JP2001505778A

JP2001505778A - ＨＩＶ感染の初期の検出のための未変性の（ｎｏｎ―ｄｅｎｔｕｒｅｄ）ＨＩＶ抗原を使用する新規のＥＩＡ試験

Info

Publication number: JP2001505778A
Application number: JP52666298A
Authority: JP
Inventors: ダブリュー．クロイド，ミルズ; エム．ラムセイ，キース
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 1996-10-09
Filing date: 1997-10-09
Publication date: 2001-05-08
Also published as: US6492104B1; CN1251614A; EP0951563A1; US6074646A; EP0951563A4; US20030180313A1; WO1998023771A1; AU7400998A

Abstract

(57)【要約】初期の抗HIV抗体の存在を免疫学的に同定し得る組換えヒト免疫不全ウイルス抗原が、多数の細胞株で安定に発現される。これらの抗原は、ヒト免疫不全ウイルスの暴露／感染の検出、および特発性の慢性リンパ球減少症（ICL）におけるHIV感染のスクリーニング方法において有害ではない手段としていくつかの臨床的に重要な適用を有する。これらの技術は、既存の免疫学に基づく検出方法およびPCRに基づく検出方法よりも改良されている。なぜなら、これらは、HIVの構造的エピトープと反応する抗HIV gp160抗体を検出しないこれらの型のアッセイに従来の形態では陰性と決定されたサンプル中の感染／暴露の検出を提供するからである。本発明は、幼児におけるヒト免疫不全ウイルスの暴露／感染の検出における特定の適用を見出す。記載される方法の初期の検出は、標準的なウェスタンブロットまたはELISA方法では以前には検出不可能であるクラスの「初期の」抗ヒト免疫不全ウイルス抗体を検出し得る、記載される組換えの構造的に完全なヒト免疫不全ウイルスの保存された免疫反応性によってもたらされる。ヒト免疫不全ウイルスgp160エンベロープ抗原は、これらの改善されたスクリーニング方法において臨床的サンプルを用いて試験される特異的な組換え抗原の1つを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 HIV感染の初期の検出のための未変性の（non-dentured）HIV抗原を使用する新規のEIA試験発明の背景１．発明の分野本発明は、一般に、診断およびスクリーニング試験の分野に関する。より詳細には、本発明は、サンプル中の初期の抗HIV抗体の検出のための改良された方法、およびヒト免疫不全ウイルスの暴露または幼児における感染の検出のための初期の診断に関する。本発明のさらなる局面は、特発性の慢性のリンパ球減少症患者においてHIVを検出するための方法に関する。本発明はまた、組換えタンパク質の分野に関し、例えば、いくつかのヒト免疫不全ウイルス株の組換えタンパク質および組換えタンパク質合成調製物が開示される。本発明はまた、市販の診断アッセイおよび予後アッセイのプレートおよびキットの分野に関し、例えば、記載される組換えヒト免疫不全ウイルス抗原またはヒト免疫不全ウイルス感染細胞単離物の調製物を含む、初期の抗HIV抗体を検出するために設計されたアッセイプレートが記載される。 II．発明の背景ヒト免疫不全ウイルス（HIV）に感染した患者は、ウイルスに対する体液性免疫応答を最終的に増大することが知られている。抗HIV抗体の産生は、この応答を検出するための1つの指標である。いくつかの研究において、抗HIV抗体がHIV の培養および患者のサンプル中でのHIV抗原の検出のいずれよりも診断のためにより確実であることが報告されている^1,2。結果として、抗HIV抗体の検出試験は、感染の診断の最も一般的な方法である。EIAおよびウェスタンブロットアッセイの両方が、現在、抗HIV抗体の検出に使用されている。残念なことに、いくらかの不確実さが、従来の抗HIV抗体スクリーニング方法（例えば、従来のEIAによる）の使用に伴って存在し続けている。従って、さらなる確証的な試験(例えば、ウェスタンブロット（WB）または固定した細胞の免疫蛍光アッセイ)が、推奨されるさらなる試験手順となっている。これらおよび他のさらなる予防的試験の措置にも関わらず、多数の研究によって、ウイルスに対する抗体が徹底的な試験の後でさえも検出不可能であるHIV感染の見かけ上は無症状の期間の存在が報告されている。この期間は、感染時点から感染が従来の血清転換アッセイによって検出可能な時点までにわたることが報告されている。この無症状の期間は、感染が従来のEIAおよびウェスタンブロットアッセイによって検出可能である前の、数ヶ月からおよそ２年半まで持続することが報告されている。一方、必ずしも成功しないが、抗HIV抗体が従来のEIAまたはWBによって検出され得ない場合、HIVを増幅するために抹消血リンパ球を培養することによって、ウイルスの検出がもたらされる。しかし、PCRに基づくHIV検出方法を使用するいくつかの最近の研究は、高リスクの集団におけるPCR(+)陽性、血清(-)陰性の場合の症例を報告し続けている^110-17。それにもかかわらず、PCRは、通常、従来の血清転換方法より前に感染を検出し、少なくともいくつかの場合において、上記の無症状の感染期間は約１ヶ月まで減少する。従来の試験方法を用いて陰性試験された血液中のHIV伝達の速度は、比較的一定の速度でに維持され続ける²⁵。例えば、EIAの従来の方法を使用する、見かけ上は「血清陰性である」血液に由来するHIV-1伝達が、報告され続けている^21-23 。提供された器官はまた、HIV疾患の伝達の供給源であり続け、HIV感染は、再度従来のアッセイによってHIV血清陰性が試験される個体に由来する器官のレシピエント中で診断される。過去の研究は、初期のドナーの培養（education）および自己排除措置が、疾患の伝達速度を低下させることを報告した²⁶。しかし、抗体試験を伴うこのような排除方法は、少なくともいくらかの擬陰性の結果の可能性を低下させることが期待されるが、報告されたHIVの症例の少なくとも小さなサブセットにおいては問題の部分的および不完全な解決を提供するのみである。いくつかの研究は、従来のEIA、WB、およびPCRに基づく検出技術を用いて陰性を試験した高リスクの個体において、HIV特異的Ｔ細胞の存在を報告する。他の報告は、HIV特異的抗体をインビトロで産生するＢ細胞の存在を同定し、これは、EIA陰性、WB陰性である高リスクの被検体に存在する³⁰。これらのアプローチは可能性のある選択肢であるが、試験するためにはそれらは比較的複雑でありそして難しい手順であり、従って、大規模な臨床的スクリーニングには非実用的である。再度、この型の試験にかかる費用および時間は、信頼性がありそして実用的なHIVのスクリーニングおよび検出アプローチのために医学の分野での必要性に任される。幼児の初期のHIV感染は、特に困難な問題である。現在の技術は、明らかな臨床的症状を発症していない18ヶ月齢未満の幼児が感染しているかどうかを診断することが困難である。抗HIV抗体についての従来のHIV血清学的試験は、幼児における感染を検出するためには不適切である。なぜなら、検出される抗体が幼児の感染に必然的ではないからである。しかし、HIV陽性の母親の感染には必然的である。この母性から由来する抗体は、代表的には、幼児の系において21ヶ月まで持続する³⁴。 IgAおよびIgMの両方ともが、胎盤を通過しない。従って、子どもにおける研究は、幼児のHIV感染の指標としてのIgAおよびIgMの検出を強調した。1つの研究において、従来のスクリーニングアッセイ（WB、EIA）を使用して、HIV特異的IgA およびIgMの両方が、血清陽性の母親から生まれた12ヶ月齢までの幼児において見出され、IgMと比較して２倍多くのサンプル（66％対33％）³⁵がIgA抗HIVを生じた。現在、出生時に約50％、3ヶ月齢までに90％、そして６ヶ月齢までにほぼ全ての感染した幼児が、従来のHIV培養、PCR、IgA抗体試験、およびp24抗原試験を使用して同定され得る³⁸。しかし、感染した幼児のわずか１／２でしか出生時には HIVが検出され得ないという事実は、改良された幼児での初期のHIV検出が必要とされ続けていることを再度指摘する。発明の要旨本発明は、一般におよび全体的な意味で、組換えHIVエンベロープタンパク質およびペプチド、ならびにその初期の抗HIV抗体の免疫反応性フラグメントに関し、これらは、初期の抗HIV抗体に免疫病理学に結合し得る。本発明の記載で使用される場合、初期の抗HIV抗体は、HIVウイルスに感染したヒトで誘導される最初の抗ヒト免疫不全ウイルス抗体として定義され、これらの抗体は、HIV gp160抗原の構造的エピトープを認識し得、そして構造的エピトープを維持していないHIV gp160標的抗原を使用する現在のEIAまたはウェスタンブロットアッセイによっては、検出不可能である。本発明はさらに、改良されたHIV検出方法およびスクリーニング方法を提供し、初期の抗HIV抗体の同定を可能にする。これらの初期の抗HIV抗体は、標的抗原が、初期の抗体認識に必要な十分に保存された構造的エピトープを欠いているこれらのアッセイで組織学的に使用されるので、以前は従来のアッセイを使用して検出されなかった。本発明の組成物およびアッセイは、HIVエンベロープタンパク質（詳細には、H IV gp160）の構造的エピトープを含む改良されたHIV標的抗原を含む。記載される抗原を使用して検出可能な初期の抗HIV抗体は、一時配列のエピトープを認識せず、従って、少なくとも部分的に変性されたHIV標的抗原を使用する従来の血清学的試験（EIAおよびウェスタンブロット）では検出されない。 PCRに基づくアッセイがHIVを検出するための従来のEIAおよびウェスタンブロットの血清学に基づくアッセイを超えるわずかな改良を提供するので、本明細書中に記載されるEIAもまた、PCRに基づく検出方法およびスクリーニング方法を超える改良された方法を提供することが期待される。ヒト免疫不全ウイルスの組換えタンパク質およびペプチド本発明のいくつかの実施態様において、初期の抗HIV抗体に免疫学的に結合し得る組換えヒト免疫不全ウイルスエンベロープタンパク質を含む組換えタンパク質が提供される。例えば、特定の実施態様において、これらの組換えタンパク質は、SDS/PAGEによって決定された場合に約160、000ダルトンの分子量を有するとさらに定義され得る。これらの特定の形態において、組換えHIVタンパク質はHIV エンベロープタンパク質であるHIV gp160である。本発明の組換えHIVエンベロープタンパク質はさらに、それらが調製されるプロセスを参照して記載され得る。例えば、1つの実施態様において、このプロセスは以下の工程を包含する：ヒト免疫不全ウイルスエンベロープタンパク質（例えば、gp160）をコードする、核酸配列またはヒト免疫不全ウイルス核酸配列の制限フラグメントを調製する工程；真核生物細胞をトランスフェクトし得るベクターに制限フラグメントを挿入して組換えベクターを提供する工程；初期の抗HI V抗体に結合し得るヒト免疫不全ウイルスエンベロープタンパク質を発現し得る真核生物細胞をトランスフェクトして組換え真核生物細胞を提供する工程；組換え哺乳動物細胞を組換えHIVタンパク質の発現に適切な条件下で培養する工程；および初期の抗HIV抗体に結合し得る組換えHIVエンベロープタンパク質を回収する工程。本明細書中に記載されるHIVエンベロープタンパク質の核酸配列を発現し得る哺乳動物細胞の例は、GEM細胞株である。このようなCEM細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）から入手可能である。哺乳動物細胞をトランスフェクトし得るベクターの例は、pLNSXのようなレトロウイルスベクターである。アデノウイルスまたはプラスミドのような他のキャリアもまた、HIVエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を導入するために使用され得る。プロセスの特定の実施態様において、組換えレトロウイルスベクターはpLNSX-envである。組換えヒト免疫不全ウイルスタンパク質の他の実施態様において、タンパク質は、組換えgp160ヒト免疫不全ウイルス糖タンパク質またはgp160タンパク質のフラグメント（例えば、gp160タンパク質のgp120またはgp41フラグメント）を含むと記載される。いくつかの実施態様において、本発明の組換えHIVエンベロープタンパク質およびペプチドはさらに、組換えヒト免疫不全ウイルスを発現するベクターでトランスフェクトされた哺乳動物細胞の実質的に精製された未変性の溶解物から調製された組換えタンパク質およびペプチド、ならびにこれらのトランスフェクトされた哺乳動物細胞の実質的に精製された未変性の発現産物を含む組換えタンパク質／ペプチドを含むと記載される。なお他の実施態様において、組換えタンパク質／ペプチド調製物は、組換えヒト免疫不全ウイルスgp160タンパク質の合成物を含み、この合成物は、1つ以上のヒト免疫不全ウイルス株由来の組換えgp160タンパク質を含む。 gp160をコードするヒト免疫不全ウイルス遺伝子を有するレトロウイルス発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳動物細胞株は、HIV感染患者から得られたヒト免疫不全ウイルスのいくつかの異なる株から得られるgp160をコードする核酸フラグメントを用いて調製されている。例えば、組換えHIVエンベロープタンパク質は、HIV₂₁₃ウイルス株から調製されている。特定の実施態様において、タンパク質／ペプチドgp160合成調製物は、従来のE IAおよびウェスタンブロット技術によって血清陰性であると決定された多数の代表的な血清サンプル中で検出される初期のHIV抗体と免疫反応性であることが見出された、少なくとも３つの異なるHIV株の組換えgp160タンパク質発現産物を含む。例として、３つのこのようなHIV株は、HIV₂₁₃、HIV_C、およびHIV_AC-1である。これらのHIV株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション受託機関（12301 ParK Lawn Drive，Rockville，MD 20852）に寄託されている。寄託情報は以下の通りである： HIV₂₁₃-ATCC VR 2247 HIV_C-ATCC VR HIV_AC-1-ATCC VR 2246 HIV_TP-1-ATCC VR 2245 標的抗原は、これらのgp160をコードする核酸配列またはそのフラグメントを有するレトロウイルスベクターまたは他のベクターでトランスフェクトされた真核生物細胞から得られる発現産物、あるいはこのようにトランスフェクトされた真核生物細胞の実質的に未変性の溶解物のいずれかから調製され得る。ヒト免疫不全ウイルスの組換えタンパク質／ペプチド調製物および細胞溶解物の記載において本発明の記載で使用される場合、句「実施的に未変性」は、ヒト免疫不全ウイルスエンベロープgp160タンパク質または初期の抗HIV抗体に結合するために十分なその部分の保存された配置完全性を有するタンパク質を定義するように使用される。標的抗原として使用されるタンパク質／ペプチドの構造は、この初期の抗体認識を提供することにおいて重要である。本発明者らは、本明細書中で、初期の抗HIV結合認識を可能にするための十分なタンパク質／ペプチドの構造的完全性を保存する手順を提供する。本明細書中の開示、他の類似のタンパク質／ペプチド調製のプロセスが初期の抗ヒト免疫不全ウイルスのスクリーニングのために有用な標的抗原組成物を生じるように工夫され得ることが予想される。従って、すべてのこのような改変された手順は、それらが本明細書中で記載される手順および特異的な物質の主要でないかまたは重要ではない改変を示す限りは、本発明の範囲内に含まれることが、本発明者らによって意図される。多数の異なるHIV株が本発明によって試験されたが、本明細書中では特に記載されていないかまたは試験されていない他のHIVウイルス株もまた、本発明の種々のHIVタンパク質／ペプチドの調製に使用され得る。他のHIVウイルス株が、初期の抗HIV抗体を認識し得る、定義された実質的に保存された構造的エピトープに関して完全なHIVタンパク質を提供するために使用され得ることが、期待される。組換えタンパク質／ペプチド標的抗原を作製するために使用される特定の記載されたHIV株は、従来の抗体試験手順によって血清陰性であることが決定されたヒト患者の血清または血漿サンプル中の初期のHIV抗体に結合する観察された活性に基づいて選択された。従って、さらなるこのような代表的な株は、本明細書中で概説された手順を使用して同定および選択され得、そして本明細書中で詳細に記載される手順に従って再び実質的に処理されて、患者のサンプル中の初期の抗HIV抗体およびHIV感染のスクリーニングおよび診断にもまた有用な組換えHI V抗原を提供する。特定の実施態様において、本発明の組換えタンパク質／ペプチドは、初期の抗 HIV抗体に免疫学的に結合し得る、十分に構造的に完全なHIVエンベロープタンパク質を含む。上記の抗原は、gp160 HIVエンベロープタンパク質をコードする配列を有する発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳動物細胞または他の真核生物細胞由来の発現産物として単離可能である。例えば、HIV gp160エンベロープタンパク質は、ウイルス株HIV_C、HIV₂₁₃、またはHIV_AC-1に感染した真核生物によって発現されるタンパク質であり得る。gp160抗原、またはそのかわりにgp4 1もしくはgp120 HIVエンベロープ抗原を発現し得る他のHIV単離株が、同様に本発明と組み合わせて使用され得ることもまた予想される。 HIVエンベロープタンパク質の精製された調製物本発明のさらなる局面は精製に関し、そして特定の実施態様において、記載される組換えHIVエンベロープタンパク質調製物の実質的な精製に関する。本明細書中で使用される用語「精製されたエンベロープタンパク質」は、HIV感染細胞の可溶性の集団の形態で、または組換え発現細胞からタンパク質としてのいずれかで真核生物から単離可能なタンパク質組成物を意味することが意図される。これらの精製されたエンベロープタンパク質はさらに、本質的に未変性であり、そして初期の抗HIV抗体と結合し得ると定義される。HIVエンベロープタンパク質は、その天然の入手可能な状態に比例して任意の程度まで精製される。いくつかの実施態様において、精製された抗原の状態は、全哺乳動物細胞溶解物中に存在するときの組換え抗原の純度に比例する。従って、精製されたHIVエンベロープタンパク質はまた、組換えエンベロープタンパク質を意味し、完全な組換え発現哺乳動物細胞中で天然に生じ得る環境に束縛されない。一般に、「精製された」は、種々の非HIVエンベロープ成分（例えば、他の細胞成分）が除去されているHIVエンベロープタンパク質組成物をいい、そしてこの組成物は、その抗原性および／または初期の抗HIV抗体と相互作用する能力を実質的に維持している。用語「実質的に精製された」が使用される場合、これは、ヒト免疫不全ウイルスエンベロープタンパク質が組成物の主要な成分（例えば、組成物中のタンパク質の約50％、約60％、約80％、または約90％、またはそれ以上を構成する）を形成する組成物をいう。 HIVタンパク質の精製の程度を定量するための種々の方法が、本発明の開示を考慮して当業者に公知である。これらは、例えば、SDS/PAGE分析によって画分中の種々のポリペプチドの数を評価することによって、初期の抗HIV抗体を検出するための調製物の活性を決定することを含む。いくつかの実施態様において、組換えHIVタンパク質は、粗細胞溶解物から約80％の純度で均質に発現されるように精製され、その結果、クマシー染色されたSDS PAGEゲルの単一のバンドで同定可能である。タンパク質調製物のSDS PAGEゲル分析は、当業者に周知である。タンパク質精製での使用に適切な種々の技術が、当業者に周知である。これらは例えば、硫酸アンモニウム、PEG、抗体などでの沈殿、または熱変性、それに続く遠心分離による沈殿；クロマトグラフィー工程（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー）；等電収束（isoelectric focusing）；ゲル電気泳動；ならびにこのような技術および他の技術の組み合わせを含む。本明細書中で示される特異的な例は、組換えgp/60を発現する哺乳動物細胞の精製であり、これは、プラスチックのEIAプレートのウエルに結合させた抗gp41モノクローナル抗体に結合する親和性を使用して可溶化される。本発明のトランスフェクトされた哺乳動物細胞由来のいくつかの組換えHIVタンパク質調製物は、80％の純度を有する。この数値は、例えば、２つの非gp160 分子に対して８つのgp160 HIV抗原分子という比を示す。より低い純度またはより高い純度の調製物もまた、初期の抗HIV抗体の検出に有用である。本明細書中以下で開示される好ましい精製方法はいくつかの工程を含み、そして実質的に精製された組換えHIVエンベロープタンパク質を調製するために、本発明者らによって現在知られている最も良好な様式を示し、そしてなおその天然の形態を維持する。この方法は、SDS-PAGE測定によって評価された場合に組換え HIVタンパク質の実質的な精製を、そして初期の抗体に結合する能力を生じ、同時にEIAプレートをコーティングするので、現在好ましい。HIVでトランスフェクトされた哺乳動物細胞からの組換えタンパク質の精製の好ましい様式は、本明細書中以下に記載される順序での特定の工程の実行を含む。しかし、当該分野で一般に公知であるように、種々の精製工程の実行の順序が変更され得ること、または特定の工程が省略され得ることが考えられ、そしてなお、実質的に精製された組換えHIVエンベロープタンパク質（例えば、組換えgp160 HIVエンベロープタンパク質）の調製のための適切な方法を生じる。上記のように、特定の実施態様における使用のためには好ましいが、HIVでトランスフェクトされた哺乳動物細胞の溶解物が常にそれらが最も精製された状態で提供される、一般的な必要性は存在しない。実際、あまり実質的には精製されていない細胞溶解物（それでもなお、天然の状態と比較して組換えHIVエンベロープタンパク質（例えば、gp160）に富む）が特定の実施態様において有用性を有する。これらは例えば、初期の抗HIV抗体の検出を含む。このような実施態様での使用のための部分的に精製されたHIVでトランスフェクトされた哺乳動物細胞溶解物の画分は、本明細書中で記載される工程の１つまたは組み合わせに対してHIVでトランスフェクトされた哺乳動物細胞溶解抽出物を曝すことによって得ることができる。HIV組換えエンベロープ調製物はまた、HIVエンベロープ抗原（例えば、gp160）をコードする核酸配列を有する細胞から分泌された産物として得ることができる。組換えベクター本発明の組換えベクターは、真核生物細胞をトランスフェクトし得る任意のビヒクルを含み得る。例として、このようなビヒクルは、レトロウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターを含む。プラスミドはまた、本発明のHIVエンベロープタンパク質をコードするHIV核酸フラグメントを導入するために使用され得る。いくつかの実施態様において、レトロウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルスエンベロープタンパク質（例えば、gp160）をコードする核酸配列、またはヒト免疫不全ウイルスエンベロープタンパク質の初期の抗HIV抗体の免疫反応性フラグメントをコードする核酸配列を含む。特定の実施態様において、ヒト免疫不全ウイルスエンベロープタンパク質をコードする核酸配列は、ヒト免疫不全ウイルス核酸配列のSalI-XhoI制限フラグメントを含む。例として、本発明者らは、いくつかのヒト免疫不全ウイルス（詳細には、HIV Ｃ株、213株、およびAC-1株）のSalI-XhoI制限フラグメントを調製し、そしてレトロウイルスベクター（例えば、pLNSXレトロウイルスベクター）中にフラグメントを平滑末端連結した。哺乳動物細胞株別の局面において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルスエンベロープタンパク質およびペプチドを発現する組換え哺乳動物細胞を提供する。任意の種々の哺乳動物細胞または細胞株が、それらが初期の抗HIV抗体を免疫学的に検出し得る組換えHIVタンパク質を発現し得る限りは、使用され得る。例として、使用され得る細胞株はCEMヒト細胞株（詳細には、CEMヒトＴ細胞と記載される）である。組換えHIVエンベロープタンパク質およびペプチドを調製するための方法組換えHIVエンベロープを調製するための方法もまた提供される。１つの特定の実施態様において、この方法は、ヒト免疫不全ウイルスエンベロープタンパク質をコードする配列を含むように遺伝子操作されたレトロウイルスベクターで哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程を包含する。次いで、これらのトランスフェクトされた哺乳動物細胞は、例えば、G418に対する抗生物質耐性によるような、スクリーニングプロセスに供され、そしてヒト免疫不全ウイルスエンベロープタンパク質の最大量を発現するクローンが選択される。例として、最大量のHI Vエンベロープタンパク質を発現するクローンが、抗HIV gp160モノクローナル抗体（例えば、DZ33，Medarex，Inc.）を使用して選択され得る。本発明によって単離されたHIVエンベロープタンパク質gp160を発現する1つの特定のクローンは、クローン７である。クローン７は、HIV₂₁₃株のenv遺伝子を含むLNSXレトロウイルスベクターでのCEM細胞株のトランスフェクションによって得られた。このクローン７は、フローサイトメトリーによって試験され、そして組換えHIV gp160タンパク質の高レベルの発現を示した（図５）。 1つ以上のHIV株から得られるgp160の融合タンパク質を発現する他のクローンもまた得ることができる。このようなクローンは、例えば、所望のHIV単離物から得られる核酸のgp160をコードするフラグメントを含むレトロウイルスベクターを構築すること、次いで上記の構築物で哺乳動物細胞をトランスフェクトすることによって達成される。任意の本明細書中で記載される組換えHIV抗原が、単独で、または初期の抗HIV 抗体の検出のための標的抗原と組み合わせて使用され得る。記載されるウイルス株由来のこれの組換え抗原の組み合わせが、今日までに試験された患者のサンプルの最も広い範囲で初期の抗HIV抗体を検出するために特に効果的であることが証明されている。組換えHIVエンベロープタンパク質／ペプチドを産生する方法／プロセス本発明はまた、組換えHIV抗原を産生する方法／プロセスを提供する。1つの実施態様において、この方法は、ヒト免疫不全ウイルスgp160エンベロープタンパク質をコードする核酸フラグメントを得る工程；核酸フラグメントをベクター中に連結して組換えベクターを提供する工程；組換えベクターで哺乳動物細胞をトランスフェクトしてトランスフェクトされた哺乳動物細胞を提供する工程；および組換えgp160タンパク質を回収する工程を包含する。組換えgp160タンパク質は、抗原の初期の抗HIV抗体を検出する能力を破壊しない可溶化剤（例えば、ジギトニン）中で感染させた哺乳動物細胞を可溶化すること、次いで、可溶化した調製物中の細胞性成分を除去することによって回収され得る。あるいは、組換えHI V抗原は、組換え真核生物細胞由来（例えば、gp160 HIVエンベロープタンパク質を分泌するように遺伝子操作された酵母細胞由来）の分泌産物として回収され得る。サンプル中の初期の抗HIV抗体を検出するための標的抗原として使用された組換えgp160を回収するために使用される方法は、HIVに感染したCEM細胞に対する、可溶化剤としての1.0％のジギトニンの使用による。この手順は、実施例３に記載される。組換えHIV gp160抗原は、プレートのウェルに全組換え細胞溶解物を注ぐことによってELISAプレート上に捕捉された。これは、マウス抗gp41 muAB でコートされる。次いで、プレートが洗浄されて、細胞性成分および他の抗原が除去された。この様式で、所望のHIV gp160抗原がプレート上に単離された。特定の実施態様において、組換えgp160エンベロープタンパク質を調製するための方法は以下の工程を包含する：gp160 HIVエンベロープタンパク質をコードする核酸フラグメントを得る工程；哺乳動物細胞をトランスフェクトし得るベクターに上記のフラグメントを挿入する工程；および上記のベクターでgp160エンベロープタンパク質を発現し得る哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程。この方法は、組換えgp160タンパク質を回収するさらなる工程を包含し得る。アッセイプレートいくつかの実施態様において、アッセイプレートのウェルは、最初に抗gp41抗体または抗gp160抗体でコートされ得る。これによって、穏やかな可溶化緩衝液（例えば、約0.1％から約10％のジギトニン（特に、約１％のジギトニン））の存在下でプラスチックにHIV gp160抗原を固定する。このようなアプローチは、プラスチック製のウェルでアッセイプレートを調製する際に特に効果的である。本発明の他の実施態様におけるアッセイプレートは、複数のマイクロタイターウェルを含み、そしていくつかの実施態様では、ポリスチレンマイクロタイターウェルを含む。これらのウェルは、約500ng／ウェルの組換えHIVエンベロープタンパク質、または組換えHIV抗原、またはHIV感染した全細胞もしくはその細胞溶解物でコートされる。初期の抗HIV抗体検出アッセイなお別の実施態様において、本発明は、標的抗原として上記の天然または組換えHIVタンパク質／ペプチドを使用する、改良された抗HIV抗体検出アッセイを提供する。これらの改良されたアッセイ（特に、ELISAサンドイッチ型アッセイ、サンドイッチ型アッセイにおける初期の抗HIV抗体の検出を提供する）は、サンプル中の初期の抗HIV抗体の検出を提供し、これは、従来のEIAおよびWB技術を使用して抗HIV抗体陰性を試験する。 EIAのこの形式は、HIV抗原（HIVでトランスフェクトされた哺乳動物細胞から発現される組換えHIVエンベロープタンパク質、またはHIVエンベロープタンパク質を発現する実質的に未変性の可溶化されたHIVに感染した哺乳動物細胞の溶解物のいずれかである、抗原）で直接コートされたプレート、または抗体捕捉サンドイッチアッセイとして作用するように設計されるプレートを使用することが記載され得る。イムノアッセイ上記のように、本発明の組換えgp160が免疫原として（例えば、ワクチン開発に関して、または抗gp160の構造的エピトープ反応性抗体の検出のためのイムノアッセイにおける抗原として）の有用性を見出されることが提言される。イムノアッセイの原点に戻ると、それらの最も単純で直接的な意味では、本発明の好ましいイムノアッセイは、当該分野で公知の種々の型の酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を含む。しかし、本明細書中で記載されるgp160調製物の有用性がこのようなアッセイに対して制限されないこと、および他の有用な実施態様がRIAおよび他の酵素に結合していない抗体結合アッセイまたは手順を含むことが容易に明らかである。 ELISAアッセイのいくつかの実施態様において、天然のgp160またはgp160抗原配列を取り込んでいる適切なペプチドが、選択された表面（好ましくは、ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルのような、タンパク質親和性を示す表面）に固定される。洗浄して不完全に吸着した物質を除去した後、試験血清に関して抗原的に中性であることが既知の、非特異的タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン（BSA）、カゼイン、粉乳の溶液、ゼラチン、PVP、スーパーブロック、またはウマアルブミン）をウェル上に結合させるか、またはコートすることが所望される。これによって、固定されている表面上の非特異的吸着部位をブロックすることが可能であり、従って、この表面上での抗血清の非特異的結合によって生じるバックグラウンドが減少する。適切なコーティング時間（例えば、３時間）の後、コートされたウェルは適切なタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン（BSA）、カゼイン、粉乳の溶液、ゼラチン、PVP、スーパーブロック、またはウマアルブミン）でブロックされ、そして数回（例えば、４または５回）適切な緩衝液（例えば、PBS）でリンスされる。次いで、プレートのウェルはは乾燥させられ得るか、またはそうでなければ、それらがまだ湿っている間に使用され得る。ウェルへの抗原性物質の結合、バックグラウンドを減少させるための非反応性物質でのコーティング、および結合していない物質の除去のための洗浄後、固定されている表面が免疫複合体（抗原／抗体）の形成を行う様式で、試験される抗血清または臨床的もしくは生物学的抽出物と接触させられる。このような条件は、好ましくは、BSA、ウシガンマグロブリン（BGG）、およびリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）／Tweenのような希釈剤で抗血清を希釈することを含む。これらの添加された試薬はまた、非特異的バックグラウンドの減少を補助する傾向がある。次いで、層状にした抗血清は、１から４時間、室温（好ましくは、20℃から25℃）でインキュベートされる。インキュベーション後、抗血清でコートされた表面が洗浄され、その結果、非免疫的に複合体化した物質が除去される。好ましい洗浄手順は、PBS／Tweenのような溶液、またはホウ酸緩衝液で洗浄する工程を含む。試験サンプルと結合した抗原との間での特異的免疫複合体の形成、および続く洗浄の後、免疫複合体の形成の出現およびその量でさえも、一次抗体に対する特異性を有する二次抗体に対して同様に曝すことによって決定され得る。当然、ここで試験サンプルは代表的にはヒトの器官であり、二次抗体は好ましくは、ヒト IgG、IgM、またはIgAに対して一般的に特異性を有する抗体である。検出手段を提供するために、二次抗体は、好ましくは、適切な色素原性物質とともにインキュベートした際に発色を生じる、結合された酵素を有する。従って、例えば、抗血清を結合させた表面を、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、またはペルオキシダーゼを結合した抗ヒトIgGと、免疫複合体の形成の進行に好ましい時間および条件下で、接触およびインキュベートすること（例えば、PBS-TweenのようなPBS含有溶液中で室温で2時間のインキュベーション）が所望される。第2の酵素タグ化抗体を伴うインキュベーション、および続く結合していない物質を除去するための洗浄の後、標識の量は、酵素標識がペルオキシダーゼの場合には、色素原性物質（例えば、尿素およびブロモクレゾールパープル、または 2,2'-アジド-ジ-(3-エチル-ベンズチアゾリン-6-スルホン酸［ABTS］およびH₂O₂ )をともなうインキュベーションによって、定量される。次いで、定量は、色素精製の程度を、例えば可視スペクトル分光光度計を使用して測定することによって達成される。各マイクロタイターウェル中には、約10μlの試験患者サンプルが、約90μlの反応緩衝液（例えば、約１％のジギトニンまたは他の穏かなタンパク質可溶化剤を含有するPBS）とともに配置される．ELISAプレートのコントロールウェルは、正常な血清（初期の抗HIV抗体を含まないヒト血清）、ウェスタンブロットを使用して評価された場合に血清転換されていなかったHIV患者の被検体から回収した初期の抗HIV抗体、および従来の抗HIV抗体検出技術を使用して血清転換された患者から得られた後期の抗HIV抗体を含む。幼児における初期のHIV感染の検出特定の実施態様において、本発明は、幼い子どもにおいて初期のIgMまたはIgA 抗HIV抗体を検出するための方法を提供する。これらの方法は、12ヶ月齢未満の幼児におけるHIV感染のより早期の検出を提供するように、既存の技術よりも改良されている。初期の抗HIV抗体の検出キット本発明のなお別の局面において、キットが、初期の抗HIV抗体の検出のために想定される。いくつかの実施態様において、本発明は、初期の抗HIV抗体およびヒト免疫不全ウイルス感染を検出するための診断キットを意図する。このキットは、本明細書中に記載される天然のまたは組換えHIV抗原と免疫反応性である初期の抗HIV抗体を検出し得る試薬を含む。いくつかの実施態様において、キットはまた、組換えHIVエンベロープ抗原と免疫反応性である初期の抗HIV抗体を検出し得る二次抗体を含む容器手段を含み得る。キットのHIV抗原試薬は、液体の溶液として、固体支持体に結合されて、または乾燥粉末として提供され得る。好ましくは、試薬が液体の溶液で提供される場合、液体の溶液は水溶液である。好ましくは、提供される試薬が固体支持体に結合されている場合、固体支持体はクロマトグラフ媒体、プラスチックビーズもしくはプレート、または顕微鏡スライドであり得る。提供される試薬が乾燥粉末である場合、粉末は、適切な溶媒の添加によって再構成され得る。なお他の態様において、キットはさらに、適切な溶媒を含有する容器手段を含み得る。いくつかの実施態様において、キットは、多量の二次抗体（例えば、アルカリホスファターゼと結合されたヤギ抗ヒトIgGもしくはIgM、または他の抗ヒトIg二次抗体）を含有する容器手段、および非変性性可溶化剤（例えば、約１％のジギトニン）を含有する多量の緩衝液を含む第2の容器手段を含む。他の実施態様において、キットはさらに、適切な基質（例えば、アルカリホスファターゼについてはPNPP、またはペルオキシダーゼにについては9-ジアニシジン）を含有する第３の容器手段を含む。適切な「終結」緩衝液（例えば、0.5M N aOH）を含有する第４の容器手段もまた、キットの種々の実施態様に含まれ得る。キットはさらに、アッセイの手順工程を概説する説明書を含み、そしてこれは、当業者に公知の代表的なEIA様式と同じ工程に実質的に従う。特発性の慢性リンパ球減少症のスクリーニング本発明のなお別の局面において、特発性の慢性リンパ球減少症においてHIVの証拠についてサンプルをスクリーニングする方法が提供される。いくつかの実施態様において、この方法は、患者から生物学的な体液サンプルを得る工程；標識された組換えタンパク質と患者のサンプル中に存在する任意の抗体との間での免疫複合体の形成を可能にするに十分な条件下で、上記のサンプルを、初期の抗HI V抗体に結合し得る天然または組換えヒト免疫不全ウイルスエンベロープタンパク質に曝し、その結果、インキュベーション混合物を提供する工程；およびインキュベーション混合物での免疫複合体形成の存在を同定し、ここで標識された免疫複合体形成の存在が特発性の慢性リンパ球減少症におけるHIVのスクリーニングを提供する工程を包含する。図面の簡単な説明以下の図面は本明細書の一部を形成し、そして本発明の特定の局面をさらに示すために含まれる。本発明は、1つ以上のこれらの図面を本明細書中に示される特定の実施態様の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、さらによく理解され得る。図１。従来のEIAアッセイによって「血清陰性」を試験した個体はHIV感染しており、そして患者由来のウイルス単離物で感染させた生細胞と免疫反応する、検出可能な初期の抗HIV抗体を有する。「血清陰性」であるHIV感染した被検体R6およびR23由来の血清を、生存している未感染のH9細胞またはそれら自身のHIV単離物（HIV_R6またはHIV_R23）で感染させたH9細胞に対して滴定し、そしてFITCに結合させたヤギ抗ヒトIg（多価）によって染色した。膜蛍光発光細胞の割合を、UV 顕微鏡下でスコアし、そしてサンプル中の初期の抗HIV抗体の存在を示す。図２。「血清陰性」であって、なおHIV感染した被検体に由来する抗体は、HIV 感染した細胞の溶解物のHIV gp160と反応する。NP-40で可溶化した［³⁵S］メチオニン標識H9細胞（未感染またはHIV_pm213で感染させた）由来の免疫沈降物のSD S-PAGE分析。レーン１〜３および８は、HIV_pm213で感染させたH9由来の溶解物であり、そしてレーン４〜７は未感染のH9溶解物である。レーン１および４、R23 血清；レーン２および５、R6血清、レーン３および６、R78血清；レーン７および８、R58血清（R23、R6、snf R78は、日常的なEIAおよびウェスタンブロットではHIV抗原について陰性であり、R58はEIAおよびWBtである）。図３。HIV₂₁₃で感染させたジギトニン溶解H9細胞のRIP NS＝正常なヒト血清； R6およびR23＝「初期の」血清；^*＝抗gp160モノクローナル抗体（F 105）で予め浄化した溶解物。図４。種々の洗浄剤で溶解させ、そして正常なヒト血清（NS）または初期の抗 HIV抗体を有する患者由来の血清（NIA-0145,8363）のいずれかで免疫沈降させた、HIVで感染した［³⁵S］メチオニン標識H9細胞のSDS/PAGE。図５。フローサイトメトリーを使用して、HIV₂₁₃gp160でトランスフェクトした細胞の３つの別々のクローン（CEM-HIV env-1 env-4、env-7）に結合した抗gp 41および抗gp120 mabのレベルを、非発現コントロールと比較して決定した。細胞を、20μg/mlのコントロール（無関係なIgG、影をつけた曲線）、または抗g41 mAB（5F3ヒトmAB、点線）、または抗gp120（gpIII_2,3マウスmAB、実線）で染色した。検出を、第２の種特異的フィコエリトリン（PE）結合抗体を使用して行った。図６。HIV 213 SalI-BamI配列（核酸配列）。好ましい実施態様の詳細な説明本発明の天然または組換えHIVエンベロープ抗原は実質的に未変性であり、そして優先的に保存された天然の構造を有する。特定のHIV株が同定され、そして本明細書中のいくつかの例示的な組換えHIV標的抗原の記載において使用されている。しかし、これらは、請求の範囲に含まれる診断／スクリーニングアッセイまたは手順の範囲を限定することを意図しない。組換えHIV抗原を使用するEIAが開発されており、これは、HIVで感染させた生細胞の免疫蛍光を用いて検出される初期の抗HIV抗体を検出する。本発明のEIAは、それを変性しない方法で（例えば、可溶化剤であるジギトニンの使用によって）哺乳動物細胞中でベクターから発現されるgp160 HIVタンパク質が可溶化される標的抗原を含み、そしてEIAアッセイプレートのウェルをコートするために使用される。これらの構造的に保存された天然の抗原模倣エピトープと血清反応性である、患者中の初期抗HIV抗体は、適切な標識抗ヒトイムノグロブリン（例えば、アルカリホスファターゼ標識抗ヒトIgG）、または幼児の症例においては抗ヒトIgMもしくはIgAを用いて検出される。以下の実施例は、gp160の構造的エピトープと反応する抗HIV抗体のウェスタンブロットまたは従来のEIAにおいて陰性であるとスコアされた、HIV感染被検体中の存在を示すことを含む。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において良好に機能することが本発明者らによって発見された技術を示すことは当業者に明らかであるはずであり、従って、その実施の好ましい態様を構成することが考えられ得る。しかし、当業者には、本発明を考慮して、多くの変更が開示される特異的な実施態様の中で行われ得、そしてなお、本発明の精神および範囲を逸脱することなく類似または同様の結果を得ることが明らかである。以下の実施例で使用される方法のいくつかは、以下のように記載される：方法生細胞の膜蛍光アッセイ：１．標的細胞は急に感染したH9またはCEMT細胞であり、これらはHIVを産生する。２．標的細胞を遠心分離チューブにピペットで入れ、そして室温で10分間回転させ、液体を吸引し、そしてペレットをペレットの５倍容量の培地中に再懸濁する。３．96ウェル丸底プレートの個々のウェルに５０μlの１°抗体を添加する。４．各ウェルに10μlの標的細胞を添加する。５．シールし、そして室温で1時間インキュベートする。６．プレートを回転させ、液体を吸引し、培地で２回リンスし、そして液体を吸引する。７．各ウェルに50μlの２°FITC抗体を添加し、適切に希釈し、そして1時間室温でインキュベートする。８．プレートを回転させ（5'×2,000rpm）、液体を吸引し、そして培地で2回、細胞をリンスする。９．各ウェルに２％のホルマリンを含有する１滴のグリセロール／PBS（１：１）を添加し、そして混合する。１０．細胞懸濁物を、顕微鏡スライドの上のカバースリップの下に載せる。放射免疫沈降およびSDS/PAGEのプロトコール：細胞の放射性標識：１．懸濁培養のために、細胞を後期対数期まで増殖させる。増殖培地を除去し、細胞をメチオニン非含有培養培地で１回洗浄する。37℃にて20〜30分間細胞をインキュベートして、細胞のメチオニンプールの枯渇を補助する。２．洗浄培地を除去し、そして50マイクロキュリー／mlの³⁵Sメチオニンを含有するmet非含有培養培地の最小容量を添加する。３〜４時間または必要とされる時間インキュベートする。３．細胞を収集するために、遠心分離によって懸濁培養物を回収し、そして冷 PBSで１回洗浄する。1.0mlの溶解緩衝液（0.5％ NP40、または１％のジギトニンなど）を添加する。遠心分離チューブに移し、ボルテックスし、そしてサンプルを−70℃に保つ。４．TCA沈殿を使用して放射性標識したタンパク質の量を測定する。タンパク質分解の直前に、遠心分離器でサンプルを15分間遠心分離して核酸および不溶性の破砕物をペレット化する。細胞溶解物からの免疫沈降およびSDS/PAGE：１．溶解物の適切な容量を、放射性標識タンパク質の量に基づいてスクリューキャップ遠心分離チューブに等分する。代表的なRIPは10⁶cpmを含み得る。予備洗浄が必要な場合は、１：100（ｖ）抗体（正常な血清）を添加し、ボルテックスし、そして30分間氷上でインキュベートする。100マイクロリットルの、Protein A-Sepharoseまたはホルマリンで固定したStap hulococcus aureus（Cowan株）のいずれかを添加し、混合し、30分間氷上に保持する。５分間遠心分離し、そして上清を回収し、そして新しいスクリューキャップチューブに移す^*。サンプル（１〜２×10⁶細胞等量）の予め洗浄した溶解物を、３〜５μl の血清または100μlの組織培養モノクローナル抗体上清とともに、一晩４ ℃で免疫沈降させる。S．aureusを含む沈殿を回収し、そして還元条件（５％の2-メルカプトエタノール）下でSDS（10％）-PAGEによって分析する。実施例１−標的抗原として生細胞免疫蛍光を用いる初期の抗HIV抗体本実施例は、従来の抗HIV抗体検出技術によって血清陰性であると以前に診断されたヒト患者の血清における、初期の抗HIV抗体の存在を実証する。４人の高リスクの感染したEIA−、WB−個体のうちの４人における初期の抗HIV 抗体の存在を、非変性試験（生細胞膜免疫蛍光）を使用するこの実施例において示した。これらの抗HIV抗体はIgGイソ型であり、そしてそれらの同型のHIV、および多数の他のHIV-1単離物と反応することが見出されている（表１）。これらの血清は、コントロールと同様にHIVに未感染の細胞とは反応しなかった。実施例２−臨床的スクリーニングにおけるHIV株の免疫反応性本実施例は、HIV感染個体由来のEIA+、WB+血清が、天然のHIVエンベロープ抗原に対して非常に多くの型特異性を有し、そして生細胞免疫蛍光を使用する場合、種々のHIV株に対して活性であることを示した本発明者らの以前の研究と同様に、種々のHIV株の概要を示す。表2は、特定のHIV株が、他のHIV単離体ではなく感染個体由来の抗体によって認識されるようであることを実証するデータを提供する。個体（EIA陰性、WB陰性）。これらのデータを表３にまとめ、これは、HIV 213 株、AC-1株、およびＣ株がほとんどの血清と反応することを示す。表３種々のHIV-1株に対する「初期の」抗体の生細胞免疫蛍光反応性漸増的に、進行した感染被検体および「初期の」感染被検体の両方についてのすべてのデータは、１つ以上のこれらの３つのHIV株がほとんど全ての（全部ではないが）感染したヒト由来の抗体と反応することを示す。高リスクのEIA陰性、WB陰性である個体のやり大きな群もまた、試験した。生細胞の膜免疫蛍光において反応性である抗体が、それらの約25％に存在することを見出した。表４に示すデータは、Clericiら²⁸に報告された研究に含まれる一人の高リスクの患者由来の抗HIV免疫蛍光力価を示す。表４同じ患者から連続的に得られた血清の膜免疫蛍光力価たとえこの個体がFDAに認可された血清学的試験において「血清陰性」であり、そしてHIVについてPCR陰性であったとしても、この個体は膜蛍光によって低いが有意な抗HIV抗体力価を有した²⁸。これと一致して、この個体はHIV反応性Ｔ細胞を有し、これは彼らの報告に基づいて形成された。表５は、別の一連の個体の膜蛍光力価を示す。示されるサンプルは、多数の正常なコントロール、および日常的な試験によって血清陽性であった感染個体を含んだ。表５血清の膜免疫蛍光反応性のまとめ膜蛍光力価は、これらの試験に完全に対応した。この群はまた、８から10ヶ月間にわたって持続的に出血した５人の高リスクの個体を含んだ。これらの個体の１人（20664）は、FDAに認可された試験によってはまだ血清陰性であった最初の往診時には、HIV₂₁₃に対して低い免疫蛍光力価を有した。およそ４ヶ月後には、この個体はEIAおよびウェスタンブロットで陽性であり、そしてHIV₂₁₃に対する膜免疫蛍光によって１：160の力価を有し、HIV_AC-1に対してもまたそうであった。第2の個体（40301）は、彼の第2回目の往診時にHIV_AC-1に対する膜免疫蛍光によって力価を初めて生じ、これは次の往診時には増大した。第3の被検体（41593）は、彼の最後の往診時に膜免疫蛍光で血清陽性になったが、彼はEIAおよびウェスタンブロットでは陰性であった。この群の他の２つの個体は、従来の試験によって血清転換しておらず、そして膜免疫蛍光によって血清転換していない高リスクの個体であった。表６に、65の個体についての膜免疫蛍光反応性をまとめる。この群には、健常なコントロール、陽性コントロール（EIA／ウェスタンブロット陽性）、おならびに高リスクであるがEIAおよびWBでは血清陰性であった36個体を含んだ。後者うちの12は、膜免疫蛍光で陽性であり、そしてHIVペプチドに対するＴ細胞反応性を有することもまたすでに見出されていた。表６血清の膜免疫蛍光力価全ての高リスクの「血清陰性」被検体からのデータを、表７にまとめる。これらの血清のほとんどは一度だけ入手し、そしてさらなる50人の患者の血清を含む。表７ HIVに対する抗体についての高リスクの被検体由来の血清の生細胞免疫蛍光試験のまとめ 109の被検体のうちの29の被検体が、3つのHIV株の少なくとも1つについて生細胞蛍光に対する反応性を有した。これらの8つを、感染細胞中のジギトニンで可溶化したウイルスタンパク質の免疫沈降についてランダムに試験し、これらが全てHIV gp160と反応することを見出した。生細胞蛍光において、低リスクのHIV-N EGATIVE個体は陽性が見出されず（すなわち、力価≦１：10）、そして感染被検体中の力価は、疾患の段階にほぼ対応する。生細胞蛍光での高力価は、通常、EI Aおよびウェスタンブロットで陽性とスコアされた個体で見出され、そしてより低い力価の個体は通常、EIAおよびウェスタンブロットでスコアされなかった。生細胞免疫蛍光アッセイの相対感度生細胞の免疫蛍光は、必ずしも全ての場合においてEIAおよびWBよりもより感度の高いアッセイではない。コントロール（陰性）血清は、１：10より大きい希釈では細胞を染色しないが、EIAおよびWBにおけるそのような低い希釈で陽性の反応を生じる。そしてこれらの試験の高い感受性が、ほとんどの抗原と反応する、ヒト血清中に存在する非常に少ない量の抗体をスコアすることを可能にするようである。約44〜95％のHIV感染個体が、有意なレベルの自己抗体を有する³³。生細胞蛍光は、１：10以上に希釈された血清中のこれらの抗体を検出するには感度が低すぎる。また、抗HIV抗体について陽性である血清は、１：10、000〜１：3 0、000に希釈され得、そしてEIAおよびWBで反応性のままであるのに対して、これらの同じ血清は１：5000以上に希釈された場合は生細胞蛍光において反応性ではない。生存している感染細胞を使用することによって、質量に基づく抗体の検出の感度よりは大きくないが、天然の構造的エピトープに対する抗体の検出が可能である。実施例３−可溶化研究−初期の抗HIV抗体を検出するための非生存細胞標的抗原本実施例は、患者のサンプル中の初期の抗HIV抗体を検出するための非生細胞標的抗原の有用性を実証する。本実施例中のデータはまた、初期の抗HIV抗体を検出するための、ヒト免疫不全ウイルスエンベロープタンパク質の実質的に保存された構造的エピトープの重要性を実証する。初期の抗HIV抗体について免疫反応性であるHIVタンパク質に対する種々の可溶化剤の効果を、多数の異なる界面活性剤でHIV標的抗原を調製することによって試験した。この研究は、初期の抗HIV抗体を、標的抗原としてHIVを用いて感染させた生細胞以外を用いて、ヒト血清サンプル中で検出し得ることを実証する。これらのサンプルは、抗体について血清陰性であることが、標的抗原として変性させたHIVタンパク質を使用して（ウェスタンブロットおよび従来のEIAにおいて）以前に決定されている。 HIV感染させたヒトCEM細胞を、表８に列挙した試薬の１つで可溶化した。各抗原調製物を、6人の患者由来の血清中に含まれる初期の抗HIV抗体によって免疫沈降する能力について試験した。これらの患者の血清を、生細胞免疫蛍光アッセイを使用して初期の抗HIV抗体について陽性を試験し、そして変性したHIV標的抗原を用いる従来のウェスタンブロットアッセイによって抗HIV抗体の存在について陰性を試験した。各抗原調製物をまた、生細胞免疫蛍光アッセイで決定した場合に初期抗HIV抗体を含まなかったコントロールの血清サンプルを用いて試験した（「NS」＝正常な血清）。表８に全てのデータをまとめ、そしてこれは、ジギトニンが、この研究で試験した他の界面活性剤と比較して、標的抗原としての使用についてタンパク質／ペプチドに対して最も少ない変性効果を提供するために使用され得る、代表的な可溶化剤であることを示す。これらのデータは、これらの「初期の」抗体がHIV gp 160の構造的エピトープを認識する証拠を提供する。約0.1〜約５％の間の濃度のジギトニンが、初期の抗HIV抗体を検出する反応性を損なうことなく本発明の標的HIV抗原を調製するために使用され得ることが、予想される（comemplate）。表８種々の界面活性剤中でのHIV gp160に対する「初期の」抗体の反応性のRIP/SDS-PAGE試験のまとめ図４は、本研究の代表的な例を示し、そして「初期の」抗体が、約１％のジギトニンおよび0.5％のNP40中で可溶化したgp160を免疫沈降したことを実証する。初期の抗HIV抗体は、ジギトニン中で可溶化したgp160を標的抗原として使用した場合に、全ての血清サンプル中で検出された。初期の抗HIV抗体はまた、NP40で可溶化したHIV標的抗原を使用する6つの患者の血清サンプルのうちの３つで検出された。しかし、初期の抗HIV抗体は、10mM CHAPS、0.5％SDS、0.5％デオキシコール酸、1.0％オクチルグルコシド、１mM K₂PO₄、0.5mMドデシルマルトシド、または0.3mM Theirstで処理したHIV抗原を使用するいずれの血清においても検出されなかった。 1つの実施態様において、HIV感染細胞を１％のジギトニン中で可溶化し、そして標的抗原としてEIAプレートをコートするために使用する。これらの放射性免疫沈降（RIP）およびSDS/PAGEの研究はまた、抗体がウイルス抗原に対して反応性であり、そしてウイルス誘導性細胞性抗原に対しては反応性ではないことを実証した。CHAPSで可溶化したHIV抗原は、初期の抗HIV抗体を含有する血清で検出可能な免疫沈降物を示さなかった（図２、レーン１および２）。4つの血清のうちの1つが、0.5％のNP40で可溶化した、³⁵Sメチオニン標識した感染細胞を使用して免疫沈降物を提供した（図２、レーン４および５）。この割合のNP40可溶化剤によるわずかな変性によって、他の3つの血清中の抗体によって認識される抗原性エピトープを破壊した。 1つの反応性の血清によって、約160、000の分子量のタンパク質を免疫沈降した（図２）。免疫沈降されたこのタンパク質を、そのようなRIP反応性が抗gp160モノクローナル抗体でNP40細胞性溶解物を置き換えることによって排除され得ることを示すことによって、HIV gp160であると確認した（図３）。以下の実施例は次のことを概説する：（ａ）HIV AC-1株およびＣ株からのgp16 0を発現するCEM株の造成；（ｂ）EIAでのバックグラウンドの結合を減少させるための適切なブロッキング試薬の決定を含む、EIAの様式（すなわち、抗原または抗体捕捉サンドイッチアッセイでのウェルの直接のコーティング）；乾燥使用形式または湿潤使用形式でのEIAプレート上での決定研究、および本発明の商業的な態様でのアッセイプレート上でのHIVタンパク質の抗原性構造を保存するための方法。実施例４−組換えGP160 HIVタンパク質／ペプチド本実施例は、初期の抗HIV抗体と免疫学的に反応し得る、構造的に完全な組換え標的抗原を提供するための、本発明の有用性を実証する。初期の抗HIV抗原の存在は、生細胞免疫蛍光アッセイで観察される抗HIV抗体の検出に匹敵する。 CEMヒトＴ細胞中での、レトロウイルスベクター（pLNSX）中のHIV 213株由来のSalI-XhoI制限フラグメントの安定な発現を、すでに達成している（図５）。このフラグメントを、ベクター中に平滑末端連結し、そしてその後、エレクトロポレーションによってトランスフェクションし、細胞をG418で選択し、次いで個々のクローンを限界希釈によって得、そしてHIV gp160に対するF105モノクローナル抗体（Medarex，Inc.）を使用して、エンベロープの高発現について試験した。得られたクローン（クローン７）を、フローサイトメトリー（図５）によって研究し、そしてこれは、gp160の高い発現を示した。クローン７は、生細胞蛍光アッセイで有用であり、そしてH9 HIV感染細胞を使用して検出された初期抗HIV抗体と反応することが観察されている。他の2つのHI V株（HIV_CおよびHIV_AC-1）のエンベロープ遺伝子のクローニングもまた、上記の発現ベクター系を使用して達成されている。初期の抗HIV抗体の結合および検出のためのHIV標的抗原の、保存された構造的完全性の重要性を実証するさらなる証拠が、組換えgp160抗原を使用して本発明者によって行われた研究で提供される。HIV₂₁₃のエンベロープを、E．coli中で発現させた。次いで、この抗原を使用して、生細胞免疫蛍光アッセイで初期の抗 HIV抗体を有すると同定された患者の血清からの初期の抗HIV抗体の免疫沈降を試みた。 E．coliで発現させた組換えgp160 HIVエンベロープ抗原は、患者のサンプル中の初期の抗HIV抗体によっては沈殿しなかったが、ジギトニンで可溶化したHIV₂₁ ₃ 感染細胞の抗原は沈殿した。これらの結果は、初期の抗HIV抗体が保存された一次構造のみを有するgp160 HIV表面抗原には免疫学的に結合し得ないことを実証した。なぜなら、E．coliは、初期の抗HIV抗体による認識に必要な十分な構造的特徴を有する組換えタンパク質を提供し得ないからである。細菌中でのgp160の過剰発現は、タンパク質の適切な折り畳みおよびグリコシル化ができない。実施例５−幼児における抗HIV抗体の検出本実施例は、幼児における初期の抗HIV抗体の存在を実証し、従って、幼児におけるHIV感染を検出するための天然の組換えHIV抗原アッセイの有用性を実証する。これらの研究で試験したサンプルは、従来の抗体検出技術を使用してHIV血清陽性であると決定された母親から生まれた（bom）、48人の赤ちゃん（生後1日から６ヶ月）由来のサンプルによって構成した小児科学的HIV集団から得た。PBMC もまた、p24抗原捕捉EIAおよびPCRによる検出のために培養した。HIVを、これらの幼児の６人において見出した。表９は、未感染の細胞および感染細胞に対する生細胞膜免疫蛍光での、幼児の血清の滴定の結果をまとめる。表９ HIVとのIgM反応についての幼児の血清の生細胞免疫蛍光試験 6人の感染した幼児のそれぞれが、HIV感染細胞と反応する初期IgM抗体を有した。血清は未感染の細胞とは反応せず、そしてこれらの血清はまた、類リウマチ因子が検出される可能性を排除するためのSepharoseプロテインＧとの吸着によるIgGの除去後に反応性であった。未感染の幼児は抗HIV IgMを有さず、従って、生細胞蛍光による抗HIV IgMの存在とウイルスの存在との間に100％の一致が存在した。感染が見出された1日齢の赤ちゃんから得られた血漿中の抗HIV IgMの中程度の力価の存在に注目した。これらのデータは、乳児が明らかに子宮内で感染したことの陽性の徴候を提供する。これらのデータは、感染した幼児が、抗原として生存している感染細胞を使用して検出され得るHIV特異的IgMを有することを示す。従って、HIVタンパク質の構造的エピトープと反応性であるIgMおよびIgA抗体を検出する小児科学的HIV試験キットを、この特定の適用のために提供する。このデータは、HIV特異的Ｔ細胞、Ｂ細胞、および構造的エピトープを認識する抗HIV抗体が、他の方法では免疫学的にサイレントな感染の初期のウィンドウの間に産生され、そして最終的に感染した個体が変性したタンパク質（現在のEI A／WBアッセイでの従来の「抗体陽転」）と反応する抗体を産生するという議論を支持する。 HIV血清陽性の母親から生まれた幼児の他の調査による前向き研究は、12人のH IV培養-陽性の幼児のうちの10人が、出生から27週間齢までに検出可能なHIV組換えタンパク質に対するIgA抗体を有したことを示す³⁶。ほとんどの場合、試験した最初の血清を、２ヶ月齢後に採集した。1歳以上の子どもでは、全てのサンプルがHIV特異的IgAについて陽性であり、一方、50％のみが検出可能なIgMを含んだ。注目すべきことに、３ヶ月齢以下の13人の感染した幼児のうちわずか2人が彼らの改変したウェスタンブロット手順によって検出されたIgAを有した。試験手順（ウェスタンブロットまたはドットブロット）に関わらず、HIVに対する検出可能な抗体を有する最初の血清サンプルは、エンベロープ糖タンパク質gp160 に反応性であった。上記の知見は、幼児におけるHIVの新規の診断試験としての本発明の有用性を実証する。これは、現在の方法よりも改良されている。なぜなら、この方法は、標準的なスクリーニング方法よりもはるかに早くHIVを検出し、そして幼児の感染にさらに特異的であり、母親の感染には特異的ではないからである。特定の実施態様において本発明は、小児科学的被検体が、小児科学的HIV感染の改良された早期の診断の一部としての、HIV gp160の構造的エピトープに特異的なIgMまたはIgAの存在による初期の抗HIV抗体試験によってHIV感染についてスクリーニングされる、試験レジメを含む。実施例６−血液バンク中の血液のスクリーニング方法 HIV感染についての現行の試験は、最近感染した個体をスコアせず、そして、前AIDS期の後期の小さな断片さえも見逃す。ウイルスが、このようなEIA陰性、W B陰性患者から検出され得るので、これらがその期間の他の人々に対してウイルスを伝達し得る可能性が非常に高い。さらに、彼らが、感染していないと考えられている血液を提供する場合、彼らの血液の輸血のレシピエントに対する危険性が存在する。従って、本発明の型の試験について最も重要な必要性の1つは、献血の血液バンクのモニタリングでの拡大された使用である。さらに、これらの型の被検体の多くが、おそらくほとんど性的に活発であり、本発明で開示される試験は、性的に伝達される疾患を扱う診療所、あるいは試験現場などで試験される初期のHIV感染個体を検出することに有用性を有する。本発明の方法は、初期の抗HIV抗体を検出する、組換え非生細胞のHIV標的抗原の使用を提供する。いくつかの実施態様において、この方法はEIAを含み、ここで、哺乳動物細胞中でベクターから発現されたgp160は、例えばジギトニンで可溶化され、そして標準的なEIAプレートのウェルをコートするために使用される。次いで、これらのネイティブな抗原と反応する、患者の血清中の初期の抗HIV 抗体が、標識試薬（例えば、抗ヒトIg抗体に結合されたアルカリホスファターゼ）を使用して検出される。実施例７−未変性の組換えGP160 HIV抗原を用いるEIAアッセイ本実施例は、未変性の非生細胞のHIV標的抗原を使用する、初期の抗HIV抗体の検出のためのEIAを提供することについての本発明の有用性を実証する。これらの未変性のHIV抗原は、標的抗原として使用されるHIV感染細胞と比較して低下したバイオハザードを示すが、本質的に同じ抗HIVの初期抗体検出アッセイを提供する。本実施例で例示される特定の未変性の非生細胞HIV標的抗原は、組換えgp1 60 HIV抗原である。この試験は、初期の抗HIV抗体の検出を提供するが、これはまた、従来の抗HIV 抗体検出方法で検出される後期の抗体との陽性の反応を示す。 gp160 HIV標的抗原を、実施例４（HIV₂₁₃）に記載のように調製する。しかし、コードする核酸配列の一部として単離され得、そして組換え産生され得る任意のHIVエンベロープタンパク質が、本発明と組み合わせて使用され得、上記の抗原は、初期の抗HIV抗体の認識および結合を促進するために必要な、保存された構造的統合性を有する。1つの実施例において、哺乳動物細胞中でベクターから発現されたgp160を、約１％のジギトニン中で可溶化し、そして例えば、標準的な9 6ウェルマイクロタイタープレートのウェルをコートするために使用する。サンプル（好ましくは、生物学的サンプル（固形の組織または体液））中に存在する任意の初期の抗HIV抗体は、抗原と免疫学的に反応し、そして初期の抗体を、アルカリホスファターゼ標識抗ヒトIgG、または幼児の場合には抗ヒトIgMもしくはIgAを使用して検出する。 EIAアッセイは、本開示の情報によって与えられる当業者に公知の任意の種々の試験形式（例えば、抗原でのアッセイウェルの直接のコーテイング、または抗体捕捉サンドイッチアッセイ）に従い得る。抗原を含むかまたは抗原で処理されるアッセイプレートを、初期の抗HIV抗体に結合するかまたはその結合を攻撃する能力の顕著な欠失を伴わずに乾燥させ得ることが予想される。 EIA形式の決定全ての「初期」および「後期」の抗体と反応するHIV gp160発現細胞を、穏かな可溶化剤（例えば、ジギトニン）中で可溶化する。この溶解物を、低温でSeph adex G2000カラム上でサイズ分画し、そしてHIV gp160を含有するピーク（RIPによって決定する）を使用して、500ng/ウェルでポリスチレンマイクロタイターウェルをコートする。コーティングの３時間後、ウェルをBSAで「ブロック」し、そして緩衝液で５回洗浄する。ウェルは、乾燥させるか、またはPBSで湿らせたままにするかのいずれである。10μlの「初期の」抗体を、90μlの反応緩衝液（約１％のジギトニンを含有するPBS）を含有する個々のウェルに添加する。続く工程は、室温で約１時間のインキュベーション、約1%のジギトニン緩衝液での３回のリンス、およびアルカリホスファターゼと結合させたヤギ抗ヒトIgGまたはI gMとの室温（20℃）で約１時間のインキュベーションを包含する代表的なEIA形式である。次いで、ウェルを２回洗浄し、そして基質緩衝液中で基質を添加する。終結緩衝液の添加後、プレートをELISAプレートリーダーで読みとる。コントロールは、抗体を含まない、正常な血清、およびEIA/WB陽性の血清由来のHI V抗体を含むウェルを含む。初期の抗体がこの試験における上記の健常なコントロール血清（すなわち、４ ×以上の希釈で）を有意に記録する場合、次いでこの特定の形式を商業的な実施態様において使用する。さらなる改良が、アッセイになされ得ることが想像される。さらに、より高度に精製されたgp160調製物が、当業者に周知のアフィニティー精製技術によって調製され、そして本発明に従って初期の抗HIV抗体の検出において標的抗原として使用される。ジギトニン可溶化物質がプラスチックプレートに適切に貼りつかない場合、いくつかの他の方法が使用され得る。1つの方法は、抗gp41抗体または抗gp160抗体でプレートを最初にコーティングすることであり、この方法は次いで、ジギトニンの存在下でプラスチックに対してgp160を固定化する。このサンドイッチEIAはまた、コーティングの間に抗原を精製する。いくつかの他のモノクローナル抗体（例えば、gp160に対するモノクローナル抗体であるF105、またはgp41に対するモノクローナル抗体であるchessie 8のような）もまた、プレートに対する抗体の最初のコーティングを提供するために使用され得る。本実施例は、本発明のEIAにおいてバックグラウンドの結合を減少させるために使用される技術および試薬を記載する。ヒトの抗体の検出においてEIAに伴う共通の問題は、正常なコントロール血清とのバックグラウンド結合の比較的高い程度である。代表的には、正常な血清は、HIV抗体について本明細書中で記載される試験で陰性であるために、１：100以上に希釈される必要がある。以下の試薬を、単独または組み合わせてのいずれかでブロッキング剤として試験する：ウシ血清アルブミン PVP スーパーブロックコントロール血清との高度な結合がなお観察される場合、ヒト免疫系によってはおそらく見られない他のタンパク質（例えば、ウマアルブミン）が使用される。最も低いバックグラウンド結合を提供するブロッキング剤を選択し、そしてこの方法の種々の実施態様において使用する。スーパーブロックは、EIAプレートをブロックするために使用される市販のブロッキング剤（Pierce Chemical）である。乾燥プレートを、初期の抗体との維持された反応性を評価するために最初に乾燥させる。あるいは、プレートを、抗原の構造的統合性の保存をさらに増強するために乾燥させる前にスクロース溶液で処理し得る。この技術は、タンパク質の部分的な水和を維持するために、他のEIAとともに使用する。あるいは、グリセリンまたはゼラチンを使用し得、これは抗原を保存し得、一方、部分的に乾燥させ、次いで、再水和の際にアッセイを行う最初の工程として溶解され得る。なお別の場合は、プレートのウェルを湿ったまま維持し、そしてプレートのウェルをシールしてEIA手段を使用するための用意として漏れを防ぐ。 EIAを、HIV感染個体（現在使用されている試験において血清陽性であるHIV感染個体と、現在の試験ではスコアされなかった初期の感染個体との両方）からの長年にわたって回収した、凍結した貯蔵血清のパネルに対して試験する。未感染のコントロール血清もまた、コントロールとして試験する。これらのすべてを、試験血清の最適条件を決定するために、未希釈または新規のEIA中での種々の希釈物を試験する。実施例８−他のGP160発現細胞株の開発本実施例は、組換えHIV抗原を発現する細胞株（例えば、GEM細胞株）の開発に使用される方法を概説する。これらの細胞株は、初期の抗HIV抗体反応性を有する。例示的な組換えHIV抗原は、HIV 213株、AC-1株、およびＣ株のHIV抗原を含む。これらの組換え抗原で感染させた細胞株は、開発されたHIV感染細胞株に類似の、初期の抗HIV抗体検出活性を有する抗原を発現し、そして本明細書に記載する。ヒト免疫不全ウイルス由来の制限フラグメントを、ウイルスエンベロープタンパク質をコードする核酸フラグメント、またはその抗原的に活性なフラグメントに隣接する、既知の制限部位を使用して入手し得る。例として、特定のHIV単離物（例えば、本明細書に記載されるHIV_AC-1およびHIV_C）由来のSalI-XhoIフラグメントを、適切なプラスミド（例えば、pUC19プラスミド）中にクローニングし得る。制限マッピングを、当業者に周知の技術に従って、このフラグメントがHIV エンベロープタンパク質をコードすることを確認するために使用し得る。次いで、得られたフラグメントを、適切なベクター（例えば、pLNSXレトロウイルスベクター）のクローニング部位に連結し得る（図５を参照のこと）。次いで、レトロウイルスベクターを使用して、適切な哺乳動物細胞株（例えば、ミンクのMiLu 細胞（ATCC CCL64）または適切であると考えられる任意の他の株）をトランスフェクトする。次いで、細胞を所望の選択機構（例えば、抗生物質耐性（例えば、 400〜800マイクログラム／mlのG418で１〜２週間））を用いて選択し得る。次いで、Terasakiプレート中での限界希釈によって、選択手順からの生細胞を、クローニングし得る。次いで、個々のクローンを、モノクローナル抗体F105（Medare x，Anandale，New Jersey）を使用する生細胞蛍光（実施例１を参照のこと）によって、組換えHIV gp160の発現についてスクリーニングし得る。フローサイトメトリーによる蛍光強度測定に基づいて、最大量の組換え抗原を発現するクローンを拡大させ得、そして細胞のバンクを生存可能に凍結する。本明細書で記載する組換えHIV抗原は、初期の抗HIV抗体の検出に有用であり、抗原は、維持されるHIV抗原の構造的エピトープ（詳細には、gp160のようなHIV エンベロープ抗原）を有し、そして初期の抗HIV抗体と反応する。HIV gp160抗原の非生細胞調製物は、ジギトニン中で可溶化したgp160遺伝子のフラグメントを有する組換えレトロウイルスシャトルベクターで感染させた全生細胞を使用して、初期の抗HIV抗体免疫反応性を維持することが示されている。いくつかの実施態様において、gp160をコードする核酸フラグメントを有するレトロウイルスベクターで感染させた全細胞を１％のジギトニンで可溶化し、そしてEIAプレートをコートするために使用する。HIV感染細胞の単離物（例えば、HIV₂₁₃）由来のg p160発現産物もまた、記載するアッセイ方法で使用し得る。実施例９−抗体についてのアッセイに基づく抗原としての組換えHIVタンパク質発現細胞対生HIVで感染させた細胞の比較試験この研究のために、41の長期的に研究した高リスクの個体から血清を収集した。各血清を、生細胞免疫蛍光において組換えHIV抗原を発現するCEM細胞、およびHI Vに対する抗体についての３つの市販のEIA（Abbott Laboratories、Electronucl eonics、およびOrganon-Technica）を用いて試験した。アッセイ手順は、製造者によって推奨された。CEM株を使用して陽性であるが、３つの市販のアッセイでは陰性であることが見出されれた個体を同定した。血清収集の時点で採取したこれらの患者のそれぞれから得たPBLサンプルを、H IV DNAについてPCRによって分析し、培養物中に置き、そして正常なドナー由来の精製したCD4リンパ球と同時培養した。後者は、HIVを増幅するので、HIVを単離する非常に敏感な方法である。従って、本発明者らの試験でのみ陽性である被検体には、血清収集時でのリンパ球中のHIVを直接検出する確認試験を有する。これらの41人の被検体からのデータは、組換え抗原を発現する細胞の使用がHI V感染細胞に類似の初期の抗HIV抗体を検出するように作用することを実証する。表10 組換えgp160を発現するCEM細胞を使用する生細胞免疫蛍光による「初期の」抗ＨＩＶ抗体の存在の評価実施例10−生細胞EIAまたは固定した細胞EIA 本実施例は、標的抗原として所望のHIVエンベロープ抗原を発現する生存している組換え細胞を使用する、本発明のアッセイプレートの特定の想定される実施態様を実証する。これらの組換え生細胞を、種々の異なる機構（例えば、増殖するための基板に付着しなければならない細胞株の使用によって）を通じてプレートのウェルに接着させ得る。これらのプレートの特定の実施態様は、生細胞EIAまたは固定した細胞EIAを含み、ここでウェルは、HIV 213株、AC-1株、またはＣ株のエンベロープタンパク質を発現する生細胞をプレーティングされる。これらの生細胞はプラスチックプレートに付着する。基板に付着することによって増殖する細胞株としては、ミンクの胚繊維芽細胞（MiLu）、およびヒトまたは種々の動物種由来の他の繊維芽細胞株または上皮細胞株が挙げられる。細胞を、上記のウイルス株の１つまたは任意の組み合わせのエンベロープ遺伝子を含む、広宿主性MuLVパッケージレトロウイルスで感染させる。次いで、細胞を、G418耐性について選択する。次いで、選択した細胞を別々にクローニングし、そして生細胞免疫蛍光によって評価した場合に最高レベルのエンベロープタンパク質を発現するクローンを、EIAで使用する。EIAのために、細胞を、96ウェル平底マイクロタイタープレートにプレーティングし、付着させ、そしてコンフルエントまで増殖させる。プレートを、生細胞で使用し得るか、あるいは細胞を、初期抗HIV抗体を検出するために必要なgp160の構造的エピトープを破壊しない穏かな固定剤（例えば、0.5％グルタルアルデヒド）で固定し得る。試験血清ならびに既知の陽性および陰性のコントロール血清の希釈物を個々のウェルに添加し、１〜２時間インキュベートし、次いで除去する。次いで、ウェルをPBSで３〜５回洗浄する。次いで、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）と結合させた二次抗血清を、各ウェル中で１〜２時間インキュベートし、続いてPBSで３回リンスする。次いで、基質を、可視色が検出されるまでウェルに添加する。次いで、プレートを、当業者に周知の技術を使用してEIAプレートリーダーで読みとる。＊＊＊＊本明細書中に開示および請求される全ての組成物および方法は、本発明の開示を参照して過度の実験を伴わずに実行および達成され得る。本発明の組成物および方法が、好ましい実施態様に関して記載されているが、変化が本明細書中で記載される組成物、方法、ならびにその方法の工程または一連の工程において、本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく適用され得ることが、当業者に明らかである。より詳細には、化学的かつ生理学的に関連する特定の試薬が本明細書中に記載される試薬を置換され得るが、同じまたは類似の結果を達成することが明らかである。当業者に明らかであるこのような置換および改変の全てが、添付の請求の範囲によって規定される本発明の精神、範囲、および概念の範囲内であると考えられる。参考文献本明細書中で示される例示的な手順または他の詳細を提供する範囲のための以下の参考文献は、本明細書中に参考として詳細に援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ０７Ｋ 14/155 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ラムセイ，キースエム. アメリカ合衆国アラバマ 36695，モビル，アップルクロスドライブエヌ. 6600

Claims

【特許請求の範囲】１．初期の抗HIV抗体に免疫学的に結合し得る組換えヒト免疫不全ウイルスエンベロープタンパク質を含む組換えタンパク質であって、SDS/PAGEによって決定された場合に約160、000ダルトンの分子量を有するとさらに規定される、タンパク質。２．以下のプロセス：エンベロープタンパク質gp160をコードするヒト免疫不全ウイルスの核酸を含む制限フラグメントを調製する工程；該制限フラグメントを、真核生物細胞中で発現し得るベクター中に挿入する工程；該組換えベクターで真核生物細胞をトランスフェクトする工程；および初期の抗HIV抗体に免疫学的に結合し得る組換えタンパク質を回収する工程、によって調製されるとさらに規定される、請求項１に記載の組換えタンパク質。３．前記真核生物細胞が、例えばCEMまたはMu-1-Luのような哺乳動物細胞株である、請求項２に記載の組換えタンパク質。４．前記真核生物哺乳動物細胞がCEMまたはMu-1-Luである、請求項３に記載の組換えタンパク質。５．前記組換えベクターがpLNSX-envである、請求項２に記載の組換えタンパク質。６．初期の抗ヒト免疫不全ウイルス抗体に結合し得るヒト免疫不全ウイルスgp16 0タンパク質をコードする配列を有する核酸分子を含む、組換えベクター。７．前記組換えベクターがgp160 HIVタンパク質をコードする配列を含む、請求項６に記載の組換えベクターを含む、哺乳動物細胞。８．前記gp160 HIVタンパク質をコードする配列が、HIV₂₁₃、HIV_AC-1、HIV_C由来のSalI-XhoI制限フラグメント、またはこれらの組み合わせである、請求項７に記載の哺乳動物細胞。９．CEMまたはMu-1-Lu細胞としてさらに規定される、請求項７に記載の哺乳動物細胞。１０．前記gp160 HIVタンパク質をコードする配列が、HIV₂₁₃由来のSalI-XhoI制限フラグメント（ATCC VR2247）である、請求項７に記載の哺乳動物細胞。１１．以下の工程：幼児から得た生物学的サンプルを未変性の免疫不全ウイルス抗原に曝して、インキュベーション混合物を形成させる工程；ヒト免疫不全ウイルスとの免疫複合体形成の存在についてインキュベーション混合物をモニターする工程；および組換え抗体に対するIgAまたはIgM抗HIV抗体免疫結合の存在を同定する工程、を包含する、ヒト免疫不全ウイルスに対する初期の幼児の感染を検出するためのスクリーニング方法であって、ここで、未変性のヒト免疫不全ウイルス抗原−Ig MまたはIgA抗体免疫複合体形成の存在が、幼児におけるヒト免疫不全ウイルスによる感染を示す、方法。１２．前記ヒト免疫不全ウイルス抗原が、HIV₂₁₃から得た組換えヒト免疫不全ウイルスgp160エンベロープタンパク質（ATCC 2247）である、請求項１１に記載の方法。１３．以下の工程：特発性の慢性リンパ球減少症を有するかまたは有する疑いのある患者から、生物学的サンプルを得る工程；該サンプルを、該サンプル中の任意の抗体と組換えタンパク質との間での免疫複合体の形成を可能にする条件下で未変性のヒト免疫不全ウイルス抗原に曝して、インキュベーション混合物を提供する工程；および抗-抗体二次試薬によって、標識されたヒト免疫不全ウイルス抗原とのインキュベーション混合物中の免疫複合体形成の存在を同定する工程、を包含する、特発性の慢性リンパ球減少症を有する患者から、HIVについて生物学的サンプルをスクリーニングする方法であって、ここで、サンプル中の抗体との免疫複合体形成の存在が特発性の慢性リンパ球減少症におけるHIVのスクリーニングを提供する、方法。１４．初期の抗ヒト免疫不全ウイルス抗体に結合し得る実質的に未変性の精製されたヒト免疫不全ウイルスエンベロープタンパク質を含む、複数のマイクロタイターウェルを含む、アッセイプレート。１５．前記マイクロタイターウェルが、実質的に未変性の精製された組換えヒト免疫不全ウイルスエンベロープタンパク質でコートされる、請求項１４に記載のアッセイプレート。１６．前記実質的に未変性の精製された組換えヒト免疫不全ウイルスエンベロープタンパク質が、組換えgp160エンベロープタンパク質としてさらに規定される、請求項１４に記載のアッセイプレート。１７．以下：請求項１４で規定されたアッセイプレート；抗HIV初期抗体に対して結合親和性を有する標識された二次抗体を含む容器手段、を含む、初期の抗ヒト免疫不全ウイルスについてサンプルをスクリーニングするためのキット。１８．精製された真核生物細胞の溶解物から得られる組換えHIVエンベロープタンパク質gp160を含む、初期の抗HIV抗体に免疫学的に結合し得る標的抗原調製物であって、該真核生物細胞の溶解物がHIV感染した哺乳動物細胞由来の溶解物を含み、該細胞がHIV_AC-1で感染させられ、哺乳動物細胞がHIV_Cで感染させられ、そして哺乳動物細胞がHIV₂₁₃で感染させられた、調製物。１９．前記哺乳動物細胞の溶解物が、約0.1％〜約10％のジギトニンでHIVを発現する哺乳動物細胞を可溶化するプロセスによって調製される、請求項１８に記載の標的抗原。２０．前記哺乳動物細胞がCEM細胞である、請求項１８に記載の標的抗原。２１．前記哺乳動物細胞がMu-1-Luである、請求項１８に記載の標的抗原。２２．HIV₂₁₃、HIV_AC-1、およびHIV_Cからなる群から選択されるウイルス単離物由来の組換えgp160を発現する、アッセイプレートに接着させた細胞を含む、初期の抗HIV抗体を検出することにおける使用のための、アッセイプレート。２３．前記細胞がMu-1-Lu細胞である、請求項２２に記載のアッセイプレート。