JP2009216696A - 2つの展開液の展開方向を交差させ、かつ、異なる方向から展開させる測定キット、及びイムノクロマトグラフ方法 - Google Patents
2つの展開液の展開方向を交差させ、かつ、異なる方向から展開させる測定キット、及びイムノクロマトグラフ方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009216696A JP2009216696A JP2008249999A JP2008249999A JP2009216696A JP 2009216696 A JP2009216696 A JP 2009216696A JP 2008249999 A JP2008249999 A JP 2008249999A JP 2008249999 A JP2008249999 A JP 2008249999A JP 2009216696 A JP2009216696 A JP 2009216696A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- developing
- solution
- substance
- silver
- test substance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
【解決手段】第一の展開液を流すための第一の展開部材と第二の展開液を流すための第二の展開部材とを持ち、第一の展開液の展開方向と第二の展開液の展開方向とを交差させ、かつ、異なる方向にして展開を行い、かつ、各展開方向の下流にはそれぞれ吸水部位を設置することを特徴とする測定キット。
【選択図】なし
Description
好ましくは、第一の展開液を流すための部材の、第一の展開液の展開方向と第二の展開液の展開方向との交差部位に、該被験物質に対する結合物質を保持する。
好ましくは、該第一の展開液の展開方向と該二の展開液の展開方向の成す角が、60度から150度である。
好ましくは、該第一の展開液の展開方向と該二の展開液の展開方向の成す角が、垂直である。
好ましくは、該第一の展開液を展開させた後に、該二の展開液を展開させる。
好ましくは、第一の展開部材が不溶性担体である。
好ましくは、該不溶性担体が多孔質担体である。
好ましくは、該被験物質に対する第2の結合物質または該被験物質の類似部位を持つ化合物で修飾した標識物質が含まれる。
好ましくは、標識物質が金属コロイドである。
好ましくは、被験物質の展開方向と増幅液の展開方向とが45度から170度である。
好ましくは、被験物質の展開方向と増幅液の展開方向とが60度から150度である。
好ましくは、被験物質の展開方向と増幅液の展開方向とが垂直である。
好ましくは、多孔質担体がニトロセルロースである。
好ましくは、銀を含む化合物及び銀イオンのための還元剤を用いて増感するための反応時間が7分以内である。
好ましくは、検出部位の標識物質の数が1×106/mm3以下である。
好ましくは、標識物質が、金属コロイドである。
また、イムノクロマトキット、及びイムノクロマト方法に関する説明は、以下の通りである。
一般に、イムノクロマトグラフ方法とは以下のような手法で被分析物を簡便・迅速・特異的に判定・測定する手法である。すなわち、被分析物と結合可能な固定化試薬(抗体、抗原等)を含む少なくとも1つの反応部位を有するクロマトグラフ担体を固定相として用いる。このクロマトグラフ担体上で、分析対象物結合可能な試薬によって修飾された検出用標識物が分散されてなる分散液を移動層として前記クロマトグラフ担体中をクロマトグラフ的に移動させると共に、前記分析対象物と検出用標識物とが特異的に結合しながら、前記反応部位まで到達する。前記反応部位において、前記分析対象物と検出用標識物の複合体が前記固定化試薬に特異的結合することにより、被分析液中に分析対象物が存在する場合にのみ、前記固定化試薬部に検出用標識物が濃縮されることを利用し、それらを目視または適当な機器を用いて被分析液中に被験出物が存在することを定性および定量的に分析する手法である。
本発明のイムノクロマトグラフ方法で分析することのできる被験試料としては、分析対象物を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物(特にヒト)の体液(例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰)若しくは排泄物(例えば、糞便)、臓器、組織、粘膜や皮膚、それらを含むと考えられる搾過検体(スワブ)、うがい液、又は動植物それ自体若しくはそれらの乾燥体を挙げることができる。
本発明のイムノクロマトグラフ方法では、前記被験試料をそのままで、あるいは、前記被験試料を適当な抽出用溶媒を用いて抽出して得られる抽出液の形で、更には、前記抽出液を適当な希釈剤で希釈して得られる希釈液の形、若しくは前記抽出液を適当な方法で濃縮した形で、用いることができる。前記抽出用溶媒としては、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒(例えば、水、生理食塩液、又は緩衝液等)、あるいは、前記溶媒で希釈することにより直接抗原抗体反応を実施することができる水混和性有機溶媒を用いることもできる。
本発明のイムノクロマトキットは、検体の有無を検出するイムノクロマトグラフストリップと増幅液添加用パットと吸水用パットとから構成される。また、増幅液添加用パットと吸水用パットは、別々の部材でもよく、また一体型の部材でもよい。イムノクロマトグラフ用ストリップと増幅液添加用パットと吸水用パットの接地は、基本的には互いにメンブレン部分を合わせて重ねているだけであるが、圧力をかけた方法、テープなどで固定する方法、接着剤を用いる方法など、この記載に限定されない。イムノクロマトグラフ用ストリップとしては、通常のイムノクロマトグラフ法に用いることができるイムノクロマトグラフ用ストリップである限り、特に限定されるものではない。例えば、図6に模式的に従来のイムノクロマトグラフ用ストリップの平面図を模式的に示す。図7に図6で示されたイムノクロマトグラフキットの縦断面を模式的に示す縦断面図である。
示す方向)の上流から下流に向かって、試料添加パッド5、標識化物質保持パッド(例えば金コロイド抗体保持パッド)2、クロマトグラフ担体(例えば抗体固定化メンブレン)3、及び吸収パッド4がこの順に、粘着シート5上に配置されている。
検出用標識物は、免疫凝集反応に用いられている着色粒子を使用することができる。例えば、金属コロイドのような金属等を用いることができる。担体粒子(又はコロイド)の平均粒径は、0.02〜10μmの範囲が好ましい。色素を含有したリポゾ−ムやマイクロカプセル等も着色粒子として使用することができる。従来公知の着色金属コロイドはいずれも標識用着色粒子として使用することができる。例えば、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、鉄コロイド、水酸化アルミニウムコロイド、およびこれらの複合コロイドなどが挙げられ、好ましくは、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、およびこれらの複合コロイドである。特に、金コロイドと銀コロイドが適当な粒径において、金コロイドは赤色、銀コロイドは黄色を示す点で好ましい。金属コロイドの平均粒径としては、約1〜500nmが好ましく、特に強い色調が得られる5〜100nmがさらに好ましい。
本発明では、標識物質は、被験物質に対する第一の結合物質で修飾されている。第一の結合物質とは、例えば該被験物質(抗原)に対する抗体、該被験物質(抗体)に対する抗原、該被験物質(たんぱく質、低分子化合物等)に対するアプタマーなど、該被験物質に対して親和性を持つ化合物であればなんでもよい。
本発明のイムノクロマトグラフ方法においては、分析対象物に対して特異性を有する抗体として、特に限定されるものではないが、例えば、その分析対象物によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その分析対象物によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片[例えば、F(ab’)2、Fab、Fab’、又はFv]を用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。
クロマトグラフ担体としては、多孔性担体が好ましい。特に、ニトロセルロース膜、セルロース膜、アセチルセルロース膜、ポリスルホン膜、ポリエーテルスルホン膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布、布、または糸等が好ましい。
試料添加パッドの材質は、セルロース濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、及び綿布等の均一な特性を有するものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。試料添加部は、添加された分析対象物を含む試料を受入れるだけでなく、試料中の不溶物粒子等を濾過する機能をも兼ねる。また、分析の際、試料中の分析対象物が試料添加部の材質に非特異的に吸着し、分析の精度を低下させることを防止するため、試料添加部を構成する材質は、予め非特異的吸着防止処理して用いることもある。
標識化物質保持パッドの素材としては、例えば、セルロース濾紙、グラスファイバー、及び不織布等が挙げられ、前述のように調製した検出用標識物を一定量含浸し、乾燥させて作製する。
吸収パッドは、添加された試料がクロマト移動により物理的に吸収されると共に、クロマトグラフ担体の検出部に不溶化されない未反応標識物質等を吸収除去する部位であり、セルロ−ス濾紙、不織布、布、セルロースアセテート等吸水性材料が用いられる。添加された試料のクロマト先端部が吸収部に届いてからのクロマトの速度は、吸収材の材質、大きさなどにより異なるので、その選定により分析対象物の測定に合った速度を設定することができる。
以下、本発明のクロマトグラフ方法について、その具体的な実施態様であるサンドイッチ法及び競合法について説明する。
(サンドイッチ法)
サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により被験物質の分析を実施することができる。まず、被験物質(抗原)に対して特異性を有する第1抗体及び第2抗体を、先に述べた方法により予め調製しておく。また、第1抗体を、予め標識化しておく。第2抗体を、適当な第一の不溶性担体(例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等)上に固定し、被験物質(抗原)を含む可能性のある被験試料(又はその抽出液)と接触させると、その被験試料中に被験物質が存在する場合には、抗原抗体反応が起きる。この抗原抗体反応は、通常の抗原抗体反応と同様に行なうことができる。前記抗原抗体反応と同時又は反応後に、過剰量の標識化第1抗体を更に接触させると、被験試料中に被験物質が存在する場合には、固定化第2抗体と被験物質(抗原)と標識化第1抗体とからなる免疫複合体が形成される。
競合法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により被験物質の分析を実施することができる。競合法は、サンドイッチ法でアッセイすることができない低分子化合物の抗原を検出する手法として知られている。
本発明において、使用することのできる増幅液とは、写真化学の分野での一般書物(例えば、「改訂写真工学の基礎-銀塩写真編-」(日本写真学会編、コロナ社)、「写真の化学」(笹井明、写真工業出版社)、「最新処方ハンドブック」(菊池真一他、アミコ出版社))に記載されているような、いわゆる現像液のことである。
本発明では、液中に銀イオンを含み、液中の銀イオンが現像の核となるような金属コロイド等を中心に還元される、いわゆる物理現像液であれば、どんなものでも増幅液として用いることができる。
本発明で用いる銀含有化合物としては、有機銀塩、無機銀塩、もしくは銀錯体を用いることができる。
また還元剤の存在下で50℃以上まで加熱されると、光に比較的に安定な金属銀を形成する銀塩または配位化合物であってもよい。
ヘテロ環を含まないメルカプトまたはチオン誘導体のうち有用な化合物としては以下に挙げるものがあるが、これらに制限されるわけではない。
チオグリコ−ル酸銀塩(例えば炭素原子数12から22までのアルキル基を持つS−アルキルチオグリコ−ル酸の銀塩)、ジチオカルボン酸の銀塩(たとえばジチオ酢酸の銀塩又はチオアミドの銀塩)
置換または無置換の安息香酸銀(例えば3,5−ジヒドロキシ安息香酸銀、o−メチル安息香酸銀、m−メチル安息香酸銀、p−メチル安息香酸銀、2,4−ジクロロ安息香酸銀、アセタミド安息香酸銀、およびp−フェニル安息香酸銀)、タンニン酸銀、フタル酸銀、テレフタル酸銀、サリチル酸銀、フェニル酢酸銀、又はピロメリット酸銀。
そのような銀のカルボン酸塩は、米国特許第5,491,059に記載されている。ここで記載されている銀塩の混合物はどれでも、本発明においては必要に応じて使うことができる。
米国特許第4,504,575に記載のスルホン酸塩の銀塩もまた、本発明の態様においては使用することが出来る。
有機銀塩は、銀として一般に0.001モル/m2〜0.2モル/m2、好ましくは0.001モル/m2〜0.05モル/m2含有される。
本発明に用いられる無機銀塩は、例えば、ハロゲン化銀(塩化銀、臭化銀、塩臭化銀、ヨウ化銀、塩ヨウ化銀、塩ヨウ臭化銀、およびヨウ臭化銀等)、チオ硫酸塩(例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩等)の銀塩、チオシアン酸塩(例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩等)の銀塩、および亜硫酸塩(例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩等)の銀塩等が挙げられる。
本発明に用いられるハロゲン化銀の粒子形成方法は、写真業界でよく知られており、例えば、リサーチディスクロージャー1978年6月の第17029号、及び米国特許第3,700,458号に記載されている方法を用いることができるが、具体的にはゼラチンあるいは他のポリマー溶液中に銀供給化合物(例えば、硝酸銀)及びハロゲン供給化合物を添加することにより調製される。
銀イオンのための還元剤は、銀(I)イオンを銀に還元することができる無機・有機のいかなる材料、またはその混合物でも用いることができる。
無機還元剤としては、Fe2+、V2+、Ti3+、などの金属イオンで原子価の変化し得る還元
性金属塩、還元性金属錯塩が知られており、本発明に用いることができる。無機還元剤を用いる際には、酸化されたイオンを錯形成するか還元して、除去するか無害化する必要がある。例えば、Fe+2を還元剤として用いる系では、クエン酸やEDTAを用いて酸化物であるFe3+の錯体を形成し、無害化することができる。
本系ではこのような無機還元剤を用いることが好ましく、より好ましくはFe2+の金属塩が好ましい。
D−またはL−アスコルビン酸とその糖誘導体(例えばγ−ラクトアスコルビン酸、グルコアスコルビン酸、フコアスコルビン酸、グルコヘプトアスコルビン酸、マルトアスコルビン酸)、アスコルビン酸のナトリウム塩、アスコルビン酸のカリウム塩、イソアスコルビン酸(またはL−エリスロアスコルビン酸)、その塩(例えばアルカリ金属塩、アンモニウム塩または当技術分野において知られている塩)、エンジオールタイプのアスコルビン酸、エナミノールタイプのアスコルビン酸、チオエノ−ルタイプのアスコルビン酸)、たとえば米国特許第5,498,511、EP−A−0585,792、EP−A−0573700、EP−A−0588408、米国特許第5,089,819、米国特許第5,278,035、米国特許第5,384,232、米国特許第5,376,510、JP7−56286、米国特許第2,688,549、およびReseach Disclosure37152(1995年3月)に記載されているような化合物。
ヒンダードフェノールは、ベンゼン環上に一つだけの水酸基を有し、少なくとも一つの置換基を水酸基に対してオルト位に有する化合物である。ヒンダードフェノール還元剤は複数の水酸基を別々のベンゼン環に持っていれば、複数の水酸基を有していて構わない。
ヒンダードフェノール還元剤は、たとえば、ビナフトール類(すなわちジヒドロキシビナフトール類)、ビフェノール類(すなわちジヒドロキシビフェノール類)、ビス(ヒドロキシナフチル)メタン類、ビス(ヒドロキシフェニル)メタン類(すなわちビスフェノール類)、ヒンダ−ドフェノール類、およびヒンダードナフトール類が挙げられ、これらは置換されていて構わない。
1,1’−ビ−2−ナフトール、1,1’−ビ−4−メチル−2−ナフトール、および米国特許第3,094,417号と米国特許第5,262,295号に記載されている化合物。
2−(2−ヒドロキシ−3−t−ブチル−5−メチルフェニル)−4−メチル−6−n−ヘキシルフェノール、4,4’−ジヒドロキシ−3,3’,5,5’−テトラ−t−ブチルビフェニル、4,4’−ジヒドロキシ−3,3’,5,5’−テトラメチルビフェニル、および米国特許第5,262,295号に記載の化合物。
4,4’−メチレンビス(2−メチル−1−ナフト−ル)、米国特許第5,262,295号に記載の化合物。
ビス(2−ヒドロキシ−3−t−ブチル−5−メチルフェニル)メタン(CAO−5)、1,1’−ビス(2−ヒドロキシ−3,5−ジメチルフェニル)−3,5,5−トリメチルヘキサン(NONOXまたはPERMANAX WSO)、1,1’−ビス(3,5−di−t−ブチル−4−ヒドロキシフェニル)メタン、2,2’−ビス(4−ヒドロキシ−3−メチルフェニル)プロパン、4,4’−エチリデン−ビス(2−t−ブチル−6−メチルフェノ−ル)、2,2’−イソブチリデン−ビス(4,6−ジメチルフェノ−ル)(LOWINOX 221B46)、2,2’−ビス(3,5−ジメチル−4−ヒドロキシフェニル)プロパン、および米国特許第5,262,295号に記載の化合物。
2,6−ジ−t−ブチルフェノール、2,6−ジ−t−ブチル−4−メチルフェノール、2,4−ジ−t−ブチルフェノール、2,6−ジクロロフェノール、2,6−ジメチルフェノール、および2−t−ブチル−6−メチルフェノール。
1−ナフトール、4−メチル−1−ナフトール、4−メトキシ−1−ナフトール、4−クロロ−1−ナフトール、2−メチル−1−ナフトール、および米国特許第5,262,295号に記載の化合物。
アミドキシム類(例えばフェニルアミドキシム)、2−チエニルアミドキシム、p−フェノキシフェニルアミドキシム、脂肪族カルボン酸アリルヒドラジドとアスコルビン酸の組み合わせ(例えば2,2’−ビス(ヒドロキシメチル)−プロピオニル−β−フェニルヒドラジドとアスコルビン酸の組み合わせ)、ポリヒドロキシベンゼンとヒドロキシルアミン、レダクトンおよびヒドラジンの少なくとも一方の組み合わせ(たとえばヒドロキノンとビス(エトキシエチル)ヒドロキシルアミンの組み合わせ)、ピペリジ−4−メチルフェニルヒドラジン、ヒドロキサム酸(例えばフェニルヒドロキサム酸、p−ヒドロキシフェニルヒドロキサム酸、およびo−アラニンヒドロキサム酸)、アジンとスルホンアミドフェノール類の組合せ(たとえばフェノチアジンと2,6−ジクロロ−4−ベンゼンスルホンアミドフェノール)、α−シアノフェニル酢酸誘導体(例えばエチル−α−シアノ−2−メチルフェニル酢酸、エチル−α−シアノフェニル酢酸)、ビス−o−ナフトール(例えば2,2’−ジヒドロキシ−1−ビナフチル、6,6’−ジブロモ−2,2’−ジヒドロキシ−1,1’−ビナフチル、ビス(2−ヒドロキシ−1−ナフチル)メタン)、
ヒドロキシルアミン(ヒドロキシルアミンとアルキルとアリ−ル置換誘導体を含む)、米国特許第5,545,505に記載のアルカノールアミンとフタル酸アンモニウム、米国特許第5,545,507に記載のヒドロキサム酸化合物、米国特許第5,558,983に記載のN−アシルヒドラジン化合物、米国特許第5,637,449に記載の水素原子ドナー化合物。
増幅液のその他の助剤としては、緩衝剤、防腐剤、例えば酸化防止剤または有機安定剤、速度調節剤を含む場合がある。緩衝剤としては、例えば、酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウムまたはこれらのどれかの塩、またはトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを用いた緩衝剤、その他一般的化学実験に用いられる緩衝剤を用いることができる。これら緩衝剤を適宜用いて、その増幅液に最適なpHに調整することができる。
(1-1)抗インフルエンザA型B型抗体修飾金コロイドの作成
(1-1-1)抗インフルエンザA型抗体修飾金コロイドの作成
直径50 nm金コロイド溶液(EM.GC50、BBI社)9 mLに50 mM KH2PO4バッファー(pH 7.5)1mLを加えることでpHを調整した金コロイド溶液に、90 μg / mLの抗インフルエンザA型モノクローナル抗体(Anti-Influenza A SPTN-5 7307、Medix Biochemica社)溶液1 mLを加え攪拌した。10分間静置した後、1%ポリエチレングリコール(PEG Mw.20000、品番168-11285、和光純薬)水溶液を550 μL加え攪拌し、続いて10 %牛血清アルブミン(BSA FractionV、品番A-7906、SIGMA)水溶液を1.1 mL加え攪拌した。この溶液を8000×g、4 ℃、30分遠心(himacCF16RX、日立)した後、1 mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散した。この後、20 mLの金コロイド保存液(20 mM Tris-HClバッファー(pH 8.2), 0.05 % PEG(Mw.20000), 150 mM NaCl, 1 % BSA, 0.1 % NaN3)に分散し、再び8000×g、4℃、30分間遠心した後、1 mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散し、抗体修飾金コロイド(50 nm)溶液を得た。
直径50 nm金コロイド溶液(EM.GC50、BBI社)9 mLに50 mM KH2PO4バッファー(pH 8.0 )1mLを加えることでpHを調整した金コロイド溶液に、80 μg / mLの抗インフルエンザB型モノクローナル抗体(MONOTOPE aby Influenza B Virus (nuclear) Purified 1131、ViroStat, Inc.)溶液1 mLを加え攪拌した。10分間静置した後、1%ポリエチレングリコール(PEG Mw.20000、品番168-11285、和光純薬)水溶液を550 μL加え攪拌し、続いて10 %牛血清アルブミン(BSA FractionV、品番A-7906、SIGMA)水溶液を1.1 mL加え攪拌した。この溶液を8000×g、4 ℃、30分遠心(himacCF16RX、日立)した後、1 mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散した。この後、20 mLの金コロイド保存液(20 mM Tris-HClバッファー(pH 8.2), 0.05 % PEG(Mw.20000), 150 mM NaCl, 1 % BSA, 0.1 % NaN3)に分散し、再び8000×g、4℃、30分間遠心した後、1 mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散し、抗体修飾金コロイド(50 nm)溶液を得た。
(1-1)で作成したインフルエンザA型、B型抗体修飾金コロイドを、1:1で混合し、金コロイド塗布液(20 mM Tris-Hclバッファー(pH 8.2), 0.05 % PEG(Mw.20000), 5 % スクロース)及び水により希釈し、520 nmのODが3.0となるように希釈した。この溶液を、8 mm×150 mmに切ったグラスファイバーパッド(Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社)1枚あたり0.8 mLずつ均一に塗布し、一晩減圧乾燥し、金コロイド抗体保持パッドを得た。
25 mm×200 mmに切断したニトロセルロースメンブレン(プラスチックの裏打ちあり、HiFlow Plus HF120、ミリポア社)に関し以下のような方法により抗体を固定し抗体固定化メンブレンを作成した。メンブレンの長辺を下にし、下から7 mmの位置に、1.5 mg / mLとなるように調製した固定化用抗インフルエンザA型モノクローナル抗体(Anti-Influenza A SPTN-5 7307、Medix Biochemica社)溶液をインクジェット方式の塗布機(BioDot社)を用いて幅0.7mm程度のライン状に塗布した。同様に、下から10 mmの位置に、1.5 mg /mLとなるように調製した固定化用抗インフルエンザB型モノクローナル抗体(MONOTOPE a by Influenza B Virus (nuclear) Purified 1131、ViroStat, Inc.)溶液を幅0.7mm程度のライン状に塗布した。さらに同様に、下から13 mmの位置に、0.5 mg / mLとなるように調製したコントロール用抗マウスIgG抗体(抗マウスIgG(H+L),ウサギF(ab')2, 品番566-70621、和光純薬)溶液をライン状に塗布した。塗布したメンブレンは、温風式乾燥機で50℃、30分間乾燥した。ブロッキング液(0.5 w%カゼイン(乳由来、品番030-01505、和光純薬)含有50 mMホウ酸バッファー(pH 8.5))500 mLをバットに入れ、そのまま30分間静置した。その後、同様のバットに入れた洗浄・安定化液(0.5 w%スクロースおよび0.05 w%コール酸ナトリウムを含む50 mM Tris-HCl(pH 7.5)バッファー)500 mLに移して浸し、そのまま30分間静置した。メンブレンを液から取り出し、室温で一晩乾燥し、抗体固定化メンブレンとした。
バック粘着シート(ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社)に、(1-3)で作成した
抗体固定化メンブレンを貼り付けた。その際メンブレン長辺側のうち、抗インフルエンザA型抗体ライン側を下側とする。抗体固定化メンブレンの下側に約2 mm重なるように2で作成した金コロイド抗体保持パッドを貼り付け、約4 mm重なるようにして金コロイド抗体保持パッド下側に試料添加パッド(18 mm×150 mmに切ったグラスファイバーパッド(Glass
Fiber Conjugate Pad、ミリポア社))を重ねて貼り付けた。さらに、抗体固定化メンブレンの上側には約5 mm重なるように吸収パッド(20 mm×150 mmに切ったセルロ−ス膜(Cellulose Fiber Sample Pad、ミリポア社、厚み0.8mm)、を重ねて貼り付けた。これら重ね張り合わせた部材(イムノクロマト本体部材)を、部材の長辺側を15 mm幅になるように短辺に平行にギロチン式カッター(CM4000、ニップンテクノクラスタ社)切断していくことで、15 mm×55 mmのイムノクロマト用ストリップを作成した。これらを試験用イムノクロマトキットとした。この際の吸収パットの体積は、240 mm3であった。
(1-4)で作成した試験用イムノクロマトグラフキットの2本の捕捉部位(TL)の間のエリアのうちストリップの両端から真ん中になる点を、増幅液添加用パットと吸水用パットとを結ぶ直線が通るようにし、この増幅液展開方向と検体液展開方向とのなす角が45、60、90、135、150,170度となるようにして、増幅液展開の上流端となる端に増幅液添加用パット(18 mm×8mmに切ったグラスファイバーパッド(Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社)に13mm×8mmのバック粘着シート(ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社)
を貼ったもの)をテーフ゜で貼り付け、下流端となる端に吸水用パット(100mm×8mmに切ったセルロースメンブレン(CF6、ワットマン社、厚み1.37mm、体積1096 mm3)に95mm×8mmに切ったバック粘着シート(ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社)を貼ったもの)を貼り付けた。
PBSバッファー(和光純薬)に1重量%のBSA(シグマ社)を溶解した1%BSA入りPBSバッファーを洗浄液とした。
(1-6-1)増幅液Aの作成
(1-6-1-1)増幅液A-1の作成
水325gに、硝酸鉄(III)九水和物(和光純薬、095-00995)を水に溶解して作成した1mol/Lの硝酸鉄水溶液40mL、クエン酸(和光純薬、038-06925)10.5g、ドデシルアミン(和光純薬、123-00246)0.1g、界面活性剤C9H19-C6H4-O-(CH2CH2O)50H 0.44gを溶解させる。全て溶解したら、スターラーで攪拌しながら硝酸(10重量%,)を40mL加える。この溶液80mLを測りとり、硫酸アンモニウム鉄(II)六水和物(和光純薬、091-00855)を11.76g加えこれを増幅液A-1とした。
硝酸銀溶液10mL(10gの硝酸銀を含む)に水を加えて全体量が100gとなるようにし、増幅液A-2(10重量%硝酸銀水溶液)を作成した。
増幅液A-1 40mLを測りとり、増幅液A-2を4.25mL加え攪拌し、増幅液Aとした。
<比較例1>0度方向からの増幅
(2-1)抗原液の点着・展開
検体液として、クイックS-インフルA・B「生研」陰性/陽性コントロール(品番322968、デンカ生研)を使用した。1質量%BSAを含むPBSバッファーでこの陽性コントロール液を希釈し、市販イムノクロマト検出キット「キャピリアFluA・B」(アルフレッサファーマ)による検出限界はA型B型とも1/40であった。今回は1質量%BSAを含むPBSバッファーで、この陽性コントロールを希釈し、1/200に希釈し、これを検体液として用いた。
なおこのメンブレンに、PBSバッファーを送液することによるバックグランドの洗浄を行い、この検出ライン部分を切り出し、王水により金を抽出した後、高分解能ICP質量分析装置 HR-ICP-MS(Element XR、サーモフィッシャーサイエンティフィック社)で測定し、存在する金量を定量した。金コロイト゛粒子径を50 nmとして測定した金量から計算し、金コロイド個数を算出し、さらにメンブレン単位体積当りの金コロイド粒子数を求めたところ、870000個/mm3であった(3回の平均値)。
抗原液展開後、イムノクロマトストリップのパッド類を全てはずし、増幅液展開の上流端となる端に増幅液添加用パット(18 mm×8mmに切ったグラスファイバーパッド(Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社)に13mm×8mmのバック粘着シート(ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社)を貼ったもの)をテーフ゜で貼り付け、下流端となる端に吸水用パット(100mm×8mmに切ったセルロースメンブレン(CF6、ワットマン社)に95mm×8mmに切ったバック粘着シート(ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社)を貼ったもの)を貼り付けた。(1-6)で作成した増幅液Aを40mL入れたプラスチックトレイに増幅液添加用パット浸漬し、2分間銀増幅を行った。その後、このメンブレンを増幅液から取り出し、3分間よく水洗した。これをイムノクロマトグラフ用濃度測定器(ICA-1000、浜松ホトニクス)を用いて測定し、リファレンス白板に対する反射光学濃度を測定した。2回測定し、その平均を小数点以下第4位を四捨五入し、バックグランド測定結果とした。測定位置は、2本の捕捉部位(TL)の中心、かつメンブレンの2本の捕捉部位で囲まれるエリアのうちメンブレンの両端から真ん中になる点を測定した。これの濃度をバックグランッド濃度として表1に示す。
において洗浄操作を行わなかったメンブレンの増幅後の濃度も共に示した。この値を各測定したバックグランッド濃度から引いたものを、残存金によるバックグランド金に起因するバックグランドと考え、図3にあわせて示した。
(2−2)で増幅した際の検出ラインの見やすさをバックグランドとのコントラストが取れて見やすいほうから順に、◎、○、△、×、××(見えない)、で評価した。結果を表1に示す。
増幅液展開方向と検体液展開方向とのなす角が30度となるように(1-5)で作製したキットを使用した。抗原液の点着は、(2-1)と同様に行い、抗原液点着10分後、増幅液添加用パットを(1-6)で作成した増幅液Aを40mL入れたプラスチックトレイに増幅液添加用パット浸漬し、2分間銀増幅を行った。その後、このメンブレンを増幅液から取り出し、3分間よく水洗した。これをイムノクロマトグラフ用濃度測定器(ICA-1000、浜松ホトニクス)を用いて測定し、リファレンス白板に対する反射光学濃度を測定した。2回測定し、その平均を小数点以下第4位を四捨五入し、バックグランド測定結果とした。測定位置は、2本の捕捉部位(TL)の中心、かつメンフ゛レンの2本の捕捉部位で囲まれるエリアのうちメンブレンの両端から真ん中になる点を測定した。これの濃度をバックグランッド濃度として表1に示す。
増幅液展開方向と検体液展開方向とのなす角が45度となるように(1-5)で作製したキットを使用した。他は<実施例1>と同様に実験を行った。
増幅液展開方向と検体液展開方向とのなす角が60度となるように(1-5)で作製したキットを使用した。他は<実施例1>と同様に実験を行った。
増幅液展開方向と検体液展開方向とのなす角が90度となるように(1-5)で作製したキ
ットを使用した。他は<実施例1>と同様に実験を行った。
増幅液展開方向と検体液展開方向とのなす角が120度となるように(1-5)で作製したキットを使用した。他は<実施例1>と同様に実験を行った。
増幅液展開方向と検体液展開方向とのなす角が135度となるように(1-5)で作製したキットを使用した。他は<実施例1>と同様に実験を行った。
増幅液展開方向と検体液展開方向とのなす角が150度となるように(1-5)で作製したキットを使用した。他は<実施例1>と同様に実験を行った。
増幅液展開方向と検体液展開方向とのなす角が170度となるように(1-5)で作製したキットを使用した。他は<実施例1>と同様に実験を行った。
増幅液展開方向と検体液展開方向とのなす角が180度となるように(1-5)で作製したキットを使用した。他は<実施例1>と同様に実験を行った。
0度方向からの増幅<比較例1>、180度方向からの増幅<比較例2>に比べ、異なった
角度から増幅した実施例1〜7で増幅後のバックグランドノイズが下がった。増幅液の展開によりバックグランドに非特異的に存在する標識の金が洗い流され、バックグランドノイズが下がったと考えられる。増幅液展開方向と検体液展開方向のなす角と非特異的に残存する標識物質によるバックグランドとの関係を表1に示す。
45度から170度、特に60度から150度、その中でも特に90度において大きくバックグランドノイズが下がった。バックグランドノイズが下がったサンプルでは、検出ラインとバックグランドとのコントラストが向上し、視認度が上がった。
Claims (21)
- 第一の展開液を流すための第一の展開部材と第二の展開液を流すための第二の展開部材とを持ち、第一の展開液の展開方向と第二の展開液の展開方向とを交差させ、かつ、異なる方向にして展開を行い、かつ、各展開方向の下流にはそれぞれ吸水部位を設置することを特徴とする測定キット。
- 第一の展開液を流すための部材の、第一の展開液の展開方向と第二の展開液の展開方向との交差部位に、該被験物質に対する結合物質を保持する、請求項1に記載の測定キット。
- 該第一の展開液の展開方向と該二の展開液の展開方向の成す角が、45度から170度である、請求項1に記載の測定キット。
- 該第一の展開液の展開方向と該二の展開液の展開方向の成す角が、60度から150度である、請求項1に記載の測定キット。
- 該第一の展開液の展開方向と該二の展開液の展開方向の成す角が、垂直である、請求項1に記載の測定キット。
- 該第一の展開液を展開させた後に、該二の展開液を展開させる、請求項1から5の何れかに記載の測定キット。
- 該第一の展開液を被験物質、該第二の展開液を増幅液または増幅液の一部を含有する液とする、請求項1から6の何れかに記載の測定キット。
- 第一の展開部材が不溶性担体である、請求項1から7の何れかに記載の測定キット。
- 該不溶性担体が多孔質担体である、請求項8に記載の測定キット。
- 該被験物質に対する第2の結合物質または該被験物質の類似部位を持つ化合物で修飾した標識物質が含まれる、請求項1から9の何れかに記載の測定キット。
- 標識物質が金属コロイドである、請求項1から10何れかに記載の測定キット。
- 被験物質と、該被験物質に対する第一の結合物質で修飾した標識物質とを、これらを混合させた状態で第一の不溶性担体上において展開し、該被験物質に対する第二の結合物質、または被験物質に対する第一の結合物質への結合性がある物質、を有する第一の不溶性担体上の反応部位において該被験物質と該標識化物質を捕捉して該被験物質を検出することを含むイムノクロマトグラフ方法において、銀を含む化合物及び銀イオンのための還元剤を含む増幅液を用いて増感することによって被験物質の検出を行うことを含み、被験物質の展開方向と増幅液の展開方向とが交差し、かつ、異なる方向にして展開を行うことを特徴とするイムノクロマトグラフ方法。
- 該第一の結合物質及び/又は第二の結合物質が抗体である、請求項12に記載のイムノクロマトグラフ方法。
- 被験物質の展開方向と増幅液の展開方向とが45度から170度である、請求項12に記載のイムノクロマトグラフ方法。
- 被験物質の展開方向と増幅液の展開方向とが60度から150度である、請求項12に記載のイムノクロマトグラフ方法。
- 被験物質の展開方向と増幅液の展開方向とが垂直である、請求項12に記載のイムノクロマトグラフ方法。
- 多孔質担体がニトロセルロースである、請求項12から16の何れかに記載のイムノクロマトグラフ方法。
- 平均粒子サイズが1μm以上20μm以下のサイズを有する標識物質を検出する、請求項12から17の何れかに記載のイムノクロマトグラフ方法。
- 銀を含む化合物及び銀イオンのための還元剤を用いて増感するための反応時間が7分以内である、請求項12から18の何れかに記載のイムノクロマトグラフ方法。
- 検出部位の標識物質の数が1×106/mm3以下である、請求項12から19の何れかに記載のイムノクロマトグラフ方法。
- 標識物質が、金属コロイドである、請求項12から20の何れかに記載のイムノクロマトグラフ方法。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008249999A JP2009216696A (ja) | 2008-02-12 | 2008-09-29 | 2つの展開液の展開方向を交差させ、かつ、異なる方向から展開させる測定キット、及びイムノクロマトグラフ方法 |
US12/325,057 US7998753B2 (en) | 2007-11-29 | 2008-11-28 | Measurement kit and an immunochromatography method |
EP08020718A EP2065706B1 (en) | 2007-11-29 | 2008-11-28 | Immunochromatography method |
US13/177,971 US8877515B2 (en) | 2007-11-29 | 2011-07-07 | Measurement kit and an immunochromatography method |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008029989 | 2008-02-12 | ||
JP2008249999A JP2009216696A (ja) | 2008-02-12 | 2008-09-29 | 2つの展開液の展開方向を交差させ、かつ、異なる方向から展開させる測定キット、及びイムノクロマトグラフ方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009216696A true JP2009216696A (ja) | 2009-09-24 |
Family
ID=41188691
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008249999A Pending JP2009216696A (ja) | 2007-11-29 | 2008-09-29 | 2つの展開液の展開方向を交差させ、かつ、異なる方向から展開させる測定キット、及びイムノクロマトグラフ方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2009216696A (ja) |
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011075366A (ja) * | 2009-09-30 | 2011-04-14 | Fujifilm Corp | クロマトグラフ測定装置 |
JP2011117906A (ja) * | 2009-12-07 | 2011-06-16 | Fujifilm Corp | イムノクロマトグラフ方法 |
JP2012098237A (ja) * | 2010-11-05 | 2012-05-24 | Japan Advanced Institute Of Science & Technology Hokuriku | イムノクロマトグラフィーにおける多段階増感操作をワンステップにする流路設計 |
JP2013213803A (ja) * | 2011-09-29 | 2013-10-17 | Fujifilm Corp | クロマトグラフキット及びクロマトグラフ方法 |
EP2713164A1 (en) | 2012-09-27 | 2014-04-02 | FUJIFILM Corporation | Chromatography method and kit |
JP2015535078A (ja) * | 2012-10-16 | 2015-12-07 | ボディテックメド インコーポレイテッドBoditechmed. Inc | サブパッドを備えた側方流動分析用ストリップ及びこれに用いられる側方流動分析用カートリッジ |
JP2017509889A (ja) * | 2014-03-31 | 2017-04-06 | ワットマン・ゲーエムベーハー | ラテラルフロー試験及びそれに関係する改善 |
JP2018021790A (ja) * | 2016-08-02 | 2018-02-08 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 流体制御機構およびこれを用いたイムノクロマトグラフィー分析用キット |
CN111707819A (zh) * | 2020-06-22 | 2020-09-25 | 上海雄图生物科技有限公司 | 一种afb1、zen、don三指标定量层析试纸条 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3496154B2 (ja) * | 1993-12-07 | 2004-02-09 | ベックマン コールター インコーポレイテッド | 試薬供給を調節する障壁を有する検定装置 |
WO2006099191A2 (en) * | 2005-03-11 | 2006-09-21 | Chembio Diagnostic Systems, Inc. | Dual path immunoassay device |
-
2008
- 2008-09-29 JP JP2008249999A patent/JP2009216696A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3496154B2 (ja) * | 1993-12-07 | 2004-02-09 | ベックマン コールター インコーポレイテッド | 試薬供給を調節する障壁を有する検定装置 |
WO2006099191A2 (en) * | 2005-03-11 | 2006-09-21 | Chembio Diagnostic Systems, Inc. | Dual path immunoassay device |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011075366A (ja) * | 2009-09-30 | 2011-04-14 | Fujifilm Corp | クロマトグラフ測定装置 |
JP2011117906A (ja) * | 2009-12-07 | 2011-06-16 | Fujifilm Corp | イムノクロマトグラフ方法 |
JP2012098237A (ja) * | 2010-11-05 | 2012-05-24 | Japan Advanced Institute Of Science & Technology Hokuriku | イムノクロマトグラフィーにおける多段階増感操作をワンステップにする流路設計 |
JP2013213803A (ja) * | 2011-09-29 | 2013-10-17 | Fujifilm Corp | クロマトグラフキット及びクロマトグラフ方法 |
EP2713164A1 (en) | 2012-09-27 | 2014-04-02 | FUJIFILM Corporation | Chromatography method and kit |
US9678081B2 (en) | 2012-09-27 | 2017-06-13 | Fujifilm Corporation | Chromatography method and chromatographic kit |
JP2015535078A (ja) * | 2012-10-16 | 2015-12-07 | ボディテックメド インコーポレイテッドBoditechmed. Inc | サブパッドを備えた側方流動分析用ストリップ及びこれに用いられる側方流動分析用カートリッジ |
JP2017509889A (ja) * | 2014-03-31 | 2017-04-06 | ワットマン・ゲーエムベーハー | ラテラルフロー試験及びそれに関係する改善 |
JP2018021790A (ja) * | 2016-08-02 | 2018-02-08 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 流体制御機構およびこれを用いたイムノクロマトグラフィー分析用キット |
CN111707819A (zh) * | 2020-06-22 | 2020-09-25 | 上海雄图生物科技有限公司 | 一种afb1、zen、don三指标定量层析试纸条 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5275737B2 (ja) | イムノクロマトグラフ方法 | |
JP5117928B2 (ja) | イムノクロマトグラフデバイス | |
JP5091074B2 (ja) | 断片化抗体を用いたイムノクロマトグラフ方法 | |
JP5435878B2 (ja) | 断片化抗体を標識物質に固定した標識粒子 | |
US7998753B2 (en) | Measurement kit and an immunochromatography method | |
JP2009216696A (ja) | 2つの展開液の展開方向を交差させ、かつ、異なる方向から展開させる測定キット、及びイムノクロマトグラフ方法 | |
JP5728453B2 (ja) | クロマトグラフ方法及びクロマトグラフキット | |
JP4865664B2 (ja) | 多孔性担体内で2以上の液を混合する方法 | |
JP4980945B2 (ja) | 金属粒子及びそれを用いた検査方法 | |
JP5091075B2 (ja) | イムノクロマトグラフ方法 | |
JP4892500B2 (ja) | 非特異吸着抑制剤を用いたイムノクロマトグラフ方法 | |
JP2009216695A (ja) | イムノクロマトグラフ方法 | |
JP5091009B2 (ja) | イムノクロマトグラフ方法 | |
JP4977588B2 (ja) | イムノクロマトグラフ方法 | |
EP2065706B1 (en) | Immunochromatography method | |
JP2009085700A (ja) | イムノクロマトグラフキット | |
JP4870695B2 (ja) | メンブレン内の標識を洗浄、増幅、停止する方法 | |
JP4913025B2 (ja) | イムノクロマトグラフ方法 | |
JP5128256B2 (ja) | イムノクロマトグラフ方法 | |
JP2013181935A (ja) | クロマトグラフ方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20110209 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120313 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20120314 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120511 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20121002 |