデシルシロキサンおよびトリクロロオクタデシル
シランのようなペルフルオロアルキルシラン類で被覆し
たガラス繊維膜である。ガラス繊維膜にペルフルオロア
ルキルシラ７類ヲ被覆する典型的な方法を実施例ＩＫ示
す。

多孔性スペーサー層７２はたとえばレーヨンのようなセ
ルロース不繊布でつ（ることができ、−般に気孔径は疎
水膜６０の気孔径よりも大きい。

スペーサー層は主として後記のように上層を通過してパ
ッド８０に吸収された液体を湿潤疎水層、結局試験領域
中に逆行させないように作用する。

しかし、スペーサー層は好ましいけれども、残りの層の
特性が試験領域に物質が逆行する危険を実質的にゼロと
するような場合には省（ことができることを理解すべき
である。適当なレーヨンシートはＮｅｗ　Ｈ（Ｌｍｐ８
ｈｉｒｇ州ＫＩＩ＃？Ｚｅの５ｃｈｌａｉｃｈａｒαｎ
ｄ　５ｃｈｓａｌｌから市販されている。

吸収剤パッド８２はアッセイ試薬および任意の洗浄液の
実質的にすべての液体を吸収するだけの吸収力を有する
多孔性物質よりなる。パッド８２は、また検定液を試験
領域中にもたらす毛管作用を開始させるのに役立ち、か
つそれ自体、たとえばセルロース吸収紙のようなセルロ
ース物質から好適につ（ることができる。適当なセルロ
ース吸収紙はＰｇｎｎｓｙｌ　ｖａｎｉａ州、Ｍｏ５ｎ
ｔ　Ｈｏ１ｌｙ　ＳｐｒｉｎｇｓのＦｉｌｔｒａｔｉｏ
ｎ　５ｃｉａｎｃｔｒｓ　　から入手可能である。

本発明の定量装置は競合アッセイ、好ましくはサンドイ
ンチ検定法を含む任意の流通免疫検定法に用いられると
考えられる。前記のように、親水膜は分析物用結合剤を
被覆することができる。分析物が抗原である場合には、
親水膜上に被覆され、ｂ る結合剤は通常捕捉抗体（ｃｏｐｔｕｒｅ　ａｎｃＬ＃
ｏｄｙ　）と呼ばれる特定の抗体である。分析物が抗体
であれば、結合剤は捕捉抗原（ｃｏｐｔｕｒｇ　ａｎｔ
ｉｇｅｎ）と呼ばれる特定の抗原である。いずれの場合
でも、親水膜に結合剤の被覆を施した後、いかなる粘性
の結合部位にも不活性タンパク質を満たしてトレーサー
のようないかなる他の検定試薬の膜への非特定結合を防
ぐことが好ましい。（本開示において、不活性タンパク
質という用語は、不活性タンパク質が本発明のアッセイ
の一部ではない他の物質に対してたぶん免疫学的に反応
性があるであろうということを含んで、アッセイのいか
なる池の成分に対しても免疫学的に不活性であり、かつ
検定媒質中の他のタンパク質と非特定的に実質的には結
合しないタンパク質を意味する。）適当な不活性タンパ
ク質の典型的な非限定の例はアルブミンおよびカゼイン
である。

本発明の装置で都合良く行うことができる流通検定法の
別の態様では親水膜を不活性タンパク質で被覆すること
ができる。この検定の態様では、分析物が不活性タンパ
ク質の被覆に直かに固着する。したがって捕捉抗体また
は抗原の必要は無くなる。

免疫検定法の場合には、本発明は、不活性タンパク質お
よび／または結合剤を親水膜、好ましくは親水膜中の試
験領域にしっかりと固着させ、フィルタースタックのそ
の他の、要素を包囲体中に集める装置の提供を意図する
ことが理解される。

しかし、ある用途に対しては、結合剤を省いて、裸の親
水膜を与えるのが好ましいことがあることがわかる。

組立てた装置を用いる含量検定の実施は、分析物を含む
と思われる水溶液を開口部２２および２４を経て被覆親
水膜に与えることによって開始される。水溶液は親水膜
を濡らし、分析物の結合剤への結合が生じる。しかし、
水溶液がフィルタースタック中の親水膜の下に置かれた
疎水膜を濡らさないので検定溶液の流動は起らない。し
たがって、流動が技術者の掌握下にない先行技術の装置
とは対照的に、結合を完了させるのに必要なだけの時間
を経過させることができる。

結合が完了すると、開口部２２および２４を経て疎水膜
を濡らす改良試薬を加えることによってたとえば、アセ
トン、界面活性剤および洗浄剤である。好適な湿潤剤は
アルコール類で、もつとも好ましいのはメタノールであ
る。

本発明によれば、疎水膜は、−旦湿潤剤で濡らされると
、アッセイに用いる次の水性試薬を浸透させ得る状態に
保たれることが見出された。このように分析物を捕捉じ
た親水膜は、その後通常の免疫検定法に従い、遂次トレ
ーサー溶液および発色試薬溶液および任意の適当な洗浄
液で処理することができる。

免疫検定法で周知なように、サンドイッチ検定法におけ
るトレーサーは、標識を共有結合で結合させた分析物に
特有の抗体であることができる。

競合検定法においては、トレーサーは分析物に結合され
る標識を含み、トレーサーと分析物は結合剤の結合部位
を得ようと競争する。適当な標識は、たとえば、吸収染
料、螢光染料、かつ好ましくは酵素である。

標識として酵素を用いる好適な検定法において結合後に
試験領域に通す。トレーサーの一部として試験領域に捕
捉された酵素は色原体と反応して、好ましくは膜上に沈
澱して、インサート２０の異なる色のバックグラウンド
と対照して容易に認めることができる着色生成物を生じ
る。標識が吸収染料である場合には、発色試薬の必要な
いことは明らかである。標識が螢光染料である場合には
、検出は、試験領域に励起光線を当てて螢光を観察する
ことによって行われる。

上記分析物の免疫検定法は本発明の装置として意図され
るただ一つの用途にすぎない。当業者は、分析物がＤＮ
ＡまたはＲＮＡの試料中の特定の配列であるアッセイ法
に該装置を使用することができることを即座に認めよう
。たとえば、ＤＮＡ試料は通常の方法、たとえば加熱、
および親水膜に吸収させた変性物質によって変性させる
ことができる。吸収は技術的に周知の架橋剤を用いる共
有結合的か、（Ｂ１５ｃｈｏｆｆ等、Ａｎａｌ　、Ｂｉ
ｏｃｈａｍ、　。

１９８７年、第１６４巻、３３６頁）または非共有結合
的であることができる（Ｗａｒｄ等、ｐｒｏｃ。

Ｎ、白Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、　１９８３年
、第８０巻、４０４５頁）。湿潤剤による処理によって
疎水膜を活性化させた後、分析物の配列の補足として標
識ストランド（５ｔｒａｎｄ）を含む溶液を通すことが
できる。もしも混成が起ると、標識は親水膜上に捕捉さ
れ、したがってその検出は分析物の配列の特徴を示す。

本発明の別の態様によれば、フィルタースタックを有す
る包囲体を含む分析物の含量検定を行うための試薬キッ
トが提供される。フィルタースタックの親水膜は、親水
膜、好ましくは親水膜中の試験領域に分析物用結合剤を
固着させることができる。キットはトレーサー、および
好ましくは水溶液として与えられる色原体、および湿潤
剤を含むことができる。標準液（既知の虚度の分析物を
有する試料）、緩衝液、および洗浄液がキットの中に含
まれて試験バイアルのような適当な容器で供給すること
ができる。

実施例Ｉ ガラス繊維フィルター（Ｇａｉｎαｎ型式ＡＩＥ。

６Ｆ）を四半分に切断して、トルエン−水をＤｅａｎ　
５ｔａｒｋ　トラップで回収しなから２００１１のトル
エン中で２時間還流させた。ＬＨ，ＩＢ、２Ｂ、２８−
ペルフルオロオクチルトリエトキシシラン（１０Ｆ、１
９．６ミリモル）を加えて還流を４時間継続させ、Ｄ−
αｎｓｔαデにトラップから定時的にトルエン−水を除
去した。冷却後、フィルターヲトルエンで洗い、最後に
１２０”Ｃのオープン中で一夜間乾燥した。

実施例■ 実施例■のペルフルオロアルキルシラ／被覆膜を図に示
す装置の中に置き、フィルタースタックの上部に多孔性
の親水性ニトロセルロース膜（Ｆａｌｌ　Ｃｏｒｐ、　
）を置いた。インサートおよび蓋の開口部からリン酸塩
緩衝液（１００μｌ）を加えると親水膜はすぐに濡れた
。５分間流動は全（認められなかった。メタノール（３
００μｌ）を加えると、そこで膜を通って吸収剤パッド
への溶液の流動が生じた。

無被覆ガラス繊維フィルターを用いる比較実験において
は、メタノールを加えな（てもリン酸塩緩衝液はフィル
タースタック中を流れた。

このヨウに、本発明は、機械的変化によるのではな（簡
単な試薬の添加によって流動開始をユーザーの調整に委
ねる流通検定装置を提供する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の好ましい検定装置の斜視図である。 第２図は仮想のフィルタースタックを示す本発明の検定
装置の透視平面図である。 第３図は装置の構成要素の配列を示す本発明の好ましい
検定装置の斜視分解図である。 （外４名）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．包囲体およびその中のフィルタースタック（ｓｔａ
   ｃｋ）を含んで成り、該フィルタースタックが、 ａ）第１の面および第２の面を有し、分析物用結合剤を
   その上に有する多孔性親水膜、 ｂ）第１の面および第２の面を有し、該第１の面は前記
   親水膜の第２の面と接し、試薬で濡れるまで水性流体を
   通過させない多孔性疎水膜、および ｃ）前記疎水膜の第２の面に接する吸収剤物質のパッド
   を含み、 該親水膜、該疎水膜および該パッドは、前記試薬によつ
   て該疎水膜が濡れるときに、流体が連通し；前記包囲体
   は底部および蓋を含み、該蓋はその中にインサートのあ
   るくぼみを有し、該蓋およびインサートは前記親水膜の
   第１の面に対して連通している一直線に並んだ開口部を
   有することを特徴とする分析物の試験（アツセイ）用器
   具。
2. ２．前記多孔性親水膜がガラス、ナイロンおよびセルロ
   ースより成る群から選ばれる請求項１記載の器具。
3. ３．前記結合剤が抗体、抗原および不活性タンパク質よ
   り成る群から選ばれる請求項１記載の器具。
4. ４．前記多孔性疎水膜がポリエチレン、ポリシロキサン
   、ポリテトラフルオロエチレンおよび疎水性物質を被覆
   したガラス繊維より成る群から選ばれる請求項１記載の
   器具。
5. ５．包囲体およびその中のフィルタースタックを含んで
   成り、該フィルタースタックが、ａ）多孔性親水膜、 ｂ）前記親水膜に接し、試薬によつて活性化されるまで
   水性流体を通過させない、多孔性疎水膜、および ｃ）前記疎水膜に接する吸収剤物質を含み、前記包囲体
   が上部壁に該親水膜に対する連通を与える開口部を有す
   ることを特徴とする分析物の試験器具。
6. ６．包囲体およびその中のフィルタースタックを含んで
   成り、該フィルタースタックが、ａ）上面、底面および
   その中の試験領域に固着している分析物用結合剤を有す
   る多孔性親水膜、ｂ）上面および下面を有し、該上面は
   前記親水膜の底面に接し、試薬で濡れるまで水性流体を
   通過させない多孔性疎水膜、 ｃ）上面および下面を有し、該上面が前記疎水膜の下面
   に接する多孔性物質のスペーサー層、ｄ）前記スペーサ
   ー層の底面に接する吸収剤物質のパッドを含み、 前記の親水膜、疎水膜、スペーサー層および吸収剤パッ
   ドは前記疎水膜が前記試薬で濡れるときに流体が導通し
   、前記包囲体は底部と蓋を含み、該蓋はくぼみを形成す
   る上方に延びるリムを有し、該くぼみはその中にインサ
   ートを有し、該蓋およびインサートは前記親水膜中の試
   験領域上部に一直線に並んだ開口部を配設させて、該領
   域に対して連通している分析物の試験器具。
7. ７．ａ）包囲体、 ｂ）分析物用結合剤を付着させている多孔性親水膜、該
   親水膜に接する疎水膜、および該疎水膜に接する吸収剤
   物質のパッドを含む前記包囲体中のフィルタースタック
   、および ｃ）前記分析物および抗分析物の１つに結合される標識
   を含むトレーサーを含んで成る分析物の試験を行う物質
   のキット。
8. ８．前記標識が酵素であり、前記キットが着色生成物を
   得るために該酵素と反応性のある色原体をさらに含む請
   求項７記載のキット。
9. ９．前記結合剤が抗体、抗原および不活性タンパク質よ
   り成る群から選ばれる請求項７記載のキット。
10. １０．さらに、既知量の前記分析物、緩衝液および洗浄
    液より成る群から選ばれる試薬を含む請求項７記載のキ
    ット。