JPH0373854A - 細長い膜流れ抜け診断装置及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本出願はＡｌｂｅｒｔ　Ｅ、　Ｃｈｕ、　Ｐｅｔｅｒ　
Ｋ、　Ｃｈｕｎ及びＳｉｕ　Ｃｈｉｎ　ＣｏＹｅｕｎｇ
の名において１９８７年１０月１日に出願された係属出
願第１０３，８４５号（発明の名称二指示された流れ診
断装置及び方法）の−部継続出願である。

〔技術分野〕

本発明は液体試料中の分析物（ａｎａｌｙｔｅ）アッセ
イのための装置及び方法に関する。さらに詳しくは、本
発明は生物検体に由来する液体試料中の分析物のための
固定化された特異的結合受容体（ｒｅｃｅｐ　ｔｏｒ）
を用いる装置及び方法に関する。

〔発明の背景〕

生物検体に由来する試料中の特異物質の存在もしくは量
を決定できる′アッセイ系の開発については以前から関
心がもたれていた。過去２０年に亘って、特異的標的物
質に指向した天然に存在する受容体を用いる免疫アッセ
イが臨床上重要な物質を検出するための価値ある診断用
道具を提供してきた。先行技術には多くの免疫アッセイ
があり、そこでは免疫学的一対のひとつの成分、例えば
抗原もしくは抗体が検出し得る信号を提供する標識で標
識した相補的パートナ−を用いて検出もしくは測定され
る。

競合結合技術として知られる１つのアッセイ技術におい
ては、検出される物質は限られた数の受容体部位に対し
て同じ物質の標識した試薬と競合する。例えば液体試料
中の未知量の選ばれた抗原の検出については、既知量の
標識した抗原を試料に加え、ついでその抗原に特異的な
受容体抗体と接触−させる。抗体に結合する標識した抗
原の量は試料中の未知抗原の量に逆比例する。

サンドイッチアッセイと呼ばれる別のアッセイでは、受
容体抗体を固体表面に結合させ、ついで試料中の選ばれ
た抗原がその抗体に結合する。ついで結合した抗原に結
合し得る第２の標識された抗体を抗原と反応させ固定化
反応産物を生成させる。反応産物中の標識を試料中の抗
原の存在の表示として検出する。

サンドイッチ技術を用いる抗原の検出もしくは測定につ
いては、標識抗体及び表面上の受容体抗体の両方につい
て長年に亘って抗血清が用いられてきた。より最近では
かかるアッセイにおいて抗血清の代りにモノクローナル
抗体が用いられている。Ｗａｃｌａら、Ｃ１１ｎ、　Ｃ
ｈｅｍ、、　２８　　（９）　、　　１９８６−１９６
６　　（１９８２）に記載されたかかる系のＩつでは、
受容体抗体は特定抗原ｈＣＧの１つのサブユニットに指
向し、酵素標識モノクローナル抗体は別のサブユニット
に指向する。このアッセイでは、受容体抗体は試料を加
える試験管の内側上に固定化される。

固体表面上での反応は比較的遅い。これは固定化された
試薬と試料中の分析物の間の接触が限られているからで
ある。多孔性膜内に受容体抗体を固定化し、三次元マト
リソクス中に該抗体分子をさらすことによってアッセイ
時間が減少した。かかる系の多くにおいて、標的抗原を
含有する液体試料は膜を通して下に横たわる吸収材に引
き入れる。競合結合アッセイでの使用について記載され
たかかる系の１つは米国特許第３８８８６２９号である
。

競合もしくはサンドイッチアッセイで使用について記述
された他の系は米国特許第４２４６３３９及び４３６６
２４１を包含する。

膜の上に抗体を固定し、抗原を結合し、それを検出する
ことは、例えばサンドイッチアッセイにおいて知られて
いる。試料溶液及び試薬は膜を通して膜の他方の側の上
の吸収材に流れる。かかる系の１つは米国特許第４６３
２９０１号に記載されている。しかしながら、この型の
系をタンパク質ブロットの検出に利用できるという示唆
はない。

タンパク質プロッティングは電気泳動的に分離した生物
タンパク質試料の固定化マトリフクスへの移動と引き続
いての検出を記述するために用いられる用語である。生
物検体がタンパク質であるとき、このブロットはウェス
タンブロットと称せられる。

タンパク質の分離のための一般技術及び固定比相上での
プロッティングのための一般技術は周知である〔分子微
生物学の技術（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　　ｉｎＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬ　Ｊ、　Ｗａ
ｌｋｅｒ及びＩＡ、　Ｇａａｓｔｒｅ　（＆Ｈ）　　；
　Ｇ、　Ｂｅｒｓ及びり、　Ｇａｒｆｉｎ＋Ｂｉｏ　　
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　３巻（４）　、２７６−２８
８頁（１９８５）　　；　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　　１００
　　（１９８７）、２８１　　２８２）。

記載されている如く、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
はこの分離のための１つの適当な技術である。ニトロセ
ルロース、ＤＢＭ及びＤＰＴ紙及びイオン交換紙（例え
ばＤＥＡＥ）を包含するプロソティングマトリックスが
利用できる。ニトロセルロースは特に有効なプロンティ
ング膜である。

代表的な適用においてはタンパク質は電場の影響下にゲ
ル中を移動する。移動速度はタンパク質の電荷、大きさ
及び形に依る。ゲル中のタンパク質はついで電気泳動的
にニトロセルロース膜の如き支持媒体に移される。

プロッティングプロセス後、膜上のタンパク質を上述の
技術のいずれかで検出する。通常、抗体、及び酵素複合
体、コロイド金と抗体との複合体等の種々の標識した物
質がタンパク質を検出するのに用いられてきた。膜への
非特異的結合をさけるべく、プロッティングの特異性を
コントロールすることは困難であることが知られている
。従って、試料及び標識抗体の添加に先立って、種々の
ブロッキング剤を膜に適用してきた。共通の有効なブロ
ッキング剤は界面活性剤ツイーン−２０である。

このブロッキング剤は通常例えば０．０５％ツイーン−
２０の低い濃度で加える。

電気泳動的に分離したＨＩＶ−１ウイルスタンパク質を
含有するニトロセルロース条片がエイズ患者血清中の抗
体の検出用に市販されている。かかる技術においては、
条片を血清試料及び標識第２抗体の溶液に浸漬し、イン
キュベーション中機械的に攪拌する。通常洗浄工程がイ
ンキュベーション間に必要とされる。オーバーレイ　（
ｏｖｅｒｌａｙｓ）と呼ばれるこのタイプの操作は代表
的な場合数時間を要する。従って、この操作は労働及び
装置集中的である。

さらに、かかるタンパク質含有ニトロセルロース条片の
連続的攪拌によるインキュベーションにより、ブロット
されたタンパク質の実質的部分が膜から溶出する。この
オーバーレイ手法の他の問題点はタンパク質ブロットが
液固体界面を横切る物質輸送における拡散を制限する溶
媒の非攪拌層（ネルンスト　（Ｎｅｒｎｓ　ｔ）　）に
よって取り囲まれていることである。このため存在する
抗体がバルク溶液から拡散によって補給されるよりも早
く結合する。従って、観察される速度定数は予想される
より遅く、より遅い反応が起こる。

抗ＨＩＶ免疫プロッティングアッセイのために種々の標
識試薬が用いられてきた。代表的には、かかるアッセイ
は抗原結合１次抗体を視覚化する２次抗体を使用する。

酵素も用いられてきたが、全標識２衣抗体も用いられて
きた。

〔発明の概要〕

本発明は液体試料、特に生物検体に由来する試料中の分
析物を検出するためのアッセイ装置及び方法を提供する
。本発明の装置は標的物質に直接的にもしくは間接的に
結合することができる固定化受容体を有する多孔性反応
膜を有する。本装置はまた多孔性反応膜に隣接して位置
した、液体試料を吸収できる吸収材体をも有する。

液体試料は膜上で検出し得る反応産物を生成してアッセ
イされる。好ましいアッセイ態様においては、液体試料
は生物から取り出され（例えば尿もしくは血清）、標的
物質として、膜上に固定化された受容体によって結合さ
れる代表的には抗原、抗体またはハプテンを含有するの
ではないかという疑いがかけられる。

サンドイッチアッセイにおける選ばれた抗原の検出にお
いては、（抗原が結合する）受容体抗体試薬を膜上に固
定化する。流体試料中の標的抗原は受容体抗体に結合す
る。２次試薬である。標的抗原に結合し得る可溶性標識
抗体がついで結合抗原と反応して膜上に検出し得る反応
産物を生成する。これらの反応は同時にもしくは逐次的
に行うことができる。

本発明においては、膜上の受容体は抗原、好ましくはタ
ンパク質ブロットであり、液体試料中の結合し得る標的
物質は抗体よりなる。さらに詳しくは、好ましい抗原は
ＨＩＶウィルスタンパク質である。

本装置は、容器壁と反応膜の間のシールを定める（ｄｅ
ｆｉｎｅ）　、細長い流体出入口の周囲に配置された流
体シールを有する該流体出入口を有する。

好ましくは、反応膜は条片（ｓｔｒｉｐ）であり、流体
シール手段は容器壁から条片に向けて突き出た連続した
縁である。好ましい膜はニトロセルロース、特により好
ましくは紙で裏張りした （ｐａｐｅｒ−ｂａｃｋｅｄ）　ニトロセルロースであ
る。

本発明の別の態様は試料の添加に先立って反応膜にプロ
ソキング溶液を適用することである。特に、好ましいブ
ロソキング溶液は約１％と約２％の間のツイーン−２０
界面活性剤であり、ウシ血清アルブミンと組合せたもの
が特に有効である。

〔好ましい態様の説明〕

本発明は流体試料、特に生物検体に由来する試料中の分
析物（ａｎａｌｙｔｅ）もしくは標的物質を検出するた
めの改良されたアッセイ装置及び方法を提供する。さら
に具体的には、ホスは患者、例えばエイズ（ＡＩＤＳ）
を有することが疑われる患者の血清中の抗体をウィルス
もしくは組換えＨＩＶタンパク質、またはその部分例え
ばＥＮＶ９エンベロープタンパク質（ＧＰ１２０及びＨ
ＩＶウィルスのＧＰ４１の部分）等のその部分を用いて
検出するために有用である。

本発明の装置は液体試薬を貯蔵する、膜上でそれらの反
応をさせる、及び標的物質を検出するという組合せ機能
を発揮する。さらに具体的には、本装置は標的物質に直
接的もしくは間接的に総合できる固定化された受容体、
具体的には抗原を含有するかもしくはそれを金遣させた
多孔性反応膜を有する。本装置はまた多孔性膜の下に位
置してこれを支持する吸収材体をも有する。本装置は受
容体に隣接した流体出入口を定める頂壁を有し、また流
体出入口の周囲に配置された流体シーノベ好ましくは縁
（ｒ　ｉｍ）を有する箱様容器に形態化される。

図面に沿って説明すると、第１図は使い捨てできまたは
適当な洗浄で再使用できる本発明の代表的アッセイ装置
１０を示す。本装置は長方形で図示されているが、液体
を受は及び−時的に供給するための適当な出入口を有す
る限り、他の適当な形を採用できる。

第１〜４図について説明すると、本発明の装置は容易に
組立て分解可能な形態で示される。一般に数１０で示さ
れる本装置は、第３及び４図でもっともよく図示され、
頂壁の頂から底へ内方に傾斜する並行な細長い側壁１４
ａ及び１４ｂによって定められる液体出入口１４を有す
る頂壁１２を有する。過剰量で出入口１４に適用され、
頂壁のレベルで出入口１４の部分に入れられる液体を入
れておくため、該出入口の周囲には上方へ突き出た縁１
５が設けられる。

頂壁１２の底側に下方へ突き出した壁１６の連続した縁
１６の形態のシーリング手段が設けられる。このシーリ
ング手段は出入口１４の周囲に配置され、容器頂壁１２
の底と後記する反応膜１８の間のシールを定める。図示
されるごとく、かかるシーリング手段は出入口１４の出
口周辺に伸びる完全な連続縁１６の形態を有する。望ま
れる場合には、出入口１４を通って流れる液体が、シー
リング手段の周囲で洩れることなく、膜を通して吸収材
体２０に流れ続ける限り、他のシーリング手段も採用し
得る。

第１及び３図に示すごとく、本装置はまた吸収材２０の
囲いを定める、垂直に上方に突き出た側壁２２ａを有す
る底壁２２を有する。頂壁１２の側壁１２ａは、ぎりぎ
りの公差（許し代）で（ｉｎ　ｃｌｏｓｅ　ｔｏｌｅｒ
ａｎｃｅ）　、上方に突き出た側壁２２ａとび、ったり
合う（ｆｉｔ　ｏｖｅｒ）　ｏ頂壁１２と底壁２２は組
み合わされて出入口１４を通して以外液体に対してシー
ルされた箱様囲いを形成する。

頂壁１２と底壁２２をお互いに接触させて流体対し込め
関係に保つ安全手段として締め付は手段を用いる。図示
されるごとく、かかる締付は手段は壁１２及び２２を箱
様囲いに保持しながら同壁土を滑らかに移動する（ｓｌ
ｉｄｅ）細長いＵ形部材２４よりなる。構成部分１２．
２２及び２４はポリカーボネート、ポリエチレン、ポリ
プロピレン、ポリ塩化ビニル等の使い捨て可能なプラス
チック材料で形成されるか、または望ましく装置１ｏの
再使用を可能にする金属（例えばアルミニウム）等の耐
用材料で形成されるのが適当である。

図示されるごとく、膜手段１８は外部的に視覚化し得る
上面を有する多孔性反応膜を包含する。

反応膜は試薬及び試料成分の反応産物を反応に悪影響を
与えることなく固定化できるタイプのものならいずれの
タイプのものでもよく、液体試料の残りもしくは洗浄溶
液の通過を可能にする。適当な膜は、本発明の実施にお
いて採用される受容体試薬を固定化できるいずれかの材
料、例えばナイロン、グラスファイバーまたは選ばれた
受容体に直接的にもしくは間接的にカップリングされ得
る他の天然もしくは合成材料で形成できる。膜の多孔度
は好ましくは約０．２〜約１・２μの間である。

しかしながら、今のところ好ましい態様として、膜手段
１８は紙で裏張りしたニトロセルロース（ｐａｐｅｒ−
ｂａｃｋｅｄ　ｎ１ｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）または
同様な性質を有する他のタイプのニトロセルロース膜よ
りなる。この態様は濾紙と同様な多孔性紙で裏張りした
ニトロセルロース膜よりなる。代表例は５ｃｈｌｅｉｃ
ｈｅｒ及び５ｃｈｕｅｌｌによって商品名バッターＴ−
コート（ＢＡＣ−Ｔ−ＫＯＴＥ）の下に市販されている
。この好ましい膜はニトロセルロース単独より実質上耐
用性があり、他のいずれかの支持成分なしに採用し得る
。また、このものは反応に高められた感度を与える。ま
た、Ｍｉｃｒｏｎ　５ｅｐａ−ｒａｔｉｏｎ社によって
ニトロプラス（ＮＩＴＲＯＰＬＵＳ）の名の下に供給さ
れるが如きポリエステル支持ニトロセルロースも使用で
きる。

下記に示す如く、代表的系においては、まず結合試薬を
膜に固定化する。この試薬はアッセイすべき液体試料中
の予め定めた標的物質と反応し捕獲する。異形的には抗
体、抗原等の免疫タンパク質であるかかる試薬は吸着も
しくは共有結合によってニトロセルロース等の膜上に直
接もしくは間接的に固定化される。

膜の深さもしくは厚さは試料成分を捕獲するのに十分な
量の結合試薬が固定化されるように選択する。しかしな
がら、その厚さは液体試料の膜を通しての移動が不当に
遅延するほど大きいものであってはならない。

本装置の吸収材体２ｏは多孔性膜を通して液体を、例え
ば毛細管作用によって、引っ張ることができる既知の常
用の吸収材料のいずれであってもよい。有用な材料は酢
酸セルロース繊維、ポリエステル、ポリオレフィンまた
は他のかかる材料を包含する。市販の濾紙の層を、もし
くはトイレットペーパーの層さえも、用いることも好都
合であることが判明した。これらは本発明のアッセイ装
置いられた液体を吸収するのに十分な量を提供するよう
選ぶことができる。

本発明装置の１つの面においては、患者の血清の抗体に
ついてのウェスタンブロット分析のためにフロースルー
系（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ系）が提供される。この
系は常用のウェスタンブロットオーバーレイ技術に対し
いくつかの重要な利点を有している。このうち重要なも
のは１時間より短い時間で、より具体的には５〜１０分
もしくはより短い時間でテストを行う能力である。さら
に、テストは実験室技術者（ｌａｂ　ｔｅｃｈｎｉｃｉ
ａｎｓ）によって容易に行える。

図示されるごとく、縁１６は容器頂１ｏから、吸収材体
２０に支えられた反応膜１８の方へ突き出ている。本ユ
ニットが第３図に示す如く、閉じられていて試料の適用
に対し用意ができている場合、縁１６は膜１８の頂面に
対して、縁１６の壁と反応膜との間の実質的な洩れを防
ぐに十分な圧縮下に圧せられている。空間（ｏｐｅｎ　
５ｐａｃｅ）　　２６は縁壁１６の周囲に対し、頂壁１
２の底と吸収材体２０の頂きの間で定められる。これに
より、縁１６の周囲の洩れを防ぐことができ、液体が、
膜１８の上面に沿って流れ縁１６との接触点を通って洩
れるよりも、出入口１４及び膜１８のさらさられた領域
を通って流れることが判明した。好ましくは、縁１６は
条片の長さに沿って、膜側壁１８ａの内側で膜１８と接
触する。図示される如く、縁壁１６は膜１８との接触点
で約５ｍｍより小さい、好ましくは約３ｍｍより小さい
最大厚さを有する縁を与える。また、図示される如く、
かかる接触点は空間２６を与える接触点の外側に対し、
膜１８の上面１８ｂの実質的部分を残す。図示される如
く、かかる空間は出入口にさらされた上部膜の部分より
もより大きな領域を有する。

本発明のアッセイ装置の別の形態を第５図に示す。この
装置は機能的に第１〜４図の装置と等価であるが、多く
の繰り返し使用に役立つ構成においてより価値がある。

数３０で一般に表示されるこの装置は第１〜４図の膜１
８と同様の膜３２及び吸収材体２０と同様の吸収材体３
４を有する。

頂壁３６は長方形の形状をしており、実質的な厚みを有
し、硬質プラスチック材で形成されている。

頂壁３６は第１〜４図の下方に突き出た縁１６と同様な
シーリング手段として役立つ下方に突き出た縁４０を有
する出入口３８を定める。頂壁３８は下を切り取られて
吸収材３４が入れられる凹所３６ａを定める。

この装置はまた、これも硬質プラスチックで作られるの
が適当である平底壁４２を有する。吸収材３４は底壁４
２に載っている。

このユニットを一般的に防流体性の長方形の箱に形づく
るため締付は手段４４が用いられる。締付は手段４４は
頂壁３６に、ピボット様動きのために（ｆｏｒ　ｐｉｖ
ｏｔａｌ　ｍｏｖｅｍｅｎｔ）　、取り付けられるＵ形
アーム４６及び４８を有する。壁４６及び４８は頂壁３
６及び底壁４２に密着させるときユニットを箱様形態に
保つ。別のクランプ（締付具）５０も任意的に頂壁３６
に取り付けることができ、それより下方へ伸びている。

このものは底壁４２がその中へスライドする（ｓｌｉｄ
ｅ）角片（ａｎｇｌｅｐｉｅｃｅ）を包含する。図示さ
れた態様では、締付は手段４４は金属で形成され、頂及
び底壁３６及び４２は耐用性プラスチック材料で形成さ
れる。

ホスは試料成分が抗原、抗体もしくはハプテンをはじめ
とする免疫ペアー（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐａ
ｉｒ）の１つの成分である免疫アッセイに特に適用でき
る。免疫ペアーは免疫的にお互いに結合する２つの成分
を包含する。特定の免疫ペアーは抗原とその抗体（モノ
クローナル抗体もしくはポリクローナル抗体）、生物学
的に機能するハプテンとその体、酵素とその基質、ホル
モンとその受容体、ビタミンとその受容体、ビオチンと
アビジンもしくはビオチンの抗体、及びレシチンとその
特異的結合重、二もしくは三Ｗ！類または糖タンパク質
を包含する。

記載の簡明化のため、抗原−抗体免疫ペアーを用いる免
疫アッセイについて系を記述する。液体試料は生物由来
のもの（例えば尿もしくは血清）であり、１つの試薬は
標識した抗原もしくは抗体よりなる。

抗原の検出のためのサンドイッチアッセイについてまず
述べると、その１つの試薬は試料中の予め定めた抗原に
特異的な標識した抗体である。この系は本装置への液体
試料の添加に先立って膜ディスク２４ａ上に固定化した
、これも予め定めた抗原に特異的な捕獲抗体を第２の抗
体として用いる。モノクローナルもしくはポリクローナ
ル抗体等のタンパク質を膜ディスク２４ａ等の固体表面
に失活なしに固定化する技術は周知である（例えば５ｃ
ｈｕｕｒｓ　、米国特許第３５５１５５５号及びＭｅｎ
ｄｒｙら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、３５
．　１９８０．２８５参照）。

ナイロン等のプラスチック材料に対しては、かかるタン
パク質は共有結合によって固定化できる（例えば米国特
許第３７２０７６０号参照）。ナイロンの単位面積あた
りに固定化されるタンパク質の量はニトロセルロースの
それより大きい。

サンドイッチアッセイについて記述された標識した抗体
もしくは抗原は抗体に複合化させた（ｃｏｎ　ｊ　ｕｇ
ａ　ｔｅｄ）放射性、酵素もしくは金属錯体（ｍｅｔａ
ｌ　ｃｏｒＰｐｌｅｘ）標識をはじめとする常用のタイ
プのいすでもよい。かかる免疫物質（ｉｍｍｕｎｏｌ。

ｇｉｃａｌ　５ｕｂｓｔａｎｃｅ）と標識との間の複合
体の形成は周知である：例えば（ａ）放射性標識−米国
特許第３６４６３４６号、Ｈｕｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒ
ｅｌ　４２（１９６２）、９４５、（ｂ）酵素標識−米
国特許第３６５４０９０．３７９１９３１及び３８１７
８３８号、Ｗｉｌｓｏｎら、免疫蛍光法及び関連染色技
術（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅ　ａｎｄＲ
ｅｌａｔｅｄ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｔｑｕｅ
ｓ）、Ｋｎａｐｐ、＋　Ｗ、ら編、Ｌ、　５ｅｖｉｅｒ
−Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ、　Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃ
ａｌ出版、ニューヨークーアムステルダム、１９７８．
２１５−２２４頁、（ｃ）蛍光消滅剤標識（ｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｎｔｑｕｅｎｃｈｅｒ　１ａｂｅｌｓ）−米国
特許第３９９６３４５号、（ｄ）放射標識−米国特許第
４０６２７３３号、ｆｅ）蛍光または酵素標識−米国特
許第４０６７９５９号、（ｆ）化学発光標識（ｃｈｅｍ
ｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　１ａｂｅｌｓ）−米国特許
第４１０４０２９号、（ｇ）非酵素触媒標識−米国特許
第４１６０６４５　、（ｈｌ酵素対標識−米国特許第４
２３３４０２号、化学的に誘導した蛍光標識−米国特許
第４７２０４５０号、及び（ｉ）酵素非イオン電荷標識
−米国特許第４２８７３００号。さらに、米国特許第４
３６６２４１号に記載された標識も用い得る。また、コ
ロイド金標識を以下に詳細に論する。細胞化学マーカー
（ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍａｒｋｅｒｓ）等のプ
ローブのために有用なコロイド金複合体は顕微鏡検査法
について周知である。例えば走査電子顕微鏡検査法（Ｓ
ｃａｎｎｉ−ｎｇ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｓｃ
ｏｐｙ）　、１９８１、■、９−３１頁、「免疫細胞化
学Ｊ　　ｒＩｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔ−ｒｙ
）　、Ｐｏ１ａｋ　Ｊ、　Ｎ、ら編、Ｂｒ１ｓｔｏｌ　
、ロンドン、ボストン（１９８２）、８２−１１２頁、
及びＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ
　Ｍｅｔｈｏｄｓ　７　（１９８３）、１−１８頁参照
。他の常用のマーカーに比べ、コロイド金粒子マーカー
は使用が簡単である。例えば、それらは放射性同位元素
等の他のマーカーの検出に必要とされる器具を必要とし
ない。さらに、酵素の場合と異なり、それらは基質添加
という付帯工程を必要としない。しかしながら、それら
は市販の免疫アッセイキットにあまり用いられていない
。これはおそらく反応体の混合に常用の技術を用いるそ
れらの可視性（ｖｉｓｉｂｉｌｉｔｙ）の低レベルによ
るものと思われる。例えば、以前の膜系におけるコロイ
ド金複合体を用いるアッセイの感度は望まれる感度レベ
ルを提供するのに不十分であると思われてきた。水膜を
通しての液体試料及び試薬の流れを推進させることによ
り、感度が改善されてコロイド金粒子複合体が高価な顕
微鏡を使用することなく免疫アッセイキットの有用な試
薬となることが判明した。

水系の増加によっても金−免疫試薬（ｉｍｍｕｎｏｌ。

ｇｉｃａｌ　ｒｅａｇｅｎｔ）複合体の感度が不十分で
ある場合には、Ｈｏｌｇａｔｅ　　Ｃ，Ｓ、ら、Ｊ、　
Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃ−ｈｅｍ、　３１．
９３８　　（１９８３）及びＤａｎｃｈｅｒ　Ｇ、ら、
Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、３１．
１３９４（１９８３）”に記述されたような全錯体の感
度を高める技術を用いることができる。この系はコロイ
ド金に吸収された免疫試薬、免疫グロブリンを用いる「
間接的」技術である。金粒子は銀沈殿反応によって顕在
化される。要するに、銀量上（ｓｉｌｖｅｒ　ｅｎｈａ
ｎｃｅｍｅｎｔ）は銀イオンを銀金属に変換する写真物
理現像剤プロセスを触媒する金の触媒作用を利用する。

適当なコロイド金もしくは金ゾル粒子サイズは３〜１５
０１ｍである。この免疫金−銀染色法は銀染色なしの金
粒子の使用に比べ、２００倍までの高められた感度を与
えることができる。

本発明は競合結合技術にも適用できる。液体試料中の抗
原の検出のためのかかる系においては、免疫ペアーの対
応するメンバー、すなわち抗体を膜表面に固定化する。

試料中の検出すべき抗原分析物と同じ免疫学的性質を有
する上述の方法で標識した抗原を膜上の固定化した抗体
と接触させる。

固定化抗体は限られた量供給され、その結果試料中の抗
原と標識抗原との間で競合が起こる。かくして標識から
発せられる信号は試料中の抗原の量に逆比例する。サン
ドイッチアッセイと同様、抗原と抗体の役割を逆にして
競合結合アッセイを行うことができる。この場合、免疫
ベアーの固定化メンバーは標識化した抗体と競合する試
料中の抗体の検出のための抗原である。

上述した免疫アッセイはサンドイッチアッセイ及び競合
結合アッセイである。ホスが米国特許第４３６６２４１
号に記述された如き他の免疫アッセイにも有用であるこ
とが理解されるべきである。

分析される物質は種々の生物由来物質、例えばタンパク
質を包含する。以下はこれらの物質のいくつかのリスト
である（リストされた物質はまた免疫的に反応する抗体
及びその両分を包含する）：鬼皮ｌ旦工」ヱ ＩｇＥ、ＩｇＡＸＩｇＭＸＩｇＤ 欺生立 アエロバクタ−・アエロバクタ 好気性胞子懲戒桿菌（Ｂｕｃｉｌｌｉ）バチルス・アン
トラシス（ａｎｔｈｒａｃｉｓ）バチルス・ズブチリス バチルス・セレウス 嫌気性胞子形成桿菌 クロストリジウム・ボッリヌム（Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）
クロストリジウム・チタン（ｔｅｔａｎｉ）クロストリ
ジウム・バーフリングンス（Ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）
プルセラ菌（Ｂｒｕｃｅｌ　１ａｅ） プルセラ・メリテンシス（＋ｒ＋ｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）
プルセラ◆アボルタス（ａｂｏｒｔｕｓ）プルセラ・シ
ュイス（ｓｕｉｓ） クラミジア（ｃｈｌａｍｙｄｉａ）　（分類できな６１
寄生細菌／ウイルス）クラミジア・エイジェンツ（ａｇ
ｅｎｔｓ）　（命名不離か〉クラミジア・トラコマティ
ス（ｔｒａｃｈｏｍａｔ　ｉｓ）コリネバクテリウム属
（ｃｏｒｙｎｅｂａｉｔｅｒｉａ）コリネバクテリウム
・ジフテリエ（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）エシェリヒア
◆コリ 菌類 クリプトコツカス・ネオフォーマシス（ｎｅｏｆｏｒｍ
ａｎｓ）とストプラズマ　・　カブシュラダム（Ｈｉｓ
ｔｐｌａｓｍａ　　ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）コチジオイ
デス◆イミティス（ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ　１ｍｍ
１ｔｉｓ）キャンディダ・アルビカンス ムコール・コリンビッツ　−（ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒ）
〔アブシジア　・コリン上１ｘう（ａｂｓｉｄｉａ　　
ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）］へモフィラスーボルデテラ （）Ｉｅｍｏｐｈｉｌｕｓ−Ｐｏｒｄｅｔｅｌｌａ）群
ヘモフィラス・インフルエンゼ（ｉ　ｎｆ　１ｕａｎｚ
ａｅ）Ｈ，デュクレイー（ｄｕｃｒｅｙｉ） Ｈ，ヘモフィラス（ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｈ，エジプ
ティヵス（ａｅｇｙｐｔ　１ｃｕｓ）Ｈ，パラインフル
エンゼ（ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ケンブシーラ
・二ｘ−モニエ（ｋｅｉｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ）ミコバクテリア属 ミコバクテリウム・チュペキニロシス・ホミニス（ｔｕ
ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ｈｏｍｉｎｉｓ）ミコバクテリ
ウム・ボビス（ｂｏｖｉｓ）ミコバクテリウム・アビウ
ム（ａｖｉｕｍ）ミコバクテリウム・レプレ（ｌｅｐｒ
ａｅ）ミコバクテリウム・パラチュベキュロシスミコプ
ラズマ属 ミコプラズマ・ニューモニエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）
ミコプラズマ・ホミニス ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｅ）ナイセリア・メ
ニンギテイダイス　（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　　ｍｅｎｉ
ｎｇｉｔｉｄｉｓ）ナイセリア・ゴル−エ（ｇｏｎｏｒ
ｒｂｅａｅ）他の病原体 リステリア　・　モノサイトゲン　（ｈｉｓｔｅｒｉａ
　　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｓ）バスチューレラ属（Ｐ
ａｓｔｅｕｒｅｌｌａｅ）バスチュートラ・ベステイス
（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　−ｐｅｓｔｉｓ）パスチュ
ートラ・マルトシダ（ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）ニューモコ
ソカス属（肺炎双球菌、ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ）ジブ
ロプフカス　・ニュモニエ（Ｄｉｐｒｏｃｏｃｃｕｓ　
　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）シュードモナス・エルギノー
ザ リケソチア属（細菌様寄性菌） リ　ケ　ソチア・プロヴアゼキー（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉ
ａ　　ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）リケッチア・モーゼリ　
（ｍｏｏｓｅｒｉ）リケッチア・リケソチー（ｒｔｃｋ
ｅｔｔｓｉｉ）リケッチア・コノリ（ｃｏｎｏｒｉ） リケッチア・オーストラリス（ａｕｓ　ｔｒａ　ｌ　ｉ
ｓ）リケッチア・ツツガムシ リケッチア・ブルネッティー（Ｂｕｒｒｅｔ　ｉ　ｉ）
サルモネラ＝コレレサス（ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｓ）サ
ルモネラ・ティフィムルタム（ｔｙｐｈｉｍｕｒｔｕｍ
）サルモネラ・タイホーサ（ｔｙｐｈｏｓａ）シゲラ　
・アラビノタルト−（ｓｈｉｇｅｌｌａ　　ａｒａｂｉ
ｎｏｔａｒｄｏ）シゲラ・ボイディー（ｈｏｙｄｉｉ） シゲラ・デイセンテリｘ　（ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）
シゲラ・フレックスネリ　（ｆｌｅｘｎｅｉＤシゲラ・
シュミットジー（ｓｃｈｍｉｔｚｉｉ）シゲラ・ゾネイ
　（ｓｏｎｎｅｉ） スタフィロコッカス属 スタフィロコッカス・アウレウス スタフィロコッカス・アルバス（ａｌｂｕｓ）ストレプ
トコツカス属 ストレプトコッカス・ピオゲネス（ｐｙｏｇｅｎｅｓ）
グループＢ５Ｃ５Ｄ、Ｆ、Ｇ スピロヘータ トレポネー？−パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｐａｌ
ｌｉｄｕｍ）ボレ　リ　ア・リカレンチイス（Ｂｏｒｎ
ｅｌｉａ　　ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ）レプトスピラ・
イクテロヘモラージエ （Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ　　ｉｃｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒ
ｈａｇｉａｅ）レプトスラ・カニコーラ（ｃａｎｉｃｏ
ｌａ）トキソプラズマ・ボンデ４−　（Ｔｏｘｏｐｌａ
ｓｍａ　ｇｏｎｄｉｉ）ペプチド　びタンパク　ホルモ
ン コルチコ　ト　口　ビン　（へＣＴＨ）（アドレノコル
チコトＵピンネルモン）卵胞刺激ホルモン 黄体形成ホルモン（間質細胞刺激ホルモン）副甲状腺ホ
ルモン プロラクチン 絨毛性ゴナドトロピン インシュリン トラキシン ソマトロビン トリョードチロニン チロカルシトニン チロキシン 恩Ａ目ソヒＬ乙 アンギオテンシンＩ及び■ ブラジキニン ガストリン ヒト胎盤ラクトゲン セクレチン ペプチドホルモン オキシトシン、バソプレシン ウィルス アデノウィルス アルボウィルス イースタンウマユーセファリテイスウイルス（Ｅａｓｔ
ａｒｎ　Ｅｑｕｉｎｅ　Ｅｕｃｓｐｈａｌｉｔｉｓ　Ｖ
ｉｒｕｓ）ウエスタンウマユーセファリテイスウイルス
シンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルスセムリキフォレ
スト（Ｓｅｍｌｉｋｉ　Ｆｏｒｅｓｔ）ウィルスセント
ルイス脳炎ウィルス カリホルニア脳炎ウィルス コロラドマダニ熱病（Ｔｉｃｋ　Ｆｅｖｅｒ）ウィルス
黄熱病ウィルス デング（Ｄｅｎｇｕｅ）ウィルス 肝炎 Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウイルス ヘルペスウィルス 単純ヘルペス　Ｉ型及び■型 水痘 サイトメガロウィルス ミクソウィルス インフルエンザ（Ａ、Ｂ及びＣ型〉 パラインフルエンザ（１−４） おたふくかぜウィルス ニューキラスル病つィルス イヌジステンパーウィルス 呼吸合胞体（Ｒｅｓｐｉｒ、ａｔｏｒｙ　５ｙｎｃｙｔ
ｉａｌ）ウィルス風疹ウィルス ピコルナウィルス ポリオウィルス コクサソキーウイルス ＥＣＨ○ウィルス 鼻炎ウィルス属（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）ポックスウィ
ルス ワクシリア 伝染性軟属腫（Ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ　ｃｏｎｔａｇｉｏ
ｓｕｍ）水系は免疫アッセイに分類されない他のアッセ
イ系、例えば未知ＤＮＡ配列の検出にも適用できる。例
えば、未知のＤＮＡ配列を含む液体試料を膜に通し、膜
上にすでに固定化したＤＮＡと接触させることによって
膜上に固定化する。ついで標識ＤＮＡプローブを液体中
で膜に通する。ハイブリダイゼーションが起これば、標
識ＤＮＡプローブは検出し得る形態で膜表面に保持され
る。この系はＰｏ１ｓｋｙ−Ｃｙｎｋｉｎ　Ｒｏら、Ｃ
ｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、　　３１／　９．１４３８　　（１
９８５）に記述されている。

上述のごとく、１つのアッセイでは、免疫試薬は点とし
て現れる、膜上の少なくとも１つの決まった領域に濃縮
されるが、この点は実際は点とほぼ等しい直径のカラム
の形で膜中に拡がっている。

サンドイッチもしくは競合結合技術についていえば、こ
れは、捕獲免疫試薬、例えば抗原もしくは抗体を膜厚を
通して流して固定化することによって該試薬をかかる領
域にのみ固定化することによって達せられる。試料成分
との及び標識試薬との反応はこの領においてのみ起こる
。

点アプローチ（ｔｈｅ　ｄｏｔ　ａｐｐｒｏａｃｈ）は
下記に記すごとくある種の利点、例えば単一の装置で多
重の同時アッセイが行えるという利点を有する。また、
この方法は最終物（ｅｎｄ　ｐｅｓｄｕｃｔ）が単一領
域で濃縮されるのでより明瞭な最終物信号を与える。

点アプローチは別の利点は１つの試料中の多くの成分の
同時検出を可能にすることである。例えば、１つのアッ
セイ装置で予め定めた別個の抗原に特異的な２つの異な
る抗体を膜上の別々の位置（ｓｐｏｔｓ）に固定化でき
る。ついで抗原のいずれ１つを含有する疑いがある試料
を膜と及び２つの異なる膜に特異的な標識抗体とに接触
させる。点の一方もしくは他方で標識によって生み出さ
れた信号は抗原の一方もしくは両方の存在もしくは不存
在を示す。点（ｔｈｅ　ｄｏｔｓ）はお互いにそれらの
位置によってもしくは各固定化された抗体点付近の同定
によって区別できる。かくして、例えば、最初の点で色
が現れるが２番目では現れない場合、最初の抗原は存在
するが２番目の抗原は存在しない。両方の点が現れる場
合には両方の抗原が存在し、何の点も現れない場合には
どちらの抗原も存在しない。別法として、各点で異なる
色を生ずるよう標識を選ぶことができる。

この系は膜上の対応する数の固定化免疫試薬によって２
つ以上の液体試料成分の同時検出を含むよう拡張できる
。ある場合には、第１の抗体はいくつかの異なる抗体の
特定のサブユニットと反応する。第２の抗体が１つの抗
原のサブユニットに対してのみ特異的である場合には、
かかる第２の抗体は固定化抗体として用いることができ
、単一標識した最初の抗体は問題の抗原に対しての普遍
的に標識した抗体として用いることができる。

本発明の装置を用いるといくつかの利点がある。

１つの利点は細長い条片膜及びそれと合わせた（ｉｎ　
ｒｅｇｉｓｔｒｙ　ｗｉｔｈ　ｉｔ）細長い出入口の使
用である。これにより本装置はウェスタンブロット等の
細長い分離タンパク質の分析に適したものとなる。

また、間隔をあけ多重点ブロン）　（ｓｐａｃｅｄｍｕ
ｌｔｉｐｌｅ　ｌｏｔ　ｂｌｏｔｓ）の使用により、膜
に適用される試料の濃度を単に本装置を傾け、細長い出
入口の上端に試料を適用することによって線系変化させ
ることが可能となる。下端の点は頂部の点より高い濃度
を受ける。

常用の免疫アソセイの標準的プロトコルを本発明に用い
ることができる。例えば、サンドイソチアソセイでは試
料及び標識試薬の添加の順序は同時または逐次的である
。

ポリクローナル抗体に比しモノクローナル抗体は既知の
利点及び純度を有するが、本発明ではどちらの型の免疫
試薬も使用可能である。

上記系はイエス−ノ一定量テスト（ｙｅｓ　−ｎ。

ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｔｅｓｔ）に関して記述し
たが、分析する成分の異なる既知濃度で生成する適当な
信号、例えば色を用いる半定量的テストとしても上記系
は適している。かくして、例えば、サンドインチ技術に
よる抗原の分析については、特定の希釈度（ｃｌ　ｉ　
ｌｕ　ｔ　１ｏｎ）に対して予想される色の近似を得る
ために漸進的な（ｐｒｏｇｒｅｓｓｔｖｅ）希釈度で系
を行うことができる。未知濃度の抗原はこれらの色と比
較して、試料中の抗原の濃度の近似値を与える。

本発明の１つの面は予め膜条片上に固定化したウェスタ
ンブロットタンパク質に対する未知試料、特に血清中の
抗体の検出のためのフルースロー装置の使用である。例
えば、組換えタンパク質についてのＨＩ　Ｖ　溶解物（
Ｉｙｓａ　ｔｅ）のウェスタンブロットは商標（１）バ
イオチク／デュポン（Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｄｕｐｏｎｔ）
　ＨＩ　Ｖウェスタンブロットキット〔Ｅ。

■、デュポンデネモースアンドカンパニー（Ｅ。

Ｉ　、　ＤｕＰｏｎｔ　ＤｅＮｅｍｏｕｒｓ　＆　Ｃｏ
、）社、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ。

プラウエアー〕、（２）ノボバス（ＮＯＶＯＰＡＴＨ”
）条片〔パイラッド（ＢｉｏＲａｄ）　、Ｈｅｒｃｕｌ
ｅｓ、カリフォルニア、または（３１Ｅ　Ｐ　Ｉブロッ
ト−ＨＩＶウェスタンブロット条片〔エピトープ（Ｅｐ
ｉｔｏｐｅ）社、Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ　％オレゴン〕の
下に市販されている。

オーバレイに代りフロースルー装置を使用することによ
り、技術者の時間及び実験室装置の驚くべき節約が可能
になる。より具体的にいうと、フロースルーエイズテス
トは実質上１時間より早く行うことができる。より具体
的には、オーバーレイ操作で用いられる機械的攪拌の必
要なしに１０分より短い時間から５分程の時間で行うこ
とができる。

本発明の別の面は紙で裏張りしたニトロセルロースの使
用がある有意な利点を示すという発見である。例えば、
ＨＩＶウェスタンブロットを用い、コロイド金複合体を
用いる抗体についてのテストでは、正の強度と背景の強
度との間の差（「正味強度」〉に実質的増加がある。

本発明の別の面は正味強度を有意に増加させる、ＨＩＶ
ウェスタンブロットのためのあるブロッキング剤の使用
である。具体的には、溶液中Ｉ〜２％の濃度でのツイー
ン２０界面活性剤の使用がかかる正味強度を劇的に増加
させる。かかるツイーン２０の最適量は１．５％程度で
ある。その性能はブロッキング溶液にウシ血清アルブミ
ン（Ｂ　Ｓ　Ａ）、ゼラチン、カゼイン等の常用の非干
渉性ブロッキングタンパク質を添加することによって増
加する。

好ましくは、ウシ血清アルブミンはブロッキング溶液の
約０．５〜約１．５％の濃度で存在させるべきである。

ＨＩＶウェスタンブロットに対する患者血清中の抗体を
検出する本発明方法を行うのに適した一般的方法は以下
の如くである。最初、ＨＩＶウェスタンブロットを含有
する条片を第１〜４図の装置の吸収剤材料上に置く。つ
いで頂壁を底壁上に軽く置＜　　（ｂｅ　５ｌｉｄ　ｏ
ｖｅｒ）　ｏその結果、縁１６が祇裏張りニトロセルロ
ース膜１８の上面に対し下方に圧することになる。底壁
の側壁と頂壁の対応する側壁とを重ねた状態で、Ｕ形部
材２４を用いて系を液体が洩れないようにした箱様囲い
に保つ。

ついでブロッキング溶液を膜１６に適用する。

この場合、溶液は膜の上面に適用され、吸収剤体２０の
影響で膜を通して引っ張られる。上述した如く、特に有
効なブロッキング溶液は水をベースにし、１〜２％のツ
イーン２０及び、約０．５〜約１．５％の濃度で非干渉
性ブロソキングタンパク質、例えばＢＳＡ、カゼインも
しくはゼラチンを含有する。

ついで、希釈されていない患者血清の形態での試料を膜
の上に適用する。試料は約１５〜３０秒で膜を通して流
れる。

ついで洗浄液を約１５〜３０秒通すことによって膜を洗
浄する°。洗浄液はプロフキング溶液と同じ溶液よりな
るか、または他の既知の洗浄液、例えば低イオン強度緩
衝液（例えば２０ｍＭ以下）もしくは脱イオン水よりな
る。

ついで、患者血清中の選ばれた抗体と反応する標識複合
体を加える。好ましい態様においては、複合体は標識と
してコロイド金を有するプロティンＡよりなる。別法と
しである種の適用のため酵素もしくは放射性標識等の他
の標識も用い得る。

最終工程においては別の洗浄液を膜に適用する。

本発明の実施の具体例を例示的に以下の実施例で示す。

大旌班−よ これは第１〜４図のアッセイ装置を用いるウェスタンブ
ロットアッセイである。

ウィルスタンパク質８００微生物１−を含有するＨＩＶ
−１ウイルス溶解物を２％ＳＤＳ、２０％スクロース及
び０．０１％ブロモフェノールブルートラッキング（ｔ
ｒａｃｋ　ｉ　ｎｇ）染料を含有するｐＨ６，８の０．
１　Ｍ　）リスーＨ（ｌ緩衝液の等容量と混合した。こ
のン容液４０μｌをレンメリ　（Ｌａｅｍｍｅｌｉ　）
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１０％アクリルアミ
ド）の穴に入れた。電気泳動緩衝剤系及び操作条件はレ
ンメリのそれと同じであった（レンメリ、１９７０　　
Ｎａｔｕｒｅ　　２２７．６８０〜６８５）。

トラッキング染料がゲルの底に達したときに電気泳動操
作を終了させた。ゲルを取り出し、バイオラッドトラン
スブロット（Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ）マニュアルに記述し
たようにして洗浄したくバイオランド研究所社、Ｈｅｒ
ｃｕｌｅｓ＋　カリフォルニア）。ついでゲル中のタン
パク質をバイオラッドトランスブロット装置を用いて紙
裏張りニトロセルロースに移した。用いたプロトコル及
び試薬はトランスブロット操作マニュアルに記述した通
りであった。電気泳動ブロッティングは３０Ｖの一定電
圧下で一夜行った。ブロットを移した紙裏張りニトロセ
ルロースをついで２枚の吸収剤濾紙の間に置き一夜乾燥
させた。

ウィルスタンパク質が存在したレーンに相当するシート
から条片を切り出し、第１〜４図の濾過装置にセットし
た。

１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）中に２％ｖ／ｖン
イーン２０，０．１５Ｍ塩化ナトリウム及び１％ｗ／ｖ
ウシ血清アルブミンを含有する緩衝液０．５−を加え、
膜を通して流して残りの反応性部位をブロフクした。漿
液陽性の（ｓｅｒｏｐｏｓｉ　ｔｉｖｅ）ヒト血清試料
〔バイオチック・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
　）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　、　ＭＤからのコントロー
ル物質）０．３−を加え、膜を通して流れさせた。膜洗
浄のため同じ緩衝液　０．３−を加え流れ入るにまかせ
、ついで脱イオン水０．３−を加えた。ついでプロティ
ンＡコロイド金の溶液０．４ｄを加えて膜中に流れさせ
た（粒子サイズ１５ｎｍ及び波長５２０　ｎｍでの光学
密度２．５のプロティンＡコロイド金はＥ−Ｙラボラト
リ−社より人手し得る）。ついで、最終洗浄として脱イ
オン水０．４−を流れ込ませた。

漿液陽性を示すに必要な土寄は明瞭な赤色バンドとして
現れた。最初の緩衝液の添加から帯の展開時までの全操
作に５分要した。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のアッセイ装置の分解組立図である。 第２図は第１図のアッセイ装置の平面図である。 第３図は線３−３に沿って見た、第２図のアッセイ装置
の拡大横断面図である。 第４図は第３図のアッセイ装置の部分拡大図であり、膜
及びシールを詳細に示す。 第５図は本発明のアッセイ装置の別の態様である。 図面番号の説明 １８・・・・・・反応膜、 ２０・・・・・・吸収剤体 ４６８− 手 続 補 正 書 （方式） １、事件の表示 平成２年特許願第１３６９１１号 ２、発明の名称 細長い膜流れ抜は診断装置及び方法 ３、補正をする者 事件との関係 出 願 人 ４、代 理 人 ５、？ｉｌｉ正命令の日付 平成２年８月２８日 ４６９−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、結合し得る標的物質を含有する疑いがある液体試料
   中の該物質の検出及び／または測定のためのアッセイに
   使用する貯蔵及び反応装置であって、 （ａ）上面及び下面（少なくとも上面には該結合し得る
   物質に直接もしくは間接に結合できる受容体を固定化さ
   せている）を有する液体透過性多孔性反応部材、 （ｂ）該反応膜の下面に隣接して位置した表面を有する
   、液体を吸収できる吸収材体、及び （ｃ）該反応膜及び吸収材のための容器手段であって、
   該受容体に隣接した液体出入口を定める頂壁を含み、及
   び該容器頂壁と反応膜の間のシールを定める、液体出入
   口の周囲に配置された液体シール手段を含む（該頂壁及
   び膜は該シール手段の周囲に対する開かれた空間よりな
   る貯蔵及び反応装置。 ２、シール手段が容器頂壁から反応膜の方へ突き出した
   連続した縁よりなり、縁と反応膜とが縁の反応膜の間の
   実質的な洩れを防ぐに十分な圧縮下に接触している請求
   項１の貯蔵及び反応装置。 ３、反応膜が条片の形態にあり、流体出入口が細長い溝
   穴よりなり、及び縁がある位置で条片と接触して該開か
   れた空間にさらされた条片の部分を残す請求項１の貯蔵
   及び反応装置。 ４、受容体が条片に沿って広がったウェスタンタンパク
   質ブロットよりなり、標的物質が抗体よりなる請求項３
   の貯蔵及び反応装置。 ５、該抗原が多数の区切られたタンパク質点ブロットよ
   りなる請求項１の貯蔵及び反応装置。 ６、縁の巾が約５ｍより短い請求項３の貯蔵及び反応装
   置。 ７、多孔性膜がニトロセルロースよりなる請求項１の貯
   蔵及び反応装置。 ８、多孔性膜が吸収材体に面した少なくとも１つの液体
   透過性支持材に結合したニトロセルロース膜よりなる請
   求項１の貯蔵及び反応装置。 ９、支持材が紙、ファイバーグラスまたはポリエステル
   である請求項７の貯蔵及び反応装置。 １０、反応膜が吸収材体上に載っており、容器手段から
   容易に外し得る請求項１の貯蔵及び反応装置。 １１、容器頂壁が容器手段に取り外し可能に取り付けら
   れている請求項１の貯蔵及び反応装置。 １２、結合し得る標的物質を含有する疑いがある液体試
   料中の該物質の検出及び／または測定のためのアッセイ
   に使用する貯蔵及び反応装置であって、 （ａ）上面及び下面（少なくとも上面には該結合し得る
   物質に直接もしくは間接に結合できる受容体を固定化さ
   せている）を有する液体透過性多孔性反応条片、 （ｂ）該反応膜の下面に隣接して位置した表面を有する
   、液体を吸収できる吸収材体、及び （ｃ）該反応膜及び吸収材のための容器手段であって、
   該受容体に隣接した細長い溝穴の液体出入口を定める頂
   壁を含み、及び該容器頂壁と反応膜の間のシールを定め
   る、液体出入口の周囲に配置された液体シール手段を含
   む （該頂壁及び膜は該シール手段の周囲に対する開かれた
   空間を定め、該シール手段が容器頂壁から反応膜の方へ
   突き出した連続した縁よりなり、縁と反応膜とが縁の反
   応膜の間の実質的な洩れを防ぐに十分な圧縮下に接触し
   ている）容器手段 よりなる貯蔵及び反応装置。 １３、結合し得る標的抗体を含有する疑いがある液体サ
   ンプル中の該抗体の検出及び／または測定のためのアッ
   セイであって、アッセイ装置として、 （ａ）上面及び下面（少なくとも上面には該結合し得る
   物質に直接もしくは間接に結合できる、ウェスタンブロ
   ットタンパク質抗原よりなる受容体を固定化させている
   ）を有する液体透過性多孔性反応部材、 （ｂ）該反応膜の下面に隣接して位置した表面を有する
   、液体を吸収できる吸収材体、及び （ｃ）該反応膜及び吸収材のための容器手段であって、
   該受容体に隣接した出入口を定める壁を含み、液体出入
   口の周囲に配置された液体シール手段を含み、及び該容
   器壁と反応膜の間のシールを定める容器手段 よりなる装置を用い、 該透過性反応膜の上面に試料、認識し得る標識物質及び
   他の試薬を適用して適用された液体を該流体出入口及び
   膜下面に浸透させて吸収体に至らしめ、ついで該上面上
   の結合し得る物質に結合した標的物質の存在もしくは不
   存在の表示として該上面に結合した標識物質を検出する
   ことを特徴とするアッセイ。 １４、シール手段が容器頂壁から反応膜の方へ突き出し
   た連続した縁よりなり、縁と反応膜とが縁の反応膜の間
   の実質的な洩れを防ぐに十分な圧縮下に接触している請
   求項１３のアッセイ。 １５、多孔性反応膜がニトロセルロースよりなる請求項
   １３のアッセイ。 １６、多孔性膜が吸収材体に面した少なくとも１つの液
   体透過性支持体に結合したニトロセルロース膜よりなる
   請求項１３のアッセイ。 １７、標識がコロイド金よりなる請求項１３のアッセイ
   。 １８、１０分より少ない時間で行われる請求項１３のア
   ッセイ。 １９、タンパク質ブロットがＨＩＶタンパク質よりなる
   請求項１３のアッセイ。 ２０、ＨＩＶタンパク質が組換えＨＩＶタンパク質より
   なる請求項１９のアッセイ。 ２１、ＨＩＶタンパク質がウィルス溶解物よりなる請求
   項１９のアッセイ。 ２２、標識物質の添加に先立って、約１％と約２％の間
   のツイーン２０界面活性剤よりなるブロッキング剤を反
   応膜に加える請求項１３のアッセイ。 ２３、ブロッキング剤が界面活性剤と非干渉性ブロッキ
   ングタンパク質血清アルブミンの組合せよりなる請求項
   １３のアッセイ。 ２４、結合し得る標的抗体を含有する疑いがある液体サ
   ンプル中の該抗体の検出及び／または測定のためのアッ
   セイであって、アッセイ装置として、上面及び下面（少
   なくとも上面には該結合し得る物質に直接もしくは間接
   に結合できる、タンパク質抗原よりなる受容体を固定さ
   せている）を有する液体透過性多孔性ニトロセルロース
   反応部材；該反応膜の下面に隣接して位置した表面を有
   する、液体を吸収できる吸収材体；及び該反応膜及び吸
   収材のための容器手段であって、該受容体に隣接した出
   入口を定める壁を含み、液体出入口の周囲に配置された
   液体シール手段を含み、及び該容器壁と反応膜の間のシ
   ールを定める容器手段よりなる装置を用い、 （ａ）該反応膜に約１％と約２％の間のツイーン２０界
   面活性剤及び約０．５％と約１．５％の間の非干渉性タ
   ンパク質を含有するブロッキング溶液を適用し、 （ｂ）該透過性反応膜の上面に試料、認識し得る標識物
   質及び他の試薬を適用して適用された液体を該流体出入
   口及び膜下面に浸透させて吸収体に至らしめ、ついで （ｃ）該上面上の結合し得る物質に結合した標的物質の
   存在もしくは不存在の表示として該上面に結合した標識
   物質を検出する ことを特徴とするアッセイ。 ２５、非干渉性タンパク質がウシ血清アルブミンよりな
   る請求項２４のアッセイ。