JPH06502723A

JPH06502723A - 抗体を検出する分析系の感度及び／又は特異性の決定方法

Info

Publication number: JPH06502723A
Application number: JP4501275A
Authority: JP
Inventors: オスザー，カート　ビー．; ケラーマン，ゴットフリード　エッチ．
Original assignee: ヴェリジェン，インコーポレーテッド
Priority date: 1990-11-09
Filing date: 1991-11-06
Publication date: 1994-03-24
Also published as: AU650707B2; EP0556327A1; EP0556327A4; FI932080A; FI932080A0; WO1992008471A1; KR930701975A; CA2055177A1; AU9094291A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】抗体を検出する分析系の感度及び／又は特異性の決定方法、　技術分野この発明は、ウィルス及び／又は他の微生物感染因子に対する抗体の存在又は欠如を検出する分析系における感度及び／又は特異性を決定するためのブタの血清交換パネルの使用、及びブタの血清交換パネルを製造する方法に関する。特に、この発明は、ブタの免疫グロブリンＩｇＧ、ブタの免疫グロブリンＩｇＡ及びブタの免疫グロブリン［ｇＭの血清交換パネルの使用に関する。

発明の背景抗原の存在に応答して産生ずる抗体の存在又は欠如を検出することかできる分析系は、公知である。このような分析系は、とりわけ種々の疾病の診断において有用性か証明されてきた。

例えば、エイズ（後天性免疫不全症候群）及びＣＭＶ　（サイトメガロウィルス）のようなウィルス感染は、これらの疾病にかかっていると推測される患者において、免疫グロブリン［ｇＧｌ［ｇＡ及び１ｇＭを含むウィルス抗体の存在を検出する分析によって診断されるであろう。抗原−抗体結合を使用するこのような分析系の例には、エライザ（ＥＬｆＳＡ）、ウェスタンプロット、迅速ウェスタンプロット（Ｑｕｉｃｋ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｓ）　（米国特許第４、８１６．３８７号及び第４．８５５．２３５号）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が含まれる。このような診断薬は、一様に、試験系の完全性を保証するために対照を含有する。

典型的に、診断薬は、陽性及び陰性対照の両方を有する。陽性対照は、例えば、抗体試験系に用いられる抗原に特異的に反応する抗体か抗原に結合すること（試験系に用いられる抗原が、正確に働いていることを示している）や、結合した免疫グロブリンを検出するために用いられる抗免疫グロブリンが働いていることなどの、試験系の活性に関する適切な情報を提供する。

エライザ系の場合には、抗免疫グロブリンは、色素体反応を与えるために系に加えられる基質を活性化する酵素（複合体）で標識されるであろう。即ち、この場合には、陽性対照は、複合体が反応したかどうか、及び基質が正確に活性化された色素体として働いたかどうかを示す。陰性対照は、試験系に用いられる特定の抗原に特異的に反応する抗体の欠如についての情報を提供する。また、それは、特定の試験において用いられる信号によって決定される反応レベルに関する情報を提供し、それによって、検体は陰性であると考えられるであろう。

特定の試験における区別するポイントは、しばしば、陽性対照によって及び／又は陰性対照によって得られる相対値に基づく。特に、特定の型の試験キットで用いられる対照によって得られる許容検出範囲は、その型のキットのために設計され、滴定される。特定の試験系において得られる陽性対照値は、その試験系の感度に影響を及ぼし、陰性対照値は、試験系の特異性に影響を及ぼす。

従来、血清交換パネルは、診断試験又は分析系の感度及び特異性を評価するために用いられている。血清交換パネルは、既知の微生物で感染された供血者から、時間に関して連続的な血液サンプルを採取することによって製造される。血液サンプルか採取される日か、そのサンプルにおける時間点である。血清は、ＩｇＧ　、ＩｇＡ及びＩｇＭのような微生物に対する抗体を含有す６、ＨＩＶ−１１ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−１［のようなレトロウィルスや、トキソプラズマ、サイトメガロウィルス、ボレリアｂ、（ＬＹＭＥ）及び風疹のような池の微生物に対する抗体を含有する血清交換パネルは、以下の確実な血漿交換供血者によって、又は危険度の高い個人から血液サンプルを反復して採取することによって得られてきた。それから、各供給者から集められた血液は、微生物に対する抗体の存在をみるために試験され、微少量、典型的に１００〜２５０μｌに等分され、先の使用のために保存される。連続的な時間点でのサンプルは、１群として、血清交換パネルを構成する。

特に、抗体の供給は少なくて不確実であり、抗体の質と特徴は供血者から供血者まで様々である。更に、より好結果の治療方法が知られ、かつ使用されるようになるにつれ、少数の血清陽性供血者が得られ、従って、得るのがより困難な要求される抗体が得られるであろう。

エイズ患者の場合には、献血又は血漿交換に付される患者の状態が迅速に悪化することが見出された。従って、血清交換パネルに使用するための抗体源として、患者からエイズ陽性の血液又は血漿を得ることは、避けるべきである。

前述の分析系は、抗体の存在又は欠如の検出によって、間接的に感染を検出する。血清交換パネルは、いかに早く感染を検出することができるかを示す。

これらの分析系は、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）の存在又は欠如を検出する。このような分析は、試験系に用いられる抗原に指向した血液及び体液中における［ｇＧの存在のｒ　ｆＩＩＩ御された」検出（抗ＩｇＧ共役体及び抗体陽性対照の使用によって定義される測定）を与えるのみである。感染された／免疫された個人において、抗原に指向した検出可能なｒｇＧの出現は、多くの場合、初期感染後３０日〜４０日まで起こらない。しばしば、ＥｇＧクラスの抗体は、感染／免疫処理後数ケ月又は数年間存在する。

感染の進行中（又は免疫処理後）、抗原／免疫原の方に指向した循環ｒｇＭ及び／又はＩｇＡ抗体の存在は、免疫抗原に指向した循環ＩｇＧの存在より先におこる。感染された／免疫された個人において、抗原に指向した［ｇＭ及び／又は［ｇＡ抗体は、感染／免疫処理後１４日（又はそれより遠くに）検出可能な量で存在する。ＩｇＭクラスの抗体は、初期感染／免疫後３０〜３５日で徐々に力価を失う。

ＩｇＧ以外の抗体を検出できる診断薬が望ましいことが、広く認められている。

例えば、ヒトの免疫系は、異物と体面した後徐々に、異物又は抗原に対する抗体を産生ずることによって応答することが知られている。ＩｇＧではなく［ｇＭ及び／又は［ｇＡが最初に産生されると思われる。１ｇＭ及び／又はＩｇＡを検出することかできる分析は、多くの疾病の早期検出を容易にすることか理解されるであろう。しかしながら、［ｇＭは、比較的に短命の抗体である。ＩｇＭは、感染後間もなく産生ずると同時に、結局は、ＩｇＧが増加していく量で産生されるにつれ、検出可能なレベル以下に落ちる。ＩｇＭは短い寿命を有しているので、多くの疾病か診断される前に、［ｇＭのレベルは、輿望的に検出可能なレベル以下である。従って、［ｇＭは、血清陽性供血者から容易に得ることができず、この重要な抗体の信頼できる確実な源が必要とされる。

血清交換パネルは、各々の分配のために放出されるときに、同じ高感度及び特異性で分析系が遂行することを保証するために、分析系又は診断試験キットの各製造されたバッチを試験するために用いることができる。血清交換パネルは、このような分析系又は試験キットを使用する試験実験室を、その実験室が質の高い試験を遂行していることを保証するために用いることかできる。

この発明は、例えばブタのＩｇＧ　、　ＩｇＡ及び［ｇＭ抗体血清交換パネルのような、望ましい血清交換パネルを製造する能力を提供するので、前述の欠点を克服する。この発明によれば、ウィルス及び／又は微生物感染因子に対する抗体を検出する分析系の感度及び／又は特異性を決定するために、ブタの血清交換パネルを使用する方法か提供される。

発明の概要この発明は、ウィルス及び／又は池の微生物抗原に結合する抗体の存在又は欠如を検出する分析における感度及び／又は特異性を決定するためのブタの血清交換パネルの使用、及びブタの血清交換パネルの製品を提供する。特に、この発明は、生体液中の抗原及び何れかの抗体と陽性対照中の抗原及び抗体か抗原−抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、予め決定された抗原が、抗原に対する抗体からなる生体液及び陽性対照と連続的に接触し、それとともに、複合体の形成物が検出される分析に関して育用である。分析の感度及び／又は特異性は、生体液の代わりに抗原に対するヒトの抗体を含有する血清交換パネルを用いて決定されるが、改良は、抗原に結合し、かつ抗ヒト抗体と反応するブタの抗体を含有する血清交換パネルを使用することからなる。

この発明は、予め決定された抗原に対する既知力価の抗体を含有する血清交換パネルを提供するために用いることができる。

予め決定された抗原に対する抗体を検出するための異なる分析の感度及び／又は特異性は、血清交換パネルにおける抗体の存在を測定するために各分析法を用い、その測定値を比較することによって、比較することができる。異なる分析によって得られる測定値の比較は、分析かより感受性及び／又はより特異的であることを示すであろう。

現在は、ブタの免疫グロブリンＩｇＧ、　ＩｇＭ及び／又は［ｇＡ血清交換パネルを用いることが好ましい。

この発明のさらなる利点は、１つのウィルスもしくは他の微生物感染因子のみ、又は多数のウィルスもしくは他の微生物感染因子の予め決定された抗原に反応する抗体を有するブタの血清交換パネルを製造することかできることである。このような操作は、ヒトの供血者由来の血清交換パネルではできない。

この発明のさらなる利点は、分析系の作成者か、ヒトのレトロウィルスであるＨＩｖ−１，ＨＴＬＶ−１、ＨＩＶ−２及びＨＴＬＶ−ＩＩのような微生物群に対する多数の抗体を含有するブタの血清交換パネルを、同じ分析で、多数の抗体の何れか１つを検出する分析系における感度及び特異性を開発及び制御するために使用することができることである。このような分析は、１回で１つの抗体を検出する一系列の個々の分析の代わりに、１つの試験かサンプルで行われること全可能にする。陽性反応が得られたら、それから、必要ならば、反応している正確な抗体を検出するために、サンプルを更に試験することができる。

例えば、エイズ抗体の存在のために供給された血液を分離する血液バンクは、１つの抗原のみを用いる４つの個々の分析の代ワリニ、ＨＩＶ−Ｌ　ＨＴＬＶ−Ｌ　ＨＴＬＶ−ＩＩ及びＨＩＶ−２の抗原を含有する分析を使用することができる。試験サンプルか反応しなければ、それから更なる試験は要求されない。

試験サンプルか反応したら、それから、必要ならば、試験サンプルか反応しているウィルス抗原を同定するために、４つの抗原の１つを用いる分析を用いて、更にサンプルを試験すること図１は、ブタの血清交換パネルにおけるＨＴＬＶ−１の［ｇＧの存在を測定するウェスタンプロット分析の結果、及び同パネルに関する対応するエライザ分析の結果を示す。サンプルは１〜１５まで番号づけられ、陰性対照は「ＮＣ」　として同定され、陽性対照は「ＰＣ」　として同定されている。時間点は、サンプルの下に列挙されている。サンプルのエライザの吸光度（０，Ｄ、　’）の読みは、時間点の下に示されている。サンプルのウェスタンプロットの結果は、サンプル番号の上に、ＰＣサンプルの右側に数の整列で示されたタンパク質を同定しているバンド番号１５．１９．２４．２６．２８．３２．３６及び５３と、糖タンパク質を同定しているバンド番号４６で示されている。バンド番号は、右側のカラムにおいて、対応するバンド番号で整列するサンプルにおけるバンドを同定するために用いられている。

図２は、血清交換パネルにおけるＨＴＬＶ−１の［ｇＭの存在を測定するウェスタンプロット分析の結果、及び図１と同じ方法で例証された同パネルに関する対応するエライザ分析の結果この発明によれば、ブタの血清交換パネルが、特異的な抗体を産生ずるのに望ましいウィルス又は他の微生物材料でブタを免疫すること、及び免疫されたブタから、血清交換パネルを製造するために用いられている時間点サンプルの部分標本のために、抗体含有血液の連続的な時間点サンプルを採取することによって、得られる。適切な免疫因子の例には、ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１，ＨＴＬＶ−［Ｌ　ＣＭＶ、ＬＹＭＥ、トキソプラズマ、風疹及びエプスタイン−バーウィルスか含まれる。もちろん、当業者において公知であるような他の免疫因子も有用である。

免疫処置は、１０〜５００マイクログラム（μｇ）のウィルスもしくは微生物溶解産物、又はウィルスコアもしくは外皮タンパク質又は微生物コアもしくは膜タンパク質の選択された部分からなる製剤を用いて、動物を初回ワクチン接種することで始まる。一般に、ウィルス材料は、トリトンＸ−１００，５ＤＳ（Ｆデノル硫酸ナトリウム）、メルカプトエタノール及び／又はＮＰ−４０Ｃノビプツト（Ｎｏｖｉｄｅｔ）　Ｐ　４０洗剤、非イオン性洗剤）に可溶であり、リン酸塩緩衝化生理食塩液（ＰＢＳ）、ｐＨ７，２〜７．４に懸濁される。０．１％ＮＰ４０の緩和な洗剤でウィルス材料を溶解し、溶解されたウィルス材料を５０°Ｃ〜６０°Ｃで３０分に至るまで加熱することが好ましく、次いで、溶解された外側の外皮又は外皮タンパク質のわずかな開裂を引き出すために、ウィルス材料は１％ＳＤＳで希釈される。初回注射は、アジュバントを含有し、フロイントの完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ）　（Ｆ　ＣＡ）が、この目的のために好ましい。もちろん、当業者において知られている他のアジュバントを用いてもよい。典型的に、初回ワクチン接種は、１ｒ！Ｌｌの緩衝液中のウィルス材料に１−のアジュバントを加えた総量２−からなる。ウィルス材料及びアジュバントは、注射する直前に、入念に混合されるへきである。好ましい具体例では、初回ワクチン接種は、ｌ−のＦＣＡで混合されたｌｒｄの１％ＳＤＳ中に５０〜ｌＯＯμｇのウィルス材料を含有する。

一般的に、追加免疫処置（Ｂｏｏｓｔｅｒ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）は、アジュバントで調製゛され、ｐＨ７，２〜７．４のＰＢＳ中に注射当たり、典型的にｌＯ〜５００μｇのウィルスタンパク質を含有し、およそ５０〜１００μｇが好ましい。追加免疫処置は、フロイントの不完全アジュバントで調製されるのが好ましい。追加免疫処置は、０．１％ＮＰ４０に溶解され、５０〜６０℃で３０分に至るまでの間加熱され、１％ＳＤＳで希釈された５０〜１００μｇのウィルス材料を含有するのが更に好ましい。ブースター（Ｂｏｏｓｔｅｒ（追加）〕注射は、初回ワクチン接種後およそ７〜３０日目から着手し、その後は、血清交換パネルのために必要とされる望ましい数のサンプルが得られるまで、７〜３０日毎に着手する。最初のブースター注射は、初回ワクチン接種後２４時間後に与えられるのか好ましい。４回に至るまで追加免疫処置が与えられるのが好ましい。

４回目又は最後の追加免疫処置は、フロイントの不完全アジュバントと、外側の外皮又は外皮タンパク質の開裂を引き出すため、及び内部もしくはコアタンパク質を露出するために、１％ＳＤＳに溶解され、６５〜７５°Ｃで４０分に至るまでの間加熱されたウィルス溶解産物で調製され、それによって、これらの内部タンパク質に対して免疫応答させることが更に好ましい。

一般に、最初の血液サンプルは、基準抗体レベルを設定するために、初回ワクチン接種前に採取され、試験される。現在は、皮内又は皮下注射によってワクチン接種することが好ましいが、筋肉内注射のような他の投与様式か用いられてもよい。ワクチン接種部位は、首の横で、典型的に３〜４つの異なる場所を注射するのか好ましい。首へのワクチン接種は、高い抗体価を生じると考えられるが、当業者において知られているような他のワクチン接種部位は、望ましい免疫抗体を産生するのに適切である。

血液は、望ましい血清交換パネルのために十分な数、好ましくは８〜１６時間点の連続的な血液サンプルか得られるまで、初回免疫後、好ましくは２〜３日毎に、連続的な放血によって免疫された動物から集められる。各血液サンプル又はそれらから抽出された血清における望ましい抗体の力価が測定される。血液採取の時間的調節及び回数（時間点）か、用いられている特定の免疫原において一度設定されたら、多数の動物を免疫することかできる。動物は犠牲にされ、血液は、各動物の時間点か異なり、かつ基準時間点のだめの動物を含めて、１つの時間点のみて集められる。集められたｌ動物の総血液は、１つの時間点サンプルを表す。その利点は、血清交換パネルにおいて、特定の時間点のために大量の抗体含有血液を迅速に得ることができることである。

血清交換パネルでは、免疫された動物からの血清を用いることか好ましい。しかしながら、全血、血漿又は当業者において知られているような何れかの他の形体の抗体か用いられてもよい。使用前に、血液又は血清を濾過して滅菌し、次いで、後の使用のために、部分標本を凍結することか好ましく、また、血清は、ＩｇＧ、　［ｇＭ、もしくは［ｇＡフラクションを濃縮するために、凍結乾燥もしくは乾燥され、又は分別されてもよい。

ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−Ｌ　ＨＴＬＶ−Ｉ＋、　サイトメガロウィルス、エプスタイン−バーウィルス、トキソプラズマ及びＢ型肝炎ウィルスを含有する数種のウィルスに対する抗体を含有する血清交換パネルを製造するために、先に記載した方法を用いることかできる。風疹、ボレリアｂ、（ＬＹＭＥ）、大腸菌、サルモネラ、破傷風、溶血連鎖球菌及びナイセリアのような種々の他の微生物に対する抗体を含有する血清交換パネルを製造することも、この発明の範囲内であると考えられる。

ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ウマ及びサルを含有するブタ以外の動物で、血清交換パネルのための抗体を産生ずるために、先に記載した方法を用いることができる。

以下の実施例は、この発明を例証するものと考えられる。

実施例ＩＨＴＬＶ−１に対するブタの免疫グロブリン［ｇＧ及び１ｇＭ注射のための免疫原を、タンパク質（Ｐ）１９．２４．２６．３８及び糖タンパク質（ｇｐ）４６を含有する不活性化されたＨＴＬＶ−１溶解産物を用いて調製した。０．１％ＮＰ４０（非イオン性洗剤）、０．５ｍの塩化ナトリウム及びＴＮＥ緩衝液（２９，２ｇ／　１の塩化ナトリウム、　１．２ｇ／Ｉ！のトリス及び０．３７ｇ／　ｌのＥＤＴＡ）中に１ｍｇ／ｒＩＬｌの濃度で存在するＨＴＬＶ−１溶解産物を、５６℃で３０分間加熱した。ＨＴＬＶ−１ウイルス溶解産物の１００μｌを、９００μｌの１％ＳＤＳで希釈した。注射直前に、免疫原を調製するために、この希釈されたウィルス溶解産物を、ｌ−のフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）と混合した。

注射直前に、０日めの血液２０〜５０イを、４ヶ月齢のメスのヨークシャー混合種のブタの耳静脈から採取し、ＨＴＬＶ−１に対する［ｇＧ及び［ｇｌｉｌ抗体の存在をみるために試験した。これを、基準サンプルとした。それから、ブタを、首の左側の４つの異なる部位で、皮下又は皮肉注射によって免疫した。

ブースター注射は、１ｍｌのフロイントの不完全アジュバント（ＰＴＡ）と混合した９００μｌの１％ＳＤＳ中に、１００μｌのＨＴＬＶ−１ウイルス溶解産物を含有した。最初のブースターを２４時間後に（１日目）、第２のブースターを１６日後（１７日目）（こ、第３のブースターを１４日後（３１日目）（こ投与した。１７日後（４８日目）、９００μｌの１％ＳＤＳで希釈された１００μｌのＨＴＬＶ−１ウイルス溶解産物を、まず６５〜７０°Ｃの温度で４０分間熱処理し、次いで１ｒｄ！のＦＩＡと混合して、第４のブースターを調製した。４８日目に、この第４のブースターで、ブタをワクチン接種した。ブタは合計５回の注射を受けた。

基準血液サンプルに加えて、３日目、５日目、７日目、９日目、１１日目、１３日目、１５日目、１７日目、２０日目、２３日目、２７日目、３１日目、３８日目、４８日目及び６４日目に、２０〜５０−の血液サンプルを耳静脈から採取した。基準を含めて、合計１６の血液サンプルを採取した。

各血液サンプル、陽性対照及び陰性対照を、ＨＴＬＶ−１に対する［ｇＧ抗体及びＨＴＬＶ−１に対するＩｇＭ抗体の存在をみるために、ウェスタンプロット技術を用いて別々に試験した。

タンパク質バンドの出現と相対的強度を研究した。

エライザ分析を用いて各サンプルの抗体価を決定した。血清を、１６の血液サンプルの各々から集め、ｌＯＯ〜２５０μｌの微少量に等分して標識し、１６のサンプルの各々から少なくとも１つの部分標本を含有する血清交換パネルに使用するために保存した。

不活性化されたＨＩ　ＬＶ−１ウイルス溶解産物の代わりに、不活性化されたＨＩＶ−１ウイルス溶解産物を用いたことを除いて、実施例１の方法を使用した。

ＨＩＶ−１溶解産物は、ｐ１８、ｐ２４、ｐ３ｔ、　ｇｐ４１．　ｇｐ４８、ｐ５３、ｐ５６、ｐ６４、ｇｐｌｌｏ、ｇ　ｐ　１２０及びｇ　ｐ　１６０を含有した。

ＴＬＶ−１抗原で予め覆われたデュポントウニスタンプロット（Ｄｕｐｏｎｔ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ）板を、実施例１からのブタのＨＴＬＶ−１血清交換パネルを用いて、感度と特異性をみるために試験した。血清交換パネルの部分標本を、ＰＢＳツイーンで１を３０に希釈した。単一のウェスタンプロット板に、１つの希釈された血清部分標本、例えば１日目の２μｌを加え、振動している台の上で、室温で３０分間インキュベートした。この段階を、全ての血清交換パネルの希釈された血清部分標本と、陽性及び陰性対照のために一斉にくり返した。

インキュベーション後、流体を除去し、３−のＰＢＳツイーンで連続的に４回、各板を洗浄した。

その後、各板に、ＰＢＳツイーンで１を５００に希釈された、ガンマ鎖かアルカリホスファターゼと共役したヤギの抗ヒトＩｇＧの共役体（カルバイオケム社、ロット＃０４００９０）　２ｍｌを加え、室温で３０分間インキュベートした。

流体を除去し、３艷のＰＢＳツイーンで連続的に３回、次いで３ｒｄの０．１Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，２）で１回、各板を洗浄した。

ニトロブルーテトラゾリウム塩（ＮＥＴ）：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）が１＝ｌである色素体２−を、各板に加え、室温で１０分間インキュベートした。５０μｌの２Ｎ硫酸を加えることによって、反応を停止した。それから、各板を精製水中に５分間置き、乾燥し、次いでタンパク質及び糖タンパク質のバンドを読んだ。板は、図１に示されている。

９日目（二、１つのタンパク質バンドｐ１９が現れた。２３日目（こ、高い［ｇＧの力価を示す４つのタンパク質バンドｐ１９、ｐ２４、ｐ２６及びｐ２８か現れた。３８日目で、高い［ｇＧの力価を示す８つのタンパク質と１つの糖タンパク質ｐ１５、ｐ１９、ｐ２４、ｐ２６、ｐ２８、ｐ３２、ｐ３６、ｐ５３及びｇｐ４６が現れ、それは、６４日目まで通して一定のままであった。

使用した共役体か、ＰＢＳツイーンでｌ：５００に希釈された、ｍｕｉｌｌかアルカリホスファターゼと共役したヤギの抗ヒト［ｇＭ（カルバイオケム社、ロット＃０４１８９０）　２−であったことを除いて、実施例３の方法を繰り返した。結果として生じる板は、図２に示されている。

図１と対比して、図２は、３つのタンパク質バンドｐ１９、ｐ２６及びｐ２８の出現によって、９日目までに［ｇＭが存在することを示す。２３日目で、高力価の［ｇＭが、タンパク質バンドｐ１５、ｐ１９、ｐ２４、ｐ２６、ｐ２８、ｐ３２及びｐ３６の出現によって示されている。これは、実施例３のＩｇＧ血清交換パネルと対比して、タンパク質バンドの減少する数によって示されるように、ＴｇＭ力価が低下する４８日目まで、明瞭に一定のままである。

実施例１のブタの血清交換パネルでＩｇＧの存在を測定することによって、デュボント（Ｄｕｐｏｎｔ）　ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−１エライザ試験キツトの感度を試験した。陽性及び陰性対照も測定した。エライザ分析は、製造業者の使用説明書に従って実施した。吸光度（０，Ｄ、）の読みは、図１に示されている。９日目に、０．１４の陰性対照の吸光度の読みと比較したとき、吸光度の読みにおいてわずかな上昇、０．６０か現れる。２３日目に、［ｇＧの高力価を示す１．５８までの著しい上昇かある。３８日目に、［ｇＧの高力価を示す２．１３までの他の有意な上昇がある。３８日目から６４日目まで、ＩｇＧの力価は明瞭に一定である。

実施例１のブタの血清交換パネルでＨＴＬＶ−１に対するＩｇＭの存在を測定することによって、デュボント（Ｄｕｐｏｎｔ）　ＨＴＬＶ−１エライザ試験キツトの感度を試験した。陽性及び陰性対照も測定した。エライザ分析は、製造業者の使用説明書に従い、２つの改良をもって実施した。

エライザ分析を始める前に、ＩｇＭのエライザ測定を妨げるＩｇＧを除去するために、血清交換パネルを前処理した。血清交換パネルから血清の各部分標本を、ＰＢＳツイーンて１：１ｏに希釈した。サンプル中のＩｇＧの存在量を評価し、同等量のプロティンＧ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ）　（ピアス社、イムノピュア固定化プロティンＧ）を、希釈された血清中に混合し、３７°Ｃで３０分間インキュベートした。それから、希釈されたサンプルを、１１００００ｒｐて５分間遠心分離した。上溝を除去し、それから分析に用いた。

２つ目の改良は、試験キットのｒｇＧ共役体を、ＰＢＳツイーンて１　：　４０００に希釈された、ｍｕ鎖がアルカリホスファターゼと共役したヤギの抗ヒト［ｇＭ（カルバイオケム社、ロット＃０４１８９０）を用いるＩｇＭ共役体で置き換えることであった。

結果として生じる０、Ｄ、の読みは、図２に示されている。

実施例５と対比して、９日目に、０．Ｄ、に関して、ＩｇＭの高力価を示す１．２２の読みか得られた。２３日目に、力価は、１．７５の０、　Ｄ、の読みを与えて最高まで上昇した。３８日目に、１．１７の０．Ｄ。

読みは、力価か減少していったことを示した。力価は、減少する０、Ｄ、値によって示されるように、減少し続けた。

これらのサンプルは、ウィルス及び／又は他の微生物感染因子に対する抗体の存在又は欠如を検出する異なる分析における感度及び／又は特異性を試験することにおいて、ブタの血清交換パネルが有用であることを証明している。

この発明の好ましい具体例が記載されたと同時に、種々の変形及び改良が、この発明の意図及び範囲からはずれることなしになしうろことは、その分野における通常の技術を育する人において明らかであろう。従って、上記の記載は、例証となるものとして解釈されるべきであり、以下の請求の範囲によって定義されているこの発明の範囲を限定するものではない。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）ｌ、特許出願の表示ＰＣＴ／ＵＳ　９１１０８２９６２、発明の名称抗体を検出する分析系の感度及び／又は特異性の決定方法３、特許出願人住　所　アメリカ合衆国、マサチューセッツ　０１７４８、ホブキントン、サウス　ストリート９２名　称　ヴエリジエン、インコーポレーテッド代表者　バック、ジェラルド　エフ。

国　籍　アメリカ合衆国４、代理人〒５３０住　所　大阪市北区西天７＃５丁目１−３クォーター・ワンビル５、補正書の提出年月日請求の範囲１、（ａ）ウィルス又は他の微生物の１つもしくはそれ以上の予め決定された抗原に対して反応するブタの免疫抗体の血清交換パネルを調製しく上記血清交換パネルは、上記抗原に対するブタの抗体の反応が、上記抗原に対するヒトの抗体の反応に類似している上記抗原で免疫されたブタから連続的に採取された多数の時間点での抗体含有血液サンプルからなる）、（ｂ）予め決定された抗原及びブタの抗体が抗原−ブタの抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、感度及び／又は特異性か決定される分析から１つ又はそれ以上の予め決定された抗原のサンプルの部分標本を、血清交換パネルの多数の時間点でのブタの抗体含有血液サンプルと接触させ、（Ｃ）工程（ｂ）において形成された抗原−ブタの抗体複合体か抗ヒト抗体と反応するのに十分な時間及び条件下で、抗ヒト抗体を、形成された何れかの抗原−ブタの抗体複合体と一様に接触させることによって、工程（ｂ）における何れかの抗原−ブタの抗体複合体の形成を検出する、工程からなる、ウィルス又は他の微生物の予め決定された抗原に結合するヒトの抗体の存在又は欠如を検出する分析における感度及び／又は特異性の決定方法。

２、血清交換パネルが、ブタから採取された８〜１６の連続的な時間点での抗体含有血液サンプルからなる請求項１の方法。

３、ブタの免疫抗体が、［ｇＧＳＩｇＭ、　［ｇＡ又はそれらの混合物からなる請求項１の方法。

５、ブタの免疫抗体か、ＩｇＧ、　ＩｇＭ、　［ｇＡ又はそれらの混合物からなる請求項４の方法。

６、ブタの免疫抗体が、ＨＴＬＶ−１に対する抗体からなる請求項１の方法。

７、ブタの免疫抗体か、［ｇＧ、　［ｇＭ、　ＩｇＡ又はそれらの混合物Ｉ　からなる請求項６の方法。

８、ブタの免疫抗体が、後天性免疫不全症候群（エイズ）又はエイズ関連症候群（ＡＲＣ）　、及びＨＴＬＶ−１をひきおこすヒトのレトロウィルスに対する抗体である請求項１の方法。

９、ブタの免疫抗体か、ＩｇＧ、　ＩｇＭＳ［ｇＡ又はそれらの混合物からなる請求項８の方法。

１１、ブタの免疫抗体が、ＩｇＧ、　ＩｇＭ、　ＩｇＡ又はそれらの混合物からなる請求項１０の方法。

１３、ブタの免疫抗体が、ＩｇＧ、　ＩｇＭ、　［ｇＡ又はそれらの混合物からなる請求項１２の方法。

方法。

１５、ブタの免疫抗体が、ＩｇＧ、　ＩｇＭ、　ＩｇＡ又はそれらの混合物からなる請求項１４の方法。

請求項１記載の方法。

１７、ブタの免疫抗体が、［ｇＧ、　［ｇＭ、ＩｇＡ又はそれらの混合物からなる請求項１６の方法。

項ｌの方法。

１９、ブタの免疫抗体が、ｒｇＧ、　ＩｇＭ、［ｇＡ又はそれらの混合物からなる請求項１８の方法。

国際調査報告フロントページの続き（５１）　ｌｏｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５７４　Ｃ９０１５−２ＪＩ

Claims

【特許請求の範囲】

１．（ａ）ウイルス又は他の微生物の１つもしくはそれ以上の予め決定された抗原に対して反応するブタの免疫抗体の血清交換パネルを調製し（上記血清交換パネルは、上記抗原で感染されたブタから連続的に採取された多数の抗体含有血液サンプルからなる）、（ｂ）予め決定された抗原及びブタの抗体が抗原−ブタの抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、感度及び／又は特異性が決定される分析から１つ又はそれ以上の予め決定された抗原のサンプルの部分標本を、血清交換パネルの多数のブタの抗体含有血液サンプルと接触させ、（ｃ）工程（ｂ）において形成された抗原−ブタの抗体複合体が抗ヒト抗体と反応するのに十分な時間及び条件下で、抗ヒト抗体を、形成された何れかの抗原−ブタの抗体複合体と一様に接触させることによって、工程（ｂ）における何れかの抗原−ブタの抗体複合体の形成を検出する、工程からなる、ウイルス又は他の微生物の予め決定された抗原に結合するヒトの抗体の存在又は欠如を検出する分析における感度及び／又は特異性の決定方法。
２．血清交換パネルが、ブタから採取された８〜１６の連続的な抗体含有血液サンプルからなる請求項１の方法。
３．ブタの免疫抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ又はそれらの混合物からなる請求項１の方法。
４．予め決定された抗原が、後天性免疫不全症候群（エイズ）又はエイズ関連症候群（ＡＲＣ）を示すヒトのレトロウイルスの抗原であり、ブタの免疫抗体が、後天性免疫不全症候群（エイズ）又はエイズ関連症候群（ＡＲＣ）を示すヒトのレトロウイルスに対する抗体である請求項１の方法。
５．ブタの免疫抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ又はそれらの混合物からなる請求項４の方法。
６．予め決定された抗原が、ＨＴＬＶ−Ｉの抗原であり、ブタの免疫抗体が、ＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体からなる請求項１の方法。
７．ブタの免疫抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ又はそれらの混合物からなる請求項６の方法。
８．予め決定された抗原が、後天性免疫不全症候群（エイズ）又はエイズ関連症候群（ＡＲＣ）、及びＨＴＬＶ−１を示すヒトのレトロウイルスの抗原であり、ブタの免疫抗体が、後天性免疫不全症候群（エイズ）又はエイズ関連症候群（ＡＲＣ）、及びＨＴＬＶ−１を示すヒトのレトロウイルスに対する抗体である請求項１の方法。
９．ブタの免疫抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ又はそれらの混合物からなる請求項８の方法。
１０．予め決定された抗原が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の抗原であり、ブタの免疫抗体が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に対する抗体からなる請求項１の方法。
１１．ブタの免疫抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ又はそれらの混合物からなる請求項１０の方法。
１２．予め決定された抗原が、ボレリアｂ．（ＬＹＭＥ）の抗原であり、ブタの免疫抗体が、ボレリアｂ．（ＬＹＭＥ）に対する抗体からなる請求項１の方法。
１３．ブタの免疫抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ又はそれらの混合物からなる請求項１２の方法。
１４．予め決定された抗原が、風疹の抗原であり、ブタの免疫抗体が、風疹に対する抗体からなる請求項１の方法。
１５．ブタの免疫抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ又はそれらの混合物からなる請求項１４の方法。
１６．予め決定された抗原が、トキソプラズマの抗原であり、ブタの免疫抗体が、トキソプラズマに対する抗体からなる請求項１の方法。
１７．ブタの免疫抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ又はそれらの混合物からなる請求項１６の方法。
１８．予め決定された抗原が、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）及びエプスタイン−バーウイルスの抗原からなる群から選択され、ブタの免疫抗体がＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）及びエプスタイン −バーウイルスに対する抗体の群から選択される請求項１の方法。
１９．ブタの免疫抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ又はそれらの混合物からなる請求項１８の方法。
２０．（ａ）（ｉ）初めに、フロインドの完全アジュバントの等量で希釈されたウイルス又は他の微生物溶解産物からなる製剤を哺乳動物にワクチン接種し、（ｉｉ）フロインドの不完全アジュバントで希釈された上記ウイルス又は他の微生物溶解産物からなる製剤を複数回哺乳動物にワクチン接種し、（ｉｉｉ）加熱され、その後フロインドの不完全アジュバントで希釈された上記ウイルス又は他の微生物溶解産物からなる製剤を哺乳動物にワクチン接種することによって、哺乳動物を免疫し、（ｂ）免疫された哺乳動物から、多数の血液サンプルを連続的に集めることによって抗体を得る、工程からなるウイルス又は他の微生物の１つ又はそれ以上の予め決定された抗原に反応する哺乳動物の免疫抗体の血清交換パネルの製造方法。
２１．哺乳動物がブタである請求項２０の方法。