JP2001013146A - 免疫クロマトグラフィー用試験片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】イムノアッセイに好適であり、簡便で、かつ高
感度な非特異的反応の少ない検出を可能にする免疫クロ
マトグラフィー用試験片を提供すること。 【解決手段】被検物質に対する抗体中のＦｃフラグメン
トを欠失した抗原結合性フラグメントを固定相として有
する免疫クロマトグラフィー用試験片。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、イムノアッセイに
好適であり、かつ非特異的反応を低減させうる免疫クロ
マトグラフィー試験片に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年問題となっている大腸菌Ｏ１５７を
はじめとする病原性微生物などの食品中や患者からの検
出は、多くの日数、煩雑な操作を要する場合がある。さ
らに、疾患によってはより迅速な診断が要求される場合
も多い。これらの診断には、標識化免疫測定法などの種
々の免疫測定法（イムノアッセイ）が好適に用いられて
いる。近年になり迅速かつ簡便にイムノアッセイが行え
る方法として、免疫クロマトグラフ法が注目されている
が、簡便性、感度などの点において十分なものが得られ
ていないのが現状である。

【０００３】従来の免疫クロマトグラフィーにおける被
検物質の検出においては、ニトロセルロース膜などを基
材として、該基材に抗体を固定化した試験片が用いら
れ、かかる試験片に固定化された抗体により被検物質を
捕捉し、生じた被検物質−抗体複合体を検出することに
より行なわれる。しかしながら、用いる抗体のロット
や、測定条件によっては試験片に固定化する抗体は被検
物質以外の物質との非特異的反応により、被検物質を特
異的に検出することができない場合がある。したがっ
て、非特異的反応を低減させる技術が求められている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、イムノアッ
セイに好適であり、簡便で、かつ高感度な非特異的反応
の少ない検出を可能にする免疫クロマトグラフィー用試
験片を提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、被検物
質に対する抗体のＦｃフラグメントを欠失した抗原結合
性フラグメントを固定相として有する免疫クロマトグラ
フィー用試験片に関する。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明の免疫クロマトグラフィー
用試験片は、被検物質に対する抗体のＦｃフラグメント
を欠失した抗原結合性フラグメントを有する。本発明で
はＦｃフラグメントを欠失した抗原結合性フラグメント
を固定相として用いているため、被検物質に対する特異
性を有しながら、被検物質以外の物質との非特異的反応
を起こしにくいという優れた性質を発現する。したがっ
て、本発明の免疫クロマトグラフィー用試験片によれ
ば、用いる抗体のロットや測定条件によらず、簡便で、
かつ高感度な非特異的反応の少ない検出ができるという
優れた効果を発揮する。

【０００７】本明細書において、「被検物質」とは、免
疫化学的反応（すなわち抗原抗体反応）により抗体と結
合してサンドイッチ免疫複合体を形成し得るものであれ
ば特に制限されない。例えば、細菌（特に大腸菌Ｏ１５
７、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌等の病原性細菌）、
放線菌、酵母、かび、ウイルス（特に、ＨＩＶ、ＨＢ
Ｖ、ＨＣＶ等）などの微生物またはそれらに対する抗
体、細菌等が産生する毒素、あるいは腫瘍マーカー抗原
などの生体試料中の抗原性ペプチド等が挙げられる。

【０００８】前記被検物質を含有する被検液としては、
例えば、食品から抽出した溶液やその培養上清、便懸濁
（溶解）液、血漿、血清、血液、尿、唾液などの液体試
料、あるいはこれらを適当な緩衝液によって希釈してな
る希釈液が使用される。

【０００９】本発明において、Ｆｃフラグメントを欠失
した抗原結合性フラグメントとは、被検物質に対して特
異的な結合性を有する抗体フラグメントであり、Ｆｃフ
ラグメントを欠失したものを意味し、具体的には、Ｆ
（ａｂ’）₂ 、Ｆａｂなどが挙げられ、さらに、前記抗
体の軽鎖由来の可変領域と重鎖由来の可変領域と自由度
の高いペプチド配列とからなる単鎖抗体であってもよ
い。

【００１０】前記抗原結合性フラグメントＦ（ａｂ’）
₂ およびＦａｂは、抗体のＦｃフラグメントを切断する
ことにより作製することができる。具体的には、抗体を
ペプシンを用いて切断し、得られた断片を精製すること
によりＦ（ａｂ’）₂ フラグメントを得ることができ、
抗体をパパインを用いて切断し、得られた断片を精製す
ることによりＦａｂフラグメントを得ることができる。
また、単鎖抗体は、慣用の手法により作製しうる。

【００１１】本発明の免疫クロマトグラフィー用試験片
は、基材上に固定相として前記抗原結合性フラグメント
を有する。

【００１２】また、複数の被検物質を同時に検出する場
合には、数種類の被検物質にそれぞれ特異的に結合する
数種類の抗原結合性フラグメントを試験片に固定し、複
数の固定相を設けることにより実施できる。

【００１３】基材における抗原結合性フラグメントの固
定量は、通常、０．００１〜１０ｍｇ／ｃｍ² 程度であ
る。

【００１４】本発明に用いられる基材としては、吸水性
基材が挙げられ、被検物質を含有した被検液を吸収でき
る基材、またはこれらを緩衝液によって希釈した希釈液
を吸収しうる基材であればよい。具体的には、例えば、
不織布、濾紙、ガラス繊維布、ガラスフィルター、ニト
ロセルロース、多孔質材料等が挙げられる。これらの基
材は、適度な吸水速度を有するとともに、後述の色を有
する担体を用いた場合、担体が凝集して発色した際の目
視確認性に優れる。

【００１５】本発明における基材の吸水性の程度は、５
ｍｍ幅の短冊状に裁断した基材の片端部に水を浸漬し、
１分間経過後の吸水距離が０．５〜５ｃｍ程度のものが
好ましい。

【００１６】また、これらの基材の吸水性を調整するた
めに、基材の表面に親水性重合体を被覆することもで
き、あるいは基材を親水性重合体に浸漬させることもで
きる。さらに、本発明においては基材として同一材料か
らなる基材、あるいは異種の材料からなる基材の端面を
任意の接着手段によって互いに接合して得た連続した基
材を用いることもできる。

【００１７】本発明において、基材の形状は被検液を展
開できる形状であれば特に限定されるものではなく、例
えば、矩形のシート状（片状）やロッド状等が好まし
い。

【００１８】基材と抗原結合性フラグメントとは、公知
の物理吸着法、共有結合法などにより固定することがで
きる。抗原結合性フラグメントと親水性重合体とを含む
溶液を吸水性基材に塗布した後、該親水性重合体を凝固
させる凝固溶剤に浸漬することで固定相を作製すること
もできる。親水性重合体としては、ヒドロキシプロピル
メチルセルロース、ポリビニルアルコール、ヒドロキシ
エチルセルロースなどが挙げられる。凝固溶剤として
は、アセトン、エタノール、メタノール、エーテルなど
が挙げられる。

【００１９】さらに、前記基材への非特異的吸着の低
減、展開の容易性、および基材に固定化した抗原結合性
フラグメントの安定性の効果を十分に発揮させる観点か
ら、タンパク質、界面活性剤および糖を含有した溶液で
処理してもよい。ここで、使用されるタンパク質として
は、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、スキム
ミルク等が例示され、界面活性剤としては、ポリオキシ
エチレン（１０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキ
シエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチ
レンアルキルアリルエーテルリン酸エステル、ポリオキ
シエチレンアルキルエーテルリン酸エステル、ポリオキ
シエチレンアルキルフェニルエーテル等が例示され、糖
としては、グルコース、トレハロース、サッカロース等
が例示される。

【００２０】処理液中のタンパク質の含有量は、十分な
効果を発揮させる観点から、好ましくは０．１〜１０重
量％であり界面活性剤の含有量は、好ましくは０．０１
〜１重量％であり、糖の含有量は、０．１〜１０重量％
である。

【００２１】本発明の免疫クロマトグラフィー用試験片
には、被検液を供するための試料受領部を有していても
よい。

【００２２】試料受領部とは、被検液を添加できるもの
であれば特に限定されないが、吸水性基材そのものでも
水溶液を一時的に貯留できる吸水パッドを用いてもよ
い。吸水パッドとしては、例えばポリエステル、レーヨ
ン、ポリプロピレン、セルロース、パルプなどからなる
不織布などが例示される。

【００２３】試料受領部の大きさとしては、縦および横
が、それぞれ３〜１０ｍｍ程度で、厚さは０．１〜５ｍ
ｍ程度が好ましい。

【００２４】前記試料受領部は、基材上の一端またはそ
の近傍に設置される。設置方法としては、基材上に置い
て、試験片の収納ケースにより物理的に押さえてもよい
し、糊剤などで接着してもよい。

【００２５】本発明の免疫クロマトグラフィー用試験片
において、展開移動距離は、固定相での発色の均一性お
よび発色感度の観点から、０．５ｃｍ以上、好ましくは
１ｃｍ以上となり、固定相までの被検液の到達性、発色
感度および測定時間の観点から、６ｃｍ以下、好ましく
は４ｃｍ以下となるように設定されていることが好まし
い。本発明に用いる試験片は、前記展開移動距離を得る
ように、試料受領部、抗原結合性フラグメントを固定し
た固定相などを配置すればよい。

【００２６】本発明の免疫クロマトグラフィー用試験片
には、前記固定相および試料受領部の他に、必要に応
じ、標識相、吸水パッドなどを配置してもよい。ここ
で、標識相とは、固定相に用いた抗原結合性フラグメン
トとは異なる部分に対する特異的結合体を液体成分の接
触により容易に離脱するように保持させた部分をいう。
また、吸水パッドは、展開を容易にするために用いられ
る。

【００２７】本発明の試験片は、免疫クロマトグラフィ
ーによる被検物質の検出に用いられる。免疫クロマトグ
ラフ法は、一般に以下のような工程を含むが、その検出
方法は特に限定されない。すなわち、被検物質と特異的
に結合し得る抗体を固定化した固定相を有する吸水性基
材からなる試験片の一端より、該被検物質に特異的に結
合し得る標識された抗体と被検液との混合物を吸収させ
て展開すると、該混合物中で形成された標識抗体−被検
物質複合体は固定化された抗体と結合して固定相上に捕
捉される。したがって、該固定相に結合した標識抗体を
測定することにより被検液中の被検物質を測定すること
ができる。この場合、検出用の標識物質として酵素を用
いた場合、固定相で捕捉され形成される複合体が酵素標
識複合体となり、酵素反応により生じる産物を測定する
ことにより検出を行なうことができる。また、標識物質
として蛍光標識体を用いた場合、該蛍光標識体から生じ
る蛍光を測定することにより行なうことができる。

【００２８】また、色を有する担体を用いて該担体に被
検物質に特異的に結合し得る抗体を結合させて使用した
場合、固定相に捕捉された色を有する担体を含む複合体
を目視により検出することできる。迅速な検出を行う意
味で、標識物質として着色粒子が好ましく使用される。
着色粒子は肉眼で検出可能なものであれば特に制限はな
く、例えば、金、銀、銅などの金属からなるコロイド粒
子、スダンブルーやスダンレッドIV、スダンIII 、オイ
ルオレンジ、キニザリングリーン等に代表される顔料や
染料などでラテックスを着色してなる着色ラテックスな
どを用いることができる。

【００２９】また、各種のシグナル増幅免疫クロマトグ
ラフ法も知られているが、いずれの方法においても本発
明の試験片は使用可能である。

【００３０】

【実施例】実施例１ 試験片の作製 抗大腸菌Ｏ１５７ウサギ抗体（ＩｇＧ、イムノプローブ
社製）２０ｍｇを３７℃で１８時間、ペプシン（シグマ
社製、３２００〜４５００Ｕ／ｍｇ）０．３ｍｇで処理
した。ついで、得られた産物をプロテインＡアフィニテ
ィーカラムで精製し、抗原結合性フラグメントＦ（ａ
ｂ’）₂ を得た。

【００３１】前記のようにして得られた抗原結合性フラ
グメントＦ（ａｂ’）₂ を１ｍｇ／ｍｌまたは３ｍｇ／
ｍｌとなるように、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
２）に添加して、それぞれ混合液１および混合液２を得
た。ついで、得られた混合液１または２のうち０．９μ
ｌをニトロセルロース膜〔ザルトリウス社製、３ｍｍ×
４０ｍｍ、孔径８μｍ〕にライン状に塗布した。

【００３２】得られた膜をウシ血清アルブミン（オリエ
ンタル酵母社製、１重量％）およびポリオキシエチレン
（１０）オクチルフェニルエーテル（和光純薬工業社
製、０．１重量％）、サッカロース（和光純薬工業社
製、１重量％）からなる水溶液中に１０分間浸漬させて
のち、４０℃で２時間乾燥させた。次いで、このメンブ
レンの裏側（抗体塗布面の反対側）にポリエステルフィ
ルム（１００μｍ厚）をスプレー糊を用いて貼り合わせ
た。

【００３３】それぞれ得られたＦ（ａｂ’）₂ 固定化膜
を３×４０ｍｍに裁断した。このとき、抗原結合性フラ
グメント塗布領域は、端から２０ｍｍに位置した。

【００３４】抗原結合性フラグメント塗布領域から１０
〜１５ｍｍの箇所にポリエステル不織布（３ｍｍ×８ｍ
ｍ、厚さ２．５ｍｍ）を貼り合わせた。これを試料受領
部とする。

【００３５】それぞれ試験片１（固定量：０．９μｇ）
および試験片２（固定量：２．７μｇ）を得た。

【００３６】また、前記抗大腸菌Ｏ１５７ウサギ抗体を
１ｍｇ／ｍｌとなるように前記リン酸緩衝液に添加して
混合液（混合液３）を得た。ついで、得られた混合液３
を用い、試験片１および２と同様に行なうことにより、
抗大腸菌Ｏ１５７ウサギ抗体を固定した試験片３（固定
量：０．９μｇ）を得た。

【００３７】なお、試験片上の抗原結合性フラグメント
または抗大腸菌Ｏ１５７ウサギ抗体の固定量は、塗布量
（３μｌ／ｃｍ）と抗体濃度から算出した。

【００３８】実施例２ ヤギ抗大腸菌Ｏ１５７抗体固定
化着色ラテックスの調製 青色着色カルボキシル化ポリスチレンラテックス粒子分
散液（固形分濃度５重量％、平均粒子径約０．１μｍ、
０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８）中）３ｍｌに、水
溶性カルボジイミド（１ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍ−ホウ
酸緩衝液（ｐＨ８）中）１ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌヤギ
抗大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ポリクロナール抗体〔Kirkegaa
rd & Perry Laboratories Inc.製、０．０１Ｍ−ホウ酸
緩衝液（ｐＨ８）中〕１ｍｌを加えて１０℃で３時間反
応させた後、洗浄液としてホウ酸緩衝液（ｐＨ８）を用
いて遠心分離洗浄を行い、青色着色ラテックス粒子標識
抗大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７抗体を作製した。得られた青色
着色ラテックス粒子標識抗大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７抗体
は、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８）に、固形分濃
度２重量％となるように懸濁した。

【００３９】ラテックス粒子に固定された抗体の量は、
該抗体固定後の上清をタンパク質定量して算出したタン
パク質量と固定化前に使用した抗体の量との差からラテ
ックス粒子の乾燥重量１ｇあたりの各固定量を算出し
た。なお、当該タンパク質定量は以下のようにして行な
った。

【００４０】（タンパク質定量−色素結合法(Bradford
法))固定化抗体の定量にはCoomassie Brilliant Blue G
-250による色素結合法を用いた。実際の測定は、市販キ
ットである『Coomassie Protein Assay Reagent 』(PIE
RCE 社製) を使用した。測定法は附属の手順書に従っ
た。

【００４１】検量線は、濃度既知の該抗体溶液を用いて
上記の試薬にて発色した後、５９５ｎｍの吸光度を測定
して作成した。適宜希釈した各固定化後の上清を、上記
の試薬にて発色させた後、５９５ｎｍの吸光度を測定、
検量線から当該抗体の濃度を算出し、それぞれの量を決
定した。測定は、室温（２５℃）で行なった。反応時間
は特に限定がないが、発色後９０分以内に吸光度測定を
実施した。

【００４２】その結果、抗体の固定量は１１ｍｇであっ
た。

【００４３】実施例３ 被検物質の検出 ９０℃１０分の熱処理をしたＯ１５７培養物(１．５×
１０⁶ 細胞／ｍｌ)を０．２Ｍ塩化アンモニウム緩衝液
で、７．５×１０⁵ 、３．５×１０⁵ 、１．８×１
０⁵ 、８．９×１０⁴ 、４．４×１０⁴ 細胞／ｍｌとな
るように段階的に希釈し、被検液を調製した。また、
０．２Ｍ塩化アンモニウム緩衝液のみを対照とした。

【００４４】前記のようにして得られた被検液および対
照に、実施例２で得られた抗大腸菌Ｏ１５７ヤギ抗体固
定化着色ラテックスを固形分濃度が０．０２５重量％に
なるように添加し被検混合液を得た。得られた被検混合
液１８０μｌを実施例１で作製したそれぞれの試験片の
ポリエステル不織布部（試料受領部）に滴下し、展開さ
せ、呈色を観察した。呈色は、滴下後２０分で判定し
た。

【００４５】

【表１】

【００４６】判定基準 ＋：強い発色 ±：弱い発色 −：発色なし

【００４７】表１に示すように、ＩｇＧのＦｃフラグメ
ントを欠失したＦ（ａｂ’）₂ を固定した試験片１およ
び２を用いた場合、Ｆ（ａｂ’）₂ の固定量によらず、
Ｏ１５７培養物を含まない対照では呈色が認められなか
った。

【００４８】一方、完全なＩｇＧを固定した試験片３を
用いた場合、Ｏ１５７培養物を含まない対照において非
特異的反応を起こした。

【００４９】

【発明の効果】本発明の試験片は、Ｆｃフラグメントを
欠失した抗原結合性フラグメントが用いられているた
め、簡便で、かつ高感度な非特異的反応の少ない検出を
可能にするという優れた効果を奏する。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被検物質に対する抗体中のＦｃフラグメ
   ントを欠失した抗原結合性フラグメントを固定相として
   有する免疫クロマトグラフィー用試験片。
2. 【請求項２】 抗原結合性フラグメントが、Ｆ（ａ
   ｂ’）₂ またはＦａｂである、請求項１記載の試験片。