JP2012211849A - 高感度なイムノクロマトグラフ方法 - Google Patents

Abstract

【課題】イムノクロマトグラフ方法において非測定部のバックグラウンド濃度を低下させることにより、高感度の検出を行うことができるイムノクロマトグラフ方法を提供すること。
【解決手段】被験物質と、該被験物質に対する第一の結合物質で修飾した金属を含む標識物質とをこれらの複合体を形成させた状態で、ステロイド骨格を有する界面活性剤の存在下において不溶性担体上において展開し；該被験物質に対する第二の結合物質、又は被験物質に対する第一の結合物質への結合性を有する物質を有する不溶性担体上の検出部位において該被験物質と該標識物質を捕捉して該被験物質を検出することを含むイムノクロマトグラフ方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、感度を上げるためにバックグラウンド濃度を下げることが可能なイムノクロマトグラフ方法に関する。

免疫測定方法の中でもイムノクロマトグラフ法は、操作が簡便であり短時間で測定可能であることから、一般的によく利用されている。イムノクロマトグラフ法で用いられている免疫反応としては、競合型反応又はサンドイッチ型反応が広く使われている。その中でも、イムノクロマトグラフ法ではサンドイッチ型反応が主流であり、その典型例においては、試料中の抗原よりなる被検出物質を検出するために、以下のような操作が行われる。まず、被検出物質である抗原に対する抗体により感作させた微粒子を固相微粒子としてクロマトグラフ担体に固定化することにより、あるいはこの抗体そのものをクロマトグラフ担体に直接固定化することにより、反応部位を有するクロマトグラフ担体を調製する。一方、標識微粒子に被検出物質と特異的に結合可能な抗体を感作させて感作標識微粒子を調製する。この感作標識微粒子を試料と共に、クロマトグラフ担体上でクロマトグラフ的に移動させる。以上の操作により、クロマトグラフ担体に形成された反応部位において、固定化された抗体が固定化試薬となり、これに被検出物質である抗原を介して感作標識微粒子特異的に結合し、その結果、感作標識微粒子が反応部位に捕捉されることにより生ずるシグナルの有無または程度を目視で判定することにより、試料中の被検出物質の存在の有無または量を測定することができる。

上記したイムノクロマトグラフ法においては、非測定部に非特異吸着した金コロイドにより高いバックグラウンド濃度が発生し、測定部位と非測定部の濃度差がなくなり被測定物の検出感度を下げるという問題があった。上記した問題を解消するために、界面活性剤を添加した試料を、クロマトグラフ担体上でクロマトグラフ的に移動させることによって、バックグラウンド濃度を低下させることが報告されているが（特許文献１）、その効果は十分なものではなかった。

また、イムノクロマトグラフ法においては、感度が低いために抗原が検出されない（偽陰性）問題を回避するために、検出シグナルを増幅させる方法が行われる場合がある（特許文献２及び非特許文献１）。シグナル増幅の方法として、標識としてアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素を用いる場合があるが、金属コロイド標識及び金属硫化物標識からなる群から選んだ標識に銀を含む化合物及び銀イオンのための還元剤を用いて増感すること（銀増幅）によって検出を行う場合もある。このような検出シグナルを増幅させる方法においては特に、非測定部に非特異吸着した金コロイドにより高いバックグラウンド濃度が発生し、測定部位と非測定部の濃度差がなくなり被測定物の検出感度を下げるという問題が顕著になる。

特開２００５−２９１７８３号公報 特開２００２−２０２３０７号公報

Journal of Chromatography, 878 (2010) 271-277

本発明が解決しようとする課題は、イムノクロマトグラフ方法において非測定部のバックグラウンド濃度を低下させることにより、高感度の検出を行うことができるイムノクロマトグラフ方法を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ステロイド骨格を有する界面活性剤の存在下において反応を行うことにより、非測定部への金属を含む標識物質の非特異吸着を減少させ、これにより非測定部のバックグラウンド濃度を低下できることを見出した。

本発明によれば、被験物質と、該被験物質に対する第一の結合物質で修飾した金属を含む標識物質とをこれらの複合体を形成させた状態で、ステロイド骨格を有する界面活性剤の存在下において不溶性担体上において展開し；該被験物質に対する第二の結合物質、又は被験物質に対する第一の結合物質への結合性を有する物質を有する不溶性担体上の検出部位において該被験物質と該標識物質を捕捉して該被験物質を検出することを含むイムノクロマトグラフ方法が提供される。

好ましくは、ステロイド骨格を有する界面活性剤が、N,N-ビス(3-D-グルコンアミドプロピル)コールアミド(BIGCHAP)、3-[(3-クロルアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホネート(CHAPS)、又はデオキシコール酸である。
好ましくは、被験物質と界面活性剤を含む溶液であって界面活性剤濃度が0.05〜10重量％である溶液を不溶性担体上において展開させる。

好ましくは、不溶性担体が多孔性担体である。
好ましくは、金属を含む標識物質が、金属コロイドである。
好ましくは、金属コロイドが金コロイドである。
好ましくは、第一の結合物質が抗体であり、及び／又は第二の結合物質が抗体である。

好ましくは、該被験物質に対する第二の結合物質、又は被験物質に対する第一の結合物質への結合性を有する物質を有する不溶性担体上の検出部位において該被験物質と該標識物質を捕捉した後、捕捉した標識物質を増幅して該被験物質を検出する。
好ましくは、捕捉した標識物質を増幅する工程を、銀を含む化合物及び銀イオンのための還元剤を含む増幅液を用いて行う。
好ましくは、増幅液が２価の鉄イオンを含む液である。
好ましくは、検出時に平均粒子サイズが1μｍ以上20μｍ以下のサイズを有する標識物質を検出する。

本発明によれば、イムノクロマトグラフ方法において非測定部のバックグラウンド濃度を低下させることにより、高感度の測定を行うことができる。

図１は、実施例で用いたアッセイ用デバイスを示す。 図２は、実施例で用いたアッセイ用デバイスを示す。

以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明のイムノクロマトグラフ方法においては、被験物質と、該被験物質に対する第一の結合物質で修飾した金属を含む標識物質とをこれらの複合体を形成させた状態で、ステロイド骨格を有する界面活性剤の存在下において不溶性担体上において展開することを特徴とする。

本発明で用いる界面活性剤としては、ステロイド骨格を有するものであれば特に限定されない。ステロイド骨格を有する界面活性剤の具体例としては以下のものを上げることができる。
デオキシコール酸
コール酸
3alpha,7alpha-Dihydroxy-5beta-cholanic Acid (ケノデオキシコール酸)
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate (CHAPS)
グリココール酸
ヒオデオキシコール酸
3α-ヒドロキシ-7-オキソ-5β-コラン酸
5beta-Cholanic Acid-3alpha-ol (リトコール酸)
3alpha,7alpha-Dihydroxy-12-oxo-5beta-cholanic Acid (12-オキソケノデオキシコール酸)
タウロコール酸
3alpha,7beta-Dihydroxy-5beta-cholan-24-oic Acid N-(2-Sulfoethyl)amide (タウロウルソデオキシコール酸)
5beta-Cholanic Acid-3alpha,7beta-diol (ウルソデオキシコール酸)
N,N,-Bis(3-D-gluconamidopropyl)cholamide (BIGCHAP)
タウロデオキシコール酸

上記の中でも特に好ましいものとしては、デオキシコール酸、コール酸、3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate (CHAPS)、グリココール酸、5beta-Cholanic Acid-3alpha-ol (リトコール酸)、タウロコール酸、N,N,-Bis(3-D-gluconamidopropyl)cholamide (BIGCHAP)、及びタウロデオキシコール酸などを挙げることができる。

ステロイド骨格を有する界面活性剤の存在下において不溶性担体上において展開する方法としては、検体を流した際に界面活性剤が検体と共に流れる方法であればよい。使用態様としては、被験物質と界面活性剤を含む溶液を不溶性担体上において展開させる方法、不溶性担体上のサンプルパット、コンジュケートパット、メンブレンなどにステロイド骨格を有する界面活性剤を予め担持しておく方法が挙げられる。
ステロイド骨格を有する界面活性剤を不溶性担体上に担持する方法としては、ステロイド骨格を有する界面活性剤の溶液をクロマトグラフ担体に添加した後、乾燥される方法が挙げられる。
本発明においては、好ましくは、被験物質と界面活性剤を含む溶液を不溶性担体上において展開させることができる。被験物質と界面活性剤を含む溶液における界面活性剤濃度は、本発明の効果が達成できる限りは限定されないが、一般的には、0.05〜10重量％であり、好ましくは0.1〜5.0重量％であり、特に好ましくは0.25〜1.0 重量％である。

１．クロマトグラフ
一般に、クロマトグラフ方法とは以下のような手法で被分析物を簡便・迅速・特異的に判定・測定する手法である。すなわち、被分析物と結合可能な固定化試薬（抗体、抗原等）を含む少なくとも１つの反応部位を有するクロマトグラフ担体（不溶性担体）を固定相として用いる。このクロマトグラフ担体上で、分析対象物結合可能な試薬によって修飾された標識物質が分散されてなる分散液を移動層として前記クロマトグラフ担体中をクロマトグラフ的に移動させると共に、前記分析対象物と標識物質とが特異的に結合しながら、前記反応部位まで到達する。前記反応部位において、前記分析対象物と標識物質の複合体が前記固定化試薬に特異的結合することにより、被分析液中に分析対象物が存在する場合にのみ、前記固定化試薬部に標識物質が濃縮されることを利用し、それらを目視または適当な機器を用いて被分析液中に被検出物が存在することを定性および定量的に分析する手法である。

本発明におけるクロマトグラフ方法を行うキットや装置は、銀を含む化合物及び銀イオンのための還元剤を内蔵していてもよく、前記固定化試薬に結合した前記分析対象物と標識物質の複合体を核として増幅反応によって、シグナルを増幅し、結果として高感度化を達成することができる。本発明によれば、迅速な高感度クロマトグラフを行うことができる。

２．被検試料
本発明のクロマトグラフ方法で分析することのできる被検試料としては、分析対象物を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物（特にヒト）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰）若しくは排泄物（例えば、糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚、それらを含むと考えられる擦過検体（スワブ）、うがい液、又は動植物それ自体若しくはそれらの乾燥体を挙げることができる。

３．被検試料の前処理
本発明のクロマトグラフ方法では、前記被検試料をそのままで、あるいは、前記被検試料を適当な抽出用溶媒を用いて抽出して得られる抽出液の形で、更には、前記抽出液を適当な希釈剤で希釈して得られる希釈液の形、若しくは前記抽出液を適当な方法で濃縮した形で、用いることができる。前記抽出用溶媒としては、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒（例えば、水、生理食塩液、又は緩衝液等）、あるいは、前記溶媒で希釈することにより直接抗原抗体反応を実施することができる水混和性有機溶媒を用いることもできる。

４．構成
本発明のクロマトグラフ方法において使用することのできるクロマトグラフ用ストリップとしては、通常のクロマトグラフ法に用いることができるクロマトグラフ用ストリップである限り、特に限定されるものではない。例えば、クロマトグラフ用ストリップは、展開方向の上流から下流に向かって、試料添加パッド、標識化物質保持パッド（例えば金コロイド抗体保持パッド）、クロマトグラフ担体（例えば抗体固定化メンブレン）、及び吸収パッドがこの順に、粘着シート上に配置することができる。前記クロマトグラフ担体は、捕捉部位を有し、分析対象物と特異的に結合する抗体又は抗原を固定化した領域である検出ゾーン（検出部と記載することもある）を有し、所望により、コントロール用抗体又は抗原を固定化した領域であるコントロールゾーン（コントロール部と記載することもある）を更に有する。前記標識化物質保持パッドは、標識化物質を含む懸濁液を調製し、その懸濁液を適当な吸収パッド（例えば、グラスファイバーパット）に塗布した後、それを乾燥することにより調製することができる。前記試料添加パッドとしては、例えばグラスファイバーパットを用いることができる。

４−１．標識物質
本発明で用いる標識物質としては、被験物質（抗原）と特異的に結合する検出物質を標識するのに用いる標識として、金属コロイド標識又は金属硫化物標識を用いる。前記金属コロイド標識又は金属硫化物標識としては、通常のイムノクロマト法に用いることができる標識である限り、特に限定されるものではなく、金属コロイド標識としては、例えば、白金コロイド、金コロイド、銀コロイド、鉄コロイド、又は水酸化アルミニウムコロイドなどを挙げることができ、金属硫化物標識としては、例えば、鉄、銀、鉛、銅、カドミウム、ビスマス、アンチモン、錫、又は水銀の各硫化物を挙げることができる。本発明のイムノクロマト法においては、これらの金属コロイド標識及び／又は金属硫化物標識の１又はそれ以上を標識として用いることができる。金属コロイドと特異結合物質との結合は、従来公知の方法（例えばThe Journal of Histochemistry and Cytochemistry, Vol.30,No.7,pp691-696,(1982)）に従い行うことができる。

４−２．結合物質
本発明では、標識物質は、被検物質に対する第一の結合物質で修飾されている。第一の結合物質とは、例えば該被検物質（抗原）に対する抗体、該被検物質（抗体）に対する抗原、該被検物質（たんぱく質、低分子化合物等）に対するアプタマーなど、該被検物質に対して親和性を持つ化合物であればなんでもよい。

本発明では、不溶性担体は、（ａ）被検物質に対する第二の結合物質、又は（ｂ）第一の結合物質への結合性を有する物質を有している。 該被検物質に対する第二の結合物質とは、例えば該被検物質（抗原）に対する抗体、該被検物質（抗体）に対する抗原、該被検物質（たんぱく質、低分子化合物等）に対するアプタマーなど、該被検物質に対して親和性を持つ化合物であればなんでもよい。また、第二の結合物質と第一の結合物質とは異なるものでも良いし、同一のものでもよい。被検物質に対する第一の結合物質への結合性を有する物質とは、被検物質そのものでも良いし、第一の結合物質が認識する部位を持つ化合物でもよく、たとえば被検物質の誘導体とタンパク質（例えばＢＳＡなど）とを結合させたような化合物などがそれにあたる。

好ましくは、第一の結合物質が抗体であり、及び／または第二の結合物質が抗体である。本発明のイムノクロマトグラフ方法においては、分析対象物に対して特異性を有する抗体として、特に限定されるものではないが、例えば、その分析対象物によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その分析対象物によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］を用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行うことができる。

４−３．クロマトグラフ担体
クロマトグラフ担体としては不溶性担体を使用し、その中でも多孔性担体が好ましい。特に、ニトロセルロース膜、セルロース膜、アセチルセルロース膜、ポリスルホン膜、ポリエーテルスルホン膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布、布、または糸等が好ましい。

通常、クロマトグラフ担体の一部に検出用物質を固定化させて検出ゾーンを作製する。検出用物質は、検出用物質をクロマトグラフ担体の一部に物理的または化学的結合により直接固定化させてもいいし、検出用物質をラテックス粒子などの微粒子に物理的または化学的に結合させ、この微粒子をクロマトグラフ担体の一部にトラップさせて固定化させてもいい。なお、クロマトグラフ担体は、検出用物質を固定化後、不活性蛋白による処理等により非特異的吸着防止処理をして用いるのが好ましい。

４−４．試料添加パッド
試料添加パッドの材質は、セルロース濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、及び綿布等の均一な特性を有するものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。試料添加部は、添加された分析対象物を含む試料を受入れるだけでなく、試料中の不溶物粒子等を濾過する機能をも兼ねる。また、分析の際、試料中の分析対象物が試料添加部の材質に非特異的に吸着し、分析の精度を低下させることを防止するため、試料添加部を構成する材質は、予め非特異的吸着防止処理して用いることもある。

４−５．標識化物質保持パッド
標識化物質保持パッドの素材としては、例えば、セルロース濾紙、グラスファイバー、及び不織布等が挙げられ、前述のように調製した標識物質を一定量含浸し、乾燥させて作製する。

４−６．吸収パッド
吸収パッドは、添加された試料がクロマト移動により物理的に吸収されると共に、クロマトグラフ担体の検出部に不溶化されない未反応標識物質等を吸収除去する部位であり、セルロ−ス濾紙、不織布、布、セルロースアセテート等吸水性材料が用いられる。添加された試料のクロマト先端部が吸収部に届いてからのクロマトの速度は、吸収材の材質、大きさなどにより異なるので、その選定により分析対象物の測定に合った速度を設定することができる。

５．免疫検査の方法
以下、本発明のクロマトグラフ方法について、その具体的な実施態様であるサンドイッチ法について説明する。

サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により被検物質の分析を実施することができる。まず、被検物質（抗原）に対して特異性を有する第１抗体及び第２抗体を、先に述べた方法により予め調製しておく。また、第1抗体を、予め標識化しておく。第2抗体を、適当な第一の不溶性担体（例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等）上に固定し、被検物質（抗原）を含む可能性のある被検試料（又はその抽出液）と接触させると、その被検試料中に被検物質が存在する場合には、抗原抗体反応が起きる。この抗原抗体反応は、通常の抗原抗体反応と同様に行なうことができる。前記抗原抗体反応と同時又は反応後に、過剰量の標識化第1抗体を更に接触させると、被検試料中に被検物質が存在する場合には、固定化第2抗体と被検物質（抗原）と標識化第1抗体とからなる免疫複合体が形成される。

サンドイッチ法では、固定化第2抗体と被検物質（抗原）と第1抗体との反応が終了した後、前記免疫複合体を形成しなかった標識化第1抗体を除去し、続いて、第一の不溶性担体における固定化第2抗体を固定した領域について第一の光学濃度測定を行うことによって標識物を定量し、被検試料中の被検物質の量を測定することができる。次いで、金属イオン及び還元剤を供給することにより、前記免疫複合体を形成した標識化第1抗体の標
識からの信号を増幅した後に、第二の光学濃度測定を行うことによって、増幅後の標識物質を定量し、被検試料中の被検物質の量を測定することができる。

６．洗浄
本発明においては、被験物質と、該被験物質に対する第一の結合物質で修飾した金属を含む標識物質とをこれらの複合体を形成させた状態で、タンパク質のプロテアーゼ分解物の存在下において不溶性担体上において展開した後に、洗浄液を不溶性担体上に展開し、その後、捕捉した標識物質を増幅してもよい。

（洗浄液）
前記免疫複合体を形成しなかった標識化抗体を除去するための洗浄液は、洗浄の機能があればどんなものでもよい。

洗浄液は特異的な結合反応以外でクロマトグラフ担体内に残存している、つまり非特異的に残存している標識物質を洗浄するための液体であれば特に限定されるものではなく、単なる水やエタノールなどの溶剤単独でも良いし、例えば１％BSA入りのPBSバッファーや界面活性剤等の溶液等を用いることができる。また、洗浄液として、後述する銀イオンを含む液体、銀イオンの還元剤を含む液体を用いることもできる。なお、洗浄液は展開途中に非特異的に残存した標識物質を洗浄しながら展開するので標識物質を含みながら展開されることになるが、展開される前の洗浄液は洗浄効果を高めるために、標識物質を含んでいない液を用いる。なお、洗浄効果を上げる為にそのpHを調整したり、界面活性剤成分やBSAなどのタンパク質、ポリエチレングリコールなどの高分子化合物を加えたりした洗浄液を用いてもよい。

（洗浄液の展開、その方向）
洗浄液は、検体液を展開した後に、クロマトグラフ用ストリップに添加しクロマトグラフ用ストリップに残存する抗原抗体反応で結合した以外の標識物を洗浄する。洗浄液の送液方法としては、検体液を展開した後にそのまま試料滴下部に添加する方法や、予めストリップに洗浄液送液の為の洗浄液添加パット、吸水パットを付着させておき、その洗浄液添加パットに添加し吸水パット方向へ送液する方法、予めストリップに洗浄液の添加部位を備えておき、検体液の展開後にその洗浄液の添加部位に洗浄液を添加する方法、などがあるが、より好ましくは、検体液をストリップに展開した後に洗浄液送液の為の洗浄液添加パット、吸水パットをストリップに付着させ、洗浄液添加パットに洗浄液を供給し、洗浄液を展開させる方法である。洗浄液添加パットに洗浄液を供給する方法としては、洗浄液の入ったポットに洗浄液添加パットを挿入してもいいし、洗浄液添加パットに洗浄液を滴下しても良い。

本明細書中では、該被検物質の液の展開方向とは、試料添加パッドと吸収パッドとを結ぶ方向と定義し、洗浄液の展開方向とは、洗浄液送液の為の洗浄液添加パットと吸水パットとを結ぶ方向と定義する。

被検物質の液の展開方向と洗浄液の展開方向との成す角が45度から170度の場合、洗浄
効果が大きくなる。さらに、該被検験物質の液の展開方向と洗浄液の展開方向との成す角は、好ましくは60度から170度、さらに好ましくは60度から150度である。

洗浄液添加パット（第二の不溶性担体とも標記する）は、洗浄液を添加できればなんでもよく、グラスファイバーパッドやセルロースメンブレン、ニトロセルロースメンブレンなどを用いることができる。
吸水パットは、吸水することができる物質ならばなんでもよく、セルロース、ニトロセルロース、グラスファイバー、それらの混合体などを用いることができる。

７．増幅液
増幅溶液は、含まれる薬剤が標識物質や被検物質の作用により、触媒的に反応することで、着色した化合物や発光などを生じ、シグナルの増幅を起こすことができる溶液である。例えば、金属標識上で、物理現像により金属銀の析出を起こす銀イオン溶液や、ペルオキシダーゼ標識と過酸化水素の作用により色素となる、フェニレンジアミン化合物とナフトール化合物の溶液などが挙げられる。

詳細には、写真化学の分野での一般書物（例えば、「改訂写真工学の基礎-銀塩写真編-」（日本写真学会編、コロナ社）、「写真の化学」（笹井明、写真工業出版社）、「最新処方ハンドブック」（菊池真一他、アミコ出版社））に記載されているような、いわゆる現像液を用いることができ、液中に銀イオンを含み、液中の銀イオンが現像の核となるような金属コロイド等を中心に還元される、いわゆる物理現像液であれば、特に限定されることなく増幅溶液として用いることができる。

増幅液の具体例としては、銀を含む化合物及び銀イオンのための還元剤を含む増幅液を用いることができる。以下、銀を含む化合物と銀イオンのための還元剤等について説明する。

（銀（イオン）を含む化合物）
銀イオン含有化合物としては、有機銀塩、無機銀塩、もしくは銀錯体を用いることができる。好ましくは、水などの溶媒に対して溶解度の高い銀イオン含有化合物であり、硝酸銀、酢酸銀、乳酸銀、酪酸銀、チオ硫酸銀などが挙げられる。特に好ましくは硝酸銀である。銀錯体としては、水酸基やスルホン基など水溶性基を有する配位子に配位された銀錯体が好ましく、ヒドロキシチオエーテル銀等が挙げられる。

無機銀塩、もしくは銀錯体は、銀として一般に0.001モル／ｍ²〜0.2モル／ｍ²、好ましくは0.01モル／ｍ²〜0.05モル／ｍ²含有されることが好ましい。

（銀イオンのための還元剤）
銀イオンのための還元剤は、銀イオンを銀に還元することができれば、無機・有機のいかなる材料、またはその混合物でも用いることができる。
無機還元剤としては、Fe²⁺、V²⁺、Ti³⁺、などの金属イオンで原子価の変化し得る還元性金属塩、還元性金属錯塩を好ましく挙げることができる。無機還元剤を用いる際には、酸化されたイオンを錯形成するか還元して、除去するか無害化する必要がある。例えば、Fe²⁺を還元剤として用いる系では、クエン酸やEDTAを用いて酸化物であるFe³⁺の錯体を形成し、無害化することができる。本系ではこのような無機還元剤を用いることが好ましく、より好ましくはFe²⁺の金属塩が好ましい。

なお、湿式のハロゲン化銀写真感光材料に用いられる現像主薬（例えばメチル没食子酸塩、ヒドロキノン、置換ヒドロキノン、３−ピラゾリドン類、ｐ−アミノフェノール類、ｐ−フェニレンジアミン類、ヒンダードフェノール類、アミドキシム類、アジン類、カテコール類、ピロガロール類、アスコルビン酸（またはその誘導体）、およびロイコ色素類）、および本分野での技術に熟練しているものにとって明らかなその他の材料、例えば米国特許第6,020,117号に記載されている材料も用いることができる。

還元剤としては、アスコルビン酸還元剤も好ましい。有用なアスコルビン酸還元剤は、アスコルビン酸と類似物、異性体とその誘導体を含み、例えば、Ｄ−またはＬ−アスコルビン酸とその糖誘導体（例えばγ−ラクトアスコルビン酸、グルコアスコルビン酸、フコアスコルビン酸、グルコヘプトアスコルビン酸、マルトアスコルビン酸）、アスコルビン酸のナトリウム塩、アスコルビン酸のカリウム塩、イソアスコルビン酸（またはＬ−エリスロアスコルビン酸）、その塩（例えばアルカリ金属塩、アンモニウム塩または当技術分野において知られている塩）、エンジオールタイプのアスコルビン酸、エナミノールタイプのアスコルビン酸、チオエノ−ルタイプのアスコルビン酸等を好ましく挙げることができ、特にはＤ、ＬまたはＤ，Ｌ−アスコルビン酸（そして、そのアルカリ金属塩）若しくはイソアスコルビン酸（またはそのアルカリ金属塩）が好ましく、ナトリウム塩が好ましい塩である。必要に応じてこれらの還元剤の混合物を用いることができる。

８．その他の助剤
増幅溶液のその他の助剤としては、緩衝剤、防腐剤、例えば酸化防止剤または有機安定剤、速度調節剤を含む場合がある。緩衝剤としては、例えば、酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウムまたはこれらのどれかの塩、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いた緩衝剤、その他一般的化学実験に用いられる緩衝剤を用いることができる。これら緩衝剤を適宜用いて、その増幅溶液に最適なｐＨに調整することができる。また、カブリ防止剤としてアルキルアミンを添加剤として用いることができ、特に好ましくはドデシルアミンである。またこれら添加剤の溶解性向上のため、界面活性剤を用いることができ、特に好ましくはＣ₉Ｈ₁₉-Ｃ₆Ｈ₄-Ｏ-（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）₅₀Ｈである。

９．検出時の平均粒子サイズの算出方法
検出時（増幅後）、テストライン部を切り出し、試料裏面をカーボンペーストで試料台に取り付けた後、断面を切り、カーボン蒸着し、走査型電子顕微鏡にて、形状と大きさを観察する。例えば、日立ハイテクノロジーズ製ＦＥ-ＳＴＥＭ Ｓ-5500で、加速電圧10ＫＶで反射電子による試料表面の観察をＳＥＭで行う事ができる。その後、シグナル粒子を100粒子選び、粒子の投影面積の円相当直径を測定し、平均値を算出し、検出時の平均粒子サイズとする。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

（１）インフルエンザウィルス抗原検出イムノクロマトキットの作成
（1-1）抗インフルエンザA型抗体修飾金コロイドの作成
（1-1-1）F(ab’)₂断片化抗インフルエンザA型ウイルス抗体の作製
抗インフルエンザA型ウイルス抗体（品番7307、メディックスバイオケミカ社）を使用し、ImmunoPureIgG1 Fab and F(ab')₂ Preparation Kit（品番 44880、ピアース社）を用いて作製した。

（1-1-2）抗インフルエンザA型断片化抗体修飾金コロイドの作成
直径50 nm金コロイド溶液（EM.GC50、BBI社）9 mLに50 mM KH2PO4バッファー（pH 7.5）1mLを加えることでpHを調整した金コロイド溶液に、160 μg / mLの（1-1-1）で作製したF(ab’)₂断片化抗インフルエンザA型ウイルス抗体溶液1 mLを加え攪拌した。10分間静置した後、1%ポリエチレングリコール（PEG Mw.20000、品番168-11285、和光純薬）水溶液を550 μL加え攪拌し、続いて10 %牛血清アルブミン（BSA FractionV、品番A-7906、SIGMA）水溶液を1.1 mL加え攪拌した。この溶液を8000×ｇ、４ ℃、30分遠心（himacCF16RX、日立）した後、1 mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散した。この後、20 mLの金コロイド保存液（20 mM Tris-HClバッファー(pH 8.2), 0.05 % PEG（Mw.20000）, 150 mM NaCl, 1 % BSA）に分散し、再び8000×ｇ、４℃、30分間遠心した後、1 mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散し、抗体修飾金コロイド（50 nm）溶液を得た。

(1-2) 抗H5インフルエンザ抗体修飾金コロイドの作成
（1-2-1）F(ab’)₂断片化抗H5インフルエンザウイルス抗体の作製
抗H5インフルエンザウイルス抗体（品番AM00942PU-N、ACRIS社）を使用し、Pierce F(ab’)₂Preparation Kit（品番 44988、Thermo社）を用いて作製した。

（1-2-2）抗H5インフルエンザウイルス抗体修飾金コロイドの作成
直径50 nm金コロイド溶液（EM.GC50、BBI社）9 mLに20 mM Boraxバッファー（pH 9.0）1mLを加えることでpHを調整した金コロイド溶液に、4 μg / mLの（1-2-1）で作製したF(ab’)₂断片化抗H5インフルエンザウイルス抗体溶液1 mLを加え攪拌した。10分間静置した後、1%ポリエチレングリコール（PEG Mw.20000、品番168-11285、和光純薬）水溶液を550 μL加え攪拌し、続いて10 %牛血清アルブミン（BSA FractionV、品番A-7906、SIGMA）水溶液を1.1 mL加え攪拌した。この溶液を8000×ｇ、４ ℃、30分遠心（himacCF16RX、日立）した後、1 mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散した。この後、20 mLの金コロイド保存液（20 mM Tris-HClバッファー(pH 8.2), 0.05 % PEG（Mw.20000）, 150 mM NaCl, 1 % BSA）に分散し、再び8000×ｇ、４℃、30分間遠心した後、1 mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散し、抗体修飾金コロイド（50 nm）溶液を得た。

（1-3）抗インフルエンザA型断片化抗体修飾金コロイド保持パットの作成
（1-1）で作成したインフルエンザA型抗体修飾金コロイドを、金コロイド塗布液（20 mM Tris-Hclバッファー(pH 8.2), 0.05 % PEG（Mw.20000）, 5 % スクロース）及び水で希釈し、520 nmのODが6.0となるように希釈した。この溶液を、8 mm×150 mmに切ったグラスファイバーパッド（Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社）1枚あたり0.8 mLずつ均一に塗布し、一晩減圧乾燥し、金コロイド抗体保持パッドを得た。

(1-4) 抗H5インフルエンザウイルス抗体修飾金コロイド保持パットの作成
（1-2）で作成したH5インフルエンザ抗体修飾金コロイドを、金コロイド塗布液（20 mM Tris-Hclバッファー(pH 8.2), 0.05 % PEG（Mw.20000）, 5 % スクロース）及び水で希釈し、520 nmのODが6.0となるように希釈した。この溶液を、8 mm×150 mmに切ったグラスファイバーパッド（Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社）1枚あたり0.8 mLずつ均一に塗布し、一晩減圧乾燥し、金コロイド抗体保持パッドを得た。

（1-5）抗体固定化メンブレン（クロマトグラフ担体）の作成
（1-5-1）抗インフルエンザA型抗体固定化メンブレン（クロマトグラフ担体）の作成
25 mm×200 mmに切断したニトロセルロースメンブレン（プラスチックの裏打ちあり、HiFlow Plus HF120、ミリポア社）に関し以下のような方法により抗体を固定し抗体固定化メンブレンを作成した。メンブレンの長辺を下にし、下から７ mmの位置に、1.5 mg / mLとなるように調製した固定化用抗インフルエンザA型モノクローナル抗体（Anti-Influenza A SPTN-5 7307、Medix Biochemica社）溶液をインクジェット方式の塗布機（BioDot社）を用いて幅0.7mm程度のライン状に塗布した。同様に、下から13 mmの位置に、0.5 mg / mLとなるように調製したコントロール用抗マウスIgG抗体（抗マウスIgG(H+L),ウサギF(ab')2, 品番566-70621、和光純薬）溶液をライン状に塗布した。塗布したメンブレンは、温風式乾燥機で50℃、30分間乾燥した。ブロッキング液（0.5 w%カゼイン（乳由来、品番030-01505、和光純薬）含有50 mMホウ酸バッファー(pH 8.5)）500 mLをバットに入れ、そのまま30分間静置した。その後、同様のバットに入れた洗浄・安定化液（0.5 w%スクロースおよび0.05 w%コール酸ナトリウムを含む50 mM Tris-HCl（pH 7.5）バッファー）500 mLに移して浸し、そのまま30分間静置した。メンブレンを液から取り出し、室温で一晩乾燥し、抗体固定化メンブレンとした。

(1-5-2) 抗H5インフルエンザ抗体固定化メンブレン（クロマトグラフ担体）の作成
25 mm×200 mmに切断したニトロセルロースメンブレン（プラスチックの裏打ちあり、HiFlow Plus HF120、ミリポア社）に関し以下のような方法により抗体を固定し抗体固定化メンブレンを作成した。メンブレンの長辺を下にし、下から７ mmの位置に、1.5 mg / mLとなるように調製した固定化用抗インフルエンザA型モノクローナル抗体（Mouse monoclonal [15A6] to Influlenza A virus Hemagglutinin、abcam社）溶液をインクジェット方式の塗布機（BioDot社）を用いて幅0.7mm程度のライン状に塗布した。同様に、下から13 mmの位置に、0.5 mg / mLとなるように調製したコントロール用抗マウスIgG抗体（抗マウスIgG(H+L),ウサギF(ab')2, 品番566-70621、和光純薬）溶液をライン状に塗布した。塗布したメンブレンは、温風式乾燥機で50℃、30分間乾燥した。ブロッキング液（0.5 w%カゼイン（乳由来、品番030-01505、和光純薬）含有50 mMホウ酸バッファー(pH 8.5)）500 mLをバットに入れ、そのまま30分間静置した。その後、同様のバットに入れた洗浄・安定化液（0.5 w%スクロースおよび0.05 w%コール酸ナトリウムを含む50 mM Tris-HCl（pH 7.5）バッファー）500 mLに移して浸し、そのまま30分間静置した。メンブレンを液から取り出し、室温で一晩乾燥し、抗体固定化メンブレンとした。

（1-6）イムノクロマトグラフストリップの作製
バック粘着シート（ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社）に、（1-5）で作成した抗体固定化メンブレンを貼り付けた。その際メンブレン長辺側のうち、テストライン側を下側とする。抗体固定化メンブレンの下側に約2 mm重なるように(1-3)及び(1-4)で作成した金コロイド抗体保持パッドを貼り付け、約4 mm重なるようにして金コロイド抗体保持パッド下側に試料添加パッド（18 mm×250 mmに切ったグラスファイバーパッド（Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社））を重ねて貼り付けた。さらに、抗体固定化メンブレンの上側には約5 mm重なるように吸収パッド（80 mm×250 mmに切ったセルロース・グラス膜（CF6、ワットマン社））を重ねて貼り付けた。

これら重ね張り合わせた部材（イムノクロマト本体部材）を、部材の長辺側を25 mm幅になるように短辺に平行にギロチン式カッター（CM4000、ニップンテクノクラスタ社）切断していくことで、25 mm×55 mmのイムノクロマト用ストリップを作成した。それぞれ抗インフルエンザA型イムノクロマトキット、抗H5インフルエンザイムノクロマトキットとした。

（1-7）銀増幅液の作成
(1-7-1）還元剤溶液の作製
水290gに、硝酸鉄(III)九水和物（和光純薬、095-00995）を水に溶解して作製した１mol/lの硝酸鉄水溶液23.6ml、クエン酸（和光純薬、038-06925）13.1gを溶解させた。全て溶解したら、スターラーで攪拌しながら硝酸（10重量%）を36ml加え、硫酸アンモニウム鉄（II）六水和物（和光純薬、091-00855）を60.8g加えこれを還元剤溶液とした。

(1-7-2）銀イオン溶液の作製
水66ｇに、硝酸銀溶液８ｍl（10ｇの硝酸銀を含む）と１mol/lの硝酸鉄水溶液24mlを加えた。さらに、この溶液と、硝酸（10重量%）5.9ml、ドデシルアミン（和光純薬、123-00246）0.1g、界面活性剤Ｃ₁₂Ｈ₂₅-Ｃ₆Ｈ₄-Ｏ-（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）₅₀Ｈ 0.1gをあらかじめ47.6ｇの水に溶解した溶液を混合し、これを銀イオン溶液とした。

(1-8) アッセイ用デバイスの作製
図１に示す第１のデバイス部品（射出成形によるポリプロピレン製）に、図１で示すようにイムノクロマトグラフ用のテストストリップを装填した。次に、図2に示すように第２の不溶性担体および第３の不溶性担体として、グラスファイバーパッド（Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社）を装填した。図1の洗浄液貯蔵ポットには上記(1-7-1)で作製した還元剤溶液185 μLを入れ、アルミラミシート（NewADM、サンライズ社）で熱ラミネートにより封止し、第２のデバイス部品を第１のデバイス部品に嵌め合わせた。なお、図１に示したポット受け部には、上記（1-7-2）で作製した銀イオン溶液95 μLを入れ、アルミラミシートで封止した液体貯蔵ポットを装填した。

（2）評価
（2-1）点着
模擬陽性検体(BD FluエグザマンコントロールA+B-(ベクトン・ディッキンソン社))又はH5インフルエンザHAタンパクを、以下に記載の通り抽出液で希釈し、（1-6）で作成した試験用イムノクロマトグラフキットの試料添加パットに、各抽出液で希釈した液を検体注入孔に140 μL点着し、10分間静置した。具体的には、以下の比較例１、実施例１、２及び３を行った。

（比較例１）
1% BSAを含むPBSバッファーにSDS（非ステロイド骨格界面活性剤）を1%になるように 添加したものを、抽出液として使用した。抗原(模擬陽性検体(BD FluエグザマンコントロールA+B-(ベクトン・ディッキンソン社)))を抽出液で希釈して抗インフルエンザA型イムノクロマトキットに上記の通り点着した。

（比較例２）
1% BSAを含むPBSバッファーを抽出液として使用した。抗原(H5インフルエンザHAタンパク)を抽出液で希釈して抗H5インフルエンザイムノクロマトキットに上記の通り点着した。

（実施例1）
1% BSAを含むPBSバッファーにデオキシコール酸（ステロイド骨格界面活性剤）を1%になるように 添加したものを、抽出液として使用した。抗原(模擬陽性検体(BD FluエグザマンコントロールA+B-(ベクトン・ディッキンソン社)))を抽出液で希釈して抗インフルエンザA型イムノクロマトキットに上記の通り点着した。

（実施例２）
1% BSAを含むPBSバッファーにCHAPS（ステロイド骨格界面活性剤）を0.5%になるように 添加したものを、抽出液として使用した。抗原(H5インフルエンザHAタンパク)を抽出液で希釈して抗H5インフルエンザイムノクロマトキットに上記の通り点着した。

（実施例３）
1% BSAを含むPBSバッファーにBIGCHAPS （ステロイド骨格界面活性剤）を0.5%になるように 添加したものを、抽出液として使用した。抗原(H5インフルエンザHAタンパク)を抽出液で希釈して抗H5インフルエンザイムノクロマトキットに上記の通り点着した。

(2-2) 第２及び第３の不溶性担体の押し付け
検体液を10分間展開した後、第２のデバイス部品20の押し付け部位34を10Ｎの力で押し、第２のデバイス部品20をたわませることで、送液用不溶性担体（第２の不溶性担体12）をメンブレンに押し付けた。この際の、押し付け量は第１のデバイス部品10のリブ15と第２のデバイス部品20が接触することで制限されている。イムノクロマトグラフ用ストリップ（第１の不溶性担体11）のメンブレン表面と、第２のデバイス部品によって送液用不溶性担体のメンブレンに接触する部位が0.2mmに潰されるようにリブ部材15の高さを調整した。また、イムノクロマトグラフ用ストリップ（第１の不溶性担体11）のメンブレン表面と第２のデバイス部品の押付け面18aとのクリアランスが0.005mmとなるように、第２のデバイス部品の突起部の形状を調整した。

（2-3）洗浄
送液用不溶性担体を押し付けてから30秒経過したところで、第２のデバイス部品20の封止破り部19を押し付け、送液用不溶性担体とともにアルミシートを突き破り、不溶性担体12を還元剤溶液に浸した。こうして還元剤溶液をイムノクロマトグラフストリップに展開させ３分間送液した。この工程によりイムノクロマトグラフストリップが還元剤溶液に浸され、さらに特異的に吸着していない材料が洗浄された。

（2-4）増幅溶液によるシグナル増幅
第２のデバイス部品20に装填した液体貯蔵ポット32を押し込み、突起部位により封止を突き破り銀イオン溶液を液体貯蔵ポットから排出させて注入孔に注ぎ込ませた。銀イオン溶液がメンブレン表面と第２のデバイス部品の突起部位とのクリアランスに満たされ、検出ラインに吸着された金コロイド標識を１分間増幅した。

（2-5）バックグランド濃度及びテストライン濃度の評価
増幅処理が終了したイムノクロマトグラフストリップのメンブレン部分を切り出し、よく水洗した。水洗後の抗インフルエンザA型抗体固定化メンブレンを黒色版の上にのせてLAS-4000(FUJIFILM)で撮影した。水洗後の抗H5インフルエンザ抗体固定化メンブレンを白色版の上にのせてLAS-4000(FUJIFILM)で撮影した。それぞれのバックグラウンド濃度(OD)を測定した。

また、テストラインの測定値からバックグランド濃度の値を引くことによって、テストライン濃度(ΔOD)を求めた。なお、テストライン濃度(ΔOD)は、抗インフルエンザA型イムノクロマトキットの場合は模擬陽性検体(BD FluエグザマンコントロールA+B-(ベクトン・ディッキンソン社))を各抽出液で1/2560倍希釈して使用した場合、抗H5インフルエンザイムノクロマトキットの場合はH5インフルエンザHAタンパクを各抽出液で0.2 ng/mLとなるように希釈して使用した場合におけるテストライン濃度である。

上記した比較例１、比較例２、実施例１、２及び３におけるバックグラウンド濃度(OD)及びテストライン濃度(ΔOD)の測定結果を表１に示す。表１の結果よりステロイド系界面活性剤としてBIGCHAP、CHAPS、デオキシコール酸を用いた際にバックグラウンド濃度が減少し、十分に高いテストライン濃度(ΔOD)が得られた。実施例１から３のテストライン濃度（ΔＯＤ）は目視等で十分判別できるレベルであった。
なお、増幅後の銀粒子の粒径は6〜8 μmだった。

Claims (8)

1. 被験物質と、該被験物質に対する第一の結合物質で修飾した金属を含む標識物質とをこれらの複合体を形成させた状態で、ステロイド骨格を有する界面活性剤の存在下において不溶性担体上において展開し；該被験物質に対する第二の結合物質、又は被験物質に対する第一の結合物質への結合性を有する物質を有する不溶性担体上の検出部位において該被験物質と該標識物質を捕捉して該被験物質を検出することを含むイムノクロマトグラフ方法。
2. ステロイド骨格を有する界面活性剤が、N,N-ビス(3-D-グルコンアミドプロピル)コールアミド(BIGCHAP)、3-[(3-クロルアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホネート(CHAPS)、又はデオキシコール酸である、請求項１に記載のイムノクロマトグラフ方法。
3. 被験物質と界面活性剤を含む溶液であって界面活性剤濃度が0.05〜10重量％である溶液を不溶性担体上において展開させる、請求項１又は２に記載のイムノクロマトグラフ方法。
4. 不溶性担体が多孔性担体である、請求項１から３の何れか１項に記載のイムノクロマトグラフ方法。
5. 金属を含む標識物質が、金属コロイドである、請求項１から４の何れか１項に記載のイムノクロマトグラフ方法。
6. 金属コロイドが金コロイドである、請求項５に記載のイムノクロマトグラフ方法。
7. 第一の結合物質が抗体であり、及び／又は第二の結合物質が抗体である、請求項１から６の何れか１項に記載のイムノクロマトグラフ方法。
8. 該被験物質に対する第二の結合物質、又は被験物質に対する第一の結合物質への結合性を有する物質を有する不溶性担体上の検出部位において該被験物質と該標識物質を捕捉した後、捕捉した標識物質を増幅して該被験物質を検出する、請求項１から７の何れか１項に記載のイムノクロマトグラフ方法。
   
   

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