JPH03233360A - マルチウエルテスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明の分野は、固定化された特異的結合ペアメンバー
を使用し、そして臨床検体を捕集、希釈および分取する
ための装置に関する。

〔従来の技術および発明が解決しようとする課題〕特定
の分析物（ａｎａｌｙｔｅ）を検出する目的で多数のイ
ムノアッセイ方法が装置化されている。そのようなアッ
セイは医療における道具として無数の用途が見い出され
ている。分析物特異的アッセイは、感染に応答して生産
される抗体、病原性物質のｔ分、薬剤のレベル、ホルモ
ンおよび酵素等を検出するために使われている。医療に
加えて、イムノアッセイおよび他の関連アッセイは製造
業においても様々な用途が見い出されており、例えば食
品混入物の検出において使われている。

不均一イムノアッセイは、普通、固体支持体に固定化さ
れたリガンドまたは抗体を必要とする。

着目の分析物を含む試料を、固定化された免疫試薬に通
過させ、そして形成された抗体−リガント複合体の量を
測定する。不均一アッセイでは、不可欠な要素として、
固体支持体への特異的結合ペアの一方のメンバーの固定
、および支持体に結合したラベルを直接的または間接的
に検出するための手段が挙げられる。

アッセイ操作の実施の容易さは、常に重要な考慮すべき
事項である。はとんどのアッセイは多数の試薬の添加を
伴い、そして多数の洗浄工程を必要とする。理想的には
、アッセイが単純であり、且つマイクロタイタープレー
ト洗浄器やＥＬＩＳＡ　　リーダーのような複雑な装置
の使用を必要としないものであろう。医院、家庭または
現地において実施することができるイムノアッセイが特
に着目され、そして特殊な装置を使用することな〈実施
できるように開発すべきである。

着色スポットの形成により結果が可視化される多数のイ
ムノアッセイが存在する。スポットの色の強度は通常試
料中の分析物の濃度に比例し、色の強度を分析物濃度に
関連づけるために計測を必要とする。そうでなければ、
異なる試料によって生成したスポットの色の強度の目視
比較では、やっかいな主観的執行となり得る。半定量的
アッセイを用いても、差を識別するのは困難であろう。

更に、色の変化にもっばら頼るテスト結果の分析は、弱
陽性結果が得られる時に非常に困難となり得る。従って
、単純なプロトコルを有し、そして分析物の量および陽
性結果の測定に関係する主観的な誤りを実質的に減少さ
せる半定量的アッセイを提供することに関心がある。

米国特許第４．７２７．０１９号および第４．６３２．
９０１号は、検出のために適当な分析物を含む試料に暴
露した時に着色スポットを生成する固相イムノアッセイ
装置に関する。

〔課題を解決するための手段〕

液体試料中の分析物の検出のために非機器的アッセイを
実施するための方法および装置が提供される。この装置
は、多孔質反応性フィルター、多孔質分離層、非孔質流
量調整層および吸収性廃液収容層を含んで成る。前記反
応性フィルターは、放射状非直線濃度勾配に分布された
特異的結合ペアメンバーを含んで成る。多孔質反応性フ
ィルター上に円形または環状形のスポットが生成され、
この場合小さい直径のスポットは、予め決められたレベ
ルより低い分析物濃度を示す。

蓋密閉型管を含んで成るコレクター−ダイリューター−
デイスペンサーとして働く試料調製装置も提供される。

コレクター−ダイリューター−デイスペンサー装置は、
ニブによって試料を吸収する。コレクター−ダイリュー
ター−デイスペンサーは、ニブを支えるもろいバリヤー
によりニブから分離された液状媒体を含有し、ニブはキ
ャップの開口部を通って伸びている。ニブで試料を吸収
した後、バリヤーの破壊がニブを液状媒体中に落とし、
そして試料が液状媒体中に溶解する。コレクター−ダイ
リューター−デイスペンサーの側面上に加わる圧力によ
って、もとはニブを含んでいた開口部を通ってアッセイ
装置上に希釈試料を分取することが可能になる。

本発明は、下記の特定の態様の具体的説明を、明細書の
一部を形成する図面に照らし合わせて考慮することによ
り、良く理解できるであろう。

〔具体的説明〕

本発明のシステムは２つの主成分を含んで成る。

第１図に示されるような第一の成分は、着目の分析物の
存在をアッセイするための装置である。第３図と第４図
に示されるような第二の成分は、試料を希釈しそして希
釈試料を分取するための装置から成る。第二成分は、希
釈試料をアッセイ装置に適用するために用いることがで
きる。

第１図のアッセイ装置は、試料中の分析物の存在を検出
するために使われる。このアッセイ装置は、試料中に存
在する分析物の量を半定量的に測定することができる。

このアッセイ装置における検出に適当な分析物は、特異
的結合ペアメンバーのメンバーである。特異的結合ペア
は、直接的または間接的のいずれかで検出することがで
きる安定な複合体を形成するように、溶液中で特異的に
そして普通は非共有結合的に互いと結合することができ
る、２つの非同−分子として定義される。

特異的結合ペア相互作用の一般的クラスの排他的でない
例は、リガンド−レセプター相互作用であり、これは主
として抗体−ハブテンまたは抗体−抗原相互作用により
例示される。大部分のりガンドは、約１２５〜５．００
０ダルトン（Ｄａｌ）　　の非タンパク様の天然または
合成有機分子、並びにペプチドおよびタンパク質であろ
う。本発明の装置により検出され得るレセプターは、大
部分はタンパク質、例えば免疫グロブリン、その断片、
特に免疫グロブリンの一価断片、例えばＦａｂ、Ｆｖ等
、酵素、天然レセプター、例えばＴ細胞レセプター、ホ
ルモンレセプター、表面膜レセプター、レクチン等であ
ろう。他の特異的結合ペアとしては、核酸、例えばＤＮ
ＡおよびＲＮＡが挙げられる。特異的リガンドとレセプ
ターの開示については、米国特許第３．９９６．３４５
号の第１０−１７段落を参照のこと。この開示は引用に
より本明細書に組み込まれる。

本発明の装置を用いて実施されたアッセイの結果は、フ
ィルター上に形成される環状または円形のスポットとし
て視覚化される。陽性結果のスポットは暗い中心領域と
明るい外側領域を有する。

濃度の差は、暗い中心環または暗い中心環と着色した外
環の両方を有することにより検出することができる。本
発明において検出すると、結果および指示スポットの直
径と分析物濃度との間の関係が有意な利点を提供する。

予め決められた濃度範囲内の分析物については高い強度
の小スポット、およびそのような濃度より上では低い強
度の大きいスポットを提供することにより、目視検出が
分析物の量、特に限界値より下または上かどうかの合理
的判断を与えることができる。

指示スポットの直径と分析物の濃度との関係は、結合ペ
アメンバーを非直線的放射状濃度勾配において多孔質フ
ィルターに固定化することにより達成される。ここで結
合ペアメンバーは、分析物と同じ化合物、交差反応性化
合物、または相反の結合ペアメンバーであることができ
る。「相反の結合ペアメンバー」なる用語は、しばしば
指名されるメンバーとしての分析物に関して、指名され
るメンバーと共に複合体形成する特異的結合ペアのメン
バーを意味する。放射状濃度勾配は、単位面積あたりよ
り低濃度の同一特異的結合ペアメンバーを含んで成る第
二の同心円に比べて比較的小さい直径を有する円の内側
領域に最高濃度の特異的結合ペアメンバーが存在するよ
うに配置される。

通常中央の円は、外側の円の直径と比較して０．１〜０
．５：Ｌ普通は０．１〜０．３：１の範囲の直径を有す
るだろう。

第１図に示されるように、アッセイ装置は、特定の順序
で配列されそして位置を合わせてハウジング７により一
緒に保持された多重層を含む。アッセイ装置は４つの主
要層を有する。これらの層は、本質的に同じ円周寸法、
例えば長さおよび幅のものであろうが、厚さに関しては
互いに異なっていてもよい。主要層は、下向きの順序で
次のようである。最上層は多孔質反応性フィルター３で
あり、これは非孔質の仕切、例えばテープ９により領域
に分割することができる。少なくとも１つの領域、普通
は全部または大部分の領域が、分析物に関連して複合体
を形成することができる少なくとも１つの特異的結合ペ
アメンバー環１０を含む。

前記フィルター層の下にあり、前記フィルター層と接触
しているのは、多孔質分離層４である。多孔質分離層の
下には流量調整層５がある。最下層は廃液収容吸収バッ
ド６である。多孔質分離層４、流量調整層５および廃液
収容パッド６は除外することもできるが、通常は存在す
るだろう。

多孔質反応性フィルターに言及される反応性とは、この
フィルターに固定されるものが、分析物を結合すること
ができる特異的結合ペアメンバーかまたはそれの相反の
結合メンバーであることを意味する。多孔質反応性フィ
ルターは、紙、セルロース、グラスファイバー、ナイロ
ン、ＰＶＤＦ等カら成ることができる。商業的に入手可
能なそのようなフィルターの例としては、Ｉｍｍｏｂｉ
ｌｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、　Ｍｅｍｔｅｓｔ膜（
Ｍｅｍｔｅｋ）、　Ｂｉｏｄｙｎｅ（Ｐａｌｌ）。

Ｉｍｍｕｎｏｄｙｎｅ（Ｆａｌｌ）、およびＵｌｔｒａ
ｂｉｎｄ（ＧｅｌｍａｎＳｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられ
る。多孔質反応性フィルター中の孔は、約０．１μ〜１
０μ、通常的１μ〜７μの範囲の平均孔径を有するだろ
う。

多孔質反応性フィルター３は、複数の領域に分割するこ
とができ、便利には非孔質の仕切、例えばテープ９によ
り分けることができる。異なる領域は、異なる機能を果
たすことができ、例えば異なる濃度範囲の特異的結合ペ
アメンバーまたはパネルテスト適用のための異なる結合
ペアメンバーのために用意することができる。対照は、
予め決められた量の標識を有するか、または任意の結合
ペアメンバーを含まない、等であることができる。

領域の全部または一部分が特異的結合ペアメンバーを含
むことができる。領域は、便利には約３〜５０［［ｌ［
Ｉ１２、通常は４〜１４ｍｏｎ２であろう。非孔質のテ
ープは、領域と色対比を提供することができ、好ましく
は、陽性の結果の色観を強めるために白または黄色であ
ろう。テープにより提供される領域間の間隔は、通常約
０．２〜１５ｍｍ、普通は１〜４Ｉｎｍであろう。

分析物に結合するかまたは分析物と交差反応性である特
異的結合ペアメンバーが適用され、そして多孔質フィル
ターに非拡散的に結合または固定化されるようになり、
環の中心から比較的短距離において相当な濃度降下を有
する、一般に中心領域の平均濃度から約０．５　ｍｍの
バンド内部で少なくとも約２５％低下する、非直線的放
射状濃度勾配により、円形のスポットまたは環を生成す
る。使用するフィルター材料は、必然ではないが望まし
くは、特異的結合メンバーを共有結合するように化学的
に反応性である。結合ペアメンバー溶液の適当な適用に
より、より大きな半径で且つ実質的に低濃度の同中心の
外側の隣接円により囲まれた中心から小さい半径内に、
高濃度の結合ペアメンバーを得ることができる。

適用溶液は、通常は約４〜１０の範囲内のｐＨ，約１０
に／−〜５■／ｍ１の特異的結合ペアメンバー濃度を有
する緩衝液であろう。他の溶質として、約１０μＭ−Ｌ
Ｍの濃度の塩を含むことができる。緩衝液濃度を低下も
しくは増加させるか、または他の非反応性溶質、例えば
グリコールを添加することにより、特異的結合ペアメン
バーの拡散速度を変化させ、高濃度領域の直径を増加ま
たは減少させることができる。

高濃度領域は、多孔質フィルターの高反応性、溶液の適
用部位の周りの領域における圧縮、および中心領域にお
ける溶液からの特異的結合ペアメンバーの涸渇により遠
戚される。

ニブは、完全に埋まった円よりもむしろ、未着色の中心
の周りに結合ペアメンバーの環を生成するのに十分であ
るように、くぼみにおいて膜の多孔度を変化させる圧力
で多孔質反応性フィルターに適用することができる。

単一試料中の複数の分析物の存在を同時に分析できるよ
うに、異なる領域に異なる結合ペアメンバーを適用する
ことができる。同一結合ペアメンバーを異なる濃度で異
なる領域に適用し、分析物濃度の定量を助け、そして単
一のまたは小分割された多孔質反応性フィルター上での
広範囲の検出可能な分析物濃度に備えることができ、あ
るいは個々の領域が独立のフィルター要素であることが
できる。領域あたり同一結合ペアメンバーの１または複
数のスポットを、通常は同濃度で、適用することができ
る。複数の結合ペアメンバースポットが単一領域中に存
在する時、それらのスポットは重なり合ってもよい。本
発明の好ましい態様では、各測定領域に２つの結合ペア
メンバースポットが存在するだろう。負の対照を提供す
るために、１または複数の領域は結合ペアメンバーを含
まないだろう。予め決められた量の標識の存在を提供す
ることにより、分析物についての正の対照を与えること
もできる。

多孔質分離層４は、アッセイ装置の多孔質反応性フィル
ター層３のすぐ下に、直接接触して、そして位置を合わ
せて置かれる。多孔質分離層４は、多孔質反応性フィル
ター３の下面と接触している。

多孔質分離層は多孔質反応性フィルターを支持するため
に役立ち、そして試薬がアッセイ装置の最上層から下層
まで均等に流れるようにする。多孔質分離層は、本発明
と関連して使われる試薬を実質的に結合したり相互作用
したりしない任意の硬質または半硬質多孔質材料である
ことができる。

多孔質分離層用の材料の例は、グラスファイバー紙、親
水性ポリプロピレンおよびセルロースであり、好ましく
は、多孔質分離層はＨ−ＨＤＣ（Ｐａｉｌ）から作られ
る。多孔質分離層は、多孔質反応性フィルター層または
その要素と同じ円周寸法または形から本質的に成る。多
孔質分離層の厚さは、通常約０．１　ｃｕｒ〜１ｍｍの
範囲内であろう。

多孔質分離層４のすぐ下にあり接触しているのは、流量
調整層５である。便利には、流量調整支持層５は、均等
に置かれた、直線状にまたは適当に配置された、通常は
１または２本の線において配置された複数の小さな穿孔
を含み、好ましくは各領域の下に穿孔を有する。流量調
整層は、多孔質反応性フィルター３からの試薬の流れを
遅くするためと方向づけるための両方に役立つ。流量調
整層は、アッセイの実施に使用される試薬に対して実質
的に不活性である任意の非孔質湿潤性材料から作ること
ができる。流量調整層は、フィルター層と本質的に同じ
円周寸法または形のものであろう。流量調整層の正確な
厚さは、本発明の機能にとって８重要ではなく、通常は
約２〜１０ミルであろう。

穿孔は、装置を通る液体試薬の流れを妨害するのに役立
つサイズおよび数を有するだろう。一般に、多孔質反応
性フィルターと試薬との間の所望の接触時間が長くなれ
ばなるほど、穿孔の横断面積は小さくなるであろう。個
々の穿孔の形は重要でない。個々の穿孔は、普通は約５
ミル〜５０ミノへより普通には７ミル〜１５ミルの範囲
の横断面積を有し、穿孔の数は、流量調整層の長さに沿
って１ｃｍあたり約１〜１０個であろう。穿孔は、多孔
質反応性フィルター層３の異なる多孔質領域を通過する
試薬の均等な流れを与えるように、均等に分布させるこ
とができる。必須ではないけれども好ましくは、流量調
整層の穿孔は多孔質反応性フィルター３の無テープ領域
の下に置かれる。

流量調整層５の下にありそして直接接触しているのは、
廃液収容層６である。流量調整層の穿孔から流出する試
薬は直接廃液収容層に入る。廃液収容層は、アッセイ装
置のその他の層から離れた試薬溶液を引き集める。廃液
収容層の吸収容量は、特定のアッセイの実施のためにア
ッセイ装置に添加するのに必要とされる試薬の全容量よ
りも実質的に大きい。廃液収容層は、任意の便利な材料
、例えば綿、プロッティング紙、ポリエステル繊維、セ
ルロースアセテート等であることができる。

アッセイ装置の多重層は、装置ハウジング７の中に一緒
に保持される。ハウジングは、便利には成形可能である
様々な市販のプラスチック類、例えばポリエチレン、ポ
リプロピレン、スチレン、ＡＢＳ、ポリアクリレート、
ポリスチレン等のいずれかである不活性材料から作られ
るだろう。

第１図は、そのようなハウジングの１つの可能な態様を
例示する。ハウジングは、装置を通って流れる液体が多
孔質反応性フィルター３を通って均等に流れるように、
装置の層と層の間の連続的な且つ均等な接触を維持する
ために、層を圧縮することができる。好ましくは、ハウ
ジングは１または複数の部品から成ることができる。好
ましくは、ハウジングは２つの部品、即ち上部の貯槽１
と下部のケーシング７から戒るであろう。貯槽１はハウ
ジングの上の部分であり、圧縮下で層を維持するために
内側リップを有することができる。

便宜上、貯槽はハウジングの残部から分離することがで
きる。

貯槽は、希釈試料がフィルター表面上に均等に分布され
るように、部分的にまたは完全に希釈試料で満たされる
だろう。貯槽は、添加された溶液の量を示す標線を有す
ることができる。貯槽は開放底を有し、多孔質反応性フ
ィルター３により底が閉鎖される。装置の一端を他のも
のと識別するために装置をマーキングすることができる
。マーキングは、少なくとも１つの軸に沿って非対称に
ハウジングをマーキングすることによりハウジングの形
に固有のものであることができ、またはハウジング上に
存在するシンボルとして極性マーキングを明示すること
ができる。

ハウジングの正確な寸法はアッセイ装置の機能にとって
重要ではないが、一般に、装置は運搬、操作および組立
てに便利なサイズであろう。ハウジングは通常約０．５
〜５ｃｍ、好ましくは約２〜５ｃｍの範囲内の長さを有
するだろう。幅は約０．３〜３ｃｍ、好ましくは約０．
５〜ｌ　Ｃｍの範囲内であろう。

好ましくは、標準的な実験室用マルチチャンネルマイク
ロピペッタ−を使ったバッチテストを可能にするために
、幅は約９閣であろう。ハウジングの高さは約０．５〜
５ｃｍ、好ましくは約１〜３．５　ａｍの範囲内であろ
う。

第３図と第４図に描写されたコレクター−ダイリュータ
ー−デイスペンサー装置は、本発明の第一成分であるア
ッセイ装置（第１図）と共に、または独立して使用する
ことができる。コレクターダイリューター−デイスペン
サー装置は、５つの主成分を含んで成る：親水性ニブ１
１、コレクター−ダイリューター−デイスペンサー装置
の外に落ちないようにニブを保持するキャップ１４、キ
ャップ１４により密閉される柔軟性管状容器１５、液状
媒体１７、および液状媒体の流れを抑制しそして液状媒
体中に落ちないようにニブを支持するもろいバリヤー１
６゜ここでニブ１１は、キャップ１４中の開口部１８を
通って伸びている。

コレクター−タイリューター−デイスペンサーの使用法
は次のように説明される。液体試料をコレクター−タイ
リューター−デイスペンサーのニブ１１と接触させる。

試料がいったんニブにより吸収されたら、ニブを試料源
から取り出し、そしてコレクター−ダイリューター−デ
イスペンサーのニブ先端を上向きに向ける。装置内部の
もろいバリヤー１６を破壊し、バリヤー１６の破壊によ
り試料含有ニブ１１を液状媒体１７中に落下させる。そ
こで試料がニブ１１から放出され、液状媒体１７中に拡
散する。ニブは分子、粒子、例えばウィルス粒子、細胞
等を吸収し、そしてそれらを液状媒体中に拡散させるこ
とができる。液状媒体と試料が混合され、こうして試料
が希釈された後、上述したアッセイ装置中に希釈試料を
分取するためのスポイトとしてコレクター−ダイリコー
ターーディスペンサーを使用することができる。主管１
５は圧力下で変形する柔軟性材料から作られており、そ
して以前ニブ１１が伸びていたキャップ中の開口部１８
を通って希釈試料が自由に流れ出ることができるため、
コレクター−ダイリューター−デイスペンサーはスポイ
トとして使用することができる。

ニブ１１は幾つかの機能を有する。ニブは試料を吸収す
ることができ、更に吸収された試料を液状媒体１７中に
放出することもできる。ニブは、液状媒体１７中への放
出のためにタンパク質および細胞を吸収することもでき
る。更に、ニブは測定機能を有する。本質的に同一のニ
ブは、予め決められた希釈比が再現できるように、再現
可能な量の試料を吸収しそして放出するだろう。

ニブ１１は、種々の試薬に備えることにより、活性機能
を果たすこともできる。ニブ１１は、脱水形において、
検体または分析物反応性化合物、例えば抗凝血物質（Ｅ
ＤＴＡ、クエン酸塩、ヘパリン）、洗浄剤等を含むこと
もできる。ニブ１１はまた、脱水形において総合された
リガンドを含有することができ、このためニブ１１はリ
ガンド−分析物相互作用のための固相支持体として働く
ことができる。

ニブ１１を用いて試料が捕集されれば、液状媒体中への
試料の放出の前に試料をニブ１１上で乾燥させることが
可能であり、または実質的な乾燥が起こり得る前に試料
を含むニブを液状媒体と混合することができる。

ニブ１１は、通常、着目の分析物に対して実質的に不活
性であろう親水性の比較的変形しうる耐性材料から構成
されるだろう。ニブが液体試料に接触した時、水性試料
がニブに吸い込まれるように、ニブは親水性材料から作
られる。ニブに適当な材料の排他的でない例は、ナイロ
ン、ポリエチレンまたはポリプロピレンである。好まし
くは、ニブ材料はナイロンである。好ましくは、ニブは
Ａ＋ｎｅｒｉｃａｎ　Ｆｉｌｔｒｏｎａにより製造され
たＮｉｂ　９９３５６である。ニブは本質的に円筒形で
あり、ニブの暴露先端はとがっている。ニブのとがった
先端１２は、分析しようとする試料と接触される。ニブ
の反対側の端は、キャップ１４の開口部１８の直径より
も幾分大きい直径を有する球根状の形１３を有する。

ニブは、使用される試料サイズに依存して、通常約３ｍ
〜４　ｃｍの長さおよび約０．２〜３ｍｍの直径を有す
るだろう。

キャップ１４は、一端１９で閉じられた柔軟性チューブ
１５の上に乗せられる。柔軟性チューブは、スクイーズ
中に容易に変形する材料から作られる。

このチューブ用材料の例は、プラスチック、例えばポリ
エチレン、ポリプロピレン、または他の不活性エラスト
マー材料である。チューブの正確な寸法は重要でないが
、便利にはチューブは約１〜５ｍ１７の容積を有するだ
ろう。

バリヤー１６は、もろい材料、好ましくはガラスまたは
プラスチック製であり、そして指圧下で容易に破壊され
るような厚さを有する。その材料は液状媒体と試料の両
方に対して不活性であるべきである。ニブを支持するこ
とと液状媒体の流れを抑制するのと両方を可能にするバ
リヤー１６の多数の可能な形状が存在する。２つの可能
な形状を第３図と第４図に示す。第３図では、バリヤー
１６が液状媒体を含有するアンプルの頂部にある。第４
図では、バリヤー１６が柔軟性チューブを完全に横切っ
て伸びているディスクである。

液状媒体の組成は、特定のアッセイの要求条件に応じて
異なるだろう。一般に、液状媒体は水溶液であろう。液
状媒体１７は、試料を希釈するために働く以外に、アッ
セイにおいて機能を有する化合物を含むこともできる。

例えば、液状媒体は緩衝液および／または非特異的結合
ブロック剤、例えばウシ血清アルブミン、カゼイン、血
清等を含むことができる。液状媒体１７は、検体中に含
まれる分析物と結合することのできる特異的結合ペアメ
ンバー、または色素形成試薬を含むこともできる。

本発明は、固相の使用を要求する確立されたイムノアッ
セイ方法と共に使用することができる。

「イムノアッセイ」なる用語の使用は、イムノアッセイ
と、たとえ結合ペアのどちらのメンバーも抗体またはそ
の断片でないとしても、固定化された特異的結合ペアメ
ンバーを使用する類似の意図のアッセイの両方を包含す
ることを意味する。それらの方法は、特異的結合ペア複
合体の形成を検出するために様々な試薬の添加を必要と
する。結合ペア複合体の形成は、便利には酵素媒介反応
の生成物として生成されるであろう色素または蛍光団の
存在により、通常検出されるであろう。標識試薬は、フ
ィルター上に固定化された総合ペア複合体に結合するこ
とができる。適当な色素形成試薬の添加により、多孔質
反応性フィルターを着色することによって酵素標識が固
定化結合ペア複合体の位置を明らかにすることが可能に
なる。

貯槽を経てアッセイ装置に添加されるアッセイ試薬およ
び試料の量は、本発明の様々な態様によって異なる。貯
槽は希釈試料または試薬で一杯に満たすことができ、ま
たはより少ない量を添加することもできる。一般に、与
えられた特定の態様については、予め決められた且つ再
現可能な量の希釈試料が添加され、一方試薬は通常は過
剰量で存在するだろう。希釈試料の量は、コレクター−
ダイリューター−デイスペンサー装置からの小滴におい
て、または貯槽中の標線により、測定することができる
。１または複数滴の希釈試料が各無テープ領域に適用さ
れ、または貯槽が部分的にもしくは完全に満たされ得る
。好ましくは、溶液と測定領域との間の均等な接触が維
持されるように希釈試料と試薬で貯槽が満たされるだろ
う。貯槽に添加する希釈試料と試薬の量が増加すると、
添加された溶液と多孔質反応性フィルターとの接触時間
が増加し、更にフィルター表面に結合する特異的結合ペ
アメンバーの量が増加するだろう。

ＨＴＬＶ−１に対する抗体の存在について血液をアッセ
イするために本発明を用いる例を以下に示す。

使用する試薬の量は装置のサイズに応じて異なるだろう
。患者の指刺によって得られた１滴の血液をスライドガ
ラス上に置く。コレクター−ダイリューター−デイスペ
ンサー上のニブ１１の先端をスライド上の血液小滴に接
触させ（または刺した指に直接接触させてもよい）、そ
して血液をニブに吸い込ませる。ニブが飽和した時、キ
ャップ１４が頂上にくるようにコレクター−ダイリュー
ター−デイスペンサーを直立に置く。コレクター−ダイ
リューター−デイスペンサーの壁面に圧力をかけること
により、もろいバリヤー１６を破壊する。ニブが液状媒
体１７中に落下し、次いでコレクター−ダイリューター
−デイスペンサーを撹拌し、適切な混合を確保する。

次に、反応性フィルター３を覆うように、数滴の希釈試
料をアッセイ装置の頂部の貯槽に添加する。多孔質反応
性フィルターは、非直線的放射状濃度勾配において１ま
たは複数の測定領域に結合されたＨＴＬＶ−１エンベロ
ープ抗原のスポットを含有する。既知量の標識が存在す
る正の対照と、標識が全く存在しない負の対照もそれぞ
れ存在する。

貯槽への希釈試料の添加の直前に、ブロッキング剤の溶
液を貯槽に添加し、モして貯槽を排水させる。ブロッキ
ング剤とは、多孔質反応性フィルター上の利用可能な非
特異的結合部位をブロックするであろう１または複数の
化合物、例えばウシ血清アルブミンまたはカゼイン、を
含む溶液を意味する。希釈試料の添加後、希釈試料を排
水させる。

次いでビオチニル化ヤギ抗ヒ）　ＩｇＧ抗体の溶液を貯
槽に添加し、そしてこの溶液を排水させる。次に洗浄緩
衝波を貯槽に添加し、そして排水させる。

色素形成性アルカリホスファターゼ基質を貯槽に添加し
、そして排水させる。発色した後、反応停止溶液（０，
２ＭＩＪン酸塩ｐＨ６）を添加し、酵素反応を停止させ
る。

上記記載から、本発明が試料中の様々なタイプの分析物
の検出および測定に適当である様々なアッセイを実施す
るための装置および方法を提供することは明らかである
。分析物の存在は着色スポットの形成により明らかにさ
れる。試料中の分析物の濃度が予め決められた限界値を
上回るならば、着色スポットの直径が増大して大きな直
径の円を限定する。分析物濃度とスポットの直径との関
係は、色の強度の変化により結果を単に伝えるイムノア
ッセイを上回る重要な利点を構成する。本発明の他の利
点は、環状パターンの形成であり、環状パターン形成と
色形成との組合せは、単なる着色スポットの形成よりも
ずっと識別が容易である。

この利点は、色の強度が低い時に特に重要である。

色の強度の変化を判断するには、複雑な光学装置または
粗雑な評価への信用が必要である。本発明は複雑な装置
を必要としないので、医院や現地などの環境中でアッセ
イを行うことができ、従って費用と時間の両方の有意な
節約を行うことができる。

本発明はまた、成る量の試料を予め決められた比率で正
確に希釈し、そして希釈試料をアッセイ装置中に分取す
ることを可能にする、コレクター−ダイリューター−デ
イスペンサー装置を提供する。このコレクター−ダイリ
ューター−デイスペンサーは、装備の量およびテスト用
に希釈試料を調製するのに必要な工程を最少にするため
に役立つ。従って、コレクター−ダイリューター−デイ
スペンサーは、全アッセイ操作を促進しそして誤りの危
険を減らすのに役立つ。

次の実施例は例示の目的で与えられ、決して限定のため
ではない。

〔実施例〕

ＨＴＬシー１／２５ＴＡＴテスト 本発明を使用する診断テストは、ＨＴＬＶ　−１／２Ｓ
ＴＡＴテストと称するカートリッジ形において提供され
る。このカートリッジは、アッセイの実施に必要な全て
の試薬、コレクター−ダイリューター−デイスペンサー
、および複数のカートリッジを保持するためのトレー、
を含んで成るキット形において提供される。

ＨＴＬＶ−１／２５ＴＡＴテストは、ヒト血清、血漿ま
たは全血中（７）ＨＴＬＶ−１オヨびＨＴＬＶ−２ニ対
すル１ｇＧ抗体の検出のための迅速な定性的イムノアッ
セイである。このテストは、主として新鮮試料を用いた
使用のために考案される。

アッセイの原理 ＨＴＬＶ−１／２５ＴＡＴテストは、組み込まれた正お
よび負の対照との比較による単一臨床試料における抗−
ＨＴＬＶ−１および抗−ＨＴＬＶ−２抗体の検出を可能
にするパネルテストを容易に行うことができる。

非孔質の仕切により分けられた幾つかの反応性膜領域（
「ミニウェル」）はテストカートリッジ上を分割してい
る。

それらのミニウェルは、上から下に、正と負の操作対照
、ＨＴＬＶ−１／１（ＴＬＶ−２ウィルス溶解物抗原円
、およびＩＩＴＬＶ−１／ＨＴＬＶ−２合成ペプチド円
から成る。

第一のミニウェルは、赤色の非孔質仕切により第二のミ
ニウェルと分離されている。第二と第三のミニウェルは
黄色の仕切により分離されている。

同様に、第三と第四のミニウェルは白い仕切により分離
されている。

単アの臨床試料希釈液をカートリッジに適用する。膜上
に安定な青色の生成をもたらす免疫酵素反応により、結
合したＩｇＧを検出する（高感度を提供するための増幅
工程を含む）。

識別可能な二重環パターンは、テスト結果の容易で且つ
高感度の読みを保証する。正の対照は、臨床試料が省略
されなかったこと、全ての試薬が活性であったこと、お
よびテストが正し〈実施されたことを立証する。

負の対照は、陰性の検出に対する弱陽性の検体の容易な
区別を可能にする。

このテストを実施または読み取るのに特別な装置は全く
必要でない。結果は数分で得られる。テストの形式は、
標準的なマルチチャンネルマイクロピペットを使ったバ
ッチテストおよび一回テストの両方に適する。

キット成分 １、　すぐ使用できるＨＴＬＶ−ＳＴＡＴカートリッジ
２゜ ３゜ ４゜ ５゜ ６゜ ７゜ 凍結乾燥試薬（Ａ） 〔１％（Ｗ／Ｖ）カゼイン、０．１％（Ｖ／ｖ　）　Ｔ
ｗｅｅｎ　２０を含むＯ，ＬＭ　ＰＢＳ　ｐ）１７．４
　〕〕コレクターーダイリューターーデイスペンサ ー結乾燥試薬（Ｃ） 〔１％（Ｗ／Ｖ）カゼインヨを含むＯｏｌＭＰＢＳ　ｐ
Ｈ７，４中に１：１００希釈された抗ヒトＩｇＧ−ビオ
チン接合体〕 凍結乾燥試薬（Ｄ） 〔１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む０．１Ｍホウ酸塩ｐＨ８
中に１：１００希釈されたアルカリホスファターゼ−ス
トレプトアビジン接合体〕 洗浄液／緩衝液　希釈剤（Ｅ） 〔０，０１％（Ｗ／Ｖ）チメロサールを含む０．０５Ｍ
ホウ酸塩　ｐＨ８〕 色素形酸基質（Ｆ） （ブロモクロロインドキシルホスフェート溶液） ８、停止溶液（Ｇ） （０，２Ｍ　　リン酸塩　ｐＨ６） ９、抗−ＨＴＬＶ−１１１１血清 （不活性化されたもの）（Ｉ） １０、５ＴＡＴテストユニツト保持トレー（ナイロンフ
ィルターとナイロンニブ（Ｎｉｂ　９９３５６）を使っ
て、１■／ｄ　ＤＭＳＯのＨＴＬＶ−１ペプチド溶液を
０，１Ｍ酢酸塩ｐＨ４中にｌ：４０希釈する。ニブを貯
槽に取り付け、そして液体が拡散してミニウェルを覆う
までナイロンフィルター上にニブを押しつける。２つの
ニブを使ってミニウェルあたり２つの円を形成させても
よい。） アッセイを実施するための指示は次のようである。

試薬の調製 使用前に試薬類を室温に戻す。溶液Ｅを使って凍結乾燥
試薬Ａ、ＣおよびＤを再構成する。試薬を穏やかに撹拌
して混合する。試薬容器はスポイト蓋付びんである。ス
ポイトは、予め決められた量の試薬をアッセイに添加す
るために標線を有する。バッチテストを実施しようとす
る場合は、スポイトの代わりに標準的なマルチチャンネ
ル（８または１２）マイクロピペットを使うことができ
る。

アッセイ手順 一必要な数のＨＴＬＶ−３ＴＡＴカートリツジにラベル
を貼る（各検体につき１個）。カートリッジ（１〜１２
）を装置トレー中に置く。

−ＨＴＬＶ−３ＴＡＴカートリッジｌ：４００ｄの再構
成試薬Ａを添加する（標線まで満たされたスポイトＡを
使って）。完全に排水させる。

□コレクターーダイリューターーデイスペンサー（ＣＯ
Ｄ）を使って検体を捕集・希釈する。

（ＣＯＤは約３０ｄの容量を有するニブ、および０．１
Ｍ炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液、１％カゼイン、０．１％
Ｔｗｅｅｎ−２０，０，０１％チメロサール、ｐＨ９，
５を１−含むバイアルを有する。） □コレクターーグイ！Ｊニーターーデイスペンサーを使
って、カートリッジに８滴の希釈試料を添加する。３〜
５分間置く。

−２００，’の再構成試薬Ｃをカートリッジに添加する
。完全に排水させる。

□２００−の再構成試薬りをカートリッジに添加する。

完全に排水させる。

−１ｍｊ！の洗浄液Ｅをカー１−１１Ｊツジに添加する
。

完全に排水させる。

−２００４（８滴）の色素形成基質Ｆをカートリッジに
添加する。３分間置く。結果を読み取る。

□任意：５〜１０分後に再び結果を読み取る。

２００ｄの停止溶液Ｇをカートリッジに添加する。

結果の解釈 □テストの確認：赤い仕切の下の第一ミニウェル（正の
対照）において青い環が見られる。第二ミニウェル（第
一の黄色の仕切の下）は、何も認められないかまたは明
るい青色の環を示す。

−第三と第四ミニウェル（黄色い仕切と白い仕切の間）
における第二ミニウェルよりも暗い青色の環は、抗−Ｈ
ＴＬＶ−１または抗−ＨＴＬＶ−２抗体についての陽性
結果を示す。

□全てのミニウェルにおける青色発色は、テストの機能
不全を示す。

−第三ミニウェルには青い環があり且つ第四ミニウェル
に青い環がない場合、またはその逆の場合は、他のテス
トを使って再テストし確認すべきである。

使用済のカートリッジは、反応を停止させた後、乾燥保
存して永久記録として役立つことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はアッセイ装置の斜視図である。 第２図は第１図の装置の多孔質反応性フィルターの平面
図である。 第３図はコレクター−ダイリューター−デイスペンサー
装置の正面断面図である。 第４図は第３図のコレクター−ダイリ二−ターーディス
ベンサー装置の別の態様の正面断面図である。 図中、主要な部分の参照番号と対応する名称は次の通り
である： １・・・貯槽、 ３・・・多孔質反応性フィルター ４・・・多孔質分離層、 ５・・・流量調整層、 ６・・・廃液収容層、 ９・・・非孔質仕切（テープ）、 １０・・・特異的結合ペアメンバー環、１１・・・ニブ
、 １６・・・バリヤー １７・・・液状媒体。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、特異的結合ペアのメンバーである分析物を測定する
   ための診断装置であって、前記測定のために、可視検出
   可能なシグナルに備えた標識を使用し、 上の貯槽部および少なくとも１つの層を保持するための
   下のケーシング部を含むハウジング；前記ケーシング中
   に流れの方向において、 前記貯槽成分の床としての多孔質反応性フィルターであ
   って、前記フィルターに固定化された特異的結合ペアメ
   ンバーの測定円を含んで成り、そして高濃度の内円と実
   質的に低濃度の同中心の外円を含む濃度勾配を限定して
   いる多孔質反応性フィルター；および 前記多孔質反応性フィルターからの流体を収容するため
   の流体収容手段、 を含んで成る装置。 ２、前記流体収容手段が、多孔質分離層；流れの速度を
   減少させるための流量調整層；および吸収性廃液収容層
   を含んで成る、請求項１に記載の装置。 ３、分析物を測定するための診断装置であって、少なく
   とも１つの領域を有する多孔質反応性フィルターであっ
   て前記領域のうちの少なくとも１つの中に、前記フィル
   ターに固定化された特異的結合ペアメンバーの測定円を
   含んで成り、そして高濃度の内円と実質的に低濃度の外
   円を含む濃度勾配を限定している多孔質反応性フィルタ
   ーを含んで成る装置。４、前記装置が非孔質の仕切によ
   り分離された少なくとも２つの領域を含んで成る、請求
   項３に記載の診断装置。 ５、少なくとも１つの前記領域が同一の特異的結合ペア
   メンバーを有する少なくとも２つの測定円を含んで成る
   、請求項３に記載の診断装置。 ６、診断アッセイのために試料を処理するのに有用なコ
   レタクー−ダイリューター−ディスペンサー装置であっ
   て、 一端が閉鎖された圧縮可能なチューブ； 前記チューブの開放端の上に据え付けられそして少なく
   とも１つの開口部を含んで成るカバー；前記チューブ中
   の液状媒体； 前記開口部と前記媒体とを分離している少なくとも１つ
   のもろいバリヤー；および 前記バリヤーの上方にありそして前記開口部を通って伸
   びている少なくとも１つの吸収性ニブであって、前記ニ
   ブが前記開口部を通過するのを防ぐ手段を含んで成る吸
   収性ニブ、を含んで成る前記装置。 ７、前記もろいバリヤーが、前記媒体を封入しているも
   ろい封管である、請求項６に記載の装置。 ８、前記ニブがとがった先端を有する、請求項６に記載
   の装置。 ９、診断アッセイを実施するためのキットであって、請
   求項１に記載の装置、請求項６に記載の装置および前記
   アッセイを実施するための試薬、を含んで成るキット。 １０、試料中の分析物の存在を検出する方法であって、
   特異的結合ペアメンバー複合体の形成を検出するために
   可視シグナルを生じる試薬を使用し、前記試料を請求項
   ６に記載の装置のニブと接触せしめ、それにより前記試
   料が前記ニブにより吸収され； 前記もろいバリヤーを破壊し、それにより前記ニブが前
   記液状媒体と一緒になり、そして前記試料が前記媒体中
   に拡散し、ここで前記媒体は所望により前記試薬系の少
   なくとも１つの試薬を含んでおり； 特異的結合ペアメンバーである分析物を測定するための
   診断装置の貯槽に前記媒体を添加し、ここで前記装置は
   、 上の貯槽部および少なくとも１つの層を保持するための
   下のケーシング部を含むハウジング；前記ケーシング中
   に流れの方向において、 前記貯槽成分の床としての多孔質反応性フィルターであ
   って、前記フィルターに固定化された特異的結合ペアメ
   ンバーの測定円を含んで成り、そして高濃度の内円と実
   質的に低濃度の同中心の外円を含む濃度勾配を限定して
   いる多孔質反応性フィルター；および 前記多孔質反応性フィルターからの流体を収容するため
   の流体収容手段、 を含んで成り； 前記媒体を、前記多孔質反応性フィルターを通って前記
   流体収容手段中に通過させ； 前記試薬系の任意の他の試薬を前記多孔質反応性フィル
   ターに添加し；そして 既知量の分析物を有する試料を使って得られた可視シグ
   ナルに関連させて前記可視シグナルの存在を検出する、 ことを特徴とする方法。