CN102388312B - 分析方法、样品分析用具、防止样品液逆流的方法和防止背景上升的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种能够不耗费成本且利用简易的方法防止背景上升的分析方法。本发明的分析方法的特征在于，使用在展开部件(11)中从展开液流的上游至下游依次配置有展开液供给部(12)、样品供给部(13)以及固定化有与样品中的分析对象物(16)特异性结合的物质(17)的检测部(14)的样品分析用具10，向样品供给部(13)供给样品液，与上述样品液的供给同时或在上述样品液的供给之前向展开液供给部(12)供给展开液，在被标识化了的特异性结合物质(15)的存在下，通过上述展开液在展开部件(11)中展开，上述样品液被导入至检测部(14)，在检测部(14)中，形成被固定化了的特异性结合物质(17)、分析对象物(16)和被标识化了的特异性结合物质(15)的复合体(18)，通过检测复合体(18)中的标识(19)来进行分析对象物(16)的分析。

Description

分析方法、样品分析用具、防止样品液逆流的方法和防止背景上升的方法

技术领域

本发明涉及分析方法、样品分析用具、防止样品液逆流的方法和防止背景上升(background rise)的方法。

背景技术

以往，例如在感染症的诊断等中，利用免疫反应检测细菌或病毒等病原体的抗原的样品分析用具正在普及。在上述样品分析用具中，广泛使用免疫色谱法(免疫分析方法)。上述免疫分析方法是使用了与上述抗原等分析对象物特异性结合的物质(特异性结合物质)的分析方法中的一种。利用上述免疫分析方法可以进行简便且迅速的分析。近年来，也开发了将酶用于标识的免疫分析方法(酶免疫分析方法)(例如，参照专利文献1)。

上述酶免疫分析方法例如可按照以下方法进行。即，首先从鼻腔等提取样品，制备含有上述样品的样品液。另一方面，准备样品分析用具。在图6的(a)和(b)中，示出了样品分析用具的一例。图6的(a)是上述样品分析用具的平面图。图6的(b)是在图6的(a)的III-III方向观察的剖面图。上述两图中，对于相同的部分标注相同的符号。对于上述样品分析用具60而言，在多孔质体的展开部件61中，从展开液流的上游至下游(上述两图中从右侧至左侧)依次配置有展开液供给部62、样品供给部63和检测部64。在上述检测部64中，固定化有抗体(固定化抗体)。

首先，对上述样品供给部63供给上述样品液。接着，对上述展开液供给部62供给展开液。在上述展开部件61中，在利用酶标识的标识化抗体(酶标识化抗体)的存在下，通过上述供给的展开液展开，上述供给的样品液被导入至上述检测部64中。另外，通过上述供给的展开液展开，基质从上述展开液供给部62经由上述样品供给部63被导入至上述检测部64中。图6的(c)是表示上述检测部64中的抗原的检测的一例的示意图。在该图中，对于与图6的(a)和(b)相同的部分，标注相同的符号。如图6的(c)所示，上述样品中存在作为分析对象物的抗原66时，在上述检测部64中会形成上述酶标识化抗体65、上述抗原66和上述固定化抗体67的复合体68。在该状态下，通过检出由上述复合体68中的上述酶标识化抗体65的酶69和上述基质的反应所产生的发色或发光等来检出上述抗原66。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第3248436号公报

发明内容

发明要解决的问题

在上述酶免疫分析方法等免疫分析方法中，存在因背景的增加导致检测灵敏度降低的问题。另外，当增加了样品液量时，背景的增加是特别突出的问题。作为防止背景上升的方法，例如可以采取使用样品液保持部件、或增大展开部件等手段。然而，这些手段耗费成本。上述问题并不只存在于利用使用与作为样品中所含的分析对象物的抗原特异性结合的抗体的免疫反应的免疫分析方法，在所有使用与样品中所含的分析对象物特异性结合的物质(特异性结合物质)的分析方法中都可引起此问题。

因此，本发明的目的在于，提供能够不耗费成本且用简易的方法防止背景上升的分析方法、样品分析用具、防止样品液逆流的方法和防止背景上升的方法。

用于解决问题的手段

为了实现上述目的，本发明的分析方法的特征在于，其使用在展开部件中从展开液流的上游至下游依次配置有展开液供给部、样品供给部和检测部的样品分析用具，

在所述检测部中，固定化有与样品中的分析对象物特异性结合的物质，

向所述样品供给部供给含有所述样品的样品液，

与所述样品液的供给同时或在所述样品液的供给之前，向所述展开液供给部供给展开液，

在与所述分析对象物特异性结合的标识化物质的存在下，通过所述被供给的展开液在所述展开部件中展开，所述被供给的样品液被导入至所述检测部，

在所述检测部中，形成所述被固定化了的特异性结合物质、所述分析对象物、以及所述被标识化了的特异性结合物质的复合体，

通过检测所述复合体中的所述标识来进行所述分析对象物的分析。

另外，本发明的样品分析用具的特征在于，其用于所述本发明的分析方法，

在展开部件中，从展开液流的上游至下游依次配置有展开液供给部、样品供给部和检测部，

在所述检测部中固定化有与样品中的分析对象物特异性结合的物质。

另外，本发明的防止样品液逆流的方法的特征在于，其使用在展开部件中从展开液流的上游至下游依次配置有展开液供给部和样品供给部的样品分析用具，

向所述样品供给部供给含有样品的样品液，

与所述样品液的供给同时或在所述样品液的供给之前，向所述展开液供给部供给展开液，

通过所述被供给的展开液在所述展开部件中从所述上游向所述下游展开，来防止所述被供给的样品液向所述上游逆流。

另外，本发明的防止背景上升的方法的特征在于，其使用在展开部件中从展开液流的上游至下游依次配置有展开液供给部、样品供给部和检测部的样品分析用具，

向所述样品供给部供给含有所述样品的样品液，

与所述样品液的供给同时或在所述样品液的供给之前，向所述展开液供给部供给展开液，

在与被标识化了的所述分析对象物特异性结合的物质的存在下，通过所述被供给的展开液在所述展开部件中从所述上游向所述下游展开，来防止由于所述被供给的样品液向所述上游移动而引起的在所述检测部以外的位置检出所述标识。

发明效果

根据本发明，可以不耗费成本地以简易的方法防止背景的上升。

附图说明

图1的(a)是表示本发明的一个实施方式中使用的样品分析用具的一例的构成的平面图，图1的(b)是从图1的(a)所示的样品分析用具的I-I方向观察的剖面图；

图2的(a)是表示本发明的一个实施方式中使用的样品分析用具的另一例的构成的剖面图，图2的(b)是表示本发明的一个实施方式中使用的样品分析用具的再一例的构成的剖面图；

图3的(a)至(c)是说明本发明的一个实施方式中的免疫分析方法的剖面图，图3的(d)是表示检测部中的抗原的检出的示意图；

图4的(a)是表示本发明的一个实施方式中使用的样品分析用具的另一个例子的构成的平面图，图4的(b)是从图4的(a)所示的样品分析用具的II-II方向观察的剖面图；

图5是表示本发明的一个实施方式中使用的样品分析用具的再一例的构成的平面图；

图6的(a)是表示以往的酶免疫分析方法中使用的样品分析用具的一例的构成的平面图，图6的(b)是从图6的(a)所示的样品分析用具的III-III方向观察的剖面图，图6的(c)是表示检测部中的抗原的检出的示意图，图6的(d)是说明以往的酶免疫分析方法的剖面图。

具体实施方式

本发明人等为了实现上述目的，不断进行了一系列研究。其结果是，本发明人等发现了作为使用特异性结合物质的分析方法的一个例子的以往的免疫分析方法中的背景上升的原因。即，在以往的免疫分析方法中，样品液先于展开液被供给。基于图6的(d)的剖面图，说明以往的免疫分析方法中的样品液的流动。在该图中，对于与图6的(a)至(c)相同的部分，标注相同的符号。如图6的(d)所示，当供给样品液时(箭头f)，通过上述展开部件61的毛细管作用，上述样品液不仅向检测部64方向(箭头g)流动，还向展开液供给部62方向(箭头h)逆流。由于该逆流，标识化抗体的抗体与样品液中的抗原发生反应，引起在上述检测部64以外的位置的发色或发光等，背景就会上升。由该样品液的逆流引起的背景的上升，在所有使用特异性结合物质的分析方法中发生。基于这样的认识，本发明人等继续不断研究，结果发现，如果将展开液与样品液同时供给或先于样品液进行供给，就能够防止样品液向展开液供给部方向逆流，从而完成了本发明。根据本发明，不需要增大展开部件，也不需要样品液保持部件，能够不耗费成本且简易地防止背景的上升。而且，即使在增大样品液量的情况下，利用本发明也能防止背景的上升，因此也能够进一步提高例如分析精度。

上述特异性结合物质，例如可以是根据分析对象物质适当选择的来自生物体的物质，也可是人工生成(合成)的物质。作为上述特异性结合物质，可举出例如抗体、抗原、探针等。

在本发明的分析方法、防止样品液逆流的方法和防止背景上升的方法中的上述样品分析用具中，例如也可以相对于一个上述展开液供给部设置多个样品供给部和多个检测部。

在本发明的分析方法、防止样品液逆流的方法和防止背景上升的方法中，例如，上述样品分析用具还可以包括具有展开液供给口和样品供给口的盒体，上述展开部件可以配置在上述盒体内。

在本发明的分析方法、防止样品液逆流的方法和防止背景上升的方法中，例如，上述样品分析用具可以还包括第一展开液接受垫，上述第一展开液接受垫配置在比上述展开液供给部更上游的一侧并与上述展开部件接触，通过对上述第一展开液接受垫供给上述展开液，上述展开液向上述展开部件展开。

在本发明的分析方法、防止样品液逆流的方法和防止背景上升的方法中，例如，上述样品分析用具可以还包括第二展开液接受垫，上述第二展开液接受垫配置在比上述检测部更下游的一侧并与上述展开部件接触。

在本发明的分析方法、防止样品液逆流的方法和防止背景上升的方法中，例如，上述特异性结合物质可以是抗原或抗体。

在本发明的防止样品液逆流的方法中，例如也可以为上述样品分析用具还包括检测部，上述检测部与上述样品供给部相比配置在上述展开液流的更下游，上述检测部中固定化有与样品中的分析对象物特异性结合的物质，在与上述分析对象物特异性结合的标识化物质的存在下，通过上述供给的展开液在上述展开部件中展开，上述供给的样品液被导入至上述检测部中，在上述检测部中，形成上述被固定化了的特异性结合物质、上述分析对象物、以及上述被标识化了的特异性结合物质的复合体，通过检测上述复合体中的上述标识来进行上述分析对象物的分析。

在本发明的防止背景上升的方法中，例如也可以在上述检测部中固定化有与样品中的分析对象物特异性结合的物质，在与上述分析对象物特异性结合的标识化物质的存在下，通过上述供给的展开液在上述展开部件中展开，上述供给的样品液被导入上述检测部中，在上述检测部中，形成上述被固定化了的特异性结合物质、上述分析对象物、以及上述被标识化了的特异性结合物质的复合体，通过检测上述复合体中的上述标识来进行上述分析对象物的分析。

接着，对于本发明的分析方法、样品分析用具、防止样品液逆流的方法和防止背景上升的方法，以免疫分析方法为例进行详细地说明，该免疫分析方法是上述使用了特异性结合物质的分析方法之一。然而，本发明并不仅限于下述的免疫分析方法。此外，在以下的图1的(a)至图6的(d)中，对于相同的部分标注相同的符号。另外，在附图中，为了便于说明，有时将各部的结构适当地简化表示，有时各部的尺寸等与实际不同。

(实施方式1)

本实施方式的分析方法是使用固定化抗体作为上述“被固定化了的特异性结合物质”使用将酶用作标识的标识化抗体(酶标识化抗体)作为上述“被标识化了的特异性结合物质”的免疫分析方法(酶免疫分析方法)。在后述的实施方式2和3中也相同。另外，本实施方式的免疫分析方法中使用的样品分析用具是本发明的样品分析用具的一个例子。但本发明的样品分析用具并不限定于这些例子。

图1的(a)和(b)中示出了本实施方式的免疫分析方法中使用的样品分析用具的一个例子的构成。图1的(a)是本实施方式中使用的样品分析用具的平面图。图1的(b)是从图1的(a)的I-I方向观察的剖面图。如图所示，该样品分析用具10包括展开部件11。在上述展开部件11中从展开液流的上游至下游(上述两图中的从右侧至左侧)依次配置有展开液供给部12、样品供给部13和检测部14。在该样品分析用具10中，上述展开液供给部12、上述样品供给部13和上述检测部14分别为上述展开部件11中的规定区域。上述检测部14中，固定化有抗体(固定化抗体)。在该样品分析用具10中，上述检测部14为一个，但不限定于此，上述检测部例如可以根据要分析的抗原的项目数等具有多个。

上述展开部件是起到毛细管作用的多孔质结构即可。作为上述展开部件的形成材料，例如可举出多孔质膜、粒状物质或微粒粉末等。作为上述多孔质膜，例如可举出纤维素膜、乙酸纤维素、硝酸纤维素等纤维素衍生物膜、玻璃滤器、滤纸等。作为上述粒状物质或微粒粉末，例如可举出聚合物珠、玻璃珠、二氧化钛、纤维素、盐类、疏水化多糖类等。上述展开部件的尺寸没有特别的限制，例如可根据分析装置的规格等适当设定。

上述固定化抗体只要是与作为样品中的分析对象物的抗原结合的抗体即可。上述抗体可以根据后述的抗原等适当设定。上述抗体例如可以是来自生物体的抗体，也可以是人工合成的抗体。作为上述来自生物体的抗体，例如可举出免疫球蛋白(Ig)、抗体片段、嵌合(chimera)抗体等。作为上述免疫球蛋白，例如可举出IgG、IgA、IgM、IgE、IgD等。作为上述抗体片段，例如可举出Fab、Fab’、F(ab’)2等。作为上述嵌合体抗体，例如可举出人化抗体等。上述抗体例如可以是来自小鼠、兔、牛、猪、马、绵羊、山羊等哺乳动物，鸡等鸟类，人等动物种类的抗体，没有特别限制。另外，作为上述抗体，例如既可以采用以往公知的方法由来自上述动物种类的血清制作，或者也可以利用市售的各种抗体，没有特别限制。作为上述抗体，例如可以使用多克隆抗体和单克隆抗体中的任一种。作为上述人工合成的抗体，例如可举出亲和抗体(Affibody)等。作为抗体在上述检测部中的固定化方法，例如可举出使用涂布装置将含上述抗体的抗体液涂布于多孔质膜等展开部件，利用干燥机等使其风干的方法等。

在本发明中，样品分析用具例如可以使用市售品，也可自己制作。

在本发明中，上述样品液只要含有样品即可。作为上述样品，没有特别的限制，例如可举出生物体试样、食品等。上述样品可以是液状物质，也可以是将固体状物质诸如溶解、混悬或分散于缓冲液等中的样品。作为上述液状的生物体试样，例如可举出鼻腔吸引液、鼻腔清洗液、鼻腔擦拭液、鼻涕、咽喉擦拭液、含漱液、唾液、全血、血清、血浆、汗、尿等。作为上述固体状的生物体试样，例如可举出细胞、粪便等。作为上述食品，例如可举出动物和植物等食物、或加工食品等。作为上述缓冲液，没有特别的限制，例如可举出Tris缓冲液、磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、硼酸缓冲液等。上述缓冲液的pH没有特别的限制，例如为pH4～10的范围，优选pH6～9的范围。

在本实施方式的免疫分析方法中，上述样品中的分析对象物是与上述的固定化抗体和上述的标识化抗体结合的抗原。作为上述抗原，没有特别的限制，例如可举出甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、腺病毒、RS病毒、冠状病毒、星形病毒、诺罗病毒、麻疹病毒、轮状病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、人T细胞白血病病毒(HTLV-1)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、疱疹病毒、支原体、梅毒密螺旋体、沙眼衣原体、结核菌、大肠菌群、A群溶連菌、B群溶連菌、肺炎球菌、葡萄球菌、MRSA、军团杆菌、肠管出血性大肠菌O157、Vero毒素、沙门氏菌、艰难梭菌、幽门螺旋杆菌、CRP、HBs抗原、HBs抗体、HBc抗原、HBc抗体、HBe抗原、HBe抗体、前列腺特异抗原(PSA)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、黄体生成激素(LH)、肌钙蛋白T、肌钙蛋白I、肌球素、D-二聚体、大便中血红蛋白、血红蛋白A1c、IgE抗体等病原体抗原、抗体、癌标记物、激素等生物体成分、残留农药、环境激素、食品中的过敏物质等。

上述样品液可以含有例如缓冲液、表面活性剂、抗菌剂等。作为上述缓冲液，没有特别的限制，例如可举出上述的缓冲液等。作为上述表面活性剂，没有特别的限制，例如可举出阴离子性表面活性剂、非离子性表面活性剂、两性表面活性剂等。作为上述抗菌剂，没有特别的限制，例如可举出叠氮化钠、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮等。

上述酶标识化抗体只要是能与作为上述样品中的分析对象物的抗原结合的被酶标识化了的抗体即可。作为上述酶标识化抗体的抗体，例如可举出作为上述的固定化抗体的抗体而例示的抗体等。

作为上述酶标识化抗体的酶，没有特别的限制，例如可举出过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶等。上述酶标识化抗体的制备方法没有特别的限制，例如可以使用以往公知的方法。

上述酶标识化抗体，例如可以在上述样品液中含有，也可以使其浸渗在上述展开部件或另外设置的垫等中。但是，例如即使不另外设置上述垫等也可以进行更高灵敏度的分析，因此优选在上述样品液中含有上述酶标识化抗体。

作为上述展开液，例如可以使用Tris缓冲液、磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、硼酸缓冲液等缓冲液。上述展开液中，可以适当添加例如稳定化剂、抗菌剂等。另外，上述展开液的供给量例如可以根据上述样品液的供给量等进行适当设定。

在本实施方式的免疫分析方法中，通过上述展开液的展开，基质从上述展开液供给部经由上述样品供给部被导入至上述检测部中。上述基质只要是例如与上述酶反应而发色或发光等的物质即可。上述基质的种类没有特别的限制，例如可以根据上述酶标识化抗体中的酶的种类进行选择。作为具体例，例如可举出2，2’-连氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)、二氨基联苯(DAB)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)、4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷(4MUG)、3-(2’-螺金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-β-D-吡喃型半乳糖基)苯基-1，2-二氧杂环丁烷(AMGPD)等。

上述基质例如可以在上述展开液和上述样品液的至少一者中含有，也可以浸渗在上述展开部件等中。在将上述基质浸渗在上述展开部件等中的情况下，例如也可以使上述基质浸渗至上述展开部件的上述样品供给部和上述检测部之间，或者上述展开液供给部和上述样品供给部之间等。

接下来，基于图3的(a)～(d)说明本实施方式的免疫分析方法。图3的(a)至(c)为样品分析用具的剖面图。图3的(d)是表示检测部中的抗原的检出的示意图。

如图3的(a)所示，首先，对上述展开液供给部12供给上述展开液(箭头a)。供给的上述展开液如箭头b所示，向上述展开部件11中浸透。浸透于上述展开部件11中的上述展开液如箭头c所示，在上述展开部件11中朝向上述检测部14(在该图中为向左)，从上述展开部件11的上游向下游展开。此时，在上述展开液供给部附近的上述展开部件中浸渗有上述基质时，通过上述展开液的展开，上述基质向上述检测部移动。上述基质也可以配合在供给前的展开液中。

接着，如图3的(b)所示，对上述样品供给部13供给上述样品液(箭头d)。此时，虽然供给的上述样品液在上述展开部件中要向全方向展开，但是如图3的(c)所示，通过在此之前供给的上述展开液的展开(箭头c)，如箭头e所示，能够将上述样品液的展开方向设定为朝向上述检测部14的方向，能够防止向位于上述展开部件11的上游的上述展开液供给部12方向(该图中为向右)的逆流。此外，上述所谓“防止逆流”不仅仅限定于完全防止样品液逆流的情况，也包括例如与在供给展开液之前向样品供给部供给样品液的情况相比能够防止背景上升的程度地防止样品液逆流的情况。上述酶标识化抗体可以配合在供给前的上述样品液中，也可以使其浸渗于上述展开部件的上述样品供给部附近。这样，在上述展开部件11中，在上述酶标识化抗体的存在下，通过上述展开液的展开(箭头c)，上述基质、上述样品液被导入至上述检测部14中。

这样，如图3的(d)所示，在上述检测部14中，形成上述固定化抗体17、作为上述样品中的分析对象物的抗原16、以及上述酶标识化抗体15的复合体18。在上述检测部14中，检测基于上述复合体18(酶标识化抗体15)中的酶19和上述基质的反应的发色或发光等。由此，间接检测上述抗原16。上述检测例如可以通过目视来判定，也可以通过使用比色计、荧光光度计、光子计数器、感光膜等来进行。由此，可防止由于上述供给的样品液向上述展开部件中的上游侧移动而引起的在上述检测部14以外的位置的发色或发光等。其结果是，能够防止背景的上升来进行高灵敏度的免疫分析(定量分析、半定量分析、定性分析等)。此外，上述所谓“防止背景上升”不仅限定于完全防止背景上升的情况，例如包括与在供给展开液之前向样品供给部供给样品液的情况相比防止背景的上升的情况。

在本实施方式的免疫分析方法中，先于上述样品液供给了上述展开液，但并不限定于此，将上述展开液与上述样品液同时供给也可以得到同样的效果。另外，对于先于上述样品液供给上述展开液的情况，通过研究例如供给上述样品液的时机(例如，在上述展开液即将到达上述样品供给部之前供给样品液)等，可以进一步提升上述效果。上述时机可以根据例如上述展开液供给部和上述样品供给部之间的距离、上述展开液的种类、或者上述展开部件的种类、尺寸等来适当设定。在上述展开液供给部和上述样品供给部之间的距离为1～100mm的范围的情况下，例如在从向上述展开液供给部供给上述展开液开始经过0～400秒之后，向上述样品供给部供给上述样品液。在上述距离为10～80mm的范围的情况下，优选从向上述展开液供给部供给上述展开液开始经过0～360秒钟后，向上述样品供给部供给上述样品液。在上述距离为20～40mm的范围的情况下，更优选从向上述展开液供给部供给上述展开液开始经过0～180秒之后，向上述样品供给部供给上述样品液。在上述距离为30mm的情况下，特别优选从向上述展开液供给部供给上述展开液开始经过30秒之后，向上述样品供给部供给上述样品液。

另外，在本实施方式的免疫分析方法中，如前所述，由于能够防止上述样品液向展开液供给部方向的逆流，因此例如也可以增加样品液的量。由此，例如也可以进一步提高分析精度。

在本实施方式的免疫分析方法中，在上述样品中的分析对象物为抗体的情况下，例如上述检测部也可以是代替上述固定化抗体而含有固定化抗原的形态。由此，形成上述酶标识化抗体或酶标识化抗原、作为上述样品中的分析对象物的抗体以及上述固定化抗原的复合体，上述复合体中的上述酶和上述基质反应，发生发色或发光等。通过检测该发色或发光等，可以间接检测上述抗体。作为上述样品中的分析对象物的抗体，没有特别的限制，可举出各种抗体。作为上述固定化抗原的抗原，只要是能与作为上述样品中的分析对象物的抗体结合的抗原即可。作为上述酶标识化抗体的抗体，只要是与作为上述样品中的分析对象物的抗体结合的抗体即可。另外，作为上述酶标识化抗原的抗原，只要是与作为上述样品中的分析对象物的抗体结合的抗原即可。上述酶标识化抗体中的抗体的制备、标识化的方法可以应用以往公知的方法，作为酶，例如与上述相同。上述酶标识化抗原中的抗原的制备、标识化的方法可以应用以往公知的方法，作为酶，例如与上述相同。上述固定化抗原的制作方法例如可举出以往公知的方法等，没有特别限制。另外，作为将上述固定化抗原固定到检测部的方法，例如可以使用以往公知的方法等，没有特别的限制。

为了促进上述展开液的展开，本实施方式的免疫分析方法中使用的样品分析用具例如也可以包括展开液接受垫以及废液吸收垫。另外，本实施方式的免疫分析用具中使用的样品分析用具为了稳定地保持其形状，例如也可以包括支持体。

在图2的(a)的剖面图中示出了包括上述展开液接受垫、上述废液吸收垫以及上述支持体的样品分析用具的一个例子的构成。如图所示，该样品分析用具20包括展开部件21、展开液接受垫22、废液吸收垫23以及支持体24作为主要的构成部件。上述展开液接受垫22与上述展开部件21的上游侧(在图中右侧)相接触地配置。上述废液吸收垫23与上述展开部件21的比上述检测部14更下游的一侧(该图中左侧)相接触地配置。上述展开部件21、上述展开液接受垫22和上述废液吸收垫23配置在上述支持体24上。这些以外的构成与上述的样品分析用具10相同。上述“展开液接受垫”相当于本发明的“第一展开液接受垫”。上述“废液接受垫”相当于本发明的“第二展开液接受垫”。

作为上述展开液接受垫和上述废液吸收垫的材质，没有特别的限制，例如可举出聚乙烯、玻璃纤维、人造丝、尼龙、纸、纤维素等。上述展开液接受垫的形状和尺寸没有特别的限制，例如可以根据上述展开部件的形状等适当设定。

作为上述支持体的材质，没有特别的限制，例如可举出聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚酯、乙酸纤维素等。另外，作为上述支持体的形状，没有特别的限制，可举出例如膜状、片状、板状等。上述支持体的形状和尺寸没有特别的限制，可以根据上述展开部件等适当设定。

上述展开部件、上述展开液接受垫和上述废液吸收垫例如可以利用通常方法配置在上述支持体上。具体而言，例如也可以使用双面胶带或粘接剂等固定到上述支持体上。

在使用了该样品分析用具20的免疫分析方法中，例如，也可以向与展开部件21的上游侧相接触地配置的(与展开部件21一体化的)上述展开液接受垫22供给上述展开液。此时，上述展开液接受垫22的一部分为上述展开液供给部12。上述展开液供给部12是上述展开液接受垫22中的规定区域。由此，上述展开液经由上述展开液接受垫22向上述展开部件21展开。除此以外，与前述的免疫分析方法相同。另外，例如也可以将上述基质浸渍于上述展开液接受垫22中。

(实施方式2)

在图2的(b)的剖面图中示出了本实施方式的免疫分析方法中使用的样品分析用具的一个例子的构成。如图所示，该样品分析用具30在图2的(a)所示的样品分析用具的基础上还包括盒体31。上述展开部件21、上述展开液接受垫22、上述废液吸收垫23和上述支持体24配置在上述盒体31内。上述盒体31具有展开液供给口32、样品供给口33、以及窗34。上述展开液供给口32以使其下端部与上述展开液供给部12接触的方式配置。上述样品供给口33配置在上述样品供给部13的上方。上述窗34配置在上述检测部14的上方。利用这样的构成，例如操作变得容易，样品分析用具的操作性提高。另外，在该样品分析用具30中，上述展开液供给部12(展开液接受垫22)与上述展开液供给口32的下端接触，但并不限定于此。

作为上述盒体的材质，没有特别的限制，可举出例如聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚合成树脂等。上述盒体的形状和尺寸没有特别的限制，可以根据上述展开部件等的形状和尺寸适当设定。

接着，说明本实施方式的免疫分析方法。

在本实施方式的免疫分析方法中，首先，通过向上述展开液供给口32供给上述展开液来向上述展开液供给部12供给上述展开液。接着，通过向上述样品供给口33供给上述样品液来向上述样品供给部13供给上述样品液。从上述窗34观察上述检测部14中的检测结果。除此以外，与使用了图2的(a)所示的样品分析用具的免疫分析方法相同。

(实施方式3)

本实施方式的免疫分析方法是使用了可进行多个项目的分析的样品分析用具的例子。

图4的(a)和(b)示出了本实施方式的免疫分析方法中使用的样品分析用具的一个例子的构成。图4的(a)是本实施方式中使用的样品分析用具的平面图。图4的(b)是从图4的(a)的II-II方向观察的剖面图。如上述两图所示，该样品分析用具40包括正方形状的展开部件41。在上述展开部件41的中心附近，配置有一个展开液供给部42。相对于上述展开液供给部42，以上述展开液供给部42为中心，在靠近上述展开部件41的四方(图4的(a)中的上下左右方向)的端面处配置有4个样品供给部43a、43b、43c和43d，而且在其外侧配置有环状的检测部44。在该样品分析用具40中，在上述检测部44中的位于连接上述展开液供给部42与样品供给部43a的直线向外侧的延长线上的位置处与上述样品供给部43a相应地配置了检测部44a。在上述检测部44中的位于连接上述展开液供给部42与样品供给部43b的直线向外侧的延长线上的位置处，与上述样品供给部43b相应地配置了检测部44b。在上述检测部44中的位于连接上述展开液供给部42与样品供给部43c的直线向外侧的延长线上的位置处，与上述样品供给部43c相应地配置了检测部44c。在上述检测部44中的位于连接上述展开液供给部42与样品供给部43d的直线向外侧的延长线上的位置处，与上述样品供给部43d相应地配置了检测部44d。上述各检测部44a、44b、44c和44d中分别固定化有抗体(固定化抗体)。除此以外的构成与图1的(a)、(b)和图2的(a)、(b)所示的样品分析用具相同。基于这样的形态，例如通过一次分析可进行多项目的检测。上述展开液供给部也可以为二个以上，此时，相对于每一个展开液供给部，也可以设置多个样品供给部和多个检测部。

接着，参照图4的(a)，说明本实施方式的免疫分析方法。

当如图4的(a)所示向上述展开液供给部42供给上述展开液时，上述展开液在上述展开部件41中，如箭头所示，经由上述各样品供给部43a、43b、43c和43d，伴随样品等向着上述各出部44a、44b、44c和44d呈放射状展开。除此以外，与实施方式1或2所述的免疫分析方法相同。

在上述样品分析用具40中，在正方形状的展开部件41中配置了环状的检测部44，但并不限于此，例如也可以是如图5所示的包括十字状的展开部件的形态。该样品分析用具50包括十字状的展开部件51。在上述十字状的展开部件51的中心附近配置有一个展开液供给部42。以上述展开液供给部42为中心，在靠近上述展开部件51的四方(该图中的上下左右方向)的端面处配置有4个样品供给部43a、43b、43c和43d。在位于连接上述展开液供给部42与样品供给部43a的直线向外侧的延长线上，与样品供给部43a相应地配置了检测部44a。在位于连接上述展开液供给部42与样品供给部43b的直线向外侧的延长线上，与样品供给部43b相应地配置了检测部44b。在位于连接上述展开液供给部42与样品供给部43c的直线向外侧的延长线上，与样品供给部43c相应地配置了检测部44c。在位于连接上述展开液供给部42与样品供给部43d的直线向外侧的延长线上，与样品供给部43d相应地配置了检测部44d。除此以外的构成与上述的样品分析用具40相同。使用了该样品分析用具50的免疫分析方法中的展开液的展开与使用了上述样品分析用具40的免疫分析方法相同。

(实施方式4)

本实施方式的分析方法是使用着色不溶性载体粒子作为标识化抗体的标识免疫分析方法。

作为上述着色不溶性载体粒子，没有特别的限制，例如可举出着色胶乳粒子、金属胶体粒子、着色聚甲基丙烯酸甲酯粒子、着色聚乳酸粒子、着色多孔性玻璃粒子、着色二氧化硅粒子、着色琼脂糖粒子、着色葡聚糖粒子等。作为上述着色胶乳粒子，没有特别的限制，例如可举出蓝色胶乳粒子、红色胶乳粒子等。作为上述金属胶体粒子，没有特别的限制，例如可举出金胶体粒子、铂胶体粒子等。

结合了上述着色不溶性载体粒子的标识化抗体没有特别的限制，例如可以通过将上述着色不溶性载体粒子混悬在缓冲液等中，在该混悬液中加入上述抗体，使上述两者反应来制备。作为上述缓冲液，没有特别的限制，例如可举出上述的缓冲液等。

本实施方式的免疫分析方法中，例如，既可以将结合了上述着色不溶性载体粒子的标识化抗体包含在上述样品液中，也可以将结合了上述着色不溶性载体粒子的标识化抗体浸渍于上述展开部件或另外设置的垫等中。但是，例如即使不另外设置上述垫等也可以进行更高灵敏度的分析，因此优选在上述样品液中含有结合了上述着色不溶性载体粒子的标识化抗体。

在本实施方式的免疫分析方法中，在检测部中，通过检测由上述着色不溶性载体粒子凝聚而产生的着色来检测作为分析对象物的抗原。除此以外，与实施方式1至3所述的免疫分析方法相同。本实施方式中不使用基质。上述检测例如既可以通过目视判定来进行，也可以使用比色计等来进行。

(实施方式5)

本实施方式的分析方法是使用了荧光色素作为标识化抗体的标识的免疫分析方法。

作为上述荧光色素，没有特别的限制，例如可举出FITC等。通过由荧光色素标识化了的抗体或抗原，例如形成上述固定化抗体、作为分析对象物的抗原以及上述标识化抗体的复合体，或者形成上述固定化抗原、分析对象的抗体以及上述标识化抗体或上述标识化抗原的复合体，对上述复合体照射激发光，由此能够检测上述标识化抗体或上述标识化抗原的荧光色素的发光。

实施例

接下来，对本发明的实施例与比较例一并进行说明。但本发明并不受下述的实施例和比较例的任何限定。

[实施例1]

〔样品分析用具的制作〕

按照下述的顺序，制作了图2的(a)所示的构成的样品分析用具20。

(1)展开部件的制作

将硝酸纤维素膜(Millipore公司制，商品名“HA180”)切割为长50mm、宽4mm，将其作为展开部件21。在从上述展开部件21的一端(图2的(a)中的右侧端部)开始31mm的位置，将卵白过敏原提取蛋白质水溶液(用1mg/mL(5mmol/L)硼酸缓冲液(pH8.5)稀释后透析的水溶液)涂布宽度1mm。如此，在上述展开部件21表面形成固定化有抗体的检测部14。

(2)展开液接受垫的制作

将纤维素垫(Millipore公司制，商品名“AP25”)切割为长20mm、宽4mm，将其作为展开液接受垫22。在从上述展开液接受垫22的一端(图2的(a)中的右侧端部)开始10mm的位置，涂布5μL的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(20mg/mL，勃林格殷格翰公司制，商品名“BCIP”)作为基质，在37℃下放置1小时使其干燥。

(3)废液吸收垫的制作

将纤维素垫(Millipore公司制，商品名“AP25”)切割为长30mm、宽4mm，将其作为废液吸收垫23。

(4)支持体的制作

将背板片(Bio Dot公司制，PET)切割为长80mm、宽4mm，将其作为支持体24。

(5)样品分析用具的制作

向从上述支持体24的一端(图2的(a)中的右侧端部)开始10mm的位置粘贴上述展开部件21。接着，将上述展开液接受垫22的一端(图2的(a)中的右侧端部)固定在上述支持体24的一端，将上述展开液接受垫22的另一端(图2的(a)中的左侧端部)侧重叠在上述展开部件21的上游侧部分上。接着，将上述废液吸收垫23的一端(图2的(a)中的左侧端部)固定在上述支持体24的另一端(图2的(a)中的左侧端部)，将上述废液吸收垫23的另一端(图2的(a)中的右侧端部)侧重叠在上述展开部件21的另一端(图2的(a)中的左侧端部，比检测部14更下游侧的部分)上。如此，制作了本实施例的样品分析用具20。上述展开液供给部12设定为从上述展开液接受垫22的上述一端开始5mm的位置。上述样品供给部13设定为从上述展开部件21的上述一端开始25mm的位置。上述展开液供给部12和上述样品供给部13之间的距离设为30mm。

〔使用了样品分析用具的免疫分析〕

(1)样品液的制备

将60μL的碱性磷酸酶标识化抗体(酶标识化抗体，10μg，取自山羊)包含在10μL的卵白特异IgE阳性血清中，制备了3组样品液1～3。

(2)展开液的准备

制备0.1mol/L的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(pH10.0)。将该缓冲液作为展开液。

(3)分析方法的实施

首先，向上述展开液供给部12供给了100μL的上述展开液。接着，从上述展开液的供给开始经过30秒左右后，向上述样品供给部13供给了15μL的上述样品液。随后，使用免疫分析装置(Arkray(株)制，商品名“SPOTCHEM IL SL-4720”)测定了检测部的反射率。将本实施例中的3组样品的反射率(％)在下述表1中示出。上述反射率越小，就越说明背景的上升得以防止。

[实施例2]

除了供给30μL的上述样品液以外，与实施例1同样地进行了样品分析。将本实施例中的3组样品的反射率(％)在下述表1中示出。

[比较例1]

首先，向上述样品供给部13供给样品液15μL。接着，从上述样品液的供给开始经过30秒左右之后，向上述展开液供给部12供给了100μL的展开液，除此以外，与实施例1同样地进行了样品分析。将本比较例中的3组样品的反射率(％)示于下述表1。

[比较例2]

首先，向上述样品供给部13供给样品液30μL。接着，从上述样品液的供给开始经过30秒左右之后，向上述展开液供给部12供给了100μL的展开液，除此以外，与实施例2同样地进行了样品分析。将本比较例中的3组样品的反射率(％)示于下述表1。

(表1)

(评价)

如上述表1所示，在供给上述展开液后供给了15μL的上述样品液的实施例1中，与在供给等量的上述样品液后再供给上述展开液的比较例1相比，反射率小，防止了背景的上升。另外，在供给上述展开液后供给了30μL的上述样品液的实施例2中，与在供给等量的上述样品液后再供给上述展开液的比较例2相比，反射率小，防止了背景的上升。另外，在实施例1和实施例2中，防止了由增加样品量造成的背景的上升。另一方面，在比较例1和比较例2中，由于增加样品量，背景大幅上升。

产业上的利用可能性

本发明可以很好地利用于例如全血、血清、血浆、唾液、尿、脑脊液等中所含的特定物质的检测(定量分析、半定量分析、定性分析等)中，可应用于临床检查、生化学检查、医学研究等领域，其用途没有限制，可应用于广大技术领域。

符号说明

10、20、30、40、50、60 样品分析用具

11、21、41、51、61 展开部件

12、42、62 展开液供给部

13、43a、43b、43c、43d、63 样品供给部

14、44、44a、44b、44c、44d、64 检测部

15、65 酶标识化抗体

16、66 抗原

17、67 固定化抗体

18、68 复合体

19、69 酶

22 展开液接受垫

23 废液吸收垫

24 支持体

31 盒体

32 展开液供给口

33 样品供给口

34 窗

a、b、c、d、e、f、g、h 箭头

Claims (10)

1.一种分析方法，其特征在于，其使用在展开部件中从展开液流的上游至下游依次配置有展开液供给部、样品供给部和检测部的样品分析用具，

在所述检测部中，固定化有与样品中的分析对象物特异性结合的物质，

向所述样品供给部供给含有所述样品的样品液，

在所述样品液的供给之前，向所述展开液供给部供给展开液，

在与所述分析对象物特异性结合的标识化物质的存在下，通过所述被供给的展开液在所述展开部件中展开，所述被供给的样品液被导入至所述检测部，

在所述检测部中，形成所述被固定化了的特异性结合物质、所述分析对象物、以及所述被标识化了的特异性结合物质的复合体，

通过检测所述复合体中的标识来进行所述分析对象物的分析。

2.如权利要求1所述的分析方法，其中，在所述样品分析用具中，相对于一个所述展开液供给部，设置有多个样品供给部和多个检测部。

3.如权利要求1或2所述的分析方法，其中，所述样品分析用具还包括具有展开液供给口和样品供给口的盒体，

所述展开部件配置在所述盒体内。

4.如权利要求1或2所述的分析方法，其中，所述样品分析用具还包括第一展开液接受垫，

所述第一展开液接受垫与所述展开部件的上游侧相接触地配置，

通过向所述第一展开液接受垫供给所述展开液，所述展开液向所述展开部件展开。

5.如权利要求1或2所述的分析方法，其中，所述样品分析用具还包括第二展开液接受垫，

所述第二展开液接受垫配置在比所述检测部更下游的一侧，并与所述展开部件接触。

6.如权利要求1所述的分析方法，其中，所述特异性结合物质为抗原或抗体。

7.一种防止样品液逆流的方法，其特征在于，其使用在展开部件中从展开液流的上游至下游依次配置有展开液供给部和样品供给部的样品分析用具，

向所述样品供给部供给含有样品的样品液，

在所述样品液的供给之前，向所述展开液供给部供给展开液，

通过所述被供给的展开液在所述展开部件中从所述上游向所述下游展开，来防止所述被供给的样品液向所述上游逆流。

8.如权利要求7所述的防止样品液逆流的方法，其中，所述样品分析用具还包括检测部，

所述检测部与所述样品供给部相比配置在所述展开液流的更下游，

在所述检测部中固定化有与样品中的分析对象物特异性结合的物质，

在与所述分析对象物特异性结合的标识化物质的存在下，通过所述被供给的展开液在所述展开部件中展开，所述被供给的样品液被导入至所述检测部，

在所述检测部中，形成所述被固定化了的特异性结合物质、所述分析对象物、以及所述被标识化了的特异性结合物质的复合体，

通过检测所述复合体中的标识来进行所述分析对象物的分析。

9.一种防止背景上升的方法，其特征在于，其使用在展开部件中从展开液流的上游至下游依次配置有展开液供给部、样品供给部和检测部的样品分析用具，

向所述样品供给部供给含有样品的样品液，

在所述样品液的供给之前，向所述展开液供给部供给展开液，

在与分析对象物特异性结合的标识化物质的存在下，通过所述被供给的展开液在所述展开部件中从所述上游向所述下游展开，来防止由于所述被供给的样品液向所述上游移动而引起的在所述检测部以外的位置检出标识。

10.如权利要求9所述的防止背景上升的方法，其中，

在所述检测部中固定化有与样品中的分析对象物特异性结合的物质，

在与所述分析对象物特异性结合的标识化物质的存在下，通过所述被供给的展开液在所述展开部件中展开，所述被供给的样品液被导入至所述检测部，

在所述检测部中，形成所述被固定化了的特异性结合物质、所述分析对象物、以及所述被标识化了的特异性结合物质的复合体，

通过检测所述复合体中的标识来进行所述分析对象物的分析。