JP3859027B2

JP3859027B2 - 乳頭分泌液中の特定物質の測定方法

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Publication number: JP3859027B2
Application number: JP35381296A
Authority: JP
Inventors: 智子河原; 田辺　　敏雄; 信雄八田; 恵司弥生
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1996-12-18
Filing date: 1996-12-18
Publication date: 2006-12-20
Anticipated expiration: 2016-12-18
Also published as: JPH10177028A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、乳癌のスクリーニングに適した乳頭分泌液中の特定物質の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
乳癌を診断するための血中の特定物質としてＣＥＡ（癌胎児性抗原）、eｒｂＢ−２、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、ＣＡ１５−３、ＣＡ７２−４、ＴＰＡ（組織ポリペプチド抗原）、ＣＡ１２５、ＩＡＰ（免疫抑制酸性蛋白）、フェリチン、ＣＡ５４／６１、ＣＡ６０２、ＣＡ１９−９、ＣＡ５４９、ｒａｓ蛋白、Ｐ５３などが知られている。しかし、これらの物質の血中濃度を指標にした原発性乳癌の陽性率はきわめて低く、乳癌のスクリーニングに使用することは困難であった。従来、これらのマーカーは主に乳癌再発のモニターとして使われている。
【０００３】
乳癌をスクリーニングするために乳頭分泌液中の特定物質の測定が提唱されている。乳頭分泌液中の特定物質として、森らはＣＥＡ（乳癌の臨床４：９９−１０３、１９８９）を、弥生らはＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗原（日本外科学会１９９６年学術講演会要旨集１７５ページ）を、稲治らはｅｒｂＢ−２（ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒ１：２５−３０、１９９５）を報告している。また、乳頭分泌液が血性であるかどうかも乳癌診断の重要な情報となっている（弥生ら、癌と臨床６：１３３−１３９、１９９４）。
【０００４】
微量の乳頭分泌液を測定する方法として、乳頭分泌液を液体不透過性シート上に採取し乾燥させた後、そのシート上で免疫反応を行う測定方法および測定用器材が特開平１−２５００６９号公報や特開平２−２８００６１号公報に開示されており、キットも市販されている。しかし、この方法は、反応工程が多く最短で２時間半を要し、診察室で簡便に使うことはできなかった。また、吸着担体を有する貼付剤を乳房に貼付し乳頭分泌液を直接貼付剤に吸着固相化し測定する方法が特表平６−５１３９８５号公報に開示されているが、この方法は、すべての患者に対して一定量の乳頭分泌液が採取できず、貼付している時間の影響もあるので診断の正確さに問題があり、実用的ではない。
【０００５】
一方、近年血液や尿などの生体試料に対して、家庭、診療室での使用に適し、使用者の熟練や手間をほとんど必要せずに短時間で測定できる簡易測定装置が普及してきている。その一つの形態はイムノクロマト法測定装置である（特公平７−１８８７６、特公平７−７８５０３、特公平７−３６０１７、特公平６−２７７３８、特開平１−２４４３７０号公報など）。液体が毛管現象で移動することができる多孔性のシート状ストリップの一部に、測定対象物質に特異的に反応する抗体が固定化されており、その上流に金コロイドなどの着色粒子で標識された測定対象物質に特異的な抗体（標識抗体）がストリップ上に固定されていない状態で配置（塗布・乾燥等により配置）されており、標識抗体の上流から液体試料を添加すると、試料はストリップ中の毛管を伝わって浸透し標識抗体を溶解し、さらに、標識抗体を溶解した試料はストリップの抗体を固定化した部分を通過してストリップの下流に移動して、試料中に測定対象物質が存在する場合には、溶解した標識抗体と反応し、ついでストリップに固定化された抗体に「測定対象物質−標識抗体」複合体として捕獲される。未反応の標識抗体は下流に移動してしまうため、測定対象物質が存在する場合にだけテストストリップの抗体を固定化した部分に金コロイド粒子による着色が観察される。
【０００６】
もう一つの形態はフロースルー法測定装置である（特公平７−３４０１６、特公平７−１１３６３７、特開平１−２４７６８、特開平３−１１８４７３号公報など）。この装置は、測定対象物質に特異的に反応する抗体が固定化されていて液体が通過できる毛管を有する多孔性のメンブレンとその下面で毛管が連絡して接触している吸水性部材より構成される。メンブレンの上面から液体試料を添加すると、メンブレンを通過して吸水性部材に吸収され、その時、試料中に測定対象物質が存在する場合には、測定対象物質はメンブレンに固定化された抗体上に捕獲される。その後、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素で標識した測定対象物に特異的な抗体（標識抗体）を添加し、メンブレンに固定化された抗体上に捕獲された測定対象物質に反応させてサンドイッチ複合体を形成させる。さらに、洗浄液でメンブレンの毛管中にある未反応の標識抗体を吸水性部材に吸収させた後、標識した酵素により発色する基質液を添加することにより、メンブレンの抗体を固定化した部分に着色が観察される。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
乳頭分泌液は血液や尿と異なり、粘調性等の試料性状にバラつきが大きく、しかも、採取できる量が２０μｌ以下の微量である場合が多い。前述のイムノクロマト法測定装置あるいはフロースルー法測定装置はクロマト用ストリップや多孔性メンブレンの全面を濡らすような多量の血液や尿を試料とする場合に使用されており、乳頭分泌液に適用できるとは考えられていなかった。即ち、試料が粘調で微量である場合にも、展開液によって多孔性基材中を均一に移動し、正確な測定ができる程度に試料中の分析対象物質が多孔性基材に固定化された抗体によりうまく捕捉できるか不明であった。
【０００８】
本発明の目的は、微量しか採取できない乳頭分泌液中の特定物質を短時間に精度よく測定する方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、これら従来の課題を解決し、乳癌のスクリーニングに役立てようとするものである。すなわち、本発明は
（１）微量の乳頭分泌液に含まれる特定物質（測定対象物質）を測定する方法であって、該特定物質あるいは該特定物質に対する抗体を固定化した多孔性基材を使用し、乳頭分泌液を多孔性基材の該特定物質あるいは該特定物質に対する抗体を固定化した部位を通過させ、その部位あるいはその下流に検出可能な信号を得ることにより測定を行なうことを特徴とする微量の乳頭分泌液に含まれる特定物質の測定方法、
【００１０】
（２）測定に用いる乳頭分泌液の量が２０μｌ以下である上記（１）に記載の測定方法、
（３）信号を得るために標識抗体を用い、サンドイッチ形式で測定を行う上記（１）または（２）に記載の測定方法、
（４）信号を得るための標識が金属コロイド粒子、非金属コロイド粒子または着色ラテックス粒子である上記（３）に記載の測定方法、
【００１１】
（５）乳頭分泌液を展開液により多孔性基材中を移動させる上記（１）から（４）のいずれかに記載の測定方法、
（６）乳頭分泌液に含まれる特定物質が乳ガンの発症に伴い乳頭分泌液中の濃度が変化する物質である上記（１）から（５）のいずれかに記載の測定方法、
【００１２】
（７）乳頭分泌液に含まれる特定物質がＣＥＡ（癌胎児性抗原）である上記（１）から（５）のいずれかに記載の測定方法、
（８）乳頭分泌液に含まれる特定物質がＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗原である上記（１）から（５）のいずれかに記載の測定方法、
（９）乳頭分泌液に含まれる特定物質がヘモグロビンである上記（１）から（５）のいずれかに記載の測定方法、に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。乳癌の発症などに伴う乳頭分泌液は、一般に微量にしか採取できず、多くの患者を対象にして本発明の測定方法を適用するためには、測定に必要な乳頭分泌液量は５０μｌ以下、好ましくは２０μｌ以下、より好ましくは０．１〜２０μｌ、特に好ましくは０．５〜１０μｌである。患者から採取した乳頭分泌液は試験管などにとり、希釈して測定することもできるが、使用者の簡便性を考えると、そのまま希釈せずに測定する方が好ましい。さらに、乳頭より直接に一定量の乳頭分泌液が採取できる簡易測定装置を使用することは、使用者の負担を著しく軽減し、一層好ましい。
【００１４】
本発明において、乳頭分泌液中に含まれる特定物質は抗体を用いて測定可能な物質であれば特に限定されないが、乳癌のスクリーニングを目的とした場合には、乳ガンの発症に伴い乳頭分泌液中の濃度が変化する物質である。その代表的なものとして、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ｅｒｂＢ−２、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、ＣＡ１５−３、ＣＡ７２−４、ＴＰＡ（組織ポリペプチド抗原）、ＣＡ１２５、ＩＡＰ（免疫抑制酸性蛋白）、フェリチン、ＣＡ５４／６１、ＣＡ６０２、ＣＡ１９−９、ＣＡ５４９、ｒａｓ蛋白、Ｐ５３およびヘモグロビン等が挙げられる。その中で特に好ましい物質は、ＣＥＡ、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、ヘモグロビンである。これらの物質は、単独で測定しても良いし、２つ以上を組み合わせて測定しても良い。
【００１５】
特定物質に対する抗体は公知の方法で作成することができる。ウサギ、モルモット、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウマなどの哺乳動物やニワトリ、アヒル、ガチョウなどの鳥類に抗原やハプテン等を免役して得られるものや、細胞融合などの技術を用いて得られるものでもよい。抗体の種類も問わない。ＩｇＧ，ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＹ抗体のうちの１種または２種以上の混合物であってもよく、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のどちらでも使用できる。モノクローナル抗体はマウス腹水、培養上清等より得られるものであっても良い。抗体はペプシン、パパイン等の酵素処理や還元等の化学処理により、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ’、Ｆａｂの様な抗体断片にして使用することもできる。
【００１６】
多孔性基材とは、毛管作用により流体が流れることのできる孔を有する材料を意味し、ペーパークロマトグラフィーや薄層クロマトグラフィーに用いられる材料や濾過に用いられる材料等が含まれる。多孔性基材は試料が毛細管力により移動できる孔を有するものであればいずれでも良い。孔径としては０．１μｍ以上、好ましくは１〜３０μｍ、より好ましくは１〜１０μｍが良い。具体的にはシリカ、チタニア、ジルコニア、セリアおよびアルミナ等のセラミック微粒子や有機高分子の微粒子、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、ニトロセルロースや酢酸セルロースなどのセルロース誘導体等の織った繊維状マトリクスおよび織ってない繊維状マトリクスや膜、濾紙、ガラス繊維濾紙、布、綿等があげられる。微粒子はそれ自体が多孔性でなくとも、充填された状態では微粒子間に空隙が生じ多孔性基材となる。好ましくはセルロース誘導体やナイロンの膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等であり、より好ましくはニトロセルロース膜、混合ニトロセルロースエステル（ニトロセルロースと酢酸セルロースの混合物）膜、ナイロン膜、濾紙である。これらの材料は必要に応じ、プラスチック等の水不透過性の材料で裏打ちしたものであっても良い。
【００１７】
多孔性基材への測定対象物質あるいは測定対象物質に対する抗体の固定化は直接的または間接的に行われる。直接的固定化としては物理吸着を利用しても良いし、共有結合によっても良い。一般に多孔性基材がニトロセルロース膜、または混合ニトロセルロースエステル膜の場合、物理吸着を行うことができる。共有結合では多孔性基材の活性化には一般的に臭化シアン、グルタルアルデヒドおよびカルボジイミド等が用いられるが、これらに限定されるものではない。間接的な固定化としては不溶性微粒子に測定対象物質あるいは測定対象物質に対する抗体を結合させた後に多孔性基材に固定化する方法がある。微粒子への抗体の固定化には物理吸着、共有結合のいずれの方法でも使用可能である。微粒子の粒径は多孔性基材に補足されるが移動できないサイズのものを使用して多孔性基材に固定化する。不溶性微粒子としては平均粒径１０μｍ程度以下の微粒子が好適に用いられる。これらの粒子としては抗原抗体反応に使用されるものが種々知られており、本発明でもこれら公知の粒子が特に限定されずに使用できる。例えば、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体などの乳化重合法によって得られる有機高分子ラテックス粒子などの有機高分子物質の微粒子、ゼラチン、ベントナイト、アガロース、架橋デキストランなどの微粒子、シリカ、シリカ−アルミナ、アルミナなどの無機酸化物や無機酸化物にシランカップリング処理などで官能基を導入した無機粒子等が挙げられる。
【００１８】
測定対象物質あるいは測定対象物質に対する抗体を固定化した後、多孔性基材は干渉を防ぐために必要に応じて公知の方法でブロッキング処理を行うことができる。一般にブロッキング処理はウシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼイン、ゼラチン等の蛋白質、ツイーン２０、トリトンＸ−１００、ＳＤＳ等の界面活性剤、ポリビニルアルコール、エタノールアミン等のうちの１つまたは２つ以上を組み合わせて行われる。ブロッキング処理を必要としないエタノールアミン基を導入した濾紙も本発明では使用できる。
【００１９】
多孔性基材への測定対象物質あるいは測定対象物質に対する抗体の固定化には、いろいろな方法が使用できる。例えば、マイクロシリンジ、調節ポンプ付きペン、シルクスクリーン印刷、グラビア印刷、転写プリント、インキ噴射印刷等いろいろな印刷技術が使用可能である。形態としては特に限定されないが、円形のスポット、多孔性基材のクロマト方向に垂直にのびるライン、数字、文字や＋、−などの記号等として固定化することができる。また、固定化する物質の溶液に漬けて多孔性基材全体に固定化する場合もある。
【００２０】
本発明において、検出可能な信号を得るためにはラジオアイソトープ、酵素、蛍光物質、着色粒子などの標識物質を測定対象物質あるいは測定対象物質に対する抗体に結合した標識結合体を用いる必要がある。特別な装置を使用せず肉眼で結果を判定するためには発色基質との反応によって着色を得ることのできる酵素やそのまま着色が観察できる有色又は着色粒子による標識が好ましい。有色又は着色粒子は酵素反応を行わせるための洗浄操作や発色反応操作を必要としないので一層好ましい。
【００２１】
酵素としては、アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ等があり、例えば石川栄治らの「酵素免疫測定法第３版（医学書院、１９８７年）」に記載されるような公知の方法により標識結合体を調製することができる。また、それぞれの酵素に対応する発色基質も公知のものが使用でる。
【００２２】
有色又は着色粒子としては金、銀、白金、プラチナ、銅のような金属コロイド、酸化鉄のような金属酸化物コロイド、硫黄、セレン、テルルなどの非金属コロイド、顔料粒子、ラテックス粒子を染色したもの、リポソームなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。有色又は着色粒子が毛管現象により多孔性基材中を移動するためには、粒子径が毛管より小さい必要があり、平均粒径は１μｍ以下、とくに０．５μｍ以下であることが好ましい。有色又は着色粒子を用いて標識結合体を調製するには、物理吸着や化学結合などの公知の方法が使用できる。例えば、金コロイドに抗体を結合した金コロイド標識抗体は、金コロイド溶液に抗体を加えて物理吸着させた後、牛血清アルブミン溶液を添加して金コロイドの抗体未結合表面をブロックすることにより調製される。
【００２３】
標識結合体は、多孔性基材に配置（塗布・乾燥等により配置）させて使用することもできるし、標識結合体液として後から添加することもできる。
多孔性基材に配置する場合、多孔性基材が湿潤した時、速やかに溶解して毛管作用によって自由に移動できるように支持される。支持されている部位にはこれら粒子の再溶解性を良好にするため、サッカロース、マルトース、ラクトース等の糖類、マンニトール等の糖アルコールを添加して塗布したり、これらの物質を予めコーティングしておくことも可能である。標識結合体を塗布・乾燥等により配置させる多孔性基材は測定対象物質あるいは測定対象物質に対する抗体を固定化した多孔性基材であってもよく、別の多孔性基材に塗布・乾燥等により配置させたのち、測定対象物質あるいは測定対象物質に対する抗体を固定化した多孔性基材と毛管で繋がるように配置してもよい。作製する簡易測定装置の形態によって適宜選択される。また、標識結合体を多孔性基材に支持する方法としては前述の多孔性基材へ測定対象物質あるいは測定対象物質に対する抗体を固定するのに用いたのと同様な印刷技術等が使用できる。
【００２４】
標識結合体液として使用する場合、一般的には緩衝液に溶解して使用する。例えばリン酸、トリス−塩酸、酢酸、ホウ酸、炭酸、グッドの緩衝塩類を含む緩衝液などが使用でき、食塩なども添加される。また、この緩衝液には標識結合体の安定化や非特異的反応を抑制するために公知の添加剤も使用できる。例えば、牛血清アルブミン、カゼイン、ゼラチンなどの蛋白質、ポリエチレングリコール、デキストラン、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の高分子化合物や、他のイオン性界面活性剤、デキストラン硫酸、ヘパリン、ポリスチレンスルホン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等のポリアニオンまたはその塩等、アジ化ナトリウム、チメロサール、ケーソンＣＧ、長鎖アルキル４級アンモニウム塩などの抗菌剤などが添加できる。
【００２５】
本発明を実施する際に使用される測定方法としてはイムノクロマト法あるいはフロースルー法が挙げられる。測定形式としては、例えばＰ．ＴＩＪＳＳＥＮの「エンザイムイムノアッセイ（生化学実験方法１１、東京化学同人、１９８９年）」２９７〜３１４ページに記載されるような抗体あるいは抗原（測定対象物質）を固定化した固相を用いる種々の公知の形式を用いることができる。
【００２６】
イムノクロマト法は、その特定部位に測定対象物質あるいはそれに対する抗体が固定化されたクロマトグラフィー用基材（多孔性基材）中を試料（本発明の場合は乳頭分泌液）を毛管現象により移動させ、試料中の測定対象物質、標識をつけた測定対象物質あるいは測定対象物質に対する標識抗体の該特定部位での免疫反応による捕獲を検出することにより試料のアッセイを行なう方法である。
又、フロースルー法は、測定対象物質あるいはそれに対する抗体が固定化された多孔性メンブレンの上面から下面に試料（本発明の場合は乳頭分泌液）を通過させ、試料中の測定対象物質、標識をつけた測定対象物質あるいは測定対象物質に対する標識抗体の該メンブレンでの免疫反応による捕獲を検出することにより試料のアッセイを行なう方法である。
【００２７】
その代表例をイムノクロマト法で説明する。反応形式には「従来の技術」の項で説明したサンドイッチ形式や結合阻害形式あるいは競合形式などがある。結合阻害形式の例としては、液体が毛管現象で移動することができる多孔性のシート状ストリップ（クロマトグラフィー用基材）の特定部位に、測定対象である抗原が固定化されており、その上流に金コロイドなどの着色粒子で標識された標識抗体がストリップ上に固定されていない状態で塗布・乾燥等により配置されている。標識抗体の上流から液体試料を添加すると、試料はストリップ中の毛管を伝わって標識抗体を溶解し、さらに、ストリップの抗原を固定化した部位を通過して下流に移動する。試料中に抗原が存在するとき、標識抗体は試料中の抗原と先に反応するので、ストリップに固定化した抗原とは反応できない。そのため抗原固定化部位に着色は観察されず、抗原固定化部位の下流に着色が観察される。試料中に抗原が存在しないときには、標識抗体は固定化した抗原に捕獲されるため、抗原固定化部位に着色が観察され、抗原固定化部位の下流には着色が観察されない。
【００２８】
競合形式の例としては、多孔性のシート状ストリップの特定部位に測定対象である抗原に対する抗体が固定化されており、その上流に金コロイドなどの着色粒子で標識された標識抗原がストリップ上に固定されていない状態で塗布・乾燥等により配置されている。標識抗原の上流から液体試料を添加すると、試料はストリップ中の毛管を伝わって標識抗原を溶解し、さらに、ストリップの抗体を固定化した部位を通過して下流に移動する。試料中に抗原が存在するとき、固定化した抗体は試料中の抗原と反応し、標識抗原との反応は妨害される。従って、ストリップの抗体固定化部位に着色は観察されず、抗体固定化部位の下流に着色が観察される。試料中に抗原が存在しないときには、固定化した抗体に標識抗原が捕獲されるため、抗体固定化部位に着色が観察され、抗体固定化部位の下流には着色が観察されない。
【００２９】
測定形式には上に説明した以外の形式もあり、これに限定されるものではない。特に好ましい測定形式としては、多孔性基材に抗体を固定化し、標識抗体とともに測定を行うサンドイッチ形式である。
【００３０】
なお、測定対象物質が酵素や酵素活性物質である場合には、標識結合体を必要としない場合がある。例えば、ヘモグロビンはペルオキシダーゼ活性を有しており、多孔性基材に固定化された酵素活性を阻害しない抗体に捕獲されたヘモグロビンは、ジアミノベンジジンやテトラメチルベンジジンと過酸化水素よりなる発色液を使用して検出できる。本発明の測定方法には、このような場合も含まれる。
【００３１】
本発明の方法において、乳頭分泌液はキャピラリーやピペット等の器具を用いて採取することもでき、採取方法は必ずしも限定されないが、微量にしか採取できないので、乳頭から直接に一定量の試料を採取して測定する方法が好ましい。さらに、使用者が採取量を知るために注意深く目盛りを読んだり採取器具の調整しなくとも、乳頭に押し当てるだけで一定量の試料が採取できる方法はより好ましい。
【００３２】
本発明においては、必要により、測定対象物質やそれに対する抗体を固定した多孔性基材中を試料（乳頭分泌液）を移動させて測定を完了させるための展開液を別に使用する。展開液は測定対象物質やそれに対する抗体を固定した多孔性基材に試料が浸透する位置あるいはその上流から添加する。更に、展開液は別の容器に入れて添加することもできるが、あらかじめ本測定のための装置の部分として装置に組み込んで使用することもできる。展開液には標識結合体液のところで記載した緩衝液や添加物と同様なものが使用される。標識結合体液をそのまま展開液としてもよい。また、標識が酵素の場合や標識結合体液を展開液として用いた場合、多孔性基材の判定部分に標識が残り、判定を妨害することがある。その場合には、さらに洗浄液を用い、多孔性基材中に残留した標識を移動させることもできる。特に標識が酵素の場合には、非常に微量な残留であっても鋭敏に反応するので、発色反応のまえに充分洗浄する必要がある。洗浄液も標識結合体液のところで記載した緩衝液や添加物と同様なものが使用される。
【００３３】
以下に、本発明を実施する際に使用することができる具体的な簡易測定装置を図によって説明する。
【００３４】
図１はイムノクロマト法用の簡易測定装置の一例の概略図である。プラスチック製ケース２は展開液添加口３、試料添加口４および判定窓５を有する。図２は図１で示した簡易測定装置の側断面図である。クロマト用ストリップ６は両面テープ７でケース２に接着されている。クロマト用ストリップ６の最上流で展開液添加口３の直下と、最下流の位置には吸水用部品８、９が置かれ、ケースによって固定されている。クロマト用ストリップ６は判定窓５の直下に抗体を固定化した部位を有し、さらに展開液添加口３の下流で試料添加口４の上流の位置に金コロイド粒子標識抗体添着部１０を有する。試料は試料添加口４からマイクロピペット等でクロマト用ストリップに添加する。展開液添加口３から添加された展開液が金コロイド標識抗体と添加された試料をクロマトさせる。試料に分析対象物質が含まれる場合には金コロイドによる着色が判定窓５より観察できる。
【００３５】
図３はイムノクロマト法による簡易測定装置の別の一例の概略図である。プラスチック製の持ち手部分１１と吸水性材料１２からなる試料採取部分から構成される乳頭から分泌液を直接採取するための試料採取部品を有する。ポリスチレン製ケース１３は展開液添加口１４、採取部品を組み込み試料を添加する試料添加口１５および判定窓１６を有する。図４は図３で示した簡易測定装置の側断面図である。抗体固定化ストリップ１７と金コロイド標識抗体ストリップ１８は両面テープ１１０でケース１３に接着されている。金コロイド標識抗体ストリップ１８の最上流で展開液添加口１４の直下と、抗体固定化ストリップの最下流の位置には吸水用部品１１１、１１２が置かれ、ケースによって固定されている。抗体固定化ストリップ１７は判定窓１６の直下に抗体を固定化した部位を有し、金コロイド標識抗体ストリップ１８は展開液添加口１４の下流で試料添加口１５の上流の位置に金コロイド粒子標識抗体添着部１９を有する。金コロイド標識抗体ストリップ１８と抗体固定化ストリップ１７は採取部品が組み込まれた時、吸水性材料１２がそれらと一部分が重なって毛管で繋がるように分離して配置されている。試料を採取した採取部品を試料添加口１５に組み込み、展開液添加口１４より展開液を添加することにより、試料中に分析対象物質が存在する場合には金コロイドの着色が判定窓１６より観察できる。
【００３６】
図５もクロマト法による簡易測定装置の一例の概略図である。プラスチック製ケース２３は試料添加口２４と判定窓２５を有する。図６は図５で示した簡易測定装置の側断面図である。抗体固定化ストリップ２６は両面テープ２７でケース２３に固定されている。抗体固定化ストリップ２６の最上流と最下流には吸水用部品２８、２９がケースによって固定されている。抗体固定化ストリップ２６は判定窓２５の直下に抗体を固定化した部分を有する。試料はマイクロピペット等により試料添加口２４から吸水用部品２８に添加する。その後、金コロイド標識抗体を含む展開液を試料添加口２４より添加すると展開液とともに試料はクロマトされ、試料中に分析対象物質が含まれる場合には金コロイドの着色が判定窓２５より観察できる。
【００３７】
図７はフロースルー法による簡易測定装置の一例の概略図であり、試料添加口３３および空気抜き穴３６を有する筒形の装置である。図８は図７で示した簡易測定装置の側断面図である。プラスチック成形体３４に抗体固定化メンブレン３５を抗体が固定化された部分がプラスチック成形体の試料添加口３３の中心にくるように挿入し、さらに厚手の濾紙を重ねて作製した吸水用部品３７を挿入し、プラスチック成形体３４の試料添加口３３と抗体固定化メンブレン３５および抗体固定化メンブレン３５と吸水用部品３７が完全に密着し、展開液を試料添加口から添加しても周りに漏れずに抗体固定化メンブレン３５を通過して吸水用部品３７に吸収されるように下から蓋３８をする。試料をマイクロピペット等により試料添加口３３から抗体固定化メンブレン３５の抗体を固定化した部分に添加し、更に金コロイド標識抗体を含む展開液を添加する。展開液が完全に吸収された後、さらに洗浄液を添加して吸収させる。試料中に分析対象物質が含まれる場合、抗体固定化部位に金コロイドの着色が観察できる。
【００３８】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３９】
実施例１イムノクロマト法によるＣＥＡ標準液および乳頭分泌液中ＣＥＡの測定１
（１）金コロイドの調製
濃度０．０１重量％の塩化金酸水溶液２００ｍｌを沸騰させ、これに濃度１重量％のクエン酸ナトリウム水溶液３ｍｌを加え、溶液の色が赤色に変わるまで加熱沸騰を行い、平均粒径２５ｎｍの金コロイド分散液を調製した。
【００４０】
（２）金コロイド粒子標識抗体の調製
上記の金コロイド分散液１０ｍｌに０．１Ｍ塩酸−炭酸カリウム緩衝液ｐＨ９．０を０．５ｍｌ加えてｐＨを調整し、これにウサギ抗ヒトＣＥＡ抗体を、金コロイド分散液１ｍｌあたり３０μｇとなるように加えて室温で１時間緩やかに振とうした。その後、その１０ｍｌに８重量％ＢＳＡを含む２ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ９．０を１．５ｍｌ加え、室温で３０分間緩やかに振とうした。さらに、この分散液を４℃で１０，０００ｒｐｍ１時間遠心して上清を除いた後、得られたペレットに濃度１重量％のＢＳＡを含む２ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．６を１０ｍｌ加えて再懸濁した。同様にして遠心操作をさらに２回繰り返した後、上記トリス−塩酸緩衝液にてＯＤ（５２０ｎｍ）＝２０になるように再懸濁して金コロイド粒子標識抗体を調製した。
【００４１】
（３）ストリップの作製
５０ｍＭリン酸生理食塩水ｐＨ７．２に溶解したマウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体（濃度１．２ｍｇ／ｍｌ）を５×５０ｍｍに切断したミリポア社製ニトロセルロースメンブレン（ハイフローメンブレン、マイラーバック）の図１で示す検出部位５に相当する位置に幅１ｍｍのライン状に添着し風乾した。その後、濃度５重量％カゼインを含む５０ｍＭリン酸生理食塩水ｐＨ７．２に室温で２時間浸漬し、再び風乾した。さらに図２の１０の位置に相当する部位に５重量％のサッカロースを添加した（２）で調製した金コロイド粒子標識抗体液を５μｌずつ、乾燥させながら２回添着し、ストリップを作製した。
【００４２】
（４）装置の作製
図１に示すように、展開液添加口３、試料添加口４および判定窓５を有するポリエチレン製ケース２にその構成部品を納めて作製した。図２示すように、上記（３）で作製したストリップ６のマイラーバックの面を両面テープ７でケース２に接着し、その両端（展開液添加口３の直下と最下流の位置）に、ワットマン社製ガラス繊維濾紙ＧＦ／Ｄ５×８ｍｍを吸水性部材８，９として置き、ポリエチレン製ケースにより吸水性部材をストリップの上に固定し装置とした。
【００４３】
（５）測定
標準液として濃度０、２００、４００、１０００、３０００ｎｇ／ｍｌのＣＥＡと濃度１重量％のＢＳＡを含む５０ｍＭリン酸生理食塩水ｐＨ７．２及び乳癌患者の乳頭分泌液各３．０μｌを装置の試料添加口４からストリップ上に添加し、次いで、展開液として５０ｍＭリン酸生理食塩水ｐＨ７．２を１００μｌ展開液添加口３から吸水性部材８の上に添加し、１０分後に判定を行った。結果は表１に示す。標準液のＣＥＡ濃度４００nｇ／ｍｌ以上で判定窓の中に金コロイドによる赤色のバンドが観察された。既知濃度の乳頭分泌液でもそれに対応する濃度で陽性・陰性が判定された。
【００４４】
実施例２イムノクロマト法によるＣＥＡ標準液および乳頭分泌液中ＣＥＡの測定２
（１）抗体固定化ストリップの作製
５０ｍＭリン酸生理食塩水ｐＨ７．２に溶解したマウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体（濃度１．２ｍｇ／ｍｌ）を５×２６ｍｍに切断したミリポア社製ニトロセルロースメンブレン（ハイフローメンブレン、マイラーバック）の図３で示す検出部位１６に相当する位置に幅１ｍｍのライン状に添着し風乾した。その後、濃度５重量％カゼインを含む５０ｍＭリン酸生理食塩水ｐＨ７．２に室温で２時間浸漬し、再び風乾して抗体固定化ストリップを作製した。
【００４５】
（２）金コロイド粒子標識抗体ストリップの作製
東洋濾紙社製の濾紙Ｎｏ．５０を５×２０ｍｍの大きさに切断し、濃度５重量％カゼインを含む５０ｍＭリン酸生理食塩水ｐＨ７．２に室温で２時間浸漬したのち乾燥させた。さらに、図４の１９の位置に相当する部位に５重量％のサッカロースを添加した実施例１の（２）で調製した金コロイド粒子標識抗体液を５μｌずつ、乾燥させながら２回添着し、金コロイド粒子標識抗体ストリップを作製した。
【００４６】
（３）装置の作製
図３に示すように、展開液添加口１４、採取部品を組み込み試料を添加する試料添加口１５および判定窓１６を有するポリエチレン製ケース１３にその構成部品を納めて作製した。図４に示すように、上記（１）で作製した抗体固定化ストリップ１７（マイラーバックの面）および（２）で作製した金コロイド粒子標識抗体ストリップ１８を両面テープ１１０でケース３に接着し、実施例１と同様に展開液添加口１４の直下と最下流の位置に、ワットマン社製ガラス繊維濾紙ＧＦ／Ｄ５×８ｍｍを吸水性部材１１１，１１２として置き、ポリエチレン製ケースにより吸水性部材を抗体固定化ストリップおよび金コロイド粒子標識抗体ストリップの上に固定し装置とした。また、試料採取部品は東洋濾紙社製の濾紙Ｎｏ．５０を４×６ｍｍの長方形に切断した採取部分１２をプラスチック成形体１１の底面に両面テープで貼り付けて作製した（図３）。
【００４７】
（４）測定
標準液として濃度０、２００、４００、１０００、３０００ｎｇ／ｍｌのＣＥＡと濃度１重量％のＢＳＡを含む５０ｍＭリン酸生理食塩水ｐＨ７．２及び乳癌患者の乳頭分泌液の各５μｌを図３の採取部品の採取部分１２に吸収させて採取した。採取部品を装置の試料添加口１５に組み入れ、採取部品の試料採取部分１２を装置のストリップ１７，１８と密着させた。その後、展開液として５０ｍＭリン酸生理食塩水ｐＨ７．２を１００μｌ展開液添加口１４から吸水性部材１１１の上に添加し、１０分後に判定を行った。結果は表１に示す。標準液のＣＥＡ濃度４００nｇ／ｍｌ以上で判定窓の中に金コロイドによる赤色のバンドが観察された。既知濃度の乳頭分泌液でもそれに対応する濃度で陽性・陰性が判定された。
【００４８】
【表１】

【００４９】
実施例３イムノクロマト法によるＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗原の測定
（１）金コロイド粒子標識抗体を含む展開液の調製
実施例１の（１）の金コロイド分散液１０ｍｌに０．１Ｍ塩酸−炭酸カリウム緩衝液ｐＨ９．０を０．５ｍｌ加えてｐＨを調整し、これにマウス抗ＮＣＣ−ＳＴ−４３９モノクローナル抗体を、金コロイド分散液１ｍｌあたり４０μｇとなるように加えて室温で１時間緩やかに振とうした。その後、その１０ｍｌに８重量％ＢＳＡを含む２ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ９．０を１．５ｍｌ加え、室温で３０分間緩やかに振とうした。さらに、この分散液を４℃で１０，０００ｒｐｍ１時間遠心して上清を除いた後、得られたペレットに濃度１重量％のＢＳＡを含む２ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．６を１０ｍｌ加えて再懸濁した。同様にして遠心沈降処理をさらに２回繰り返した後、上記トリス−塩酸緩衝液にてＯＤ（５２０ｎｍ）＝２０になるように再懸濁し、さらにＯＤ（５２０ｎｍ）＝５になるように５０ｍＭリン酸生理食塩水ｐＨ７．２で希釈し、金コロイド標識抗体を含む展開液を調製した。
【００５０】
（２）抗体固定化ストリップの作製
５０ｍＭリン酸生理食塩水ｐＨ７．２に溶解したマウス抗ＮＣＣ−ＳＴ−４３９モノクローナル抗体（濃度５ｍｇ／ｍｌ）を５×３５ｍｍに切断したミリポア社製ニトロセルロースメンブレン（ハイフローメンブレン、マイラーバック）の図５で示す検出部位２５に相当する位置に幅１ｍｍのライン状に添着し風乾した。その後、濃度５重量％カゼインを含む５０ｍＭリン酸生理食塩水ｐＨ７．２に室温で２時間浸漬し、再び風乾して抗体固定化ストリップを作製した。
【００５１】
（３）装置の作製
図５で示すように、試料添加口２４および判定窓２５の２か所に開口部を持つプラスチックケース２３にその構成部品を納めて作製した。図６示すように、上記（２）で作製した抗体固定化ストリップ２６のマイラーバックの面を両面テープ２７でケース２３に接着し、その両端に、ワットマン社製ガラス繊維濾紙ＧＦ／Ｄ５×８ｍｍを吸水性部材２８，２９として置き、ポリエチレン製ケースにより吸水性部材を抗体固定化メンブレンの上に固定しイムノクロマト装置とした。
【００５２】
（４）測定
ＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗原濃度が既知の乳癌患者の乳頭分泌液各１０μｌを装置の試料添加口２４から添加し、次いで、５０ｍＭリン酸生理食塩水ｐＨ７．２からなる展開液５０μｌを試料添加口２４から添加し、展開液が完全に吸収された後に、更に金コロイド粒子標識抗体を含む展開液１００μｌを同様に添加し、１０分後に判定を行った。結果は表２に示す。既知濃度の乳頭分泌液で濃度に対応して陽性・陰性が判定された。
【００５３】
【表２】

【００５４】
実施例４フロースルー法による乳頭分泌液中のヘモグロビンの測定
（１）抗体固定化メンブレンの作製
濃度８ｍｇ／ｍｌのマウス抗ヒトヘモグロビン抗体を含む５０ｍＭのリン酸生理食塩水ｐＨ７．２をポール社製イムノダインイムノアフィニティーメンブレン（３μｍ）に０．５μｌドットし風乾した。その後メンブレンを濃度２．５重量％のカゼインナトリウムと濃度８重量％のサッカロースを含む５０ｍＭのリン酸生理食塩水ｐＨ７．２に室温２時間漬けた後、濾紙上にメンブレンを取り出し水分を吸い取り、乾燥して抗体固定化メンブレンを作製した。
【００５５】
（２）装置の作製
図７および図８に示すように、試料添加口３３と空気穴３６のあるプラスチック成形体３４に（１）で作製したメンブレン３５をメンブレンの抗体がドットされた部分がプラスチック成形体の試料添加口３３の中心にくるように挿入し、さらに厚手の濾紙を重ねて作製した吸水性部材３７を重ねて挿入し、プラスチック成形体の試料添加口とメンブレンおよびメンブレンと吸水性部材が完全に密着し、展開液を試料添加口から添加しても周りに漏れずにメンブレンを通過して吸水性部材に吸収されるように下から蓋３８をして装置とした。
【００５６】
（３）展開液の調製
０．１Ｍの尿素および濃度０．１重量％のツイーン２０を含む５０ｍＭのリン酸生理食塩水ｐＨ７．２を展開液とした。
【００５７】
（４）発色液の調製
濃度３ｍｇ／ｍｌになるようにテトラメチルベンジジンをジメチルホルムアミドに溶解し、その４ｍｌを９６ｍｌの０．０１２６重量％の過酸化水素を含む０．１Ｍ酢酸ナトリウムクエン酸緩衝液ｐＨ６．０に加えて良く混合し、発色液とした。
【００５８】
（５）測定
ヘモグロビンの有無が既知である乳癌患者の乳頭分泌液各１０μｌを試料添加口３３からメンブレンの抗体をドットした部分に添加した。その後、展開液を２００μｌ試料添加口３３から添加し完全に展開液が吸収されるまで待った。展開液の添加を３回繰り返した後、メンブレンの抗体をドットした部分に発色液を２００μｌ滴下して、３分後にメンブレンの着色を観察した。結果を表３に示す。ヘモグロビン陽性検体Ｉ，Ｊでは着色が観察されたが、陰性検体Ｋでは着色が観察されなかった。
【００５９】
【表３】

【００６０】
【発明の効果】
本発明によれば、微量にしか採取できない乳頭分泌液中の特定物質を、短時間に精度よく測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で用いたイムノクロマト法による簡易測定装置の概略図
【図２】図１で示した簡易測定装置の側断面図
【図３】実施例２で用いたイムノクロマト法による簡易測定装置の概略図
【図４】図３で示した簡易測定装置の側断面図（採取部品を除く）
【図５】実施例３で用いたイムノクロマト法による簡易測定装置の概略図
【図６】図５で示した簡易測定装置の側断面図
【図７】実施例４で用いたフロースルー法による簡易測定装置の概略図
【図８】図７で示した簡易測定装置の側断面図

Claims

０．１〜２０μｌの乳頭分泌液に含まれる特定物質を測定する方法であって、該特定物質あるいは該特定物質に対する抗体を固定化した多孔性基材のシート状ストリップを使用し、乳頭分泌液を希釈することなく、試料添加口からストリップまたは吸水用部品に添加し、展開液を展開液添加口または試料添加口から添加して該シート状ストリップに添着した標識抗体若しくは該展開液に溶解した標識抗体を該乳頭分泌液に接触させ、続いて該特定物質あるいは該特定物質に対する抗体を固定化した部位を通過させ、その部位あるいはその下流に検出可能な信号を得ることにより測定を行なうことを特徴とする乳頭分泌液に含まれる特定物質のイムノクロマト法による測定方法。
標識抗体の標識が金属コロイド粒子、非金属コロイド粒子または着色ラテックス粒子であり、サンドイッチ形式で測定を行なう請求項１に記載の測定方法。
標識抗体が金コロイド粒子標識抗体である請求項２に記載の測定方法。
乳頭分泌液に含まれる特定物質が乳ガンの発症に伴い乳頭分泌液中の濃度が変化する物質である請求項１から３のいずれかに記載の測定方法。
乳頭分泌液に含まれる特定物質がＣＥＡ（癌胎児性抗原）である請求項１から３のいずれかに記載の測定方法。
乳頭分泌液に含まれる特定物質がＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗原である請求項１から３のいずれかに記載の測定方法。