JP2000155121A

JP2000155121A - 免疫学的検査法

Info

Publication number: JP2000155121A
Application number: JP10328572A
Authority: JP
Inventors: Keisaku Okada; 圭策岡田; Shuji Senda; 修治千田; Takeshi Honda; 武司本田; Tetsuya Iida; 哲也飯田
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 1998-11-18
Filing date: 1998-11-18
Publication date: 2000-06-06

Abstract

(57)【要約】【課題】ヒトラクトフェリンおよびヒトヘモグロビンの
免疫学的検査法、免疫学的検査キット、免疫学的検査片
を提供し、さらに下痢疾患の診断方法を提供する。【解決手段】被検試料中に被検物質として含まれるヒト
ラクトフェリンとヒトヘモグロビンのそれぞれと結合し
うる少なくとも二種の第１免疫体を、吸水性基材上の異
なる位置にそれぞれ固定化した固定相に、着色粒子に前
記被検物質と結合しうる第２免疫体を結合させた標識免
疫体および該被検物質とを接触させ、該標識免疫体、該
被検物質および該第１免疫体からなる標識免疫複合体を
該固定相上に形成させる免疫学的検査法、該方法に用い
る免疫学的検査キット、免疫学的検査片、並びに該免疫
学的検査キット又は免疫学的検査片を適用する下痢疾患
の診断方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は簡単、迅速に且つ高
精度に被検試料中に含まれるヒトラクトフェリンとヒト
ヘモグロビンの検出を同一基材上で同時に行うことが出
来る免疫学的検査法、免疫学的検査キット、免疫学的検
査片および下痢疾患の診断方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年問題になっているベロトキシン産生
性大腸菌としてのＯ１５７は、主に感染源となる食品か
ら体内に入り、４〜９日間程度の潜伏期間を経たのちに
発症する。また、血便は感染初期から呈することもあ
り、そののち、場合によってはＯ１５７が産生するベロ
トキシンの作用によって溶血性貧血、腎不全、血小板減
少などの症状を引き起こし、溶血性尿毒症症候群（ＨＵ
Ｓ）に至ることもある。

【０００３】下痢症状を有する患者の糞便中から、この
ようなベロトキシン産生性大腸菌の検出を行う操作は非
常に煩雑であり、結果が出るまでには多くの日数を要す
るものであるが、最近は免疫測定法を用いることによっ
て比較的簡便に検出することができるようになってい
る。

【０００４】具体的な検出法としては、ラテックス凝集
法（商品名：大腸菌Ｏ１５７検出キット「ＵＮＩ」、ユ
ニパス社製）を用いる方法がある。その他に、ＥＬＩＳ
Ａ法（商品名：オーソＥ．ｃｏｌｉＯ１５７、オーソ
ダイアグノスティック社製）がある。しかしながら、上
記のラテックス凝集法は測定するまでに増菌培養が必要
であり、ＥＬＩＳＡ法は操作に手間がかかるものであ
る。

【０００５】一方、近年になり迅速かつ簡便に免疫学的
検査が行える方法として、免疫クロマトグラフ法が注目
されている。この方法では、例えば以下のようなステッ
プを経る。吸水性基材上に被検物質と結合しうる免疫体
を固定化した固定相に、該被検物質と結合しうる標識免
疫体と被検物質との複合体を結合させる。固定相にて結
合した標識免疫体を測定することにより、被検液中の被
検物質を測定することができる。上記の免疫クロマトグ
ラフ法を用いる検査キット（商品名：Ｅ．ｃｏｌｉＯ
１５７ダイレクトワコー、和光純薬社製）が市販されて
いる。

【０００６】しかしながら、上記の検出法はいずれもベ
ロトキシン産生性大腸菌の外膜のＯ抗原であるリポ多糖
（ＬＰＳ）を検出し、これにより菌の存在を測定する手
法であるが、糞便試料中でＬＰＳは経時的に分解・減少
する為、保存糞便では偽陰性を示すおそれがある。

【０００７】また、同じベロトキシン産生性大腸菌でも
血清型の異なるＯ２６やＯ１１１などでは検出できない
といった問題もある。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明では、ヒトラク
トフェリンおよびヒトヘモグロビンの検出に免疫クロマ
トグラフ法を適用し、さらにこれらを簡便、迅速に同時
検出することにより、近年問題視されているＯ１５７に
代表されるベロトキシン産生性大腸菌の判定が可能な免
疫学的検査法を提供することを目的とする。本発明の他
の目的は、該免疫学的検査法に使用される免疫学的検査
キット、免疫学的検査片を提供することを目的とする。
本発明のさらに他の目的は、下痢疾患の診断方法に関す
るものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】種々の病原性細菌によっ
て引き起こされる下痢症は、分泌性下痢と炎症性下痢の
二種に大別できる。赤痢菌やサルモネラ菌は炎症性下痢
を引き起こす代表的な細菌であり、人間の腸管上皮に侵
入し組織を破壊することにより下痢を引き起こす。この
ような炎症性下痢の場合、腸管から滲出する白血球に由
来して糞便中のラクトフェリン濃度が増加する。また、
組織の破壊に伴い血便を生じる。

【００１０】一方、分泌性下痢を引き起こす代表的な細
菌はコレラや毒素原性大腸菌であり、腸管上皮に付着後
毒素を分泌して腸管の作用に異変をきたすことにより下
痢を引き起こす。このような分泌性下痢の場合、腸管の
組織は破壊されない為、ラクトフェリン濃度は増加せ
ず、血便もほぼ見られない。

【００１１】しかし、ベロトキシン産生性大腸菌による
下痢症状は上記の分泌性下痢に相当し、下痢便中のラク
トフェリン濃度は増加しないが、別名腸管出血性大腸菌
と言われる通り血便を伴う下痢症状を呈する。即ち、下
痢便においてヒトラクトフェリン濃度が低く、ヒトヘモ
グロビン濃度が高い場合には、ベロトキシン産生性大腸
菌に由来する疾患と判断できる。

【００１２】以上のことから、下痢便中のヒトラクトフ
ェリンとヒトヘモグロビン濃度を同時に測定することに
より、下痢疾患の原因菌を判断することが可能である。
そこで、本発明者らは従来からの免疫クロマトグラフ法
において、下痢便中のヒトラクトフェリン及びヒトヘモ
グロビンを結合することができる第１免疫体群を吸水性
基材上に固定してなる固定相と、被検液中の上記被検物
質と結合することができる第２免疫体を着色粒子に結合
してなる標識免疫体液を用い、固定相を吸水性基材上の
異なる位置に固定化することによって、被検液中の被検
物質を同時に検出するという上記目的が達成できること
を見出し、本発明を完成するに至った。

【００１３】即ち、本発明の要旨は、（１）被検試料中
に被検物質として含まれるヒトラクトフェリンとヒトヘ
モグロビンのそれぞれと結合しうる少なくとも二種の第
１免疫体を、吸水性基材上の異なる位置にそれぞれ固定
化した固定相に、着色粒子に前記被検物質と結合しうる
第２免疫体を結合させた標識免疫体および該被検物質と
を接触させ、該標識免疫体、該被検物質および該第１免
疫体からなる標識免疫複合体を該固定相上に形成させる
免疫学的検査法、（２）被検物質としてのヒトラクトフ
ェリンとヒトヘモグロビンのそれぞれと結合しうる少な
くとも二種の第１免疫体を吸水性基材上の異なる位置に
それぞれ固定化した固定相を有する免疫学的検査片と、
着色粒子に前記被検物質と結合しうる第２免疫体を結合
させた標識免疫体を含有する液とから少なくとも構成さ
れる免疫学的検査キット、（３）被検物質としてのヒト
ラクトフェリンとヒトヘモグロビンのそれぞれと結合し
うる少なくとも二種の第１免疫体を吸水性基材上の異な
る位置にそれぞれ固定化した固定相と、着色粒子に前記
被検物質と結合しうる第２免疫体を結合させた標識免疫
体を液体との接触によって前記基材から脱離しうるよう
に該固定相までの展開途上に含有させた標識相とを少な
くとも設けた免疫学的検査片、（４）被検試料として便
検体を用い、前記（２）記載の免疫学的検査キット又は
前記（３）記載の免疫学的検査片を適用することを特徴
とする下痢疾患の診断方法、に関する。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明において、第１免疫体およ
び第２免疫体は被検物質としてのヒトラクトフェリン
（Ｌｆ）とヒトヘモグロビン（Ｈｂ）に対しそれぞれ特
異的に結合しうる抗体である。各被検物質の同時測定が
可能な本発明においては上記の二種の被検物質とそれぞ
れ特異的に結合しうる少なくとも二種の第１免疫体およ
び第２免疫体が用いられる。ここで、「少なくとも二種
の第１免疫体および第２免疫体」とは、第１免疫体とし
てヒトラクトフェリンとヒトヘモグロビンに対しそれぞ
れ特異的に結合する一種づつの抗体、従って合計で二種
の抗体を用いてもよく、例えばヒトラクトフェリンに対
しては異なる二種の抗体を用い、ヒトヘモグロビンに対
しては一種の抗体を用いるなどでもよく、何種類の抗体
を用いるかは適宜決定でき、二種の被検物質にそれぞれ
特異的に結合する二種の第１免疫体が少なくとも必要で
あるという意味である。第２免疫体としても同様の意味
である。

【００１５】免疫体は測定すべき被検物質に応じて、サ
ンドイッチ法などで用いられる公知のものを適宜選択す
ればよい。また、固定相に固定化する第１免疫体と着色
粒子と結合させて用いる第２免疫体（本発明では標識免
疫体という）、用いる抗体の種類、測定対象によっても
異なるが、同一の抗体を用いることも可能であり、又、
異なる抗原決定基を認識する二種の抗体を用いることも
できる。免疫体としてモノクローナル抗体やポリクロー
ナル抗体を使用することができる。一方の免疫体がモノ
クローナル抗体である場合には、もう一方の免疫体は当
該モノクローナル抗体とは異なる抗原決定基を認識する
ものが好ましい。

【００１６】本発明において用いる吸水性基材は、被検
物質を含有する被検試料、例えば、便懸濁（溶解）溶液
などを吸収できるもの、あるいはこれらを緩衝液によっ
て希釈してなる希釈液を吸収するもの、標識免疫体を含
有する液を吸収するものであれば特に限定されない。こ
こで使用される緩衝液としては、特に限定されないが、
ほう酸緩衝液、りん酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液
等が好適である。本発明においては、被検試料中の被検
物質が標識免疫体や固定相の第１免疫体と充分な反応を
行うための時間を確保できるような吸水性基材が用いら
れる。吸水性基材が吸水性に劣る場合には、後述するよ
うに被検試料が固定相に到達するのに長時間を要し、そ
の結果、迅速な測定を行うことができない。

【００１７】一方、吸水性基材の吸水性があまりに高す
ぎる場合には、被検試料中の被検物質が標識免疫体や固
定相の第１免疫体と充分な反応を行うために必要な時間
が不足するので、正確な測定を行うことが困難となる。
好ましい具体例としては、例えば不織布、濾紙、ガラス
繊維布、ガラスフィルター、ニトロセルロースフィルタ
ー、多孔質材料などが挙げられる。これらの基材は適度
な吸水速度を有すると共に、着色粒子が結合して発色し
た際の目視確認性に優れるものである。

【００１８】以上の点を考慮すると、本発明における吸
水性基材の吸水性の程度は、５ｍｍ幅の短冊状に裁断し
た吸水性基材の片端部を水に浸漬し、１分間経過後の吸
水距離が０．５〜５ｃｍ程度のものが好ましい。

【００１９】また、これらの基材の吸水性を調整するた
めに、基材の表面に親水性重合体や界面活性剤を被覆
し、あるいは含浸させることもできる。さらに、本発明
においては吸水性基材として同一材料からなる基材を用
いてもよいし、あるいは異種の材料からなるものを任意
の接着手段によって接合して得た連続した基材を用いる
こともできる。

【００２０】本発明において、吸水性基材の形状は、被
検試料を展開できる形状であれば特に限定されるもので
はなく、例えば、矩形のシート状（片状）やロッド状な
どが好ましい。

【００２１】本発明において、固定相とは被検物質と結
合しうる第１免疫体が吸水性基材上に固定化された領域
を意味する。第１免疫体を吸水性基材上に固定化する方
法（固定相の作製方法）も、特に限定されるものではな
いが、従来から知られている物理吸着法や共有結合法に
よるのが好適であり、特に、免疫体が基材から脱離しに
くい共有結合法によるのが好ましい。吸水性基材が上記
共有結合法のための官能基を有しないときは、例えば適
宜の官能基を有する重合体を用い基材を作製し、吸水性
基材の吸水性を阻害しない程度に付着させる。また、第
１免疫体および親水性重合体を含む溶液を吸水性基材に
塗布したのち、上記親水性重合体を凝固させる凝固溶剤
に浸漬することで固定相を作製することもできる。上記
親水性重合体としては、ヒドロキシプロピルメチルセル
ロース、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセル
ロースなどが用いられる。上記凝固溶剤としてはアセト
ン、エタノール、メタノール、エーテルなどを用いるこ
とができる。

【００２２】固定化する第１免疫体の量は用いる免疫体
の種類や特性によっても異なるが、通常、Ｌｆに対する
抗体であれば０．００１〜０．５ｍｇ／ｃｍ²、Ｈｂに
対する抗体であれば０．０１〜１ｍｇ／ｃｍ²の量で塗
布される。

【００２３】本発明における固定相は上記のようにして
吸水性基材上に少なくとも二種の第１免疫体を固定化し
たものであるが、後述のように、被検試料などの吸液に
よって移動してきた被検物質と標識免疫体を固定相で捕
捉して各被検物質毎に発色させるためには、各第１免疫
体は少なくとも１ｍｍ以上、各発色が混じり合わないよ
うにするためには、好ましくは５ｍｍ以上の間隔を設け
て吸水性基材上に固定化することが望ましい。

【００２４】また、本発明においては、被検試料、標識
免疫体を含有する液、被検試料および標識免疫体を含有
する液の混合物、緩衝液などの吸液が開始される部位
（以下、吸液部という）と上記固定相との間の距離は、
１〜６ｃｍ、好ましくは３〜４ｃｍ程度とする。距離が
あまりに遠すぎると、固定相まで被検物質と標識免疫体
が到達しなかったり、発色感度が強すぎたり、測定に時
間がかかったりするという問題点を生じる恐れがあり好
ましくない。一方、距離が近すぎると固定相での発色が
均一でなく、まばらになったり、発色感度が低すぎると
いう問題が生じる恐れがある。

【００２５】吸液部としては、被検試料、標識免疫体を
含有する液、被検試料および標識免疫体を含有する液の
混合物、緩衝液などの吸水性基材への移動を妨げるもの
でなければ、特に限定されず、基材と兼用したものであ
っても、あらたに不織布や織布等を該吸収性基材に接着
させたものであってもよい。

【００２６】本発明において、第１免疫体が固定化され
た固定相及び吸液部を有する吸水性基材、あるいはさら
に後述の標識相を有する吸水性基材を本発明の免疫学的
検査片ともいう。

【００２７】本発明における標識免疫体としては、着色
粒子に被検物質と結合することができる第２免疫体を結
合させたものを用いる。ここで用いる着色粒子として
は、肉眼で着色が検出可能なものであれば制限はなく、
例えば金、銀、銅などの金属からなるコロイド粒子、ス
ダンブルーやスダンレッドIV、スダン III、オイルオレ
ンジ、キニザリングリーンなどに代表される顔料や染料
などでラテックスを着色した着色ラテックスなどを用い
ることができる。目視確認性の点からは、金コロイドや
青色、赤色、緑色、オレンジ色に着色した着色ラテック
スを用いることが好ましく、さらに好ましくは青色や赤
色などで着色した水分散型高分子重合体粒子からなる着
色ラテックスを用いることが分散安定性や被検物質の検
出感度の調整し易さ等の点から望ましい。

【００２８】上記着色粒子の粒子径としては保存安定性
や調製しやすさの点から、０．０１〜３μｍ、好ましく
は０．０５〜０．５μｍの範囲とする。粒径があまりに
小さすぎると、１粒子当たりの着色の程度が少ないの
で、固定相に結合しても発色の程度が悪く、目視確認性
に劣るようになる。また、粒径が大きすぎると、着色粒
子が僅かに凝集しただけで吸水性基材に目詰まりを起こ
して吸水性を低下させたり、非特異発色を起こしたりす
ることがある。

【００２９】このような着色粒子に第２免疫体を結合す
る方法としては、従来からよく知られている方法、例え
ば共有結合法や物理吸着法、イオン結合法などを用いる
ことができるが、結合後の第２免疫体からの脱離がなく
安定である点から共有結合法を採用することが好まし
い。本発明においては被検試料中の二種の被検物質を検
出するために、対応する少なくとも二種の第２免疫体を
それぞれ別の着色粒子に結合させるが、この際に用いる
着色粒子は同一色であっても異なった色であってもよ
い。

【００３０】本発明においては、上記のような着色粒子
−第２免疫体からなる標識免疫体が、被検液や緩衝液な
どの液体との接触によって吸水性基材から脱離しうるよ
うに、標識免疫体を吸水性基材に含有させた標識相を設
けてもよい。含有方法としては、例えば標識免疫体の溶
液を吸水性基材に塗布したのち、適当な条件にて乾燥さ
せる。乾燥の一態様とし凍結乾燥させることもできる。
その他の方法としては、水溶性重合体あるいはサッカロ
ースの溶液中に標識免疫体を分散させ、この分散液を吸
水性基材に塗布したのち、乾燥させる方法を挙げること
ができる。この方法は、本発明品を調製するのに有利な
方法である。例えば、被検液と接触したときに、水溶性
重合体またはサッカロースが容易に水溶化し、標識免疫
体が速やかに基材から脱離して被検物質と反応し、吸水
性基材上を移動することができる。同様に緩衝液と接触
したときも、標識免疫体が速やかに基材から脱離して吸
水性基材上を移動することができる。また、水溶性重合
体あるいはサッカロースの濃度を調整することによっ
て、適当な粘度の溶液を得ることができるので、吸水性
基材の所定の領域に標識免疫体を含有させるのが容易で
あるのみならず、乾燥に際して標識免疫体の凝集や変性
が生じにくく、さらに、乾燥後に標識免疫体が吸水性基
材から脱離しにくいからである。

【００３１】上記のようにして用いる水溶性重合体とし
ては、例えばポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコ
ール、ポリエチレングリコール、セルロースエーテル
（例えば、メチルセルロース、エチルセルロース、カル
ボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロー
ス、オキシエチルセルロース、シアンエチルセルロース
など）、ゼラチンなどが好ましく用いられる。

【００３２】本発明で使用する、第２免疫体を結合させ
た標識免疫体を含有する液は、該標識免疫体を緩衝液に
分散させて調製することができる。ここで使用する緩衝
液は、ほう酸緩衝液、りん酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
緩衝液等が挙げられ、抗原抗体反応を阻害しないｐＨ及
び塩濃度の緩衝液を適宜使用する。標識免疫体の使用量
は、本発明の各種の態様において適宜設定することがで
きる。例えば、標識免疫体を含有する液中の標識免疫体
濃度は０．００５〜５重量％、好ましくは０．０１〜
０．５重量％の範囲とする。濃度があまりにも低すぎる
と、固定相に結合する着色粒子数が少なく、発色が悪く
なる。また、濃度が高すぎると、不経済なばかりでな
く、過剰の着色粒子が固定相以外に残留し、固定相の発
色を不明瞭にする等の問題が発生する（以下、標識免疫
体を含有する液を標識免疫体液ともいう。）。

【００３３】本発明の免疫学的検査法は、前記のように
少なくとも二種の第１免疫体を吸水性基材上の異なる位
置にそれぞれ固定化した固定相に、前記の標識免疫体お
よび被検物質とを接触させ、標識免疫体、被検物質およ
び第１免疫体からなる標識免疫複合体を該固定相上に形
成させることを特徴とするものであり、標識免疫複合体
を固定相上に形成させる態様として、以下の５つの方法
が挙げられる。

【００３４】第１の方法では、まず検査すべき被検試料
と標識免疫体液とを混合させる。この時被検試料中に含
まれる二種の被検物質（Ｌｆ、Ｈｂ）は各標識免疫体と
結合し、標識免疫体と被検物質の複合体〔標識免疫体
（着色粒子−第２免疫体）−被検物質〕をそれぞれ形成
する。次いで、固定相を設けた吸水性基材の一端から前
記被検試料と標識免疫体液の混合物を吸収させる。混合
物中で形成された複合体は液の移動とともに吸水性基材
中を移動し、固定相に到達する。固定相では移動してき
た複合体が固定相に固定された第１免疫体と更に結合
し、新たに〔標識免疫体（着色粒子−第２免疫体）−被
検物質−第１免疫体〕からなる標識免疫複合体を形成し
て、固定相上に固定化結合される。

【００３５】第２の方法では、被検試料のみを固定相を
設けた吸水性基材の一端から吸収させ、該吸水性基材中
を移動させて被検試料中の二種の被検物質（Ｌｆ、Ｈ
ｂ）を固定相上の第１免疫体に結合させる（被検物質−
第１免疫体）。この方法では、被検物質が液状のもので
あればそのまま使用し、固体状のものであれば適当な緩
衝液等で溶解、懸濁等の処理を行い、吸水性基材に吸収
されるようにしておく。次いで、標識免疫体液を該吸水
性基材の一端から吸収させ、移動させることにより、各
標識免疫体は、固定相に結合している被検物質とさらに
結合して複合体を形成して、新たに〔標識免疫体（着色
粒子−第２免疫体）−被検物質−第１免疫体〕からなる
標識免疫複合体を形成して、固定相上に固定化結合され
る。

【００３６】第３の方法では、固定相を設けた吸水性基
材の一端から標識免疫体液を吸収させる。固定相までの
展開途上に配置された被検試料中の二種の被検物質（Ｌ
ｆ、Ｈｂ）と移動中の各標識免疫体とが複合体を形成す
る。形成された複合体は液の移動とともに吸水性基材中
を移動し、固定相に到達する。固定相では移動してきた
複合体が固定相に固定された第１免疫体と更に結合し、
新たに〔標識免疫体（着色粒子−第２免疫体）−被検物
質−第１免疫体〕からなる標識免疫複合体を形成して、
固定相上に固定化結合される。展開途上に被検試料を配
置するには、液状もしくは固体状の被検試料を基材中に
吸収させ、もしくは塗布すればよい。

【００３７】第４の方法では、固定相ならびに標識相を
設けた検査片を用いる。まず、吸水性基材の一端から検
査すべき被検試料を吸収させる。被検試料は吸水性基材
中を移動して標識相に到達し、標識免疫体を基材から脱
離させる。この時被検試料中に含まれる二種の被検物質
（Ｌｆ、Ｈｂ）は各標識免疫体と結合し、複合体を形成
する。次いで、形成された複合体は液の移動とともに吸
水性基材中を移動し、固定相に到達する。固定相では移
動してきた複合体は固定相に固定された第１免疫体と更
に結合し、新たに〔標識免疫体（着色粒子−第２免疫
体）−被検物質−第１免疫体〕からなる標識免疫複合体
を形成して、固定相上に固定化結合される。

【００３８】第５の方法では、固定相ならびに標識相を
設けた検査片を用いる。まず、吸水性基材の一端から緩
衝液を吸収させる。緩衝液は吸水性基材中を移動して標
識相に到達し、標識免疫体を基材から脱離させる。この
時、緩衝液を吸収させる吸液部と標識相の間に、あるい
は標識相と固定相との間に被検試料を配置しておくこと
により、被検試料中の二種の被検物質（Ｌｆ、Ｈｂ）は
各標識免疫体と結合し、標識免疫体と被検物質との複合
体を形成する。即ち、被検試料を吸液部と標識相の間に
配置した場合は、被検試料中の被検物質は展開移動して
きた緩衝液と共に標識相まで運ばれて標識免疫体と被検
物質との複合体が形成される。また、被検試料を標識相
と固定相との間に配置した場合は、展開移動してきた緩
衝液により標識相の標識免疫体は基材から脱離して移動
し、固定相との間に配置された被検試料中の被検物質と
接触して標識免疫体と被検物質との複合体が形成され
る。次いで、形成された複合体は液の移動とともに吸水
性基材中を移動し、固定相に到達する。固定相では移動
してきた複合体は固定相に固定された第１免疫体と更に
結合し、新たに〔標識免疫体（着色粒子−第２免疫体）
−被検物質−第１免疫体〕からなる標識免疫複合体を形
成して、固定相上に固定化結合される。吸液部と標識相
の間に、あるいは標識相と固定相との間に被検試料を配
置するには、液状もしくは固体状の被検試料を基材中に
吸収させ、もしくは塗布すればよい。

【００３９】このように固定相に固定化されることによ
って、標識免疫体を構成する着色粒子は一箇所に集合、
結合し、明らかな発色となり被検物質の存在を目視確認
できるのである。本発明では固定相には二種の被検物質
に対応する第１免疫体をそれぞれ異なった位置に固定し
ているので、一度に被検物質としてのＬｆ、Ｈｂの存在
を確認することができるのである。

【００４０】従って、本発明は、糞便中に存在するＬｆ
とＨｂを同時に検出することができるものである。

【００４１】本発明は、前記の免疫学的検査法を実施す
るのに適したキットとして、被検物質としてのヒトラク
トフェリンとヒトヘモグロビンのそれぞれと結合しうる
少なくとも二種の第１免疫体を吸水性基材上の異なる位
置にそれぞれ固定化した固定相を有する免疫学的検査片
と、着色粒子に前記被検物質と結合しうる第２免疫体を
結合させた標識免疫体を含有する液とから少なくとも構
成される免疫学的検査キットを提供する。また、免疫学
的検査片として、前記固定相、着色粒子に前記被検物質
と結合しうる第２免疫体を結合させた標識免疫体を液体
との接触によって前記基材から脱離しうるように該固定
相までの展開途上に含有させた標識相とを少なくとも設
けた免疫学的検査片を使用してもよく、従って、本発明
はかかる免疫学的検査片をも提供する。

【００４２】前記キットを構成する吸水性基材上に被検
物質と結合しうる第１免疫体を固定化した固定相および
着色粒子に前記被検物質と結合しうる第２免疫体を結合
した標識免疫体を含有する液は前述と同じものが用いら
れる。

【００４３】本発明の検査キットを用いて検査する場
合、用いる吸水性基材の種類や大きさ、用いる免疫体の
特性によっても異なるが、通常、液量にして１〜５００
μｌ、被検物質の量としてＬｆおよびＨｂがそれぞれ
１．５ｎｇ以上を含有する被検試料を好適に測定するこ
とが可能である。

【００４４】本発明では、被検試料として便検体を用い
ることにより各種の下痢疾患の診断に有用であり、特
に、ベロトキシン産生性大腸菌に由来する下痢疾患の診
断に役立つものである。従って、本発明は被検試料とし
て便検体を用い、本発明の免疫学的検査キット又は免疫
学的検査片を適用して本発明の免疫学的検査法を実施す
ることによる下痢疾患の診断方法を提供する。

【００４５】

【実施例】以下、本発明の実施例を挙げ、さらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定され
るものではない。

【００４６】実施例１：被検物質の検出（１）１）標識免疫体液の作製青色着色カルボキシル化ポリスチレンラテックス粒子分
散液（固形分濃度５重量％、平均粒子径０．１μｍ、
０．０１Ｍ−ほう酸緩衝液ｐＨ８）３ｍｌに、水溶性カ
ルボジイミド（１ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍ−ほう酸緩衝
液ｐＨ８）１ｍｌ、および抗ヒトラクトフェリン抗体
（ヤギＩｇＧ（ノルディック社製）、１ｍｇ／ｍｌ、
０．０１Ｍ−ほう酸緩衝液ｐＨ８）１ｍｌを加えて１０
℃で３時間反応させたのち、洗浄液としてほう酸緩衝液
（ｐＨ８）を用いて遠心分離洗浄を行い、青色着色ラテ
ックス粒子標識抗ヒトラクトフェリン抗体を作製した。

【００４７】同様にして、抗ヒトヘモグロビン抗体（ウ
サギＩｇＧ（株式会社日本バイオテスト製）、５ｍｇ／
ｍｌ）を、赤色着色カルボキシル化ポリスチレンラテッ
クス粒子（平均粒子径０．１μｍ）に結合させて赤色着
色ラテックス粒子標識抗ヒトヘモグロビン抗体を作製し
た。

【００４８】次いで、各ラテックス粒子標識抗体を０．
０１Ｍ−ほう酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、固形分濃度２
重量％となるように懸濁させて分散液を調製した。

【００４９】２）固定相を設けた検査片の作製図１、２に示すようにニトロセルロースメンブレン（孔
径８μｍ、６ｍｍ×６０ｍｍ）からなる吸水性基材１の
一端から３０ｍｍの箇所（図中２−２）に抗ヒトラクト
フェリン抗体（ヤギＩｇＧ（ノルディック社製）、１ｍ
ｇ／ｍｌ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．４）、２５ｍ
ｍの箇所（図中２−１）に抗ヒトヘモグロビン抗体（ウ
サギＩｇＧ（（株）日本バイオテスト社製）、１ｍｇ／
ｍｌ、１Ｍりん酸緩衝液、ｐＨ７．４）をそれぞれ１．
５μｌずつ、ディスペンサーを用いてライン状に塗布し
た。

【００５０】このメンブレンをウシ血清アルブミン（１
重量％）およびポリオキシエチレン（１０）オクチルフ
ェニルエーテル（和光純薬工業社製、０．１重量％）か
らなる水溶液中に１０分間浸漬させたのち、４０℃で２
時間乾燥させて固定相を作製した。固定化量は、Ｈｂ、
Ｌｆ共に０．０２５ｍｇ／ｃｍ²であった。

【００５１】次いで、このメンブレンの裏側（抗体塗布
面の反対側）にポリエステルフィルム４（９０μｍ厚）
をスプレー糊を用いて貼り合わせた。

【００５２】抗体塗布箇所の反対端から０〜８ｍｍの箇
所にポリエステル不織布３（６ｍｍ×８ｍｍ、厚さ２．
５ｍｍ）を貼り合わせて、本発明の免疫学的検査片を作
製した。

【００５３】３）測定０．１Ｍリン酸緩衝液（０．９重量％ＮａＣｌ含有、ｐ
Ｈ７．４）に、ヒトラクトフェリン、ヒトヘモグロビン
を表１に示した濃度で分散させた検体（被検試料）を調
製した。

【００５４】この被検試料に上記１）で作製した標識免
疫体液を固形分濃度０．０２重量％となるように混合、
攪拌した後、混合液６０μｌを上記２）で作製した検査
片のポリエステル不織布部（吸液部）に滴下し、２０分
後の固相部（固定相）の発色の有無を目視確認した。

【００５５】表１に各被検物質を混合または単独で被検
試料に用いた場合の測定結果を示す。なお、各表におけ
る判定基準は以下の通りである。

【００５６】＋：固定相にライン状の発色が見られる。 −：固定相にライン状の発色が見られない。

【００５７】

【表１】

【００５８】表１に示されるように、ヒトラクトフェリ
ンおよびヒトヘモグロビンは、いずれも０．１ｎｇ／ｍ
ｌの濃度まで検出された。

【００５９】実施例２：被検物質の検出（２）表１に示した濃度で調製した被検試料６０μｌを、実施
例１の２）で作製した検査片のポリエステル不織布部に
滴下し、固定相まで展開させた。次いで、０．１Ｍリン
酸緩衝液（０．９重量％ＮａＣｌ含有、ｐＨ７．４）
に、固形分濃度を０．０２重量％となるように希釈した
標識免疫体液６０μｌを、前記検査片のポリエステル不
織布部に滴下し、２０分後の固定相の発色の有無を目視
確認した。その結果、実施例１で得られたのと同様の結
果であった。

【００６０】実施例３：被検物質の検出（３）０．１Ｍリン酸緩衝液（０．９重量％ＮａＣｌ含有、ｐ
Ｈ７．４）に、ヒトラクトフェリン、ヒトヘモグロビン
を表２に示した濃度で分散させた検体（被検試料）を調
製した。表２に示した濃度で調製した被検試料２μｌ
を、実施例１の２）で作製した免疫学的検査片の表面側
に、抗体塗布箇所の反対端から１０ｍｍの部分に吸収さ
せた。次いで、０．１Ｍリン酸緩衝液（０．９重量％Ｎ
ａＣｌ含有、ｐＨ７．４）に、固形分濃度を０．０２重
量％となるように希釈した標識免疫体液６０μｌを、前
記検査片のポリエステル不織布部に滴下し、２０分後の
固定相の発色の有無を目視確認した。

【００６１】表２に各被検物質を混合または単独で被検
試料に用いた場合の測定結果を示す。

【００６２】

【表２】

【００６３】表２に示されるように、ヒトラクトフェリ
ンおよびヒトヘモグロビンは、いずれも１ｎｇ／ｍｌの
濃度まで検出された。

【００６４】実施例４：被検物質の検出（４）１）固定相と標識相を設けた検査片の作製固定相と標識相を設けた検査片の作製は、実施例１の
１）で作製した青色着色ラテックス粒子標識抗ヒトラク
トフェリン抗体の分散液（２重量％）１ｍｌ、赤色着色
ラテックス粒子標識抗ヒトヘモグロビン抗体の分散液
（２重量％）１ｍｌ、サッカロース水溶液（２０重量
％）８ｍｌを混合し、この混合液１０μｌをレーヨン不
織布（６ｍｍ×８ｍｍ）に含浸させた後、４０℃で２時
間乾燥させた。この不織布を、実施例１の２）で作製し
たメンブレンの表面側に、抗体塗布箇所の反対側から１
２〜２０ｍｍの箇所に貼り合わせて作製した。２）測定実施例１と同様に、表１に示した濃度で調製した被検試
料６０μｌを、上記で作製した標識相を設けた検査片の
ポリエステル不織布部に滴下し、２０分後の固定相の発
色の有無を目視確認した。その結果、実施例１で得られ
たのと同様の結果であった。

【００６５】実施例５：被検物質の検出（５）実施例３と同様に、表２に示した濃度で調製した被検試
料２μｌを、実施例４の１）で作製した固定相と標識相
を設けた検査片の表面側に、標識相を設けた側の端から
１０ｍｍの部分に吸収させた。次いで、０．１Ｍリン酸
緩衝液（０．９重量％ＮａＣｌ含有、ｐＨ７．４）６０
μｌをポリエステル不織布部に滴下し、２０分後の固定
相の発色の有無を目視確認した。その結果、実施例３で
得られたのと同様の結果であった。

【００６６】また、被検試料の基材中への吸収を標識相
を設けた側の端から２３ｍｍの部分に吸収させて同様の
試験を行ったところ、同様の結果であった。

【００６７】実施例６：便検体からの検出表３に示すように、カンピロバクター由来の下痢便１検
体、ベロトキシン産生性大腸菌Ｏ１５７由来の下痢便２
検体を０．１Ｍリン酸緩衝液（０．９重量％ＮａＣｌ含
有、ｐＨ７．４）で希釈したものを被検試料として測定
を行った。

【００６８】実施例１と同様に、表３に示した希釈倍率
で調製した被検試料に実施例１の１）で作製した標識免
疫体液を固形分濃度０．０２重量％となるように混合、
攪拌した後、混合液６０μｌを、実施例１の２）で作製
した検査片のポリエステル不織布部に滴下し、２０分後
の固相部の発色の有無を目視確認した。

【００６９】表３に各被検物質の測定結果を示す。

【００７０】

【表３】

【００７１】表３に示すように、カンピロバクター由来
の下痢便検体とは異なり、ベロトキシン産生性大腸菌Ｏ
１５７由来の下痢便検体ではヒトラクトフェリンは希釈
倍率が１００倍以上では検出されないのに対し、ヒトヘ
モグロビンはいずれの倍率でも検出されており、ベロト
キシン産生性大腸菌に由来する下痢便ではヒトラクトフ
ェリン濃度が低く、ヒトヘモグロビン濃度が高いことを
本発明の免疫学的検査法により鑑別できることが示され
た。

【００７２】

【発明の効果】本発明の免疫学的検査法および免疫学的
検査キットは、上記実施例の結果からも明らかなよう
に、ヒトラクトフェリンとヒトヘモグロビンを簡便に同
時分析することができ、それぞれ別々に分析する場合と
同程度の精度で検出することができるものである。ま
た、判定は発色によって行うことができるので、目視確
認により定性的または半定性的な分析ができるととも
に、光学機器を利用することによって定量的分析も可能
となる。従って、本発明によりベロトキシン産生性大腸
菌等の各種の病原性細菌に由来する各種の下痢疾患の診
断を迅速かつ簡便に行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例１にて作製した免疫学的検査片
の一実施態様を模式的に示す平面図である。

【図２】図２は、図１に示す免疫学的検査片のＸ−Ｘ’
線断面図である。

【符号の説明】

１吸水性基材２固定相（２−１、２−２）３ポリエステル不織布４ポリエステルフィルム

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者飯田哲也大阪府吹田市山田東２−46−12

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】被検試料中に被検物質として含まれるヒ
トラクトフェリンとヒトヘモグロビンのそれぞれと結合
しうる少なくとも二種の第１免疫体を、吸水性基材上の
異なる位置にそれぞれ固定化した固定相に、着色粒子に
前記被検物質と結合しうる第２免疫体を結合させた標識
免疫体および該被検物質とを接触させ、該標識免疫体、
該被検物質および該第１免疫体からなる標識免疫複合体
を該固定相上に形成させる免疫学的検査法。
【請求項２】固定相を設けた吸水性基材の一端から被
検試料および前記標識免疫体を含有する液の混合物を吸
収させ、形成した被検試料中の被検物質と標識免疫体と
の複合体を該固定相にて第１免疫体に結合させる請求項
１記載の免疫学的検査法。
【請求項３】固定相を設けた吸水性基材の一端から被
検試料を吸収させた後、第２免疫体を結合させた標識免
疫体を含有する液を該吸収性基材に吸収させ、該固定相
の第１免疫体に結合した被検物質にさらに標識免疫体を
結合させる請求項１記載の免疫学的検査法。
【請求項４】固定相を設けた吸水性基材の一端から標
識免疫体を含有する液を吸収させ、前記固定相までの展
開途上に配置された被検試料中の被検物質と前記標識免
疫体との複合体を形成させた後、該複合体を該固定相に
て第１免疫体に結合させる請求項１記載の免疫学的検査
法。
【請求項５】固定相と、該固定相までの展開途上に第
２免疫体を結合させた標識免疫体を液体との接触によっ
て前記基材から脱離しうるように含有させた標識相とを
設けた吸水性基材の一端から被検試料を吸収させ、被検
試料中の被検物質と標識免疫体との複合体を形成させた
後、該複合体を該固定相にて第１免疫体に結合させる請
求項１記載の免疫学的検査法。
【請求項６】固定相と、該固定相までの展開途上に第
２免疫体を結合させた標識免疫体を液体との接触によっ
て前記基材から脱離しうるように含有させた標識相とを
設けた吸水性基材の一端から緩衝液を吸収させ、該緩衝
液を吸収させる吸液部と前記標識相との間に、あるいは
該標識相と前記固定相との間に配置された被検試料中の
被検物質と標識免疫体との複合体を形成させた後、該複
合体を該固定相にて第１免疫体に結合させる請求項１記
載の免疫学的検査法。
【請求項７】被検物質としてのヒトラクトフェリンと
ヒトヘモグロビンのそれぞれと結合しうる少なくとも二
種の第１免疫体を吸水性基材上の異なる位置にそれぞれ
固定化した固定相を有する免疫学的検査片と、着色粒子
に前記被検物質と結合しうる第２免疫体を結合させた標
識免疫体を含有する液とから少なくとも構成される免疫
学的検査キット。
【請求項８】被検物質としてのヒトラクトフェリンと
ヒトヘモグロビンのそれぞれと結合しうる少なくとも二
種の第１免疫体を吸水性基材上の異なる位置にそれぞれ
固定化した固定相と、着色粒子に前記被検物質と結合し
うる第２免疫体を結合させた標識免疫体を液体との接触
によって前記基材から脱離しうるように該固定相までの
展開途上に含有させた標識相とを少なくとも設けた免疫
学的検査片。
【請求項９】被検試料として便検体を用い、請求項７
記載の免疫学的検査キット又は請求項８記載の免疫学的
検査片を適用することを特徴とする下痢疾患の診断方
法。
【請求項１０】下痢疾患がベロトキシン産生性大腸菌
に由来する疾患である請求項９記載の診断方法。