JP3007410B2 - マルチウエルテスト - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明の分野は、固定化された特異的結合ペアメンバ
ーを使用し、そして臨床検体を捕集、希釈および分取す
るための装置に関する。

〔従来の技術および発明が解決しようとする課題〕

特定の分析物（analyte）を検出する目的で多数のイ
ムノアッセイ方法が装置化されている。そのようなアッ
セイは医療における道具として無数の用途が見い出され
ている。分析物特異的アッセイは、感染に応答して生産
される抗体、病原性物質の成分、薬剤、ホルモンおよび
酵素等のレベルを検出するために使われている。医療に
加えて、イムノアッセイおよび他の関連アッセイは製造
業においても様々な用途が見い出されており、例えば食
品混入物の検出において使われている。

不均一イムノアッセイは、普通、固体支持体に固定化
されたリガンドまたは抗体を必要とする。着目の分析物
を含む試料を、固定化された免疫試薬に通過させ、そし
て形成された抗体−リガンド複合体の量を測定する。不
均一アッセイでは、不可欠な要素として、固体支持体へ
の特異的結合ペアの一方のメンバーの固定、および支持
体に結合した標識を直接的または間接的に検出するため
の手段が挙げられる。

アッセイ操作の実施の容易さは、常に重要な考慮すべ
き事項である。ほとんどのアッセイは多数の試薬の添加
を伴い、そして多数の洗浄工程を必要とする。理想的に
は、アッセイが単純であり、且つマイクロタイタープレ
ート洗浄器やELISAリーダーのような複雑な装置の使用
を必要としないものであろう。医院、家庭または現地に
おいて実施することができるイムノアッセイが特に着目
され、そして特殊な装置を使用することなく実施できる
ように開発すべきである。

着色スポットの形成により結果が可視化される多数の
イムノアッセイが存在する。スポットの色の強度は通常
試料中の分析物の濃度に比例し、色の強度を分析物濃度
に関連づけるために計測を必要とする。そうでなけれ
ば、異なる試料によって生成したスポットの色の強度の
目視比較では、やっかいな主観的執行となり得る。半定
量的アッセイを用いても、差を識別するのは困難であろ
う。更に、色の変化にもっぱら頼るテスト結果の分析
は、弱陽性結果が得られる時に非常に困難となり得る。
従って、単純なプロトコルを有して、そして分析物の量
および陽性結果の測定に関係する主観的な誤りを実質的
に減少させる半定量的アッセイを提供することに関心が
ある。

米国特許第4,727,019号および第4,632,901号は、検出
のために適当な分析物を含む試料に暴露した時に着色ス
ポットを生成する固相イムノアッセイ装置に関する。

〔課題を解決するための手段〕

液体試料中の分析物の検出のために非機器的アッセイ
を実施するための方法および装置が提供される。この装
置は、多孔質反応性フィルター、多孔質分離層、非孔質
流量調整層および吸収性廃液収容層を含んで成る。前記
反応性フィルターは、放射状非直接濃度勾配に分布され
た特異的結合ペアメンバーを含んで成る。多孔質反応性
フィルター上に円形または環状形のスポットが生成さ
れ、この場合小さい直径のスポットは、予め決められた
レベルより低い分析物濃度を示す。

蓋密閉型チューブを含んで成るコレクター−ダイリュ
ーター−ディスペンサーとして働く試料調製装置も提供
される。コレクター−ダイリューター−ディスペンサー
装置は、ニブによって試料を吸収する。コレクター−ダ
イリューター−ディスペンサーは、ニブを支えるもろい
バリヤーによりニブから分離された液状媒体を含有し、
ニブはキャップの開口部を通って伸びている。ニブで試
料を吸収した後、バリヤーの破壊がニブを液状媒体中に
落とし、そして試料が液状媒体中に溶解する。コレクタ
ー−ダイリューター−ディスペンサーの側面上に加わる
圧力によって、もとはニブを含んでいた開口部を通って
アッセイ装置上に希釈試料を分取することが可能にな
る。

本発明は、下記の特定の態様の具体的説明を、明細書
の一部を形成する図面に照らし合わせて考慮することに
より、良く理解できるであろう。

〔具体的説明〕

本発明のシステムは２つの主成分を含んで成る。第１
図に示されるような第一の成分は、着目の分析物の存在
をアッセイするための装置である。第３図と第４図に示
されるような第二の成分は、試料を希釈しそして希釈試
料を分取するための装置から成る。第二成分は、希釈試
料をアッセイ装置に適用するために用いることができ
る。

第１図のアッセイ装置は、試料中の分析物の存在を検
出するために使われる。このアッセイ装置は、試料中に
存在する分析物の量を半定量的に測定することができ
る。このアッセイ装置における検出に適当な分析物は、
特異的結合ペアメンバーのメンバーである。特異的結合
ペアは、直接的または間接的のいずれかで検出すること
ができる安定な複合体を形成するように、溶液中で特異
的にそして普通は非共有結合的に互いと結合することが
できる、２つの非同一分子として定義される。特異的結
合ペア相互作用の一般的クラスの排他的でない例は、リ
ガンド−レセプター相互作用であり、これは主として抗
体−ハプテンまたは抗体−抗原相互作用により例示され
る。大部分のリガンドは、約125〜5,000ダルトン（Da
l）の非タンパク様の天然または合成有機分子、並びに
ペプチドおよびタンパク質であろう。本発明の装置によ
り検出され得るレセプターは、大部分はタンパク質、例
えば免疫グロブリン、その断片、特に免疫グロブリンの
一価断片、例えばFab,Fv等、酵素、天然レセプター、例
えばＴ細胞レセプター、ホルモンレセプター、表面膜レ
セプター、レクチン等であろう。他の特異的結合ペアと
しては、核酸、例えばDNAおよびRNAが挙げられる。特異
的リガンドとレセプターの開示については、米国特許第
3,996,345号の第10−17段落を参照のこと。この開示は
引用により本明細書に組み込まれる。

本発明の装置を用いて実施されたアッセイの結果は、
フィルター上に形成される環状または円形のスポットと
して視覚化される。陽性結果のスポットは暗い中心領域
と明るい外側領域を有する。濃度の差は、暗い中心環ま
たは暗い中心環と着色した外環の両方を有することによ
り検出することができる。本発明において検出すると、
結果および指示スポットの直径と分析物濃度との間の関
係が有意な利点を提供する。予め決められた濃度範囲内
の分析物については高い強度の小スポット、およびその
ような濃度より上では低い強度の大きいスポットを提供
することにより、目視検出が分析物の量、特に限界値よ
り下か上かの合理的判断を与えることができる。

指示スポットの直径と分析物の濃度との関係は、結合
ペアメンバーを非直線的放射状濃度勾配において多孔質
フィルターに固定化することにより達成される。ここで
結合ペアメンバーは、分析物と同じ化合物、交差反応性
化合物、または相互的結合ペアメンバーであることがで
きる。「相互的結合ペアメンバー」なる用語は、しばし
ば指名されるメンバーとしての分析物に関して、指名さ
れるメンバーと共に複合体形成する特異的結合ペアのメ
ンバーを意味する。放射状濃度勾配は、単位面積あたり
より低濃度の同一特異的結合ペアメンバーを含んで成る
第二の同心円に比べて比較的小さい直径を有する円の内
側領域に最高濃度の特異的結合ペアメンバーが存在する
ように配置される。通常中央の円は、外側の円の直径と
比較して0.1〜0.5:1、普通は0.1〜0.3:1の範囲の直径を
有するだろう。

第１図に示されるように、アッセイ装置は、特定の順
序で配列されそして位置を合わせてハウジング７により
一緒に保持された多重層を含む。アッセイ装置は４つの
主要層を有する。これらの層は、本質的に同じ円周寸
法、例えば長さおよび幅のものであろうが、厚さに関し
ては互いに異なっていてもよい。主要層は、下向きの順
序で次のようである。最上層は多孔質反応性フィルター
３であり、これは非孔質の仕切、例えばテープ９により
領域に分割することができる。少なくとも１つの領域、
普通は全部または大部分の領域が、分析物に関連して複
合体を形成することができる少なくとも１つの特異的結
合ペアメンバー環10を含む。前記フィルター層の下にあ
り、前記フィルター層と接触しているのは、多孔質分離
層４である。多孔質分離層の下には流量調整層５があ
る。最下層は廃液収容吸収パッド６である。多孔質分離
層４、流量調整層５および廃液収容パッド６は除外する
こともできるが、通常は存在するだろう。

多孔質反応性フィルターに言及される反応性とは、こ
のフィルターに固定されるものが、分析物を結合するこ
とができる特異的結合ペアメンバーかまたはそれの相互
的結合ペアメンバーであることを意味する。多孔質反応
性フィルターは、紙、セルロース、グラスファイバー、
ナイロン、PVDF等から成ることができる。商業的に入手
可能なそのようなフィルターの例としては、Immobilon
（Millipore）,Memtest膜（Memtek）,,Biodyna（Pal
l）,Immunodyne（Pall）、およびUltrabind（Gelman Sc
iences）が挙げられる。多孔質反応性フィルター中の孔
は、約0.1μ〜10μ、通常約１μ〜７μの範囲の平均孔
径を有するだろう。

多孔質反応性フィルター３は、複数の領域に分割する
ことができ、便利には非孔質の仕切、例えばテープ９に
より分けることができる。異なる領域は、異なる機能を
果たすことができ、例えば異なる濃度範囲の特異的結合
ペアメンバーまたはパネルテスト適用のための異なる結
合ペアメンバーのために用意することができる。対照
は、予め決められた量の標識を有するか、または任意の
結合ペアメンバーを含まない、等であることができる。
領域の全部または一部分が特異的結合ペアメンバーを含
むことができる。領域は、便利には約３〜50mm²、通常
は４〜14mm²であろう。非孔質のテープは、領域と色対
比を提供することができ、好ましくは、陽性の結果の色
観を強めるために白または黄色であろう。テープにより
提供される領域間の間隔は、通常約0.2〜15mm、普通は
１〜4mmであろう。

分析物に結合するかまたは分析物と交差反応性である
特異的結合ペアメンバーは、環の中心から比較的短距離
において実質的な濃度降下を有する（通常は中心領域の
平均濃度から幅約0.5mmのバンド内で少なくとも25％低
下する）非直線的放射状濃度勾配を有する円形のスポッ
トまたは環を生成するように、多孔質フィルターに適用
されそして非拡散的に結合または固定化された状態にな
る。使用するフィルター材料は、必然ではないが望まし
くは、特異的結合メンバーを共有結合するように化学的
に反応性である。結合ペアメンバー溶液の適当な適用に
より、より大きな半径で且つ実質的に低濃度の同中心の
外側の隣接円により囲まれた中心から小さい半径内に、
高濃度の結合ペアメンバーを得ることができる。

適用溶液は、通常は約４〜10の範囲内のpH、約10μg/
ml〜5mg/mlの特異的結合ペアメンバー濃度を有する緩衝
液であろう。他の溶質として、約10μＭ〜1Mの濃度の塩
を含むことができる。緩衝液濃度を低下もしくは増加さ
せるか、または他の非反応性溶質、例えばグリコールを
添加することにより、特異的結合ペアメンバーの拡散速
度を変化させ、高濃度領域の直径を増加または減少させ
ることができる。

高濃度領域は、多孔質フィルターの高反応性、溶液の
適用部位の周りの領域における圧縮、および中心領域に
おける溶液からの特異的結合ペアメンバーの涸渇により
達成される。

ニブは、完全に埋まった円よりもむしろ、未着色の中
心の周りに結合ペアメンバーの環を生成するのに十分で
あるように、くぼみにおいて膜の多孔度を変化させる圧
力で多孔質反応性フィルターに適用することができる。

単一試料中の複数の分析物の存在を同時に分析できる
ように、異なる領域に異なる結合ペアメンバーを適用す
ることができる。同一結合ペアメンバーを異なる濃度で
異なる領域に適用し、分析物濃度の定量を助け、そして
単一のまたは小分割された多孔質反応性フィルター上で
の広範囲の検出可能な分析物濃度に備えることができ、
あるいは個々の領域が独立のフィルター要素であること
ができる。領域あたり同一結合ペアメンバーの１または
複数のスポットを、通常は同濃度で、適用することがで
きる。複数の結合ペアメンバースポットが単一領域中に
存在する時、それらのスポットは重あり合ってもよい。
本発明の好ましい態様では、各測定領域に２つの結合ペ
アメンバースポットが存在するだろう。負の対照を提供
するために、１または複数の領域は結合ペアメンバーを
含まないだろう。予め決められた量の標識の存在を提供
することにより、分析物についての正の対照を与えるこ
ともできる。

多孔質分離層４は、アッセイ装置の多孔質反応性フィ
ルター層３のすぐ下に、直接接触して、そして位置を合
わせて置かれる。多孔質分離層４は、多孔質反応性フィ
ルター３の下面と接触している。多孔質分離層は多孔質
反応性フィルターを支持するために役立ち、そして試薬
がアッセイ装置の最上層から下層まで均等に流れるよう
にする。多孔質分離層は、本発明と関連して使われる試
薬を実質的に結合したり相互作用したりしない任意の硬
質または半硬質多孔質材料であることができる。多孔質
分離層用の材料の例は、グラスファイバー、紙、親水性
ポリプロピレンおよびセルロースであり、好ましくは、
多孔質分離層はＨ−HDC（Pall）から作られる。多孔質
分離層は、多孔質反応性フィルター層またはその要素と
本質的に同じ円周寸法または形のものである。多孔質分
離層の厚さは、通常約0.1mm〜1mmの範囲内であろう。

多孔質分離層４のすぐ下にあり接触しているのは、流
量調整層５である。便利には、流量調整支持層５は、均
等に置かれた、直線状にまたは適当に配置された、通常
は１または２本の線において配置された複数の小さな穿
孔を含み、好ましくは各領域の下に穿孔を有する。流量
調整量は、多孔質反応性フィルター３からの試薬の流れ
を遅くするためと方向づけるための両方に役立つ。流量
調整層は、アッセイの実施に使用される試薬に対して実
質的に不活性である任意の非硬質湿潤性材料から作るこ
とができる。流量調整層は、フィルター層と本質的に同
じ円周寸法または形のものであろう。流量調整層の正確
な厚さは、本発明の機能にとって重要ではなく、通常は
約２〜10ミルであろう。

穿孔は、装置を通る液体試薬の流れを妨害するのに役
立つサイズおよび数を有するだろう。一般に、多孔質反
応性フィルターと試薬との間の所望の接触時間が長くな
ればなるほど、穿孔の横断面積は小さくなるであろう。
個々の穿孔の形は重要でない。個々の穿孔は、普通は約
５ミル〜50ミル、より普通には７ミル〜15ミルの範囲の
横断面積を有し、穿孔の数は、流量調整量の長さに沿っ
て1cmあたり約１〜10個であろう。穿孔は、多孔質反応
性フィルター層３の異なる多孔質領域を通過する試薬の
均等な流れを与えるように、均等に分布させることがで
きる。必須ではないけれども好ましくは、流量調整層の
穿孔は多孔質反応性フィルター３の無テープ領域の下に
置かれる。

流量調整層５の下にありそして直線接触しているの
は、廃液収容層６である。流量調整層の穿孔から流出す
る試薬は直接廃液収容層に入る。廃液収容層は、アッセ
イ装置のその他の層から離れた試薬溶液を引き集める。
廃液収容層の吸収容量は、特定のアッセイの実施のため
にアッセイ装置に添加するのに必要とされる試薬の全容
量よりも実質的に大きい。廃液収容量は、任意の便利な
材料、例えば綿、ブロッティング紙、ポリエステル繊
維、セルロースアセテート等であることができる。

アッセイ装置の多重層は、装置ハウジング７の中に一
緒に保持される。ハウジングは、便利には成形可能であ
る様々な市販のプラスチック類、例えばポリエチレン、
ポリプロピレン、スチレン、ABS、ポリアクリレート、
ポリスチレン等のいずれかである不活性材料から作られ
るだろう。

第１図は、そのようなハウジングの１つの可能な態様
を例示する。ハウジングは、装置を通って流れる液体が
多孔質反応性フィルター３を通って均等に流れるよう
に、装置の層と層の間に連続的な且つ均等な接触を維持
するために、層を圧縮することができる。好ましくは、
ハウジングは１または複数の部品から成ることができ
る。好ましくは、ハウジングは２つの部品、即ち上部の
貯槽１と下部のケーシング７から成るであろう。貯槽１
はハウジングの上の部分であり、圧縮下で槽を維持する
ために内側リップを有することができる。便宜上、貯槽
はハウジングの残部から分離することができる。

貯槽は、希釈試料がフィルター表面上に均等に分布さ
れるように、部分的にまたは完全に希釈試料で満たされ
るだろう。貯槽は、添加された溶液の量を示す標線を有
することができる。貯槽は開放底２を有し、多孔質反応
性フィルター３により底が閉鎖される。装置の一端を他
のものと識別するために装置をマーキングすることがで
きる。マーキングは、少なくとも１つの軸に沿って非対
称にハウジングを作製することによりハウジングの形に
固有のものであることができ、またはハウジング上に存
在するシンボルとして極性マーキングを明示することが
できる。

ハウジングの正確な寸法はアッセイ装置の機能にとっ
て重要ではないが、一般に、装置は運搬、操作および組
立てに便利なサイズであろう。ハウジングは通常約0.5
〜5cm、好ましくは約２〜5cmの範囲内の長さを有するだ
ろう。幅は約0.3〜3cm、好ましくは約0.5〜1cmの範囲内
であろう。好ましくは、標準的な実験室用マルチチャン
ネルマイクロピペッターを使ったバッチテストを可能に
するために、幅は約9mmであろう。ハウジングの高さは
約0.5〜5cm、好ましくは約１〜3.5cmの範囲内であろ
う。

第３図と第４図に描写されたコレクター−ダイリュー
ター−ディスペンサー装置は、本発明の第一成分である
アッセイ装置（第１図）と共に、または独立して使用す
ることができる。コレクター−ダイリューター−ディス
ペンサー装置は、５つの主成分を含んで成る：親水性ニ
ブ11、コレクター−ダイリューター−ディスペンサー装
置の外に落ちないようにニブを保持するキャップ14、キ
ャップ14により密閉される柔軟性管状容器15、液状媒体
17、および液状媒体の流れを抑制しそして液体媒体中に
落ちないようにニブを支持するもろいバリヤー16。ここ
でニブ11は、キャップ14の開口部18を通って伸びてい
る。

コレクター−ダイリューター−ディスペンサーの使用
法は次のように説明される。液体試料をコレクター−ダ
イリューター−ディスペンサーのニブ11と接触させる。
試料がいったんニブにより吸収されたら、ニブを試料源
から取り出し、そしてコレクター−ダイリューター−デ
ィスペンサーのニブ先端12を上向きに向ける。装置内部
のもろいバリヤー16を破壊し、バリヤー16の破壊により
試料含有ニブ11を液状媒体17中に落下させる。そこで試
料がニブ11から放出され、液状媒体17中に拡散する。ニ
ブは分子、粒子、例えばウイルス粒子、細胞等を吸収
し、そしてそれらを液状媒体中に効率的に拡散させるこ
とができる。液状媒体と試料が混合され、こうして試料
が希釈された後、上述したアッセイ装置中に希釈試料を
分取するためのスポイトとしてコレクター−ダイリュー
ター−ディスペンサーを使用することができる。主管15
は圧力下で変形する柔軟性材料から作られており、そし
て以前ニブ11が伸びていたキャップ中の開口部18を通っ
て希釈試料が自由に流れ出ることができるため、コレク
ター−ダイリューター−ディスペンサーはスポイトとし
て使用することができる。

ニブ11は幾つかの機能を有する。ニブは試料を吸収す
ることができ、更に吸収された試料を液状媒体17中に放
出することもできる。ニブは、液状媒体17中への放出の
ためにタンパク質および細胞を吸収することもできる。
更に、ニブ計量機能を有する。本質的に同一のニブは、
予め決められた希釈比が再現できるように、再現可能な
量の試料を吸収しそして放出するだろう。

ニブ11は、種々の試薬に備えることにより、活性機能
を果たすこともできる。ニブ11は、脱水形において、検
体または分析物反応性化合物、例えば抗凝血物質（EDT
A、クエン酸塩、ヘパリン）、洗浄剤等を含むこともで
きる。ニブ11はまた、脱水形において結合されたリガン
ドを含有することができ、このためニブ11はリガンド−
分析物相互作用のための固相支持体として働くことがで
きる。

ニブ11を用いて試料が捕集されれば、液状媒体中への
試料の放出の前に試料をニブ11上で乾燥させることが可
能であり、または実質的な乾燥が起こり得る前に試料を
含むニブを液状媒体と混合することができる。

ニブ11は、通常、着目の分析物に対して実質的に不活
性であろう親水性の比較的変形しうる耐性材料から構成
されるだろう。ニブが液体試料に接触した時、水性試料
がニブに吸い込まれるように、ニブは親水性材料から作
られる。ニブに適当な材料の排他的でない例は、ナイロ
ン、ポリエチレンまたはポリプロピレンである。好まし
くは、ニブ材料はナイロンである。好ましくは、ニブは
American Filtronaにより製造されたNib 99356である。
ニブは本質的に円筒形であり、ニブの暴露先端はとがっ
ている。ニブのとがった先端12は、分析しようとする試
料と接触される。ニブの反対側の端は、キャップ14の開
口部18の直径よりも幾分大きい直径を有する球根状の形
13を有する。

ニブは、使用される試料サイズに依存して、通常約3m
m〜4cmの長さおよび約0.2〜3mmの直径を有するだろう。

キャップ14は、一端19で閉じられた柔軟性チューブ15
の上に乗せられる。柔軟性チューブは、スクイーズ中に
容易に変形する材料から作られる。このチューブ用材料
の例は、プラスチック、例えばポリスチレン、ポリプロ
ピレン、または他の不活性エラストマー材料である。チ
ューブの正確な寸法は重要でないが、便利にはチューブ
は約１〜5mlの容積を有するだろう。

バリヤー16は、もろい材料、好ましくはガラスまたは
プラスチック製であり、そして指圧下で容易に破壊され
るような厚さを有する。その材料は液状媒体と試料の両
方に対して不活性であるべきである。ニブを支持するこ
とと液状媒体の流れを抑制するのと両方を可能にするバ
リヤー16の多数の可能な形状が存在する。２つの可能な
形状を第３図と第４図に示す。第３図では、バリヤー16
が液状媒体を含有するアンプルの頂部にある。第４図で
は、バリヤー16が柔軟性チューブを完全に横切って伸び
ているディスクである。

液状媒体17の組成は、特定のアッセイの要求条件に応
じて異なるだろう。一般に、液状媒体は水溶液であろ
う。液状媒体17は、試料を希釈するために働く以外に、
アッセイにおいて機能を有する化合物を含むこともでき
る。例えば、液状媒体は緩衝液および／または非特異的
結合ブロック剤、例えばウシ血清アルブミン、カゼイ
ン、血清等を含むことができる。液状媒体17は、検体中
に含まれる分析物と結合することのできる特異的結合ペ
アメンバー、または色素形成試薬を含むこともできる。

本発明は、固相の使用を要求する確立されたイムノア
ッセイ方法と共に使用することができる。「イムノアッ
セイ」なる用語の使用は、イムノアッセイと、たとえば
結合ペアのどちらのメンバーも抗体またはその断片でな
いとしても、固定化された特異的結合ペアメンバーを使
用する類似の意図のアッセイの両方を包含することを意
味する。それらの方法は、特異的結合ペア複合体の形成
を検出するために様々な試薬の添加を必要とする。結合
ペア複合体の形成は、便利には酵素媒介反応の生成物と
して生成されるであろう色素または蛍光団の存在によ
り、通常検出されるであろう。標識試薬は、フィルター
上に固定化された結合ペア複合体に結合することができ
る。適当な色素形成試薬の添加により、多孔質反応性フ
ィルターを着色することによって酵素標識が固定化結合
ペア複合体の位置を明らかにすることが可能になる。

貯槽を経てアッセイ装置に添加されるアッセイ試薬お
よび試料の量は、本発明の様間な態様によって異なる。
貯槽は希釈試料または試薬で一杯に満たすことができ、
またはより少ない量を添加することもできる。一般に、
与えられた特定の態様については、予め決められた且つ
再現可能な量の希釈試料が添加され、一方試薬は通常は
過剰量で存在するだろう。希釈試料の量は、コレクター
−ダイリューター−ディスペンサー装置からの小滴にお
いて、または貯槽中の標線により、計量することができ
る。１または複数滴の希釈試料が各無テープ領域に適用
され、または貯槽が部分的にもしくは完全に満たされ得
る。好ましくは、溶液と測定領域との間の均等な接触が
維持されるように希釈試料と試薬で貯槽が満たされるだ
ろう。貯槽に添加する希釈試料と試薬の量が増加する
と、添加された溶液と多孔質反応性フィルターとの接触
時間が増加し、更にフィルター表面に結合する特異的結
合ペアメンバーの量が増加するだろう。

HTVL−１に対する抗体の存在について血液をアッセイ
するために本発明を用いる例を以下に示す。使用する試
薬の量は装置のサイズに応じて異なるだろう。患者の指
刺によって得られた１滴の血液をスライドガラス上に置
く。コレクター−ダイリューター−ディスペンサー上の
ニブ11の先端をスライド上の血液小滴に接触させ（また
は刺した指に直接接触させてもよい）、そして血液をニ
ブに吸い込ませる。ニブが飽和した時、キャップ14が頂
上にくるようにコレクター−ダイリューター−ディスペ
ンサーを直立に置く。コレクター−ダイリューター−デ
ィスペンサーの壁面に圧力をかけることにより、もろい
バリヤー16を破壊する。ニブが液状媒体17中に落下し、
次いでコレクター−ダイリューター−ディスペンサーを
撹拌し、適切な混合を確保する。

次に、反応性フィルター３を覆うように、数滴の希釈
試料をアッセイ装置の頂部の貯槽に添加する。多孔質反
応性フィルターは、非直線的放射状濃度勾配において１
または複数の測定領域に結合されたHTLV−１エンベロー
プ抗原のスポットを含有する。既知量の標識が存在する
正の対照と、標識が全く存在しない負の対照もそれぞれ
存在する。貯槽への希釈試料の添加の直前に、ブロッキ
ング剤の溶液を貯槽に添加し、そして貯槽を排水させ
る。ブロッキング剤とは、多孔質反応性フィルター上の
利用可能な非特異的結合部位をブロックするであろう１
または複数の化合物、例えばウシ血清アルブミンまたは
カゼイン、を含む溶液を意味する。希釈試料の添加後、
希釈試料を排水させる。次いでビオチニル化ヤギ抗ヒト
IgG抗体の溶液を貯槽に添加し、そしてこの溶液を排水
させる。次にストレプトアビジン接合アルカリホスファ
ターゼを貯槽に添加し、そして排水させる。次に洗浄緩
衝液を貯槽に添加し、そして排水させる。色素形成性ア
ルカリホスファターゼ基質を貯槽に添加し、そして排水
させる。発色した後、反応停止溶液（0.2Mリン酸塩pH
6）を添加し、酵素反応を停止そせる。

上記記載から、本発明が試料中の様々なタイプの分析
物の検出および測定に適当である様々なアッセイを実施
するための装置および方法を提供することは明らかであ
る。分析物の存在は着色スポットの形成により明らかに
される。試料中の分析物の濃度が予め決められた限界値
を上回るならば、着色スポットの直径が増大して大きな
直径の円を限定する。分析物濃度とスポットの直径との
関係は、色の強度の変化により結果を単に伝えるイムノ
アッセイを上回る重要な利点を構成する。本発明の他の
利点は、環状パターンの形成であり、環状パターン形成
と色形成との組合せは、単なる着色スポットの形成より
もずっと識別が容易である。この利点は、色の強度が低
い時に特に重要である。色の強度の変化を判断するに
は、複雑な光学装置または粗雑な評価への信用が必要で
ある。本発明は複雑な装置を必要としないので、医院や
現地などの環境中でアッセイを行うことができ、従って
費用と時間の両方の有意な節約を行うことができる。

本発明はまた、或る量の試料を予め決められた比率で
正確に希釈し、そして希釈試料をアッセイ装置中に分取
することを可能にする、コレクター−ダイリューター−
ディスペンサー装置を提供する。このコレクター−ダイ
リューター−ディスペンサーは、装備の量およびテスト
用に希釈試料を調製するのに必要な工程を最少にするた
めに役立つ。従って、コレクター−ダイリューター−デ
ィスペンサーは、全アッセイ操作を促進しそして誤りの
危険を減らすのに役立つ。

次の実施例は例示の目的で与えられ、決して限定のた
めではない。

〔実施例〕

HTLV−1/2テスト 本発明を使用する診断テストは、HTLV−1/2テストと
称するカートリッジ形において提供される。このカート
リッジは、アッセイの実施に必要な全ての試薬、コレク
ター−ダイリューター−ディスペンサー、および複数の
カートリッジを保持するためのトレー、を含んで成るキ
ット形において提供される。

HTLV−1/2テストは、ヒト血清、血漿または全血中のH
TLV−１およびHTLV−２に対するIgG抗体の検出のための
迅速な定性的イムノアッセイである。このテストは、主
として新鮮試料を用いた使用のために考案される。

アッセイの原理 HTLV−1/2テストは、組み込まれた正および負の対照
との比較による単一臨床試料における抗−HTLV−１およ
び抗−HTLV−２抗体の検出を可能にするパネルテストを
容易に行うことができる。

非孔質の仕切により分けられた幾つかの反応性膜領域
（「ミニウエル」）はテストカートリッジ上を分割して
いる。

それらのミニウエルは、上から下に、正と負の操作対
照、HTLV−1/HTLI−２ウイルス溶解物抗原円、およびHT
LV−1/HTLV−２合成ペプチド円から成る。第一のミニウ
エルは、赤色の非孔質仕切により第二のミニウエルと分
離されている。第二と第三のミニウエルは黄色の仕切に
より分離されている。同様に、第三と第四のミニウエル
は白い仕切により分離されている。

単一の臨床試料希釈液をカートリッジに適用する。膜
上に安定な青色の生成をもたらす免疫酵素反応により、
結合したIgGを検出する（高感度を提供するための増幅
工程を含む）。

識別可能な二重環パターンは、テスト結果の容易で且
つ高感度の読みを保証する。正の対照は、臨床試料が省
略されなかったこと、全ての試薬が活性であったこと、
およびテストが正しく実施されたことを立証する。

負の対照は、陰性の検体に対する弱陽性の検体の容易
な区別を可能にする。

このテストを実施または読み取るのに特別な装置は全
く必要でない。結果は数分で得られる。テストの形式
は、標準的なマルチチャンネルマイクロピペットを使っ
たバッチテストおよび一回テストの両方に適する。

キット成分 1. すぐ使用できるHTLV−カードリッジ 2. 凍結乾燥試薬（Ａ） 〔１％（w/v）カゼイン、0.1％（v/v）Twenn20を含
む0.1M PBS pH7.4〕 3. コレクター−ダイリューター−ディスペンサー 4. 凍結乾燥試薬（Ｃ） 〔１％（w/v）カゼインを含む0.1M PBS pH7.4中に
1:100希釈された抗ヒトIgG−ビオチン接合体〕 5. 凍結乾燥試薬（Ｄ） 〔１％（w/v）BSAを含む0.1Mホウ酸塩pH8中に1:100
希釈されたアルカリホスファターゼ−ストレプトアビジ
ン接合体〕 6. 洗浄液／緩衝液 希釈剤（Ｅ） 〔0.01％（w/v）チメロサールを含む0.05Mホウ酸塩
pH8〕 7. 色素形成基質（Ｆ） （ブロモクロロインドキシルホスフェート溶液） 8. 停止溶液（Ｇ） （0.2M リン酸塩 pH6） 9. 抗−HTLV−１ 陽性血清 （不活性化されたもの）（Ｉ） 10.テストユニット保持トレー （ナイロンフィルターとナイロンニブ（Nib 99356）を
使って、1mg/ml DMSOのHTLV−１ペプチド溶液を0.1M酢
酸塩pH4中に1:40希釈する。ニブを貯槽に取り付け、そ
して液体が拡散してミニウエルを覆うまでナイロンフィ
ルター上にニブを押しつける。２つのニブを使ってミニ
ウエルあたり２つの円を形成させてもよい。） アッセイを実施するための指示は次のようである。

試薬の調製 使用前に試薬類を室温に戻す。7mlの溶液Ｅを使って
凍結乾燥試薬A,CおよびＤを再構成する。試薬を穏やか
に撹拌して混合する。試薬容器はスポイト蓋付びんであ
る。スポイトは、予め決められた量の試薬をアッセイに
添加するために標線を有する。バッチテストを実施しよ
うとする場合は、スポイトの代わりに標準的なマルチチ
ャンネル（８または12）マイクロピペットを使うことが
できる。

アッセイ手順 −必要な数のHTLV−カートリッジにラベルを貼る（各
検体につき１個）。カートリッジ（１〜12）を装置トレ
ー中に置く。

−HTLV−カートリッジに400μの再構成試薬Ａを添
加する（標線まで満たされたスポイトＡを使って）。完
全に排水させる。

−コレクター−ダイリューター−ディスペンサー（CD
D）を使って検体を捕集・希釈する。

（CDDは約30μの容量を有するニブ、および0.1M炭酸
塩／炭酸水素塩緩衝液、１％カゼイン、0.1％Tween−2
0、0.01％チメロサール、pH9.5を1ml含むバイアルを有
する。） −コレクター−ダイリューター−ディスペンサーを使
って、カートリッジ８滴に希釈試料を添加する。３〜５
分間置く。

−200μの再構成試薬Ｃをカートリッジに添加す
る。完全に排水させる。

−200μの再構成試薬Ｄをカートリッジに添加す
る。完全に排水させる。

−1mlの洗浄液Ｅをカートリッジに添加する。完全に
排水させる。

−200μ（８滴）の色素形成基質Ｆをカートリッジ
に添加する。３分間置く。結果を読み取る。

−任意:5〜10分後に再び結果を読み取る。200μの
停止溶液Ｇをカートリッジに添加する。

結果の解釈 −テストの確認：赤い仕切の下の第一ミニウエル（正
の対照）において青い環が見られる。第二ミニウエル
（第一の黄色の仕切の下）は、何も認められないかまた
は明るい青色の環を示す。

−第三と第四ミニウエル（黄色い仕切と白い仕切の
間）における第二ミニウエルよりも暗い青色の環は、抗
−HTLV−１または抗−HTLV−２抗体についての陽性結果
を示す。

−全てのミニウエルにおける青色発色は、テストの機
能不全を示す。

−第三ミニウエルには青い環があり且つ第四ミニウエ
ルに青い環がない場合、またはその逆の場合は、他のテ
ストを使って再テストし確認すべきである。

使用済のカートリッジは、反応を停止させた後、乾燥
保存して永久記録して役立つことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はアッセイ装置の斜視図である。 第２図は第１図の装置の多孔質反応性フィルターの平面
図である。 第３図はコレクター−ダイリューター−ディスペンサー
装置の正面断面図である。 第４図は第３図のコレクター−ダイリューター−ディス
ペンサー装置の別の態様の正面断面図である。 図中、主要な部分の参照番号と対応する名称は次の通り
である： １……貯槽、 ３……多孔質反応性フィルター、 ４……多孔質分離層、 ５……流量調整層、 ６……廃液収容層、 ９……非孔質仕切（テープ）、 10……特異的結合ペアメンバー環、 11……ニブ、 16……バリヤー、 17……液状媒体。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ベス アトウッド アメリカ合衆国，カリフォルニア 94025，メンロー パーク，イースト グレーンウッド ドライブ 449 (72)発明者 ディビッド ラムラー アメリカ合衆国，カリフォルニア 94062，ウッドサイド，オークヒル ド ライブ 30 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/543

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】特異的結合ペアのメンバーである分析物を
   測定するための診断装置であって、前記測定のために可
   視検出可能なシグナルに備えた標識を使用し、 上の貯槽部および少なくとも１つの層を保持するための
   下のケーシング部を含んで成るハウジング； 前記ケーシング中に流れの方向において、 前記貯槽部の床としての多孔質反応性フィルターであっ
   て、前記フィルターに固定化された特異的結合ペアメン
   バーの測定円を含んで成り、そして高濃度の内円と実質
   的に低濃度の同中心の外円を含む濃度勾配を限定してい
   る多孔質反応性フィルター；および 前記多孔質反応性フィルターからの流体を収容するため
   の流体収容手段 を含んで成る装置。
2. 【請求項２】前記流体収容手段が、多孔質分離層；流れ
   の速度を減少させるための流量調整層；および吸収性廃
   液収容層を含んで成る、請求項１に記載の装置。
3. 【請求項３】分析物を測定するための診断装置であっ
   て、少なくとも１つの領域を有する多孔質反応性フィル
   ターであって前記領域のうちの少なくとも１つの中に、
   前記フィルターに固定化された特異的結合ペアのメンバ
   ーの測定円を含んで成り、そして高濃度の内円と実質的
   に低濃度の同中心の外円を含む濃度勾配を限定している
   多孔質反応性フィルターを含んで成る診断装置。
4. 【請求項４】前記装置が非孔質の仕切により分離された
   少なくとも２つの領域を含んで成る、請求項３に記載の
   診断装置。
5. 【請求項５】少なくとも１つの前記領域が同一の非特異
   的結合ペアメンバーを有する少なくとも２つの測定円を
   含んで成る、請求項３に記載の診断装置。
6. 【請求項６】診断アッセイのために試料を処理するのに
   有用なコレクター−ダイリューター−ディスペンサー装
   置であって、 一端が閉鎖された圧縮可能なチューブ； 前記チューブの開放端の上に据え付けられそして少なく
   とも１つの開口部を含んで成るカバー； 前記チューブ中の液状媒体； 前記開口部と前記媒体とを分離している少なくとも１つ
   のもろいバリヤー；および 前記バリヤーの上方にありそして前記開口部を通って伸
   びている少なくとも１つの吸収性ニブであって、前記装
   置を反転させた時、前記ニブが前記開口部を通過して落
   下するのを防ぐ手段を含んで成る吸収性ニブ を含んで成る装置。
7. 【請求項７】前記もろいバリヤーが、前記媒体を封入し
   ているもろい封管である、請求項６に記載の装置。
8. 【請求項８】前記ニブがとがった先端を有する、請求項
   ６に記載の装置。
9. 【請求項９】診断アッセイを実施するためのキットであ
   って、請求項１に記載の装置、請求項６に記載の装置お
   よび前記アッセイを実施するための試薬、を含んで成る
   キット。
10. 【請求項１０】試料中の分析物の存在を検出する方法で
    あって、特異的結合ペアメンバー複合体の形成を検出す
    るために可視シグナルを生じる試薬系を使用し、 前記試料を請求項６に記載の装置のニブと接触せしめ、
    それにより前記試料が前記ニブにより吸収され； 前記もろいバリヤーを破壊し、それにより前記ニブが前
    記液状媒体と一緒になり、そして前記試料が前記媒体中
    に拡散し、ここで前記媒体は所望により前記試薬系の少
    なくとも１つを含んでおり； 特異的結合ペアのメンバーである分析物を測定するため
    の診断装置の貯槽に前記媒体を添加し、ここで前記装置
    は、 上の貯槽部および少なくとも１つの層を保持するための
    下のケーシング部を含んで成るハウジング； 前記ケーシング中に流れの方向において、 前記貯槽部の床としての多孔質反応性フィルターであっ
    て、前記フィルターに固定化された特異的結合ペアメン
    バーの測定円を含んで成り、そして高濃度の内円と実質
    的に低濃度の同中心の外円を含む濃度勾配を限定してい
    る多孔質反応性フィルター；および 前記多孔質反応性フィルターからの流体を収容するため
    の流体収容手段、 を含んで成り； 前記媒体を、前記多孔質反応性フィルターを通って前記
    流体収容手段の中に通過させ； 前記試薬系の任意の他の試薬を前記多孔質反応性フィル
    ターに添加し；そして 既知量の分析物を有する試料を使って得られた可視シグ
    ナルに関連させて前記可視シグナルの存在を検出する、 ことを特徴とする方法。