JP2000329761A - 多孔質試薬放出システムおよびその製法 - Google Patents

多孔質試薬放出システムおよびその製法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 凍結乾燥した結合形にある試薬を放出するた
めの改良システムを提供する。 【解決手段】 少なくとも１種の試薬を含有し凍結乾燥
した親水性焼結多孔質物質のマトリックスまたは疎水性
焼結多孔質物質のマトリックスからなる多孔質試薬放出
システム。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般に、全血から
血漿または血清を分離するための方法に関する。さらに
詳しくは、本発明は、少なくとも１種の赤血球凝集剤を
組み込んだ親水性焼結多孔質物質からなる、全血から血
漿または血清を分離することのできる装置に関する。凝
集した血球は、焼結多孔質物質のマトリックスのふるい
分け作用、およびさらに任意のフィルター手段により全
血から除かれる。本発明はまた、所定量の血漿または血
清試料を診断アッセイにおける分析のために回収する装
置および方法にも関する。さらに詳しくは、本発明は、
再生可能な流体取り込み能を供する焼結多孔質物質のマ
トリックスに関する。さらに、本発明は、試薬放出シス
テムに関し、さらに詳しくは、焼結多孔質マトリックス
中に含有され、結合形で凍結乾燥され、液体との接触に
より回復可能な１種または２種以上の試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】近代
の臨床的診断法は、通常、血液試料で行なわれている。
残念ながら、全血中に存在する赤血球は、光を散乱およ
び吸収するため反射光または透過光のいずれかを測定す
るアッセイ法を妨害する。他の細胞は特定の測定を妨害
するかもしれない。たとえば、コレステロールの測定は
細胞膜中に存在するコレステロールにより影響を受け得
る。この理由のため、多くのアッセイ法は血漿または血
清で行なわれ、これらを全血から分離しなければならな
いことになる。
【０００３】全血から血漿(凝固前)および血清(凝固後)
を分離するために当該技術分野でよく知られた方法は遠
心分離である。しかしながら、遠心分離により全血を層
状にするのは、時間がかかり、面倒な実験室装置を必要
とする。バン・オス(Ｖan Ｏss)らのＶox.Ｓang.,Ｖol.
３４、３５１〜３６１(１９７８)に開示されているよう
な赤血球凝集剤を使用することは、遠心分離や赤血球分
離法を行うのに有用である。
【０００４】ドジュキ(Ｄojki)らの米国特許第４,４６
４,２５４号明細書(１９８４年８月７日発行)には、す
でに層状にされた血液試料から血清を分離することので
きるピストン装置が開示されている。この装置は、解放
末端のサンプリングチューブに連結したピストンヘッド
からなる。このピストンヘッドは一方向バルブからでき
ており、その下に多孔質プラスチックフィルターボディ
ーを含む空洞がある。ピストンヘッド−サンプリングチ
ューブを血液の層状試料を入れた試験管中に挿入する
と、血清がフィルターボディーおよびバルブを通ってサ
ンプリングチューブ内に入っていく。全血から分離する
ことのできる血清の容量および純度は、血液の層状性の
完全さによる。
【０００５】フォーゲル(Ｖogel)らの米国特許第４,４
７７,５７５号明細書(１９８４年１０月１６日発行)に
は、直径が０.２〜５ミクロンで密度が０.１〜０.５g／
cm３のガラス繊維の層に全血を通すことにより血清を分
離するための装置および該装置を用いた方法が開示され
ている。この装置により全血から分離することのできる
血漿または血清の容量は、ガラス繊維層の吸着容量の５
０％未満であると開示されている。
【０００６】ズク(Ｚuk)らの米国特許第４,５９４,３２
７号明細書(１９８８年６月１０日発行)には、全血試料
を赤血球結合剤と混合し、ついでこの混合物を、凝集し
た赤血球を除くことができるように少なくとも１種の特
異的結合成分ペアを結合させた固体の吸湿性成分で濾過
することによる分析法が開示されている。該特許は、全
血中の赤血球の凝集を引き起こすための適当な赤血球結
合剤として、抗赤血球抗体、ポリマー性アミノ酸(ポリ
リジンなど)、およびレクチン(コムギはい芽凝集素)を
開示している。
【０００７】ヒルマン(Ｈillman)らの米国特許第４,７
５３,７７６号明細書(１９８８年６月２８日発行)に
は、毛管作用を利用し全血をガラスミクロファイバーフ
ィルターに通すことにより全血から血清を分離するため
の装置および該装置を用いた方法が開示されている。こ
の特許には、赤血球凝集素を付着させたフィルターに全
血を通す別の態様が開示されている。しかしながら、開
示されたフィルターは赤血球を保持するよりも、単にそ
の流れを遅らせるだけであり、その結果、赤血球を逃れ
さすことになる。
【０００８】トラシュ(Ｔrasch)らのヨーロッパ特許公
開第１３３,８９５号公報(１９８５年３月１３日公開)
には、赤血球保持基体、および該基体を用いた、フィル
ター上に赤血球を保持し全血から血漿を回収するための
方法が開示されている。この発明の赤血球保持基体は、
血漿は通過させながら血球成分はフィルター上に除くこ
とができるように、凝集を引き起こしはするが溶血は起
こさないと記載されている。この公報はまた、保持基体
をフィルター中またはプレフィルター層中に組み込む別
の態様を開示している。この公報は、保持ゾーンのため
の吸収性物質として、セルロース、羊毛、ガラス繊維、
アスベスト、合成繊維、ポリマーまたはその混合物から
なり、ペーパー、フリース、ゲルまたは組織の形態の吸
収性の多孔質液体透過性担体またはフィルターを用いる
ことができると記載している。
【０００９】血清または血漿の分離のための最も簡便な
方法は、スピードおよび血清収量効率の観点で制限され
ている。たとえば、ガラス繊維膜を利用した血液分離装
置は比較的ゆっくりしたスピードで血清を分離する傾向
があり、かなりの量の血清または血漿が膜の間隙中に保
持される傾向がある。従って、血清および血漿を分離す
るための迅速で効率的な方法を提供する改良装置に対す
る必要性が存在する。
【００１０】血液試料を試験するに際して直面する他の
困難さは、診断アッセイにおいて使用するには一般に血
漿または血清の正確な試料容量を測定する必要があるこ
とである。この正確さの必要性は、一般に、熟練した技
術者が精巧なピペット装置を使用するとき、または高価
な自動装置を使用するときに直面する。また、血漿試料
を回収し該試料を反応ゾーンへ移動させるための膜また
はペーパーマトリックスを使用した試験ストリップ装置
が存在する。しかしながら、一般に試験ストリップ装置
は、毛管作用によって試料を該ストリップを通して反応
ゾーンへ移動させるのに必要な試料容量能しか有してお
らず、それゆえ低レベルの正確さしか必要とされない。
試験ストリップ装置において、血漿受容成分は該ストリ
ップを充填するのに必要な量の試料しか回収せず、その
ため、試料が該ストリップ中をそれ以上移動しなくなっ
てしまう。なぜなら、試料を試験ストリップ装置中で分
析に供させるために試料を牽引する力が限られ、該スト
リップが満たされる前に該試験ストリップ上の定められ
た検出ゾーンを通過する量に限られることになるからで
ある。
【００１１】また、選択した反応のみが混合により起こ
るように混合物の種々の反応成分を互いに分離すること
が臨床および研究実験室において望まれる。これらの成
分は、乾燥状態または液体で供給されてよい。液体の試
薬は乾燥状態で保存されている試薬と比較して活性な寿
命が短く限られていることが知られている。
【００１２】過去においては試薬は凍結乾燥して提供さ
れてきた。たとえば、米国特許第４,４４７,５２６号明
細書には、２種またはそれ以上の試薬の溶液または懸濁
液のそれぞれに担体マトリックスを順番に浸漬し各浸漬
の間に乾燥工程を行うか、または担体物質の２またはそ
れ以上の層を重層的に結合させて試験ストリップのため
の多相担体マトリックスを製造することにより、試薬を
組み込んだ試験ストリップのための担体マトリックスが
教示されている。担体マトリックスの例としては、フェ
ルト、織物のガラス繊維またはマットのガラス繊維、紙
およびポリマー性のマイクロカプセルが挙げられ、これ
らは試料または液体と接触したときに崩壊する。しかし
ながら、この特許は試薬を溶液中に送り出すための結合
形態を教示していない。
【００１３】英国特許出願第ＧＢ２２１６２５８Ａ号明
細書には、空気乾燥し後で溶液中で回復可能な化学試薬
を前以て決定した量で含ませた不活性な多孔質マトリッ
クスが教示されている。この特許出願は、凍結乾燥の欠
点には、使用の時点または使用の時点頃に試薬の測定可
能な必要量を可溶化し、希釈し、調製することに伴う問
題点が含まれることを教示している。
【００１４】短時間の間に溶液中に実質的に回復可能な
凍結乾燥試薬を保持させた多孔質担体を供することは有
利なことである。そのような担体には、互いに反応しな
い２種またはそれ以上の試薬を組み込むことができる。
さらに、そのような担体は、生物学的に活性な分子や化
合物などのような試薬を含ませ、ついで凍結乾燥状態で
長期間保存させ、所望のときに溶液中に実質的に回復さ
せることができる。他の観点において、そのような担体
は、生物学的に活性な分子や化合物などのような試薬を
化学試薬とともに含ませることができる。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明は、少なくとも１
種の赤血球凝集剤を組み込んだ親水性焼結多孔質物質の
マトリックスからなることを特徴とする、全血から血漿
または血清を分離するための装置であって、該マトリッ
クスは、個々の赤血球は該マトリックスを通過するが凝
集した赤血球は該マトリックスによって保持されるよう
に選択された孔径を有することを特徴とする装置;全血
から血漿または血清を分離する方法であって、(a)上記
装置の入り口に全血試料を加え、ついで該装置の出口か
ら血漿または血清を回収することを特徴とする方法;血
漿または血清試料の測定用装置であって、(a)焼結多孔
質物質のマトリックスであって、(i)該マトリックスの
所定の大きさに比例する再生可能な流体取り込み能、(i
i)血漿または血清成分との最小の反応性、および(iii)
親水性の内部表面を有することを特徴とし、それによ
り、該マトリックスが、所定量の分析用試料を回収し保
持することのできるもの、および(b)該マトリックスへ
の入り口を定めるハウジング手段からなることを特徴と
する測定用装置;分析のために血清または血漿試料を回
収する方法であって、(a)焼結多孔質物質のマトリック
スであって、(i)該マトリックスの所定の大きさに比例
する再生可能な流体取り込み能、(ii)血漿または血清成
分との最小の反応性、および(iii)親水性の内部表面を
有することを特徴とし、それにより、該マトリックス
が、所定量の分析用試料を回収し保持することのできる
ものを用意し、(b)一定量の血清または血漿を該マトリ
ックスに加え、ついで(c)所定量の血漿または血清を該
マトリックス中で回収することを特徴とする方法;少な
くとも１種の試薬を含有し凍結乾燥した親水性焼結多孔
質物質のマトリックスからなり、該マトリックスは、液
体と接触したときに含有試薬が該マトリックスから放出
されるように選択した孔径を有することを特徴とする、
多孔質試薬放出システム;少なくとも１種の試薬を含有
し凍結乾燥した疎水性焼結多孔質物質のマトリックスか
らなり、該マトリックスは、液体と接触したときに含有
試薬が該マトリックスから放出されるように選択した孔
径を有することを特徴とする、多孔質試薬放出システ
ム;および多孔質試薬放出システムの製造方法であっ
て、(a)少なくとも１種の試薬成分の溶液を調製し、(b)
上記工程(a)の溶液に既知量の焼結多孔質マトリックス
を加え、(c)上記工程(b)のマトリックスを凍結し、つい
で(d)該凍結マトリックスを凍結乾燥して、少なくとも
１種の試薬を含有するマトリックスを得ることを特徴と
する方法を提供する。
【００１６】本発明は、全血から血漿または血清を分離
するための改良された方法、装置およびキットに関す
る。さらに詳しくは、本発明の装置は、少なくとも１種
の赤血球凝集剤を組み込んだ親水性の焼結多孔質物質の
マトリックスからなる。本発明のマトリックスはさら
に、個々の血球は該マトリックスを通過するが凝集した
血球は該マトリックスにより保持されるように選択した
孔径を有することを特徴とする。本発明の装置は、該マ
トリックスの間隙内には最小量の血清または血漿を保持
しながら、全血からの血清または血漿の迅速な分離を行
うことができる。
【００１７】本発明の一態様に従えば、本発明の装置
は、少なくとも１種の赤血球凝集剤を組み込んだ親水性
の焼結多孔質物質のマトリックスからなる。全血試料を
該マトリックスの入り口に加えると、試料内の血球は該
マトリックス中に存在する凝集剤と接触する。血球は凝
集し、該マトリックスの入り口近くの間隙中に捕捉され
るが、実質的に血球を含まない血清または血漿は該マト
リックスの出口近くに集積する。受容手段(濾紙や別の
多孔質マトリックスなどの物質を含む)を、該マトリッ
クスの出口と液体受容関係にあるように組み込んでもよ
い。受容手段は、実質的に血球を含まない血清または血
漿を該マトリックスの出口から毛管作用により運ぶ働き
をし、得られた血清や血漿を分析または他の目的のため
に利用することができるようにする。
【００１８】本発明の別の態様によれば、全血試料から
血球をより効率的かつより迅速に分離するために、マト
リックスの出口と液体受容関係にあるようにフィルター
手段を組み込む。フィルター手段には、血球の保持を助
けるために少なくとも１種の赤血球凝集剤を組み込むこ
とができる。本発明はまた、本発明の第一の多孔質マト
リックスを別のマトリックスまたはフィルター手段と組
み合わせてなり、選択した成分との反応のために選択し
た分析試薬をこれらマトリックス中に組み込んだもので
ある、血液血漿または血清の選択成分の分析のための装
置および方法をも提供する。
【００１９】すでに述べたように、赤血球を除くことは
視覚的なアッセイにおいて特別の重要性を有する。にも
かかわらず、他の血球を除くこともまた望ましく、本明
細書において使用する「赤血球」なる語は、全血球をマト
リックス中に保持し、または除去する意味であることを
理解しなければならない。
【００２０】本発明はまた、所定量の血漿または血清試
料を焼結多孔質物質のマトリックスを用いて回収する装
置および方法にも関し、該焼結多孔質物質のマトリック
スは、該マトリックスの所定の大きさに比例する再生可
能な流体取り込み能、血漿または血清成分との最小の反
応性、および親水性の内部表面を有することを特徴と
し、該マトリックスはハウジング手段中に入れられ該マ
トリックスの入り口が定められる。これらの特徴によっ
て、マトリックスは所定量の試料を分析のために回収し
保持することができる。場合により、マトリックスから
の出口もまた容器手段で定めてもよい。
【００２１】本発明の回収マトリックス装置を製造する
のに使用する焼結多孔質物質としては、焼結ガラス、焼
結鋼、焼結セラミックス、焼結プラスチックおよびそれ
らの同等のものが挙げられる。特に好ましい物質はポリ
エチレンである。
【００２２】回収マトリックスは、場合により、全血か
ら血漿または血清を分離するための血液分離手段と組み
合わせて用いることができる。一般に、マトリックスは
血液分離手段と液体受容関係にあり、このため、マトリ
ックスが血液分離手段から所定量の血漿または血清を回
収することが可能になる。回収マトリックスはまた、試
料受容手段とともに用いることができ、該マトリックス
は所定量の分析用試料を該試料受容手段へ移動させる。
別のやり方として、マトリックス自体の中の血漿または
血清試料で分析を行うこともできる。
【００２３】適当な試料受容手段としては、キュベッ
ト、試験管、スライドおよび反応ウエルなどの反応また
は検出容器が挙げられる。溶離バッファーをマトリック
スに加えることにより、試料を検出容器から溶出させ
る。他の試料受容手段としては、毛管作用により試料を
マトリックスから流入させるように選択した孔径を有す
る吸収固相物質が挙げられる。試料受容手段は、場合に
よって１種またはそれ以上の分析試薬を含んでいてよ
く、該試薬は試料が該手段へ移動したときに可溶化され
る。
【００２４】分析用血清または血漿試料の回収は、一定
量の血清または血漿を回収マトリックスに加え、所定量
の血漿または血清を回収することにより行う。 本発明
はまた、凍結乾燥した結合形にある試薬を放出するため
の改良システムをも提供する。さらに詳しくは、該シス
テムは、少なくとも１種の試薬を組み込んだ焼結多孔質
物質のマトリックスからなる。このマトリックスはさら
に、試薬が乾燥状態ではマトリックスによって保持され
ているが、液体と接触したときにマトリックスから放出
されるように選択した孔径によって特徴付けられる。該
システムは、該マトリックスの間隙内には最小量の試薬
のみを保持させながら、液体へ試薬を放出することがで
きる。
【００２５】本発明の他の態様によれば、該システム
は、少なくとも１種の試薬を組み込んだ焼結物質のマト
リックスからなる。多孔質マトリックスを試薬溶液の容
器中に入れ、飽和させる。飽和後、当業者に知られた方
法により、この多孔質マトリックスを凍結させ、凍結乾
燥させる。
【００２６】本発明は、全血から血漿または血清を分離
するための改良装置および該装置を用いた分離方法を提
供する。本発明の装置は、少なくとも１種の赤血球凝集
剤を組み込んだ親水性の焼結多孔質物質のマトリックス
からなる。このマトリックスは、個々の血球は該マトリ
ックスを通過するが凝集した細胞は該マトリックスによ
って保持されるような孔径を特徴とする。該装置は、該
多孔質物質の間隙内には最小残留量の血清または血漿の
みを保持しながら、全血からの血清または血漿の迅速な
分離を行うことができる。
【００２７】本発明は、試薬を含ませ放出させるための
改良されたシステムを提供する。本発明のシステムは、
少なくとも１種の試薬を含ませた焼結多孔質物質のマト
リックスからなる。このマトリックスは、試薬が凍結乾
燥状態では該マトリックス内に保持されるが液体と該マ
トリックスとが互いに接触したときには該マトリックス
を通過することができるような孔径を特徴とする。
【００２８】本発明のマトリックスとして適当と思われ
る物質としては、焼結ガラス、焼結鋼、焼結セラミック
ス、およびプラスチックの焼結ポリマーなどが挙げら
れ、好ましい物質は、英国特許第２,１８６,２０５号明
細書に記載されているような焼結ポリエチレンとして知
られているものである。ポレックス(Ｐorex,Ｉnc.,)(フ
ェアバーン、ジョージア)またはジェネラル・ポリメリ
ック・コーポレーション(Ｇeneral Ｐolymeric Ｃorp.)
(ウエストリーディング、ペンシルベニア)から市販され
ている焼結ポリエチレンマトリックスを、約１０ミクロ
ン〜約７０ミクロンの孔径を有するものとして入手する
ことができる。そのような孔径により、個々の赤血球は
マトリックスを通過するが、凝集した赤血球はマトリッ
クス内に保持されるようになる。
【００２９】本発明のマトリックスは、水性液体の流入
を促進するため親水性である。市販のマトリックスは、
その性質が親水性か疎水性のいずれかである。疎水性の
マトリックスは、種々の知られた方法により親水性を付
与することができる。利用できるそのような方法として
は、マトリックスをプラズマ処理または界面活性剤処理
することが挙げられる。プラズマ処理は、疎水性のマト
リックスを荷電ガス(プラズマ)にさらし、固体表面に電
子荷電を付与して該表面を湿潤性にすることを含む。界
面活性剤処理は、疎水性のマトリックスを界面活性剤中
に浸漬し、乾燥させることを含む。この処理は、マトリ
ックスの表面および内部を湿らせるのを助け、その結
果、水性液体のマトリックス中への流入を促進する。広
範囲の市販の界面活性剤物質が本発明の使用に適してい
ることが考えられる。下記実施例において記載したアッ
セイでは、界面活性剤とともに成形した市販のマトリッ
クスを用いたが、これは市販の界面活性剤中に浸漬した
マトリックスに比べて好ましいものである。下記試薬放
出システムの実施例の幾つかでも、界面活性剤とともに
成形した市販のマトリックスを用いたが、これは市販の
界面活性剤中に浸漬したマトリックスに比べて好ましい
ものである。試薬放出システムの他の実施例では、界面
活性剤を含まない市販のマトリックスを用いた。
【００３０】一般に、界面活性剤は、好ましい活性を妨
害しないように、マトリックス内に置かれた反応物また
は試薬と相溶するように選択しなければならない。加え
て、界面活性剤は、赤血球の溶血を引き起こすような濃
度では存在してはならない。加えて、血漿試料の血液希
釈を防ぐために注意が必要である。血液希釈とは、高浸
透圧条件のため赤血球の内部液が血漿中に抽出されるこ
とである。
【００３１】全血試料中に抗凝集剤を加えることは、装
置中の血漿の流れを促進するために特に好ましい。血液
を装置に加える前に血液に抗凝集剤を混合することによ
り、血液が凝固するのが防がれる。抗凝集剤で処理した
血液試料から血球を分離すると血漿が得られる。これら
の抗凝集剤はまた、マトリックス中に組み込むことによ
り、血液試料を装置に加えたときに血液試料の凝固を防
ぐようにすることも考えられる。たとえば、１本の指か
らの血液の１滴を装置に直接加え、該装置内に組み込ん
だ抗凝集剤が血液と接触することによって血液の凝固を
防ぐようにすることができる。別のやり方として、前以
て抗凝集剤で処理した毛細管中に血液を回収し、この方
法で装置に移すことができる。好ましい抗凝集剤物質と
しては、ヘパリン、ＥＤＴＡおよびクエン酸塩などが挙
げられる。
【００３２】本発明に従って、赤血球凝集剤を多孔質マ
トリックス中に組み込む。凝集剤は、個々の赤血球を互
いに付着させて凝集塊を生成させる物質である。凝集剤
は、少なくともそのある量がマトリックス中に吸収され
て血液試料の存在下で可溶化されるようにするのが好ま
しいが、吸着、吸収または金属−有機染料錯体などの手
段によりマトリックス中に組み込むことができる。
【００３３】適当な凝集剤としては、天然または合成の
水溶性ポリマーが挙げられ、すでに述べたものが含まれ
るがこれらに限られるものではない。入手可能な凝集素
のうち、好ましい凝集素としては、ヘキサジメトリンブ
ロミド(hexadimethrine bromide)が挙げられ、これはア
ルドリッチ・ファイン・ケミカルズ(Ａldrich ＦineＣh
emicals)からポリブレン(Ｐolybrene)、ポリリジン、お
よび抗赤血球抗体として入手できる。ポリブレンやポリ
リジンなどの正に荷電した多価電界質は、荷電の中和、
水和での荷電、ポリマー架橋および浸透相互作用により
赤血球を凝集させると思われる。赤血球抗原に特異的な
ＩgＧ−またはＩgＭ−クラスの抗体は、それらが２つの
別の赤血球の表面上に存在する類似の抗原決定基に結合
し、このことが赤血球を互いに付着させることによって
凝集を引き起こす。凝集過程はまた、別の促進手段によ
っても、ポリビニルピロリドン(ＰＶＰ)のような二価電
界質として明らかに機能する物質を組込み、荷電した細
胞を相互に接近させ、抗体および／または他の凝集素に
よって架橋を起こさせることによっても行うことができ
る。
【００３４】高い凝集剤濃度では血液試料のマトリック
ス内での滞留時間が長くなり、マトリックス内での赤血
球の凝集の効率が増大する。しかしながら、このことは
血漿の大部分をマトリックス内に捕捉するという好まし
くない作用を有する。逆に凝集剤の濃度が低いほど血漿
の放出がよくなるが、マトリックスによって捕捉される
試料中の赤血球が少なくなる。凝集剤の濃度に加えて、
マトリックスの長さ、容量、および多孔性、およびマト
リックスによって濾過される血液試料の容量が、マトリ
ックス内での赤血球の捕捉またはマトリックスによる血
漿の溶出量に影響を与える。
【００３５】本発明の第一の態様に従えば、マトリック
スの孔径は、マトリックスの長さおよび容量、処理する
血液試料の容量、および凝集剤が赤血球を凝塊させる能
力をも考慮に入れた上で、全血中に存在する実質的にす
べての赤血球が凝集を引き起こし、マトリックス中に保
持されるように選択する。血液試料中に存在する「実質
的にすべての」赤血球を除去するとは、選択した血液分
析対象物の臨床的測定が妨害なく行えるように試料から
充分な量の赤血球が除かれることを意味する。全血中に
存在する「実質的にすべての」赤血球の除去とは、試料か
ら少なくとも９０％の赤血球が除かれることを意味する
のが好ましい。
【００３６】本発明の装置の第一の態様を利用する一つ
の方法に従い、全血をマトリックスの入り口または第一
末端に加える。血液は速やかにマトリックスの間隙を通
過していき、その内部に組み込まれた赤血球凝集剤と速
やかに接触するようになる。これらの凝集剤は赤血球の
凝集を促進し、ついで凝集した赤血球はマトリックスの
間隙内に捕捉される。このように凝集した赤血球がマト
リックス内に捕捉されることにより、赤血球からの血漿
または血清の迅速で効率的な分離が可能となる。加え
て、マトリックスは最小量の血漿または血清しか保持し
ないので、大量の血漿または血清が連続的に全血試料か
ら回収できる。場合により、血清または血漿をマトリッ
クスから毛管作用により移動させるために、濾紙や別の
多孔質マトリックスなどのフィルター手段を、マトリッ
クスの出口と液体受容関係にあるように置いてもよい。
【００３７】第１図〜第２図は、本発明の第一の態様に
従って全血から血漿を分離するための装置を図式したも
のである。第１図に示すように、装置(１０)は、入り口
(１３)および出口孔(１６)を有するハウジング(１２)を
含む。ハウジング(１２)内には装置(１７)が置かれてお
り、該装置(１７)は、多孔質ポリエチレンマトリックス
(１８)を含んでおり、該マトリックスは凝集剤を含み直
径が３.５mmで高さが５mmの円筒状に成形してある。正
確な形状および大きさは本発明にとって重要ではない
が、上記のように滞留時間や効率に影響を与える。ハウ
ジング(１２)内にはまた、ペーパーマトリックス(２０)
が置かれている。マトリックス(１８)は入り口(１４)お
よび出口(１５)を有し、該ペーパーマトリックス(２０)
と液体受容関係にある。ペーパーマトリックス(２０)お
よびマトリックス(１８)は、選択した血液分析対象物の
分析に必要な試薬を含有していてもよい。この装置の態
様は、米国特許出願の明細書中に記載されている。
【００３８】第２図に示すように、装置(３０)はハウジ
ング(３２)を含み、該ハウジングは入り口(３３)および
出口孔(３６)を有している。ハウジング(３２)内には装
置(３７)が含まれ、該装置は第一の多孔質ポリエチレン
マトリックス(３８)を含んでいる。ハウジング(３２)内
にはまた、該第一のマトリックスと液体受容関係にある
第二の多孔質ポリエチレンマトリックス(４０)および該
第二のマトリックスと液体受容関係にあるペーパーマト
リックス(４２)が含まれている。第一のマトリックス
(３８)は凝集剤を含んでおり、入り口(３４)および出口
(３５)を有している。第二のマトリックス(４０)は、特
定の血液分析対象物の測定に必要な試薬の幾つかを含ん
でおり、ペーパーマトリックス(４２)は試薬システムの
他の成分を含んでいる。第一のマトリックス(３８)はま
た、選択した血液分析対象物の分析に必要な試薬を含ん
でいてもよいことが考えられる。染料紙試薬システムの
例は、米国特許出願第２０４,４４３号明細書(１９８８
年６月９日出願)に記載されており、該文献を参照のた
め本明細書中に引用する。
【００３９】赤血球のより迅速な分離が可能な装置の第
二の好ましい態様によれば、マトリックスの孔径は、マ
トリックスの長さおよび大きさ、処理する血液試料の容
量、凝集剤が赤血球の凝塊を引き起こす能力などを考慮
に入れた上で、全血中に存在する赤血球のすべて未満が
凝集しマトリックス中に保持されるように選択する。比
較的大きな孔径のマトリックスを選択して流速を大きく
することが好ましいがすべての赤血球がマトリックスに
よって保持されるわけではないこれらの場合において
は、血漿または血清中に残留する赤血球は、赤血球凝集
剤を含浸させたまたは単独の第二のマトリックスまたは
フィルターを用いた濾過工程に引き続き供することによ
り、「透明な」血漿または血清が得られるようにする。試
料から少なくとも９７％の赤血球が除去されたときに
「透明な」血漿または血清が得られたものと解する。
【００４０】凝集した赤血球を通さないような孔径を特
徴とする濾紙は、血清または血漿をさらに精製するため
に用いることができる。加えて、この濾紙は、残留する
赤血球の保持を助けるために凝集剤をその中に組み込ん
でいる。マトリックス流から流れてきた血清または血漿
から赤血球を保持するための分離バリアーとして濾紙を
使用することにより、凝集剤で処理した一連のマトリッ
クスにフィルター物質の小片を散在させた種々の濾過態
様が可能となる。そのような使用のために考えられるフ
ィルターのタイプとしては、誘導または非誘導セルロー
ス、ナイロン、天然または合成膜、または個々のまたは
凝集した赤血球が保持されるような孔径を特徴とする多
孔質ポリエチレンマトリックスからなるフィルターが挙
げられる。２個以上のマトリックスを使用する場合は、
一方の領域から他方の領域への流れを促進するように孔
径を選択する。
【００４１】第３図〜第５図は、本発明の第二の態様に
従って全血から血漿を分離するために使用する装置を模
式的に示したものである。第３図に示すように、装置
(５０)はハウジング(５２)を含み、該ハウジングは入り
口(５３)および出口孔(５６)を有している。ハウジング
(５２)内には装置(５７)が含まれ、該装置は多孔質ポリ
エチレンマトリックス(５８)およびペーパーマトリック
ス(６６)を含んでいる。マトリックス(５８)は凝集剤を
含有しており、入り口(５４)および出口(５５)を有して
おり、該ペーパーマトリックス(６６)と液体受容関係に
ある。ペーパーマトリックスは最終赤血球濾過領域(６
０)、分析対象物試薬領域(６２)、および定量分析対象
物領域(６４)を含んでいる。
【００４２】本発明はまた、診断アッセイにおいて分析
用の所定量の血漿または血清を回収し保持するための新
規な手段をも提供する。この新規な方法は、別個の量の
血漿または血清の再生可能な回収を可能にする測定マト
リックスを用いることを含む。この方法は、下記特徴を
有するように選択した焼結多孔質マトリックスを使用す
ることにより行うことができる。すなわち、マトリック
スの所定の大きさに比例する再生可能な流体取り込み
能、血漿または血清成分との最小な反応性、および親水
性の内部表面である。これらの特徴により、マトリック
スは診断アッセイにおいて分析に適した所定量の試料を
回収し保持することができる。取り扱いを容易にするた
めにマトリックス物質は剛体であるのが好ましく、場合
によっては、所定のマトリックスの大きさに対して最大
のボイド容積を有するように選択するのが好ましい。そ
のようなマトリックスを用いることにより、試料の回収
は使用者の熟練度とは関係がなくなり、精巧な測定装置
を用いる必要もなくなる。
【００４３】本発明の利点としてさらに、本発明のマト
リックスをフロースルー(flow−through)装置や試験ス
トリップ装置などの診断装置の成分として使用すること
ができることが挙げられ、そのような装置に通常使用さ
れる紙、繊維およびニトロセルロースの吸収能や装置成
分の総合的な吸収能に依存することなく所定量の試料を
回収することができる。たとえば試験ストリップ装置に
おいては、ストリップの長さは一般に吸収することので
きる試料の容量を決定し、試験ストリップの大きさは該
試験ストリップ上の反応ゾーンおよび検出ゾーンを通る
試料の量を決定する。しかしながら、本発明のマトリッ
クス装置は、分析しようとする全試料容量を測定マトリ
ックスにより回収した後に、マトリックスそれ自身の内
かまたは試料が移動した試料受容手段の内で、所定量の
試料の回収および保持並びに全試料容量の分析を可能と
する。
【００４４】容量測定特性を供し得る幾つかの異なる物
質がある。これらの物質としては、紙、誘導セルロー
ス、多孔質プラスチック膜および焼結多孔質物質が挙げ
られる。しかしながら、これらのすべての物質が診断装
置において測定マトリックスとしての使用に同じように
適しているとはいえない。たとえば、ペーパーマトリッ
クスは充分な容量の試料を回収する能力があるが、該試
料容量を回収するに際して低い再生性しか示さなかっ
た。ナイロンもまた再生性が許容できるものではない。
そのようなマトリックスの再生性が低いことは、そのよ
うな物質が操作応力への抵抗が弱く回復力が小さいとい
う性質によるものであった。逆に、ニトロセルロース
[ミクロン・セパレイテッド(Ｍicron Ｓeparated Ｉn
c.,)、ウエストバロー、マサチューセッツ]およびウル
トラビント(Ｕltrabind)[ジャーマン・サイエンシズ(Ｇ
erman Ｓciences)、アンアーバー、ミシガン]から製造
したマトリックスは容量測定において適当な再生性を示
したが、これらの物質は一般に分析に必要な量の試料を
回収し保持するのに充分な厚みのマトリックスを製造す
るには適していない。しかしながら、多孔質焼結物質は
これらの要求を満足する構造上の剛性およびボイド容量
を有している。
【００４５】回収または測定マトリックスを行うために
重要な選択した物質の他の性質としては、マトリックス
を生成するために用いた焼結物質の粒径および孔径が挙
げられる。たとえば、適当な測定マトリックスの孔径
は、該マトリックスを使用する装置の態様と関連がある
ことがわかった。測定マトリックスが血液分離手段の下
に接触して位置している態様においては、マトリックス
中の流れの動力学は余り関係がない。マトリックスが血
液分離手段の側面に位置しており、毛管層またはストリ
ップなどの移動物質を用いて血漿を分離手段からマトリ
ックスへ移動させるときは、マトリックスの孔径は、マ
トリックス内での試料の分布を均一に保ちながら該マト
リックスにより試料の回収を行うのに充分な大きさを有
していなければならない。しかしながら、マトリックス
の孔径は、ストリップの孔径に比べて余り大きすぎては
ならない。毛管直径が大きく異なることは、流れの抵抗
の主要な因子となる。試料は、細かい孔の通路ではそれ
に沿って毛管作用により進んでいくが、粗い通路では迂
回することがある。毛管作用を有するストリップ物質が
セルロースまたはセルロース誘導体である場合は、一般
に約５μm〜約１００μmの範囲の孔径の測定マトリック
スを用いる。約１０μm〜約２５μmの範囲の孔径を用い
るのが好ましい。最も好ましい孔径は、水銀侵入(mercu
ry intrusion)法で評価して約１５μmのものであり、こ
れは「細」孔の等級とされる。約５μm〜約１０μmの範囲
の孔径は、測定マトリックス物質において超細孔径とし
て使用することができる。加えて、そのような側面態様
を毛管作用を有するストリップとともに用いて試料を血
液分離手段から回収または測定マトリックスへ移動させ
る場合には、試料の流れをマトリックスの方へ向けさせ
ることによってマトリックスの充填を最大にすることが
できる。「流れを向けさせる」なる語は、マトリックスの
全隣接表面が毛管作用を有するストリップ物質に直接接
触しない、すなわちマトリックス表面の実質部分が該ス
トリップと物理的に接触しないように、マトリックスを
該ストリップの末端部または該ストリップ中の細隙また
は空間の上部に置くことを意味する。このように流れを
向けさせる態様を用いることにより、試料がマトリック
スを迂回してストリップ物質中へ連続していくのを防ぐ
ことができる。
【００４６】本発明の別の態様において、測定マトリッ
クス物質を修飾してその製造された孔径を変えることが
できる。たとえば、ある名目上の孔径を有するように製
造した焼結ポリエチレンの多孔質マトリックスを処理物
質(デキストラン、ポリエチレングリコールまたはカル
ボキシラテックスなど)でコーティングして、一層細か
い孔径のマトリックスとしての試料回収および流れ属性
を有するマトリックスを製造することができる。マトリ
ックスを処理することにより、マトリックスのボイド容
量を減少させ、マトリックス中の流速を変えて一層小さ
な孔径を有するマトリックスの特性を擬態することがで
きる。
【００４７】本発明の回収マトリックスの他の望ましい
属性は、マトリックスの親水性である。しかしながら、
焼結物質は一般に親水性ではないので、上記血液分離手
段の処理において記載したように、焼結物質でできたマ
トリックスを界面活性剤で処理することにより親水性を
付与することができる。焼結ポリエチレンのマトリック
スを処理するのに約０.１％〜約０.５％の濃度の界面活
性剤溶液を用い、マトリックスの性能を向上させる。過
剰の界面活性剤を使用すると、試料の添加によって界面
活性剤が溶解して泡を生成し、これがマトリックスの孔
および毛管作用を妨害する。界面活性剤が不充分であっ
たり分布が不均一であると、マトリックス内に疎水性の
ポケットができて血漿が容易に流れなくなる。
【００４８】本発明の別の態様において、マトリックス
によって回収され保持された血漿または血清試料は、バ
ッファーを加えることによりマトリックスから溶出する
ことができる。溶出した試料およびバッファーは、あら
ゆる適当な受容手段により集めることができる。たとえ
ば、試験管、キュベットまたは反応ウエル中、またはス
ライド上に溶出することができる。場合により、受容手
段は、試料の診断アッセイを行うのに必要な試薬のすべ
てまたはいくらかを含んでいてよい。別のやり方とし
て、マトリックスよりも小さな孔径を有する吸収物質な
どの受容手段にマトリックスを接触させて該マトリック
スからの試料の移動を引き起こすことができる。クロマ
トグラフィー物質、吸湿性物質、多孔質物質または毛管
作用を有する物質または当業者によく知られた他の従来
の吸湿物質などのあらゆる適当な吸収物質を用いること
ができ、またこの物質は場合により診断アッセイを行う
のに必要な試薬のすべてまたはいくらかを含んでいても
よい。診断装置の試料受容手段は、使用の間中、回収マ
トリックスと直接接触させることができるし、またはマ
トリックスが所定量の試料を回収した後にマトリックス
と接触するようにしてもよい。
【００４９】一般に、測定マトリックスは、マトリック
スの入り口および場合により出口が定められるように、
非吸収性のケーシング物質内に内包もしくは収容され
る。そのような装置は、第４図および第５図に記載して
ある。第４図および第５図はまた、回収マトリックスを
血液分離手段とともに使用することも示している。第４
図および第５図に示す垂直装置の態様において、血液分
離手段から回収または測定マトリックスへの試料の移動
に及ぼす重力の影響を最小にするようにハウジング物質
を選択する。重力の影響は、本発明において血漿または
血清との相互反応が最小の物質からハウジングを成形す
ることにより最小となる。適当なハウジング物質として
は、ポリスチレン、アクリルポリカーボネート、テフロ
ン（登録商標）、ポリプロピレン、ポリエチレンおよび
シリコーンが挙げられる。血漿との相互作用が最小であ
ることによって特に好ましいハウジング物質は、ＫＲ０
０３樹脂、スチレン−ブタジエンコポリマー[フィリッ
プス６６(Ｐhillps ６６)、バートレフビル、テキサス]
が挙げられる。そのようなハウジングはまた、回収マト
リックスとハウジングとの間の血漿の接触を最小にする
ことにより回収マトリックスの過剰充填をも防ぐ。ハウ
ジングを使用することにより、下記実施例に示すよう
に、所定の大きさおよび名目上の孔径を有するマトリッ
クスが再生性のボイド容量および再生性の流れの結果を
もたらすであろう。
【００５０】第４図に示すように、装置(７０)はハウジ
ング(７２)を含んでおり、該ハウジングは入り口(７３)
および出口(７６)を有している。該ハウジング(７２)内
には装置(７７)が位置しており、該装置は第一の多孔質
ポリエチレンマトリックス(７８)、第一のフィルター手
段(８０)、第二の多孔質ポリエチレンマトリックス(８
２)および第二のフィルター手段(８４)を含んでいる。
第一のマトリックス(７８)は凝集素を含んでおり、入り
口(７４)および出口(７５)を有している。第一のフィル
ター手段(８０)は第一のマトリックス(７８)と第二のマ
トリックス(８２)との間にはさまれているので、第一の
フィルター手段(８０)の頂部は第一のマトリックス(７
８)の出口(７５)と液体受容関係にあり、第一のフィル
ター手段(８０)の底部は第二のマトリックス(８２)の頂
部と液体受容関係にある。第二の多孔質ポリエチレンマ
トリックス(８２)の底部は第二のフィルター手段(８４)
の頂部と液体受容関係にある。血液試料を装置に加える
前に、それを第三の多孔質ポリエチレンマトリックス
(８６)の頂部に液体受容関係にあるように置かれる。こ
の第三のマトリックス(８６)は、そのボイド空間内に選
択した所定量の血漿を保持および受容するように設計さ
れ、ついで血漿は受容キュベット(８８)中に洗浄され
る。第三のマトリックス(８６)は特定の血液分析対象物
の測定に必要な試薬の幾つかを含んでいてもよく、キュ
ベット(８８)は試薬システムの他の成分を含んでいても
よい。
【００５１】第５図に示すように、装置(９０)はハウジ
ング(９２)を含み、該ハウジングは入り口(９３)および
出口(９６)を有している。ハウジング(９２)内には装置
(９７)が位置しており、該装置は多孔質ポリエチレンマ
トリックス(９８)およびフィルター手段(１００)を含ん
でいる。このマトリックス(９８)は凝集剤を含んでお
り、入り口(９４)および出口(９５)を有している。フィ
ルター手段(１００)の頂部はマトリックス(９８)の出口
(９５)と液体受容関係にある。血液試料を装置(９０)に
加える前に、それを第二の多孔質ポリエチレンマトリッ
クス(１０２)の頂部に液体受容関係にあるように置く。
第二のマトリックス(１０２)は、所定量の血漿を保持お
よび受容するように設計され、ついで血漿は受容キュベ
ット(１０４)中に洗浄される。第二のマトリックス(１
０２)は特定の血液分析対象物の測定に必要な試薬の幾
つかを含んでいてもよく、キュベット(１０４)は試薬シ
ステムの他の成分を含んでいてもよい。
【００５２】本発明の装置から流れ出る血漿または血清
は、受容マトリックス中へ直接流れていってよい。装置
からの血漿または血清を受容するために利用できる異な
るタイプのマトリックスとしては、分析試薬を付着させ
た染料ペーパーマトリックス(上記米国特許出願第２０
４,４４３号明細書を参照)または焼結物質(ガラス、
鋼、セラミックス、またはプラスチックポリマーなど)
で製造した多孔質物質が挙げられ、これらマトリックス
は選択した容量の血漿または血清を保持することができ
る。染料ペーパーマトリックスの使用によれば、血漿ま
たは血清はペーパー内に入りペーパー中をフロントとし
て流れていく。血漿または血清はペーパー中に組み込ま
れた分析試薬と接触し、所望の血液成分のアッセイをペ
ーパー上で行う。
【００５３】該装置から血清または血漿の流れを授与し
得る好ましい焼結マトリックスは、処理多孔質ポリエチ
レンマトリックスである。血清または血漿は該装置から
流出し、選ばれた量が受容マトリックスに入る。受容マ
トリックスのボイド容量は、受容マトリックスに入る血
清または血漿の量を決定する。血清または血漿は、溶出
バッファーを加えることにより受容マトリックスからキ
ュベットに容出される。所望の血液成分は、所望の分析
試薬を含むキュベット中で分析される。多孔質ポリエチ
レンマトリックスは、血清または血漿の溶出後、分析物
の分析に必要な試薬を含んでいてもよい。そのような分
析は、ポリエチレンマトリックス中で行ってもよく、あ
るいは、試料および試薬をキュベット中に溶出させ、そ
の後に行ってもよい。
【００５４】本発明の装置は、一般に、血清または血漿
を他の診断法に用いる手段として利用されるが、種々の
分析試薬を、選ばれた血清または血漿の成分の分析を行
なうのに適するように該装置に加えることもできる。血
液中のコレステロール・トリグリセライドおよびグルコ
ースなどの分析物の酵素分析に利用されるような試薬が
挙げられる。種々のアッセイに用いられる試薬を、本発
明の装置に用いてもよい。本発明の他の態様におけるマ
トリックスに用いられる試薬として、たとえば、バッフ
ァー、酸類、塩基類、酵素類、酵素基質、アッセイ用試
薬および化学的分析用試薬などが挙げられる。生物学的
活性分子または成分、たとえば、抗原類、抗体類、組換
えタンパク、プラスミド、これらのフラグメントなども
マトリックスに含み得る。
【００５５】本発明の多孔質マトリックスは、多孔質マ
トリックスの容量に比例して、それらの間隙に血清また
は血漿を保留する。血清または血漿を含まない赤血球
は、一般に、外的手段で除かない限り多孔質マトリック
スの間隙に残留する。そのような外的手段としては静水
圧の使用があり、たとえばマトリックスに追加の血液試
料または溶質バッファーを適用した場合に得られる。別
法として、濾紙またはマトリックスと液体受容関係にあ
る他の多孔質マトリックスのようなフィルター手段を、
マトリックスの毛管作用により、血清または血漿の流れ
を誘引するために使ってもよい。したがって、血清また
は血漿の収量を最少にするために、流れおよび純度の点
で適合するような最も小さいマトリックスを使用するの
が望ましい。血清および血漿の多孔質マトリックス中の
流速は、接触するフィルター手段の多孔性および流れ特
性を変えることによりコントロールできる。フィルター
手段を多孔質マトリックス中の流速を高めるように選定
してもよい。別法として、血液サンプルの多孔質マトリ
ックス中により長く残留させたい場合には、多孔質マト
リックスの液体流速を比較的緩やかにするようなフィル
ター手段を選定してもよい。多孔質マトリックス中の流
速を低くすることにより、マトリックス中での凝集効果
を高めることもできる。さらに、液体流速を比較的低く
するフィルター手段を用いれば、より大きな凝集効果が
得られる利点があり、また、より小さい多孔質マトリッ
クスを使用することにより、血清または血漿収量を最少
にし得る利点も得られる。
【００５６】本発明の好ましい態様によれば、マトリッ
クスの孔径は、マトリックスの長さおよび容量、マトリ
ックスのボイド容量、試薬放出システム用の溶液の容量
および濃度に合わせて選択される。これらのファクター
は、各マトリックスに含まれる回収され得る乾燥試薬の
量を決定する。試薬放出システムを得る１つの方法で
は、既知容量の成分を既知濃度の試薬溶液と混合する。
ｐＨ適合や濾過性などを最終的に調整する。次いで、既
知量のマトリックスを溶液に加えて混合する。成分溶液
で飽和されたマトリックスの量を下記のように測定す
る。まず、マトリックスの容量、いわゆるマトリックス
のボイド容量を乾燥試薬の回収し得る量を測定すること
によって決定する。この方法は、当該分野で既知のもの
である。ついで、成分溶液で飽和されたマトリックスの
量を算出する。マトリックスは、飽和させる試薬成分の
マトリックスへの負荷を確実に完了させるために、吸引
すべきである。次にマトリックスをドライアイスの容器
に入れ凍結させる。凍結後、既知の方法により凍結乾燥
させる。本発明は、試薬が液体と接触して回復されるよ
うなユニット形式で含まれるような試薬システムを提供
するものである。試薬は、回復に最も適した条件でマト
リックスに加えられる。
【００５７】
【実施例】以下に本発明のいくつかの態様について実施
例で説明するが、本発明はこれらに限定されるものでは
ない。実施例１ 寸法が５mm×４mm×３mmである第１マトリックスを有す
る第２図に描かれた装置を、湿潤剤で処理し、pＨ５.６
のクエン酸１００mＭ中の抗赤血球抗体５mg／mlの溶液
３０μlを吸着させる。第１マトリックスの孔径および
それに吸着される凝集剤は、実質的に全ての赤血球が該
マトリックス中に保有されるように選択する。第１マト
リックスを抗体溶液で飽和させて負荷を完了する。負荷
が終われば、そのマトリックスを凍結乾燥する。寸法が
６mm×４mm×０.８mmである第２マトリックスは湿潤剤
で処理され、血漿中の分析物の定量に必要な試薬を含
む。入口から全血液を加え、それが第１マトリックスを
通るときに、試料中の赤血球は抗赤血球抗体で凝集さ
れ、凝集塊は濾去される。その赤血球を含まない血漿が
第１マトリックスから第２マトリックスへ流れ、酵素お
よびここに存在する試薬系の色素成分を可溶化する。次
いでこの混合物を、染色ペーパーマトリックス中を流通
させて、血液分析物と他の酵素と試薬系の色素成分の反
応によって分析物の定量を行なう。
【００５８】実施例２ 寸法が６mm×４mm×０.８mmである第３図に描かれた装
置を、湿潤剤で処理し、pＨ５.６の１００mＭクエン酸
バッファー中の抗赤血球抗体(ＩgＧ画分(Ｏrganon Ｔek
nika Ｃorp．製、Ｃappel Ｄivision))５mg／mlの溶液
８μlを吸着させる。抗体溶液を減圧下にマトリックス
に適用することにより負荷を完了する。負荷か終われ
ば、そのマトリックスを凍結乾燥する。入口から全血液
を加え、それがマトリックスを通るときに、試料中の赤
血球は抗赤血球抗体で凝集され、赤血球が部分的に濾別
される。最終的な赤血球濾過を、染色ペーパーマトリッ
クスの濾過部で行う。血漿は染色ペーパーマトリックス
を上昇しつづけるので、分析物定量用の試薬が凍結乾燥
されている分析物試薬部に接触する。血漿はこれらの試
薬を可溶化し、試料と試薬の反応による分析物の定量が
定量分析分析部で行なわれる。
【００５９】実施例３ 本具体例において、血液コレステロール検定を行えるよ
うに、実施例２に記載の装置を用いて全血液から血漿を
分離する。マトリックスをpＨ５.６にて、１００mＭの
クエン酸中の抗赤血球抗体(ＩgＧ画分(Ｏrganon Ｔekni
ka Ｃorp．製、Ｃappel Ｄivision))５mg／mlの溶液８
μl、１０mg／mlのコレステロールエステラーゼ、１０m
g／ml西洋ワサビペルオキシダーゼおよび５mg／mlの４
−アミノアンチピリンで負荷させる。装置を染色ペーパ
ーマトリックスのトップに接触して設置し、全血液を入
口から装置に注入する。血液を多孔質マトリックスで濾
過するときに、抗赤血球抗体で赤血球を凝集し、赤血球
を該マトリックスによって部分的に濾過する。染色ペー
パーマトリックスが装置と接触している端部から５〜６
mmの位置で最終的な赤血球濾過が行なわれる。ペーパー
端部から５〜６mmの位置において、１００mg／mlのコレ
ステロールオキシダーゼ、１％(w＼v)トリトンＸ−１０
０、および１００mＭのＮaＰＯ４からなるpＨ６.８の溶
液を含有する、幅３mmの領域である分析物定量部に血漿
が接触する。血漿はペーパーマトリックスを上昇しなが
ら、凍結乾燥試薬を可溶化する。血漿の流れは染色ペー
パーマトリックスへと移動し、そこで分析物(コレステ
ロール)の定量が行なわれる。
【００６０】実施例４ 第１図に描かれた装置においては、マトリックスを湿潤
剤で処理し、pＨ５.６の２０mＭクエン酸バッファー中
の抗赤血球抗体(ＩgＧ画分(Ｏrganon ＴeknikaＣorp．
製、Ｃappel Ｄivision))溶液２５μlを種々吸着させ
る。本装置について、下記第１表に示すデータは、２mg
／mlの抗体濃度で減圧下に負荷させたものが、ヘマトク
リットが３０〜６０％であり、２５μlの試料から少な
くとも５μlの血漿を放出する全血液から赤血球を濾別
するのに最も適していることを示している。ヘマトクリ
ットとは血液試料中に占める赤血球の容量パーセントで
ある。たとえば、ヘマトクリット３０の血液試料２５μ
lは、赤血球７.５μlと血漿１７.５μlを含有してい
る。全血液試料を抗凝固剤であるヘパリンで処理する。
この抗体濃度では、まだ実質的に試料のすべての赤血球
がマトリックス中に保有されているが、血漿はほどよい
時間内にフィルターペーパーの端から１２mm流れる。よ
り高い抗体濃度では、より大きな凝集となり、マトリッ
クス内の孔をブロックし、血漿の流れを妨げる。実質的
にすべての赤血球がマトリックス内に保有されるように
マトリックスの孔サイズと吸着される凝集剤を選択す
る。飽和(溶液にマトリックスを浸漬する)または減圧
(マトリックスを溶液に浸漬し、１０分間減圧する)によ
り、マトリックスに抗体溶液を加えて負荷を完了する。
減圧負荷の方が飽和負荷より優れていることが判る。な
ぜならば、減圧負荷は負荷後にマトリックス内にエアポ
ケットが存在しないことが確実なのである。飽和負荷は
この点において不確かである。負荷が終わればマトリッ
クスを凍結乾燥する。試験は６回行い、各試験で、濾過
ステップ後にマトリックスから液体を受容する濾紙上に
赤血球が無いという視覚的な決定により、「赤血球が実
質的にない状態(ＮoＲＢＣsと表示する)」であるかどう
かを検定する。表中、「端までの秒数」とは、血液試料を
マトリックスの入口から添加してから血漿がフィルター
部分の端に到達するまでの経過時間を意味する。
【００６１】
【表１】 n.f.＝濾紙マトリックスの端に血漿が流れてこないも
の。
【００６２】低血液ヘマトクリット(たとえば３０)の場
合、２分間程度で、１５μl以下の血漿が全血液試料２
５mlから放出されるが、高血液ヘマトクリット(たとえ
ば６０)の場合、１５分間程度で約５μlの血漿が全血液
試料２５mlから放出される。
【００６３】実施例５ 本実施例においては、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)に
対する抗体を検出する検定を行うために、実施例３に記
載の装置を、全血液と血漿の分離に用いる。マトリック
スを抗赤血球抗体(ＩgＧ画分(Ｏrganon Ｔeknika Ｃor
p．製、ＣappelＤivision))５mg／mlの溶液８μl、co−
ownedおよびco−pendingの米国特許出願第２４８８５８
号(１９８８年９月２３日出願)の記載に準じて、１０mg
／mlのＨＩＶ抗体を０.０５％ブラックラテックスと結
合させて調製した検出標識５μl、ポリ(ピロール)の懸
濁水溶液(pＨ７)で負荷する。装置を孔径５μmのニトロ
セルロース(Ｓ＆Ｓ,Ｋeene,ＮＨ)の３×３０mm片のトッ
プに接触して設置し、全血液３０μlを装置の入口から
添加する。血液を多孔質マトリックスで濾過するとき
に、抗赤血球抗体で赤血球を凝集し、赤血球を該マトリ
ックスによって部分的に濾過する。試料中の血漿をマト
リックス内の標識懸濁物と混合し、次いでニトロセルロ
ース片を入れ、ここで最終的な赤血球濾過と分離した血
漿の分析が行なわれる。
【００６４】実施例６ 第４図に描かれた装置に入口から全血液を添加する。血
液を多孔質マトリックスで濾過するときに、抗赤血球抗
体で赤血球を凝集し、赤血球を該マトリックスによって
部分的に濾過する。残りの赤血球および凝集した赤血球
の小さな固まりを第１フィルターに通し、赤血球から血
漿をさらに分離する。第１フィルターに保有されない赤
血球を第２マトリックスに通し、赤血球から血漿をさら
に分離する。最終的に、第２マトリックスに保有されな
い赤血球を、少なくとも１種の赤血球凝集剤を吸着させ
た第２フィルターに通し、血漿中の残りの赤血球を凝集
する。次いで血漿を受容マトリックスに流し、血漿量を
定量する。赤血球濾過スタックを受容マトリックスから
分離し、選択された容量の血漿に溶離バッファーを添加
して、付属キュベットに流し入れる。キュベットは種々
の分析試薬を含有している。キュベットを２度転回して
血漿と溶離バッファーの混合を完了する。指定の待機時
間後、溶液の色を標準チャートと比較して試験結果が得
られる。
【００６５】特に、第４図に描かれた装置においては、
第１マトリックス(Ｐorex４８９７)の孔径とそれに吸着
させる凝集剤を、第１マトリックス内の赤血球の大部分
(全部ではない)が凝集し、保有されるように選択する。
第１マトリックスは直径０.２インチ、長さ０.０７イン
チの円柱型に成形し、０.３５mＭクエン酸バッファー(p
Ｈ７.４)中の０.４４％(w／v)の抗赤血球抗体(ＩgＧ画
分(Ｏrganon Ｔeknika Ｃorp．製、Ｃappel Ｄivisio
n))、４.４(w／v)％のポリブレン(アルドリッヒ・ファ
イン・ケミカルズ製)、および４.４(w／v)％のＰＶＰ
(アルドリッヒ・ファイン・ケミカルズ製)の溶液１５.
０μlを吸着させる。コートした第１マトリックスをホ
ットエアオーブンで乾燥する。溶液の組成および第１マ
トリックス内に負荷する量を、赤血球の細胞溶解や血液
希釈をおこさずに非常に急速に赤血球凝集が起こるよう
に選択する。残りの赤血球を第１フィルター部分(ワッ
トマン３１ＥＴ)、第２多孔質ポリエチレンマトリック
ス(Ｐorex４９３２)、および第２フィルター部分(ワッ
トマン３１ＥＴ)を通して血漿から除去する。この最後
のフィルター部分は内部に赤血球に対する抗血清１mg／
ml溶液３６.１μlを保持している。コートした最終フィ
ルターをホットエアオーブンで乾燥する。第２表に示す
ように、この装置は血液５０μlから、９９％ヘモグロ
ビンなしの清澄な血漿１５μlを３分以内で生成する。
赤血球濾過スタック、すなわち第１マトリックス、第１
フィルター部分、第２マトリックスおよび第２フィルタ
ー部分を移動し、溶離バッファーを加えてキュベットの
中へ溶離する。
【００６６】実施例７ 第５図に描かれた装置に入口から全血液を添加する。血
液を多孔質マトリックスで濾過するときに、抗赤血球抗
体で赤血球を凝集し、赤血球を該マトリックスによって
部分的に濾過する。残りの赤血球および凝集した赤血球
の小さな固まりをフィルターに通し、赤血球から血漿を
さらに分離する。次いで血漿を受容マトリックスに流
し、血漿量を定量する。赤血球濾過スタックを受容マト
リックスから分離し、選択された容量の血漿に溶離バッ
ファーを添加して、付属キュベットに流し入れる。キュ
ベットは種々の分析試薬を含有している。キュベットを
２度転回して血漿と溶離バッファーの混合を完了する。
指定の待機時間後、溶液の色を標準チャートと比較して
試験結果が得られる。
【００６７】特に、第５図に描かれた装置においては、
マトリックス(Ｐorex４８９７)の孔径とそれに吸着させ
る凝集剤を、マトリックス内の赤血球の大部分(全部で
はない)が凝集し、保有されるように選択する。マトリ
ックスに、０.３９７mＭクエン酸バッファー(pＨ７.４)
中の０.８８％(w／v)の抗赤血球抗体(ＩgＧ画分(Ｏrgan
on Ｔeknika Ｃorp．製、Ｃappel Ｄivision))、１.７
６(w／v)％のポリブレン(アルドリッヒ・ファイン・ケ
ミカルズ製)、および１.７６(w／v)％のＰＶＰ(アルド
リッヒ・ファイン・ケミカルズ製)の溶液１５.０μlを
吸着させる。コートしたマトリックスをホットエアオー
ブンで乾燥する。溶液の組成およびマトリックス内にロ
ードする量を、赤血球の細胞溶解や血液希釈をおこさず
に非常に急速に赤血球凝集が起こるように選択する。残
りの赤血球をフィルター部分(ワットマン１ＣＨＲ)を通
して血漿から除去する。このフィルター部分は内部に赤
血球に対する抗血清１mg／ml溶液１５.０μlを保持して
いる。コートした最終フィルターをホットエアオーブン
で乾燥する。第３表に示すように、この装置は血液４０
μlから、９９％ヘモグロビンなしの清澄な血漿１０μl
を３２以内で生成する。赤血球濾過スタック、すなわち
マトリックスおよびフィルター部分を移動し、溶離バッ
ファーを加えてキュベットの中へ溶離する。
【００６８】
【表２】
【表３】
【００６９】実施例８ いくつかの方法が回収マトリックスのボイド容量および
測定容量の評価に使用できる。材料が薄くて、それが乾
燥している時と湿潤している時とで異なる形態をもって
いる場合は、拡散吸い取り(diffusion wicking)法が用
いられた。この方法では、一定量の試料を精密ピペット
を用いてマトリックスの表面に置いた。マトリックス表
面のウェットスポット(wet spot)の直径は拡散過程によ
り、マトリックス物質の容積容量と再現性のある試料回
収に関する情報を与えた。クロマトグラフィーペーパー
マトリックス(３１ＥＴセルロースペーパー、ホァット
マンアプライドテクノロジービジネス社製、ケント州、
英国)はニトロセルロース(５.０μmポア、ミクロンセパ
レイテッド、インク製)とほぼ同じ容積容量を持ってい
たが、しかし試料回収の再現性はニトロセルロース(３.
４％偏差)に比べてペーパーマトリックス(２％偏差)が
良好だった。ウルトラバインドメンブラン(ultrabind m
embrane)マトリックス(ゲルマン)は良好な再現性(２％
偏差)を示したが、これらのマトリックスは材料の薄さ
のための低い容積容量を示した。さらに厚いマトリック
ス物質を作るために、ニトロセルロースを被膜すること
は可能であるが、そのようなマトリックスは非常に破損
しやすい。
【００７０】当該物質が半透明でない場合で、その物質
の総飽和容量の測定が望まれる場合は、試料回収の前後
にマトリックスを秤量する方法を用いた。マトリックス
を均一の面積(表面積１.１３cm２のディスク形)に切り
取り、秤量し、マトリックスを試料に浸した。ついでマ
トリックスを試料から除き、過剰の試料をセルロース
(キムワイプ、キンバリークラーク、ＧＡ)のようなきめ
の荒いポアの物質を用いて急速吸い取りでマトリックス
表面から除いた。湿潤したマトリックスと乾燥したマト
リックス物質の重量差がマトリックスのボイド容量を示
した。第４表は焼結ポリエチレン(ポレックス４８９
７、ポレックステクノロジーインク製、フェアバーン、
ＧＡ)やナイロン(ナイロンメッシュ、スペクトラムメデ
ィカルインダストリーインク製、ロサンゼルス、カルホ
ォルニア)を含めたいくつかの異なるマトリックス物質
のボイド容量測定結果を示す。
【００７１】
【表４】 第４表 湿潤吸秤量法によるボイド容量 物質 薄さ 乾燥重量 ボイド容量 ボイド容 量変化 (mm) (mg) (mg) (％) ニトロセルロース 0.17 3.8 17.1 3.5 ナイロン 0.05 4.0 3.2 29.0 ポレックス 4897 1.4 72.9 64.3 1.0 ウルトラバインド 0.17 7.5 5.9 3.5 ウァットマンペーパー 0.4 20.5 40.5 3.9
【００７２】第４表の結果を比較して、焼結ポリエチレ
ンマトリックスマテリヤルがマトリックスサイズに対し
最大のボイド容量と最小の測定偏差を示すことが判明し
た。ナイロンマトリックスは容認できない再現性を示し
た。ニトロセルロースとウルトラバインドマトリックス
は多容量の試料に対しては不十分な容量を示した。後者
の物質をボイド容量を希望の範囲にするように多層に積
層することが出来るが、そのような積層体で測定する場
合その容量再現性はさらに調整しにくい。
【００７３】実施例９ 本実験はマトリックスの孔径の変更のための方法を示
す。変更はマトリックスをデキストラン溶液(２.５％／
水)で処理して行った。マトリックスの内表面をデキス
トランで被膜する効果は、異なるヘマトクリット値の血
漿試料をマトリックスに用いて測定した。実験の結果は
第５表に示す。結果から、第４図および第５図で示した
垂直配置装置あるい類似のハウジングを用いての血漿回
収に対する孔径とデキストラン被膜の効果を示す。数値
は４５％ヘマトクリット血液試料から得た血漿に対する
パーセントで表す。
【００７４】
【表５】 第５表 孔径とマトリックス被膜の効果 血液試料 非被膜 被膜 非被膜 ヘマトクリット 大径受容体 大径受容体 小径受容体 (％) (25μm) (25μm) (10μm) ０ １５０ １３２ １１０ ３０ １１２ １１８ １０５ ４５ １００ １００ １００ ５０ 未測定 ９５ ９８ ５５ ８７ ８９.１ ９５ ６０ 未測定 ８０.４ ９０ ４５％ヘマトクリット での容量(μl) ９ ６.８ ４.５
【００７５】実施例１０ 異なる物質を用いて回収マトリックス用ハウジングを作
った。最も好ましいハウジング物質は血漿や血清とハウ
ジングの相互反応が最小のものである。物質には最小流
動抵抗があるために、回収マトリックスは血液試料が低
いヘマトクリット値を有するときはオーバーフィル(ove
r fill)する傾向がある。また回収マトリックスの孔を
ふさぐ試料では物質の量が増加するため、血液試料が高
いヘマトクリット値を有するときは、回収マトリックス
は、アンダーフィル(under fill)の傾向がある。第６表
は受取血漿容量と異なる物質で出来たハウジング内の回
収マトリックスから回収した血漿容量をパーセントで比
較している。血漿試料を試験試料として用い、湿潤吸い
取り秤量法で測定した場合焼結ポリエチレン回収マトリ
ックスのボイド容量は８.５μlであった。この希望の
８.５μlは４５％ヘマトクリットの血液試料を用いて血
漿重量を測定することにより得た。ハウジングはスチレ
ン−ブタジエンコポリマー(ＫＲ００３、フィリップス
６６)、スチレン−アクリル酸アロイ(Ｑ８８６、モンサ
ント、ＭＯ)、アクリロ−ブチルスチレン(ＡＢＳ,モン
サント、ＭＯ)、ポリメチルペンテン(ＴＰＸ、三井石油
化学社製、ニューヨーク、ＮＹ)、ポリプロピレン(ＰＤ
２１３、ハイモント社製、ブルーミングトン、ＤＥ)あ
るいはポリエチレン(ＰＥ、ＧＥプラスチックス社製、
ビッツフィールド、ＭＡ)から調製した。
【００７６】
【表６】 第６表 マトリックスオーバーフィルを最小化するハウジング プラスチック樹脂 血漿受取容積 予想値8.5μlに (μl) 対する回収％ ＫＲ００３ ９.８ １１５ Ｑ８８６ １０.６ １２４ ＡＢＳ １１.０ １２９ ＴＰＸ １１.６ １３６ ＰＤ-２１３ １０.９ １２９ ＰＥ １１.６ １３６
【００７７】第７表は異なる物質で調製したハウジング
内の回収マトリックスと３２％ヘマトクリットの全血液
を用いた血漿回収結果を示す。回収パーセントは３２％
ヘマトクリットの全血液試料から回収した血漿と４３％
ヘマトクリット血液を試料として用いて回収した値と比
較して、４３％ヘマトクリットでの結果を１００％値と
して計算した。
【００７８】
【表７】
【００７９】ＫＲ００３樹脂で作ったハウジングは種々
のヘマトクリット値の試料での最も少ない血漿回収偏差
を示した。鋳型プラスチックハウジングを洗浄剤で被膜
して疎水性表面を作ったり、また硬化性シリコン(ＭＤ
Ｘ４−４１５９、ダウコーニング社製、ミッドランド、
ミシガン)を用いてシリコン化工程により、血漿回収に
対するオーバーフィリング作用とヘマトクリット作用を
最小化することは可能である。
【００８０】実施例１１ 本実験では診断用装置における直接流出と非直接流出の
効果を比較した。血液分離部は長さ０.０７４インチ、
直径０.１９４インチの焼結ポリエチレンシリンダーで
ある。血液分離部の孔径および分離部内に吸収された凝
集剤は迅速に凝集するように、また血液希釈や細胞溶解
を起こすことなくマトリックス内に赤血球の大部分を保
持するように選んだ。分離部は、界面活性剤(０.１％ト
リトンＸ−４０５、シグマ社製、セントルイス、ＭＯ)
を含む抗赤血球抗血清(オルガノンテクニカコーポレー
ション製、ダーハム、ＮＣ)のクエン酸緩衝液(０.３９
７mＭ、pＨ７.４、フッシャーケミカルズ社製、フェア
ーヘブン、ＰＡ)溶液(８.８９光学濃度(２８０nm)／ml)
で飽和しておいた。ついで分離部はホットエヤーオーブ
ンで乾燥した。
【００８１】測定あるいは血漿回収用マトリックスとし
て長さ０.０７０インチで直径０.１５０インチの大きさ
の焼結ポリエチレンシリンダーを用いた。シリンダーは
５ミクロンの表示孔径の焼結ポリエチレン(ゼネラルポ
リメリック)のストックシートから均一サイズのマトリ
ックスを除くために中空パンチを用いて作った。血漿回
収マトリックスはシートをカルボキシラテックス(セラ
ダイン社製、インジアナポリス、ＩＮ)の３％メタノー
ル懸濁液で前処理しついで真空下一夜乾燥することによ
り親水性にしておいた。吸い取りストリップはセルロー
スペーパー(シュレイチャーアンドシュエル４１０番、
ケーン、ＮＨ)で調製した。
【００８２】測定マトリックスの底表面全部が吸い取り
層の上部表面に接して配置した非直接流出装置と、測定
マトリックスの底表面の実質的部分が吸い取り層あるい
はストリップの上部表面にすき間をあけて位置している
直接流出装置を用いて比較した。血液試料を装置の血液
分離部に加え、そこで赤血球を除き、得られた血漿を毛
細作用により吸い取り層に導入させた。血漿は吸い取り
ストリップを通って回収マトリックスに連続的に導入さ
れ、吸い取りストリップの流出部上まで達する。血漿の
流出部でそれ以上動きが視覚的に見られなくなった時点
で回収マトリックスを除きその重量を測定した。使用し
たマトリックスの重量をマトリックスの使用前の既知の
重量と比較することにより、血漿回収による重量の真の
増加量を計算した。結果を第８表に示す。その結果か
ら、側面流出配置の場合には、直接流出配列の方が広範
囲のヘマトクリット値にわたって回収マトリックスの良
い均一充填を与えることが分かった。非直接流出配列で
はマトリックスのアンダーフィリングが５５％ヘマトク
リットで見られた。
【００８３】
【表８】
【００８４】実施例１２ 以下の実験では、回収マトリックスと血液分離部の精
度、測定結果と参考測定法との相関関係および測定装置
の使用におけるヘマトクリットの影響を調べた。第４図
および第５図に示した垂直積層血液分離器を用いた。血
液分離部は焼結ポリエチレン(ポレックス４８９７)で調
製した。その材料は抗ヒト赤血球抗血清(光学濃度８.８
９(２８０nm)／ml、ケッペル０１０１−１３２２、オル
ガノンテクニカコーポレーション製)の界面活性剤(０.
１％トリトンＸ−４０５)を含有したクエン酸緩衝液
(０.５７３mＭ、pＨ７.４、フッシャーケミカルズ社製)
溶液で飽和し、ついで室温で低空気層流で乾燥した。回
収マトリックスは約５μmの孔径の焼結ポリエチレンシ
ートストック(ゼネラルボリメリックス)から調製した。
シートはカルボキシラテックス(セラダイン)の３％メタ
ノール懸濁液で飽和した。ついでシートを真空デシケー
ター中で一夜放置して溶媒を除去した。
【００８５】それぞれ直径０.２００インチ、長さ０.０
６４インチの２つのディスクを血液分離部の物質からく
りぬき、第４図および第５図に示したようにシリンダー
状ハウジングに挿入した。さらに抗ヒト赤血球ＩgＧ(オ
ルガノテクニカ社製、ケッペル０２０１−１３２２)の
クエン酸ナトリウム緩衝液(２.０mＭ、pＨ７.４)溶液で
あらかじめ被膜したクロマトグラフィー用ペーパー(直
径０.２００インチ、ホアットマン１ＣＨＲ)のディスク
１つをハウジング内に置いた。回収マトリックスのディ
スク１つ(直径０.１３８インチ、長さ０.０６４インチ)
をくりぬいた。ディスク面積は回収マトリックスが約５
マイクロリットルのボイド容量になるように選んだ。第
４図に示したように、回収マトリックスをペーパーディ
スクの底表面が回収マトリックスの上部表面に接するよ
うにハウジングに挿入した。
【００８６】測定試薬をコレステロール測定用に調製し
た。血漿コレステロールの測定に必要な試薬は単位用量
試薬(unit dose reagent)と呼ばれている単位形式で放
出させた。この単位用量試薬は、測定試薬が可溶塊に成
形されている放出形式である。適当な緩衝液に接したと
きに、単位用量試薬は色素の分光度測定を阻害する不溶
性物質を残すことなく成分試薬を遊離して溶解する。コ
レステロール測定用単位用量試薬はコレステロールエス
テルヒドロラーゼ(６６６０単位、アマノ社製、トロ
イ、ＶＡ)、コレステロールオキシダーゼ(９４０単位、
ベーリンガーマンハイムバイオケミカル社製、インジア
ナポリス、ＩＮ)、ペルオキシダーゼ(１３６,０００単
位、アマノ社製)、４−アミノアンチピリン(６７７mg)
および３,５−ジクロロヒドロキシベンゼンスルホン酸
塩(２９２２mg)を含む。成分試薬は血漿試料と反応し赤
色反応生成物を生成し、これを分光度計(５１５nm)で読
み取る。
【００８７】単位用量試薬を、上述および第４図および
第５図で示した診断用装置の試料受容器として使用され
るキュベットに入れた。全血液試料(５０μl)を血液分
離部装置の最上部に置いて測定を行った。約２分後、細
胞血漿分離が完了し、回収マトリックスは血漿で満たさ
れた。血液分離部装置を装置から除き、血漿を溶出緩衝
液(０.５ml)を加えて回収マトリックスからキュベット
中へ溶出した。コレステロール測定に必要な試薬を遊離
させるために、単位用量試薬をキュベット中で血漿試料
と緩衝液に溶解した。得られた反応液の吸光度を分光度
計で読み取った。試験は６８人の患者からの全血液試料
を用いて２回繰り返して行った。測定の結果はビジョン
コレステロールアッセイ(アボット・ラボラトリーズ社
製、アボットパーク、ＩＬ)で得た測定結果と比較し
た。このシステム、つまり血液分離部、測定マトリック
スおよび単位用量試薬のシステムの総体的精度は個々の
測定値の変異係数(％ＣＶ)の平均値で計算した。この測
定の総体的精度は３.３％ＣＶとなった。本発明で測定
した各患者のコレステロールレベルとビジョンアッセイ
で決定したそれとの傾き、切片および相関係数は、傾き
０.９３、切片１４および相関係数０.９６であった。従
って、本発明の試験装置は参考測定法の結果に比較して
も許容できる精度の測定結果を示した。
【００８８】実施例１３ グルコースオキシダーゼ含有マトリックスの製法 ２５０mg／mlのグルコースオキシダーゼ(シグマケミカ
ルコーポレーション製、セントルイス、ＭＯ)と１９mg
／mlの４−アミノアンチピリン(シグマケミカルコーポ
レーション製、セントルイス、ＭＯ)を含有した成分溶
液を調製した。約６.５μlの表示マトリックス容積を持
つ多量の焼結ポリエチレン、Ｐorexo ＬＣ０６ ＷＷ５.
３マトリックス(ポレックスインク製、フェアーバー
ン、ジョージア)を本発明に従って、この成分溶液で飽
和し、凍結し、凍結乾燥した。
【００８９】実施例１４ ペルオキシダーゼ試薬含有マトリックスの製法 ７.５m
g／mlのペルオキシダーゼ(シグマケミカルコーポレーシ
ョン製、セントルイス、ＭＯ)と１００mg／mlの３,５−
ジクロロ−２−ベンゼンスルホン酸塩(ＤＣＨＢＳ)(シ
グマケミカルコーポレーション製、セントルイス、Ｍ
Ｏ)を含有した成分溶液を調製した。約６.５μlの表示
マトリックス容積を持つ多量の焼結ポリエチレン、Ｐor
exo ＬＣ０６ ＷＷ５.３マトリックス(ポレックスイン
ク製、フェアーバーン、ジョージア)を本発明に従っ
て、この成分溶液で飽和し、凍結し、凍結乾燥した。
【００９０】実施例１５ グルコース測定法 実施例１３および実施例１４に従って調製したマトリッ
クスを容器中２０mＭクエン酸ナトリウム(pＨ５.６)３m
lに加えた。その容器を約３〜５分間渦巻き撹拌して含
有試薬を溶解した。５μlのグルコース標準(シグマケミ
カルコーポレーション製、セントルイス、ＭＯ)、(表示
上で約１００mg／dl)を緩衝液とマトリックスの混合物
に加えた。容器を３０分間３７℃でインキュベートし
た。４５０、５１２および５６０nmの吸光度を、対照と
して蒸留水を用いて測定した。各標準は８回測定し、平
均値と標準偏差を計算した。
【００９１】実施例１６ グルコース測定法 実施例１３および実施例１４に従って調製したマトリッ
クスを容器中２０mＭクエン酸ナトリウム(pＨ５.６)３m
lに加えた。５μlの標準グルコース(シグマケミカルコ
ーポレーション製、セントルイス、ＭＯ)、(表示上で約
３００mg／dl)を緩衝液とマトリックスの混合物に加え
た。その容器を約３〜５分間渦巻き撹拌して含有試薬を
溶解した。容器を３０分間３７℃でインキュベートし
た。４５０、５１２および５６０nmの吸光度を、対照と
して蒸留水を用いて測定した。各標準は８回測定し、平
均値と標準偏差を計算した。
【００９２】実施例１７ グルコース測定法 実施例１３および実施例１４に従って調製したマトリッ
クスを容器中２０mＭクエン酸ナトリウム(pＨ５.６)３m
lに加えた。その容器を約３〜５分間渦巻き撹拌し含有
試薬を溶解した。５μlの標準グルコース(シグマケミカ
ルコーポレーション製、セントルイス、ＭＯ)、(表示上
で約８００mg／dl)を緩衝液とマトリックスの混合物に
加えた。容器を３０分間３７℃でインキュベートした。
４５０、５１２および５６０nmの吸光度を、対照として
蒸留水を用いて測定した。各標準は８回測定し、平均値
と標準偏差を計算した。
【００９３】
【表９】 第９表 グルコース標準(mg/dl)の450nmでの吸光度 試 料 0 100 300 500 １ 0.0807 0.1415 0.2228 0.4588 ２ 0.0895 0.1302 0.2265 0.4887 ３ 0.0818 0.1280 0.2094 0.4897 ４ 0.0818 0.1398 0.2217 0.4850 ５ 0.0818 0.1294 0.2104 0.5335 ６ 0.0867 0.1394 0.2457 0.4917 ７ 0.0820 0.1298 0.2155 0.4731 ８ 0.0864 0.1311 0.2074 0.4610 平 均 0.0838 0.1337 0.2199 0.4852 標準偏差 0.003 0.005 0.012 0.022
【００９４】
【表１０】 第１０表 グルコース標準(mg/dl)の512nmでの吸光度 試 料 0 100 300 800 １ 0.0740 0.2828 0.5492 1.3282 ２ 0.0758 0.2428 0.5718 1.4378 ３ 0.0788 0.2411 0.5151 1.4405 ４ 0.0782 0.2625 0.5484 1.4400 ５ 0.0782 0.2215 0.4998 1.5807 ６ 0.0831 0.2604 0.9280 1.4487 ７ 0.0797 0.2401 0.5184 1.3854 ８ 0.0817 0.2434 0.4948 1.3540 平 均 0.0787 0.2493 0.5407 1.4269 標準偏差 0.003 0.017 0.041 0.072
【００９５】
【表１１】 第１１表 グルコース標準(mg/dl)の560nmでの吸光度 試 料 0 100 300 800 １ 0.0671 0.1731 0.3134 0.7205 ２ 0.0660 0.1520 0.3260 0.7828 ３ 0.0704 0.1512 0.2957 0.7837 ４ 0.0691 0.1642 0.3134 0.7825 ５ 0.0619 0.1431 0.2857 0.8551 ６ 0.0715 0.1642 0.3537 0.7884 ７ 0.0692 0.1522 0.2964 0.7495 ８ 0.0698 0.1547 0.2831 0.7338 平 均 0.0681 0.1568 0.3084 0.7745 標準偏差 0.003 0.009 0.022 0.039
【００９６】実施例１８ コレステロールエステルヒドロラーゼとコレステロール
オキシダーゼ含有マトリックスの製法 ０.３７４gの４−アミノアンチピリン(シグマケミカル
コーポレーション製、セントルイス、ＭＯ)、０.２９９
gのコレステロールエステルヒドロラーゼ(ミツビシの子
会社、アマノ社製、トロイ、ＶＡ)および０.１３９gの
コレステロールオキシダーゼ(ベーリンガーマンハイム
社製、インジアナポリス、ＩＮ)を２０.４mlの５０mＭ
ＭＯＰＳＯ緩衝液(３−[Ｎ−モルホリノ]−２−ヒドロ
キシプロパンスルホン酸、シグマケミカルコーポレーシ
ョン製、セントルイス、ＭＯ)pＨ７.０に加えた。異な
る量の界面活性剤を含有する４種のポレキソ(Ｐorexo)
マトリックスを試験した。これらのマトリックスはポレ
ックスインク(フェアーバーン、ジョージア)製で、０.
３％の界面活性剤ＷＷ５含有の製品番号ＬＣ０６ ＷＷ
５.３、０.２％の界面活性剤ＷＷ５含有の製品番号ＬＣ
０６ ＷＷ５.２、０.１％の界面活性剤ＷＷ５含有の製
品番号ＬＣ０６ ＷＷ５.１および界面活性剤を含まない
製品番号ＬＣ０６であった。マトリックスを本発明の方
法に従ってこの成分溶液で飽和し、凍結し、凍結乾燥し
た。
【００９７】実施例１９ 実施例１８のマトリックスの安定性はマトリックスをバ
イヤルに入れ、そのバイヤルを乾燥することなく４５℃
で３日間インキュベートし(強調)、コレステロールエス
テルヒドロラーゼ(ＣＥＨ)、コレステロールオキシダー
ゼ(ＣＯ)および４−アミノアンチピリン(４ ＡＡＰ)の
回収パーセントを測定し、あわせてこれらの結果を実施
例１８のマトリックスを４℃に３日間乾燥保存して得た
結果(対照)と比較して調べた。これらの結果は第１２表
に示す。
【００９８】
【表１２】 第１２表 マトリックス 状 態 予想活性の回収パーセント CHE CO 4-AAP LCO6WW5.3 対 照 84% 96% 102% 強 調 1% 0% 111% LCO6WW5.2 対 照 72% 106% 95% 強 調 48% 1% 91% LCO6WW5.1 対 照 68% 81% 97% 強 調 43% 4% 97% LCO6 対 照 58% 94% 101% 強 調 34% 8% 99%
【００９９】実施例２０ コレステロール試薬含有マトリックスの製法 以下の成分を総量１０.２mlの２５０mM ＭＯＰＳＯ(pＨ
７.０)に加えた。 ０.０１１３gの塩化マグネシウム(試薬級、フィッシャ
ー製) ０.０２７６gの塩化カルシウム(試薬級、フィッシャー
製) ０.５１００gの乳糖(シグマケミカルコーポレーション
製、セントルイス、ＭＯ) １.０２００gのウシ血清アルブミン(脂肪酸不含、シグ
マケミカルコーポレーション製、セントルイス、ＭＯ) ０.３０６０gのグリセロール(シグマケミカルコーポレ
ーション製、セントルイス、ＭＯ) ０.１８６８gの４−アミノアンチピリン(シグマケミカ
ルコーポレーション製、セントルイス、ＭＯ) ２２００単位のコレステロールエステルヒドロラーゼ
(ミツビシの子会社アマノ製、トロイ、ＶＡ) ２６０単位のコレステロールオキシダーゼ(ベーリンガ
ーマンハイム社製、インジアナポリス、ＩＮ)
【０１００】試薬を本発明の方法により８.５μlの表示
上のボイド容量を持つポレックスＬＣ０６マトリックス
に負荷した。マトリックス−溶液混合物に２５インチ水
銀圧を３回加え溶液のマトリックスへの進入を高めた。
ついで容器を凍結し本発明に従って凍結乾燥した。完全
なフリット負荷を確実にするために必要な過剰の溶液か
ら得た粉末は、凍結乾燥したマトリックスを１０番のふ
るいで１５分間振とうすることにより除いた。
【０１０１】実施例２１ ペルオキシダーセ／ＤＣＨＢＳ含有マトリックスの製法 西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＰＯＤ)とＤＣＨＢＳを含
有したマトリックスを以下の方法で調製した。０.８０
６４gのＤＣＨＢＳをpＨ７.０の５０mＭ ＭＯＰＳＯ約
８.５mlに溶解した。pＨは１２ＮＨＣlでpＨ７.０に調
整し、３７,５００単位の西洋ワサビペルオキシダーゼ
(ミツビシの子会社アマノ製、トロイ、ＶＡ)をこの溶液
に溶解した。最終容量はpＨ７.０の５０mＭＭＯＰＳＯ
で１０.２mlに調整した。表示上のボイド容量がマトリ
ックス当たり８.５μlである１,０００のマトリックス
をこの溶液に添加した。混合物を本発明に従って撹拌、
凍結、凍結乾燥した。過剰の溶液は負荷したマトリック
スを１０番ふるいで１５分間振とうして除いた。
【０１０２】実施例２２ グリセロール−リン酸オキシダーゼとグリセロールキナ
ーゼ含有マトリックスの製法 ０.０２９７g／mlのアデノシン三リン酸二ナトリウム塩
(ＡＴＰ、シグマケミカルコーポレーション製、セント
ルイス、ＭＯ)、０.００９４g／mlの塩化マグネシウム
(シグマケミカルコーポレーション製、セントルイス、
ＭＯ)、０.００４７g／mlの４−アミノアンチピリン(シ
グマケミカルコーポレーション製、セントルイス、Ｍ
Ｏ)、０.０５００g／mlのショ糖(シグマケミカルコーポ
レーション製、セントルイス、ＭＯ)、０.０７３１g／m
lのウシ血清アルブミン(ＢＳＡ、脂肪酸不含、シグマケ
ミカルコーポレーション製、セントルイス、ＭＯ)、０.
０１４６g／mlのポリエチレングリコール(ＰＥＧ)(シグ
マケミカルコーポレーション製、セントルイス、Ｍ
Ｏ)、７６９Ｕ／mlのグリセロ−３−ホスフェートオキ
シダーゼ(コダック社製、ロチェスター、ＮＹ)、１０２
５４０Ｕ／mlのリパーゼ(東洋醸造、東京、日本)および
３９Ｕ／mlのグリセロキナーゼ(コダック社製、ロチェ
スター、ＮＹ)をpＨ７.０の５０mＭリン酸緩衝液６.５m
lに溶解して成分溶液を調製した。ついで新鮮なフェロ
シアン酸溶液(１.２６７２gのフェロシアン酸カリウム
三水和物を１００mlの蒸留水に溶解、シグマケミカルコ
ーポレーション製、セントルイス、ＭＯ)１００μlを混
合物に添加した。マトリックス当たり約６.５μlの表示
上のマトリックス体積を持つ多量の焼結ポリエチレンの
ポレックスＬＣ０６ ＷＷ５.３マトリックスをこの成分
溶液で飽和し、本発明の方法に従って凍結、凍結乾燥し
た。
【０１０３】実施例２３ ペルオキシダーゼとリパーゼ含有マトリックスの製法 ０.１０４１g／mlのＤＣＨＢＳ、１０２５４０Ｕ／mlの
リパーゼ(東洋醸造社製、東京、日本)および８０８Ｕ／
mlの西洋ワサビペルオキシダーゼを６.５mlのリン酸緩
衝液に溶解して成分溶液を調製した。約６.５μlの表示
上のマトリックス容積をもつ多量の焼結ポリエチレンの
ポーレックスＬＣ０６ ＷＷ５.３をこの成分溶液で飽和
し、本発明の方法に従って凍結、凍結乾燥した。
【０１０４】実施例２４ トリグリセライド測定法 実施例２２および実施例２３に従って調製したマトリッ
クスをキュベットに入れた。界面活性剤、ゲナポール
(Ｇenapol)(ヘキスト社製、西ドイツ)とトリトンＸ−１
００(Ｔotiono Ｘ−１００)(シグマケミカル社製、セ
ントルイス、ＭＯ)を含有したpＨ７.０のリン酸緩衝液
５００μlをキュベットに加えた。０、６３.４４、１６
１.０８および８７９.１２mg／dlの各トリグリセライド
標準(ＡbbottＶisiono用トリグリセライド標準として、
アボット社製、アボットパーク、ＩＬ)(保存剤不含)６
μlをキュベットに加えインキュベートした。各標準は
６回試験し、読み取った吸光度を平均して平均吸光度と
した。これらの結果は第１３表に示した。
【０１０５】
【表１３】 第１３表 トリグリセライド標準(mg/dl)の512nmでの吸光度 試 料 0 63.44 161.08 879.12* １ 0.141 0.473 0.759 3.142 ２ 0.136 0.396 0.837 3.364 ３ 0.134 0.395 0.809 3.364 ４ 0.112 0.439 0.849 3.342 ５ 0.136 0.427 0.831 2.814 ６ 0.132 0.419 0.823 3.060 平 均 0.132 0.419 0.818 3.194 ＊８７９.１２mg／dl標準における結果は、ゲナポール
とトリトンＸ−１００を含有したリン酸緩衝液(pＨ７.
０)で検体を１対１に希釈して測定し、測定値を２倍し
た。これは、この測定に使用した分光度計の測定限界の
ために必要であった。
【０１０６】第９表、第１０表および第１１表はグルコ
ース標準品０、１００、３００および８００mg／dl濃度
での４５０nm、５１２nmおよび５６０nmにおける測定吸
光度から得た結果を示す。各標準品は８回ずつ試験した
(Ｎ＝８)。グルコース標準品の各濃度における平均値お
よび標準偏差を示した。この結果からごくわずかな偏差
のみが試料間で見られ、従ってこれはこの測定システム
の再現性と信頼性を示している。第１２表の結果はコレ
ステロールオキシダーゼ活性の回収がマトリックスＬＣ
０６、疎水性マトリックスで最大であることを示す。第
１３表の結果はトリグリセライド測定に対する用量反応
直線を示す。
【０１０７】第６図のグラフは異なる濃度のグルコース
標準品で得られた吸光度と波長をプロットしたスペクト
ルを示す。最大ピークは８００mg／dlのグルコース濃度
において約５１２nmで得られた。２番目に高いピークは
３００mg／dlのグルコース濃度において約５１２nmで得
られた。３番目に高いピークは１００mg／dlのグルコー
ス濃度において得られた。グルコース標準品０mg／dl
(蒸留水)を測定した時は平たんな線が得られた。第７図
のグラフは一定の波長において吸光度と標準グルコース
濃度との直線関係を示す。異なる波長で得られた各線は
離れており、従って種々の波長で吸光度スペクトルに沿
った値が得られるということは注目すべきことである。
【０１０８】第８図のグラフは５１２nmでの吸光度と標
準トリグリセライド濃度との直線関係を示す。本発明の
概念は本明細書で特に説明した測定法のみでなく他の種
種の形式の測定法や物質にも応用できる。当分野の技術
者であれば本発明の概念が応用できる多くの他の測定法
や物質を想定することは容易であろう。ここで説明した
態様や紹介した他の態様は例でありそれに限定されるも
のではない。従って、本発明の説明は本発明を開示した
特別な態様に限定するものではなく、上記のごとく本発
明の精神および範囲内のすべての同等物と主題を包含す
るものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 第１図は、多孔質マトリックスおよび受容濾
紙マトリックスからなる装置を示す。
【図２】 第２図は、第一多孔質マトリックス、第二多
孔質マトリックス、および受容濾紙マトリックスからな
る装置を示す。
【図３】 第３図は、多孔質マトリックス、および試薬
含有ゾーンを有する受容濾紙マトリックスからなる装置
を示す。
【図４】 第４図は、第一多孔質マトリックス、第一フ
ィルター手段、第二多孔質マトリックス、第二フィルタ
ー手段、および受容多孔質マトリックスからなる装置を
示す。
【図５】 第５図は、多孔質マトリックス、フィルター
手段、および受容多孔質マトリックスからなる装置を示
す。
【図６】 第６図は、反応生成物の吸収スペクトルを示
すグラフであり、その吸収は、吸収／波長に関して０、
１００、３００および８００mg/dLのグルコース標準品
についてプロットしたものであり、最も高いピークのも
のは、８００mg/dLのグルコース標準品で得られたも
の、第二に高いピークのものは、１００mg/dLのグルコ
ース標準品で得られたもの、平坦線のものは０mg/dLの
グルコース標準品で得られたものである。
【図７】 第７図は、グルコースの分析における、用量
応答曲線を示すグラフであり、１００、３００および８
００mg/dLのグルコース標準品について波長５１２、４
５０および５６０nmにおける平均吸収値 (Ｎ＝８）をプ
ロットしたもので、波長５１２nmの曲線は四角マーク付
の線、波長４５０nmの曲線は丸マーク付の線、波長５６
０nmの曲線は菱形マーク付の線で示される。
【図８】 第８図は、トリグリセライド標準品について
の回帰線を示し、吸収／トリグリセライド濃度に関して
波長５１２nmにおける平均吸収をプロットしたものであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/28 Ｃ１２Ｑ 1/28 1/48 1/48 Ｚ (72)発明者 クリスチン・ディ・エルモア アメリカ合衆国イリノイ60087、ウォーク ガン、デウッディ・ロード37874番 (72)発明者 グラディミール・ジー・ジョージヴィッチ アメリカ合衆国イリノイ60060、マンデリ ン、ダブリン813番 (72)発明者 ツァイ−ウェン・ジェン アメリカ合衆国イリノイ60061、バーノ ン・ヒルズ、アップルトン・ドライブ311 番 (72)発明者 ゲリー・エム・ウースタ アメリカ合衆国イリノイ60031、ガーニー、 アッシュウッド・レイン5377番 (72)発明者 テリー・エイ・プライ アメリカ合衆国イリノイ60048、リバティ ビル、アーサー820番 (72)発明者 ニール・エイ・シーゲル アメリカ合衆国イリノイ60015、ディアフ ィールド、マラード・レイン531番 (72)発明者 キャシー・アール・シルバーマン アメリカ合衆国イリノイ60031、ガーニー、 アプト．７フィンチ・コート4369番

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも１種の試薬を含有し凍結乾燥
    した親水性焼結多孔質物質のマトリックスからなり、該
    マトリックスは、液体と接触したときに含有試薬が該マ
    トリックスから放出されるように選択した孔径を有する
    ことを特徴とする、多孔質試薬放出システム。
  2. 【請求項２】 焼結多孔質物質が、焼結ガラス、焼結
    鋼、焼結セラミックおよび焼結プラスチックよりなる群
    から選ばれたものである請求項１に記載の多孔質試薬放
    出システム。
  3. 【請求項３】 マトリックスの孔径が、約１０ミクロン
    〜５００ミクロンである請求項１に記載の多孔質試薬放
    出システム。
  4. 【請求項４】 試薬が、抗原、抗体、組換えタンパク質
    およびプラスミドよりなる群から選ばれたものである請
    求項１に記載の多孔質試薬放出システム。
  5. 【請求項５】 試薬が、バッファー、酸、塩基、酵素お
    よび酵素基質よりなる群から選ばれたものである請求項
    １に記載の多孔質試薬放出システム。
  6. 【請求項６】 含有試薬が、(a)グルコースオキシダー
    ゼおよび４−アミノアンチピリン、(b)ペルオキシダー
    ゼおよび３,５−ジクロロ−２−ベンゼンスルホン酸、
    (c)グリセロール−ホスフェートオキシダーゼ、グリセ
    ロールキナーゼおよびリパーゼ、または(d)リパーゼ、
    西洋ワサビペルオキシダーゼおよび３,５−ジクロロ−
    ２−ベンゼンスルホン酸からなる請求項１に記載の多孔
    質試薬放出システム。
  7. 【請求項７】 少なくとも１種の試薬を含有し凍結乾燥
    した疎水性焼結多孔質物質のマトリックスからなり、該
    マトリックスは、液体と接触したときに含有試薬が該マ
    トリックスから放出されるように選択した孔径を有する
    ことを特徴とする、多孔質試薬放出システム。
  8. 【請求項８】 焼結多孔質物質が、焼結ガラス、焼結
    鋼、焼結セラミックおよび焼結プラスチックよりなる群
    から選ばれたものである請求項７に記載の多孔質試薬放
    出システム。
  9. 【請求項９】 マトリックスの孔径が、約１０ミクロン
    〜５００ミクロンである請求項７に記載の多孔質試薬放
    出システム。
  10. 【請求項１０】 試薬が、抗原、抗体、組換えタンパク
    質およびプラスミドよりなる群から選ばれたものである
    請求項７に記載の多孔質試薬放出システム。
  11. 【請求項１１】 試薬が、バッファー、酸、塩基、酵素
    および酵素基質よりなる群から選ばれたものである請求
    項７に記載の多孔質試薬放出システム。
  12. 【請求項１２】 含有試薬が、コレステロールエステル
    ヒドロラーゼ、コレステロールオキシダーゼおよび４−
    アミノアンチピリンからなる請求項７に記載の多孔質試
    薬放出システム。
  13. 【請求項１３】 多孔質試薬放出システムの製造方法で
    あって、(a)少なくとも１種の試薬成分の溶液を調製
    し、(b)上記工程(a)の溶液に既知量の焼結多孔質マトリ
    ックスを加え、(c)上記工程(b)のマトリックスを凍結
    し、ついで(d)該凍結マトリックスを凍結乾燥して、少
    なくとも１種の試薬を含有するマトリックスを得ること
    を特徴とする方法。
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