WO2024122616A1 - イムノクロマト法検査デバイスの試料展開部の形成方法およびイムノクロマト法検査デバイス - Google Patents

イムノクロマト法検査デバイスの試料展開部の形成方法およびイムノクロマト法検査デバイス Download PDF

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test device
immunochromatographic test
cholic acid
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徹 山口
大介 加藤
志野 村松
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デンカ株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method for forming a sample development section of an immunochromatographic testing device and an immunochromatographic testing device having a sample development section formed by this method.
  • simple test reagents and kits have been developed that can perform various tests in a short time, such as for the presence or absence of pathogen infections such as viruses and bacteria, and for the presence or absence of pregnancy.
  • Pathogen components, human chorionic gonadotropin, etc. are detected or quantified.
  • Many simple test reagents are characterized by not requiring special equipment, being easy to operate, and being inexpensive; for example, simple test reagents for pregnancy diagnosis are sold at general pharmacies.
  • simple test reagents for testing pathogen infections are widely used not only in large hospitals and medical testing centers, but also in general hospitals and clinics. These facilities are often the first medical institutions that patients visit, and if the presence or absence of infection can be determined on the spot from a sample taken from a patient, treatment measures can be administered at an early stage, so the importance of simple test reagents in medical care is increasing.
  • immunoassays that utilize antigen-antibody reactions, particularly immunochromatography, are commonly known as simple testing methods.
  • a complex of a capture body (capture substance) that specifically binds to the analyte and a label that specifically binds to the analyte is formed on a membrane, and the label is detected/quantified to detect (measure or quantify) the analyte.
  • Immunochromatography requires simple measuring equipment and is cost-effective, so it is widely used to detect a wide variety of analytes.
  • a test device is provided with a detection section in which an antibody that specifically binds to the analyte is immobilized as a capture substance on a membrane strip such as nitrocellulose, and a label section that contains a label that specifically binds to the analyte.
  • a sample containing the analyte is dropped onto the detection section, and the analyte-label complex is formed and developed, and the complex is captured by the detection section to detect or quantify the label (for example, Patent Documents 1 and 2).
  • Patent Document 3 a technology has been developed to pre-treat specimens on the sample application section of an immunochromatographic testing device by pre-impregnating the sample application section with a reagent.
  • the object of the present invention is to provide an immunochromatographic testing device and a method for forming a sample development section thereof that overcomes the above problems and enables detection or quantification of the presence of an analyte more quickly and with higher sensitivity than conventional measurement methods.
  • the present invention provides the following.
  • a method for forming a sample development section of an immunochromatographic testing device comprising applying cholic acid or a salt thereof to the sample development section.
  • An immunochromatographic testing device comprising a sample development section containing cholic acid or a salt thereof.
  • the visibility of the detection area can be improved, enabling rapid and highly sensitive measurements.
  • FIG. 1A and 1B are a top view and a cutaway cross-sectional view of a testing device according to one embodiment of the present invention.
  • the sample development section in this invention is the area in the immunochromatographic testing device where the specimen sample develops. More specifically, it is the area from the tip of the sample application section to the detection line.
  • the sample development area is formed from a porous substrate such as a nitrocellulose membrane.
  • the sample development section can be pre-treated with reagents necessary for the antigen-antibody reaction.
  • a surfactant can be applied to prevent non-specific components in the specimen from being involved in the antigen-antibody reaction, or a hemolyzing agent can be applied when measuring blood samples.
  • a surfactant can be applied to prevent non-specific components in the specimen from being involved in the antigen-antibody reaction, or a hemolyzing agent can be applied when measuring blood samples.
  • the specimen is often suspended in a suspension liquid before being developed in the sample development section, but in this case, the specimen is diluted and the analyte is also diluted, affecting detection sensitivity. Therefore, components of the specimen suspension liquid, such as buffers, surfactants, various proteins, salts, and sugars, can be applied in advance.
  • a preferred method for applying cholic acid or a salt thereof to the sample development section is to add a solution of cholic acid or a salt thereof, preferably an aqueous solution in which water or an aqueous buffer is used as the solvent, by impregnation, dropwise addition, or the like.
  • aqueous solution of cholic acid or a salt thereof can be added to the labeling section.
  • the concentration of cholic acid or a salt thereof in the solution of cholic acid or a salt thereof to be added is usually 0.005% to 5% by mass, preferably 0.05% to 2% by mass, more preferably 0.1% to 0.5% by mass, and even more preferably 0.3% to 0.5% by mass.
  • the amount of cholic acid or a salt thereof added to the sample development section is usually about 0.01 ⁇ g to 100 ⁇ g, preferably about 0.1 ⁇ g to 30 ⁇ g, more preferably about 0.5 ⁇ g to 10 ⁇ g, and even more preferably about 2 ⁇ g to 8 ⁇ g.
  • an aqueous solution containing cholic acid or a salt thereof at a concentration of 0.1% by mass to 0.4% by mass can be added in an amount of 2 ⁇ g to 8 ⁇ g of cholic acid or a salt thereof.
  • specimen samples may be pharyngeal or nasal swabs, nasal aspirates, pharyngeal or nasal washes, saliva, serum, plasma, whole blood, fecal suspensions, urine, culture fluids, and those diluted with a buffer solution or used as is without dilution.
  • substances to be detected and they may be any substance to be detected.
  • virus antigens such as influenza virus, adenovirus, RS virus, HAV, HBs, HIV, and norovirus
  • bacterial antigens such as MRSA, group A streptococci, group B streptococci, and Legionella
  • toxins produced by bacteria hormones such as mycoplasma, Chlamydia trachomatis, and human chorionic gonadotropin
  • antigens such as C-reactive protein, myoglobin, cardiac troponin, various tumor markers, pesticides, and environmental hormones, and further include antibodies against the above bacteria, viruses, and the like.
  • the present invention also provides an immunochromatographic test device that includes a sample development site formed as described above. Except for the application of cholic acid or a salt thereof to the sample development site, the configuration of the test device itself may be a well-known one, for example, as described in Patent Documents 1, 2, and 3.
  • a schematic diagram of a specific example of the immunochromatographic test device of the present invention is shown in Figure 1, but the test device of the present invention is not limited thereto.
  • the top of Figure 1 is a top view, and the bottom is a cross-sectional view.
  • a nitrocellulose membrane (1) with two detection sections (3) formed thereon, an absorbent pad section (5) made of filter paper, a label section (2) formed by the above method, and a sample application section (4) made of a glass fiber filter are laminated on a plastic plate (6).
  • one end region of the absorbent pad section (5) and one end region of the nitrocellulose membrane (1), the other end region of the nitrocellulose membrane (1) and one end region of the label section (2), and the other end region of the label section (2) and one end region of the sample application section (4) are overlapped, thereby forming a continuous lateral flow path.
  • a test sample is prepared by suspending/extracting the sample in a sample suspension/extraction buffer.
  • the test device is equipped with a labeling body section (2) including a stabilized dry labeling body pad formed by the above method, in which an antibody that undergoes an antigen-antibody reaction with the analyte is labeled with colored polystyrene particles on a nitrocellulose membrane (1) laminated on a plastic plate (6), and further equipped with a detection section (3) in which an antibody that undergoes an antigen-antibody reaction with the analyte is immobilized in a line as a capture substance, and the test sample is dropped onto the sample addition section (4) of the test device.
  • the test sample containing the analyte develops the labeling body while moving horizontally on the membrane, so that if the analyte is present, a complex of the analyte-labeling body is formed, and when it reaches the detection section (3), a complex of the capture antibody-analyte-labeling body is formed on the line, and the presence or absence of the analyte in the sample is determined by detecting the presence of the complex by the colored polystyrene particles in the complex.
  • the detection section (3) is an area in which an antibody or its antigen-binding fragment is immobilized in a line shape, which undergoes an antigen-antibody reaction with the substance to be detected and can bind to the substance to be detected at the same time as the antibody or its antigen-binding fragment on the colored polystyrene particles. Other components not involved in the reaction are absorbed by the absorption pad section (5).
  • the test device of the present invention uses colored polystyrene particles bound to an antibody or an antigen-binding fragment thereof that undergoes an antigen-antibody reaction with the substance to be detected as a stabilized dry label, allowing the substance to be measured quickly and easily.
  • Example 1 Preparation of a monoclonal antibody that recognizes the N protein of SARS-CoV-2 1.
  • Preparation of SARS-CoV-2N Protein Antigen DNA encoding the SARS-CoV-2N protein was expressed in Escherichia coli using an expression vector, and the protein was purified after several days of cultivation.
  • mice were immunized with the SARS-CoV-2 N protein antigen described in 1., and iliac lymph nodes were excised from the mice after breeding for a certain period of time. Using the "mouse iliac lymph node method" (Sado Y et al., Acta Histochem. Cytochem. 39: 89-94 (2006)), multiple hybridoma cell lines producing anti-SARS-CoV-2 N protein antibodies were obtained.
  • the obtained cell line was intraperitoneally administered to pristane-treated BALB/c mice, and antibody-containing ascites was collected approximately two weeks later.
  • IgG was purified from the obtained ascites by affinity chromatography using a protein A column, and multiple purified anti-SARS-CoV-2 N protein monoclonal antibodies (hereinafter sometimes referred to as "anti-N protein antibodies”) were obtained.
  • antibodies were used that were selected from the multiple anti-SARS-CoV-2 N protein monoclonal antibodies obtained, taking into consideration their reactivity and specificity.
  • Example 2 Immunoassay device for measuring SARS-CoV-2 1. Immobilization of anti-SARS-CoV-2 N protein antibody on nitrocellulose membrane A solution of the anti-N protein antibody classified in Example 1 diluted with a buffer solution and an anti-mouse IgG antibody were prepared, and the anti-N protein antibody was applied in a line shape to the sample pad side of a nitrocellulose membrane backed with a PET film, and the anti-mouse IgG antibody was applied in a line shape to the absorbent side. The nitrocellulose membrane was then thoroughly dried under hot air to obtain an anti-N protein antibody-immobilized membrane.
  • anti-SARS-CoV-2 N protein antibody onto colored polystyrene particles
  • the anti-N protein antibody prepared in Example 1 was bound to colored polystyrene particles, suspended in a buffer solution, and thoroughly dispersed by ultrasonic treatment to obtain anti-N protein antibody-bound colored polystyrene particles. In this specification, these are referred to as anti-N protein antibody-immobilized particles.
  • SARS-CoV-2 test device The anti-N protein antibody immobilized membrane prepared in 1 and the label pads prepared in 2 and 3 were attached to other members (backing sheet, absorption band, sample pad) and cut to a width of 5 mm to prepare a SARS-CoV-2 test device.
  • Example 3 Test 1 Visibility test using sodium cholate
  • the anti-SARS-CoV-2 N protein antibody-bound colored polystyrene particles described in 3. above were diluted with a diluent to prepare a solution, to which sodium cholate was added to give concentrations of 0, 0.1, 0.2, 0.4, and 0.8% by mass to prepare a test device.
  • the visibility of the detection line was improved by adding cholic acid to both the sample development section and the sample addition section. It was also confirmed that adding cholic acid to the sample development section had a greater effect on the visibility of the detection line than the sample addition section. Furthermore, the visibility of the detection line was dramatically improved by adding cholic acid to both the sample development section and the sample addition section.

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  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

要約　従来の測定方法よりも更に迅速且つ高感度に被検出物の存在を検出又は定量することを可能にするイムノクロマト法検査デバイス並びにその試料展開部の形成方法が開示されている。イムノクロマト法検査デバイスの試料展開部の形成方法は、試料展開部にコール酸またはその塩を施すことを含む。イムノクロマト法検査デバイスは、試料展開部にコール酸またはその塩を含む。この方法を用いて形成された試料展開部を備えた検査デバイスを用いることにより、検出部の視認性を向上することができ、迅速で高感度に測定することができる。

Description

イムノクロマト法検査デバイスの試料展開部の形成方法およびイムノクロマト法検査デバイス
　本発明は、イムノクロマト法検査デバイスの試料展開部の形成方法及び該方法により形成された試料展開部を有するイムノクロマト法検査デバイスに関する。
　近年、ウイルスや細菌等の病原体感染の有無、妊娠の有無などの様々な検査を短時間のうちに行う簡易検査試薬やキットが開発されている。病原体構成成分、ヒト絨毛性ゴナドトロピン等が検出あるいは定量の対象である。簡易検査試薬の多くは、特別な設備を必要とせず操作も簡単で安価であるという特徴を有しており、例えば、妊娠診断のための簡易検査試薬は一般薬局で販売されている。また、病原体の感染を検査する簡易検査試薬は、他の検査試薬と異なり、大病院や医療検査センター以外にも一般の病院や診療所で広く使用されている。これらの施設は患者が最初に訪れる医療機関である場合が多く、患者から採取した検体についてその場で感染の有無が判明すれば、早い段階で治療措置を施すことができるため、簡易検査試薬の医療における重要性は益々高まってきている。
　現在、簡易検査方法として、抗原抗体反応を利用した免疫測定法、特にイムノクロマト法が一般に知られている。イムノクロマト法は被検出物に特異的に結合する捕捉体(捕捉物質)、および被検出物に特異的に結合する標識体の複合体をメンブラン上に形成させて、標識を検出／定量することで、被検出物の検出（測定あるいは定量）を行う。イムノクロマト法は測定装置が簡単で、またコストの点でも優れているため多種多様の被検出物の検出に広く用いられている。
　イムノクロマト法の一つの形態においては、ニトロセルロース等のメンブランストリップ上に被検出物に特異的に結合する抗体を捕捉物質として固相化した検出部、及び被検出物に特異的に結合する標識体を含む標識体部を備えた検査デバイスに、被検出物を含む検体試料を滴下して、被検出物－標識体の複合体を形成させながら展開して検出部でこの複合体を捕捉することで標識を検出あるいは定量する（例えば特許文献１及び特許文献２）。
　近年、イムノクロマト法検査デバイスの試料添加部に予め試薬を含浸させることにより、試料添加部上で検体試料を前処理する技術が開発されている。（特許文献３）
特開２００８－２６８０４３号公報 特開２００８－２０３１３５号公報 特開２０１６－１６１３２９号公報
　イムノクロマト法において検出部の視認性は重要な要素であり、判定結果に大きな影響を与える。しかし、検体成分が混入した際、視認性が悪化する場合がある。改善策として遠心分離で検体成分を除去する方法や界面活性剤を用いて視認性を向上させる方法がある。しかし、遠心分離では専用機器の導入やハンドリング効率の低下、界面活性剤の添加では感度及び特異性が低下してしまうといったデメリットがある。
　本発明の目的は、前記の問題点を改善し、従来の測定方法よりも更に迅速且つ高感度に被検出物の存在を検出又は定量することを可能にするイムノクロマト法検査デバイス並びにその試料展開部の形成方法を提供することである。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、イムノクロマト法において、試料展開部にコール酸またはその塩を施すことにより、検出部の視認性を向上することを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
(1)　試料展開部にコール酸またはその塩を施すことを含む、イムノクロマト法検査デバイスの試料展開部の形成方法。
(2)　前記コール酸またはその塩の添加量が、0.5μg～10μgである、(1)記載の方法。
(3)　前記コール酸またはその塩が、コール酸ナトリウムである(1)又は(2)記載の方法。
(4)　試料展開部にコール酸またはその塩を含む、イムノクロマト法検査デバイス。
　本発明の方法を用いて形成された試料展開部を備えた検査デバイスを用いることにより、検出部の視認性を向上することができ、迅速で高感度に測定することができる。
本発明の一実施形態である検査デバイスの上面図並びに切断断面図である。
　本発明における試料展開部とは、イムノクロマト法検査デバイスにおいて検体試料が展開する部位である。より具体的には、試料添加部の先から検出ラインまでの間である。
　試料展開部は、ニトロセルロースメンブラン等の多孔性基材で形成される。
　試料展開部には、予め抗原抗体反応に必要な試薬を施すことができる。例えば検体試料中の非特異成分が抗原抗体反応に関与しないように界面活性剤を施したり、血液検体を測定する際は溶血剤を施すこともできる。イムノクロマト法は検体試料を予め浮遊液で浮遊させてから試料展開部に展開することが多いが、その場合、検体試料が希釈されることで被検出物もまた希釈され、検出感度に支障をきたすことになる。そこで、予め検体浮遊液の成分である緩衝剤、界面活性剤、各種蛋白、塩類、糖類を施しておくこともできる。
　本発明の方法では、試料展開部にコール酸またはその塩を施すことが必要である。試料展開部に上記コール酸またはその塩を施す方法としては、コール酸またはその塩の溶液、好ましくは、水又は水系緩衝液を溶媒とする水溶液を、含浸や滴下等により添加する方法が好ましい。例えば、標識体部に、コール酸またはその塩の水溶液を添加することができる。添加するコール酸またはその塩の溶液中のコール酸またはその塩の濃度は、通常、0.005質量％～5質量％、好ましくは、0.05質量％～ 2質量％、さらに好ましくは0.1質量％～0.5質量％、さらに好ましくは0.3質量％～0.5質量％である。また、試料展開部へのコール酸またはその塩の添加量は、通常、0.01μg～100μg程度、好ましくは、0.1μg～30μg程度、さらに好ましくは0.5μg～10μg程度、さらに好ましくは2μg～8μg程度である。好ましい態様では、例えば、コール酸またはその塩の濃度が0.1質量％～0.4質量％の水溶液を、コール酸またはその塩の添加量として2μg～8μg添加することができる。
　本発明のイムノクロマト法試験デバイスを用いて検出する被検出物や検体試料は限定されない。例えば、検体試料は、咽頭あるいは鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、咽頭あるいは鼻腔洗浄液、唾液、血清、血漿、全血、便懸濁液、尿、培養液およびそれらを緩衝液で希釈したものや希釈せずにそのまま用いることができる。被検出物も何ら限定されず、検出しようとするいかなる物質であってもよい。具体例として、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、ＨＡＶ、ＨＢｓ、ＨＩＶ、ノロウイルス等のウイルス抗原、ＭＲＳＡ、Ａ群溶連菌、Ｂ群溶連菌、レジオネラ属菌等の細菌抗原、細菌等が産生する毒素、マイコプラズマ、クラミジア・トラコマティス、ヒト絨毛性ゴナドトロピン等のホルモン、Ｃ反応性タンパク質、ミオグロビン、心筋トロポニン、各種腫瘍マーカー、農薬、環境ホルモン等の抗原を挙げることができ、さらに、上記細菌、ウイルス等に対する抗体を挙げることができる。
　本発明は、上記のようにして形成される試料展開部位を含むイムノクロマト法検査デバイスをも提供する。試料展開部にコール酸またはその塩を施す点を除き、検査デバイスの構成自体は、例えば特許文献１、特許文献２及び特許文献３に記載されるような、周知のものであってよい。本発明のイムノクロマト法検査デバイスの具体例の模式図を図１に示すが、本発明の検査デバイスはこれに限定されるものではない。
　図１の上が上面図、下が切断断面図である。図示の具体例では、プラスチック板（６）上に、２個の検出部（３）が形成されたニトロセルロースメンブラン（１）、濾紙で形成された吸収パッド部（５）、上記方法により形成された標識体部（２）、及びガラス繊維フィルターで形成された試料添加部（４）がそれぞれ積層されている。そして、図示のように、吸収パッド部（５）の一方の端部領域と、ニトロセルロースメンブラン（１）の一方の端部領域、ニトロセルロースメンブラン（１）の他方の端部領域と標識体部（２）の一方の端部領域、標識体部（２）の他方の端部領域と試料添加部（４）の一方の端部領域がそれぞれ重ね合わされており、これにより、連続したラテラルフローの流路が形成されている。
　次にこの検査デバイスを用いた免疫測定法について説明する。先ず、検体を検体浮遊／抽出用緩衝液に浮遊／抽出させた検体試料を調製する。プラスチック板（６）上に積層されたニトロセルロースメンブラン（１）上に、被検出物と抗原抗体反応する抗体を着色ポリスチレン粒子で標識した、上記方法により形成される安定化乾燥標識体パッドを含む標識体部（２）を備え、更に被検出物と抗原抗体反応する抗体を捕捉物質としてライン状に固相化された検出部（３）を備えた検査デバイスの試料添加部（４）に前記検体試料を滴下する。被検出物を含む検体試料は、メンブラン上を水平方向に移動しながら標識体を展開するので、被検出物が存在すれば、被検出物－標識体の複合体を形成し、更に検出部（３）に到達するとそのライン上に、捕捉抗体－被検出物－標識体の複合体が形成され、この複合体中の着色ポリスチレン粒子により、複合体の存在を検出することで検体中の被検出物の有無を判定する。なお、検出部（３）は、被検出物質と抗原抗体反応し、且つ、着色ポリスチレン粒子上の抗体又はその抗原結合性断片と同時に被検出物に結合することが可能な、抗体又はその抗原結合性断片をライン状に固相化した領域である。反応に関与しなかった他の成分等は、吸収パッド部（５）に吸収される。
　被検出物と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を結合させた着色ポリスチレン粒子を安定化乾燥標識体として用いる本発明の検査デバイスを用いることにより、迅速且つ簡便に被検出物を測定できる。
　以下、本発明を実施例及び比較例に基づきより具体的に説明する。但し、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ蛋白質を認識するモノクローナル抗体の作製
1. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｎ蛋白質抗原の調製
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｎ蛋白質をコードするＤＮＡを発現用ベクターを用いて大腸菌に発現させ数日間培養した後に蛋白質精製したものを用いた。
２．抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｎ蛋白質モノクローナル抗体の作製
　１．のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｎ蛋白質抗原をBALB/cマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから腸骨リンパ節を摘出する、「マウス腸骨リンパ節法」(Sado Y et al., Acta Histochem. Cytochem. 39: 89-94 (2006))により抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｎ蛋白質抗体を産生するハイブリドーマ細胞株が複数得られた。
　取得した細胞株をプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約2週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水から、プロテインＡカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィー法によりIgGを精製し、精製抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｎ蛋白質モノクローナル抗体（以下「抗Ｎ蛋白質抗体」と称することがある。）を複数得た。
　以下の実施例では複数得られた抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｎ蛋白質モノクローナル抗体のうち、反応性及び特異性を考慮して選択した抗体を用いた。
実施例２　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を測定する免疫測定器具
１．抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｎ蛋白質抗体のニトロセルロースメンブランへの固定化
　実施例１で分類された抗Ｎ蛋白質抗体を緩衝液で希釈した液及び抗マウスIgG抗体を準備し、PETフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブランのサンプルパッド側に抗Ｎ蛋白質抗体、吸収体側に抗マウスIgG抗体をそれぞれ線状に塗布した。その後、ニトロセルロースメンブランを温風下で十分に乾燥させ、抗Ｎ蛋白質抗体固定化メンブランを得た。
２．抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｎ蛋白質抗体の着色ポリスチレン粒子への固定化
　実施例１で作製した抗Ｎ蛋白質抗体を着色ポリスチレン粒子に結合させ、緩衝液に懸濁し、超音波処理により十分に分散させた、抗Ｎ蛋白質抗体結合着色ポリスチレン粒子を得た。本明細書において、抗Ｎ蛋白質抗体固定化粒子と呼ぶ。
３．抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｎ蛋白質抗体結合着色ポリスチレン粒子の塗布及び乾燥
　２で作製した抗Ｎ蛋白質抗体固定化粒子の懸濁液をグラスファイバー不織布に8.0μg塗布し、温風化で十分に乾燥させた。本明細書において、標識体パッドと呼ぶ。
４．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査デバイスの作製
　１で作製した抗Ｎ蛋白質抗体固定化メンブランと２及び３で作製した標識体パッドを他部材（バッキングシート、吸収帯、サンプルパッド）とを貼り合せて5 mm幅に切断し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査デバイスとした。
実施例３　試験
１．コール酸ナトリウムによる視認性試験
　上記3．の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｎ蛋白質抗体結合着色ポリスチレン粒子を希釈液で希釈した溶液にコール酸ナトリウムを０、０．１、０．２、０．４、０．8質量％の濃度になるよう調整し、検査デバイスを作製した。
　それぞれの検査デバイスを用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２組換えＮＰ抗原（CerTest社）を使用してイムノクロマト試験を行い、視認性試験を行った。視認性試験は各検査デバイスを１０個用いて検出ラインの見えやすさを◎、〇、△、×で評した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示されるように、コール酸ナトリウムを添加することで検出ラインの視認性の向上が見られた。0.4質量％で最も視認性が向上しており、0.8質量％より高い濃度になると検出ラインの視認性の向上が低下する傾向がみられた。
２．コール酸ナトリウムの添加部位の比較
　試料添加部と試料展開部にコール酸ナトリウム（コール酸）とデオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）の２種類の界面活性剤を添加し視認性が向上するかを検討した。上記1．の抗Ｎ蛋白質抗体を緩衝液で希釈した液にコール酸を０．２質量％、DOCを0.1質量%の濃度になるよう調整した。さらに上記3．の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｎ蛋白質抗体結合着色ポリスチレン粒子を希釈液で希釈した溶液にコール酸を０．２質量％、DOCを0.1質量%の濃度になるよう調整し、検査デバイスを作製した。
　それぞれの検査デバイスを用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２組換えＮＰ抗原を使用してイムノクロマト試験を行い、視認性試験を行った。視認性試験は各検査デバイスを８個用いて検出ラインの見えやすさを〇、△、×で評価した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示されるように、試料展開部、試料添加部のどちらにおいてもコール酸を添加することで検出ラインの視認性の改善が見られた。また、試料添加部に比べ試料展開部にコール酸を添加した方が検出ラインの視認性において高い効果が得られることが確認された。さらに、試料展開部、試料添加部の両部位にコール酸を添加することで劇的に検出ラインの視認性が向上した。
１ 　ニトロセルロースメンブラン
２　標識体部
３　検出部
４　試料添加部
５　吸収パッド部
６　プラスチック板

Claims (4)

  1. 　試料展開部にコール酸またはその塩を施すことを含む、イムノクロマト法検査デバイスの試料展開部の形成方法。
  2. 　前記コール酸またはその塩の添加量が、0.5μg～10μgである、請求項１記載の方法。
  3. 　前記コール酸またはその塩が、コール酸ナトリウムである請求項１又は２記載の方法。
  4. 　試料展開部にコール酸またはその塩を含む、イムノクロマト法検査デバイス。
PCT/JP2023/043859 2022-12-07 2023-12-07 イムノクロマト法検査デバイスの試料展開部の形成方法およびイムノクロマト法検査デバイス WO2024122616A1 (ja)

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JP2022-195693 2022-12-07
JP2022195693 2022-12-07

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2010001598A1 (ja) * 2008-06-30 2010-01-07 積水メディカル株式会社 結合アッセイ用多孔性固相及びこれを用いた結合アッセイ法
JP2012211849A (ja) * 2011-03-31 2012-11-01 Fujifilm Corp 高感度なイムノクロマトグラフ方法
WO2017163341A1 (ja) * 2016-03-23 2017-09-28 デンカ生研株式会社 イムノクロマト法検査デバイスの試料添加部の形成方法及びイムノクロマト法検査デバイス

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